CN118436632B - Teriflunomide在制备预防和/或治疗原发性纤毛不动综合征的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了Teriflunomide在制备预防和/或治疗原发性纤毛不动综合征的药物中的用途，属于医药领域。本发明首次发现Teriflunomide可以有效恢复纤毛运动功能，在制备预防和/或治疗原发性不动纤毛综合征的药物中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及Teriflunomide在制备预防和/或治疗原发性纤毛不动综合征的药物中的新用途。
背景技术
原发性纤毛运动障碍综合征（Primary ciliary dyskinesia，PCD）是与运动纤毛异常相关的疾病，具有高度的遗传异质性和临床异质性。运动纤毛结构和功能的损伤会造成多种临床表征，包括新生儿呼吸窘迫，持续性湿咳，传导性听力受损，支气管扩张，鼻窦炎，上下呼吸道反复感染，百分之五十的患者出现内脏异位。
PCD的主要病因是运动纤毛出现结构紊乱以及功能受损，纤毛功能异常导致了呼吸道黏液清除效率降低，进而诱发反复的呼吸道感染对肺部组织造成不可逆的伤害。
PCD的常规临床治疗手段主要包括下呼吸道清理、体位引流、正压通气治疗、雾化吸入等来排除黏液，PCD肺功能衰退严重的患者甚至会通过肺移植来进行治疗。但是，这些治疗手段费用较高，患者依从性较差，开发治疗PCD的新药具有重要意义。
Teriflunomide（特立氟胺）是一种治疗多发性硬化症的药物，已于2010年7月在美国通过临床Ⅲ试验，于2012年9月在美国获准使用。目前还未见Teriflunomide用来治疗原发性纤毛不动综合征的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供Teriflunomide用来治疗原发性纤毛不动综合征的新用途。
本发明提供了Teriflunomide在制备预防和/或治疗原发性不动纤毛综合征的药物中的用途。
进一步地，所述药物是恢复纤毛运动功能的药物。
进一步地，所述药物是以Teriflunomide为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的药物制剂。
进一步地，所述的药物制剂为口服制剂或注射制剂。
进一步地，所述口服制剂为片剂、颗粒剂、胶囊剂。
进一步地，所述注射制剂为粉针剂。
本发明还提供了一种预防和/或治疗原发性不动纤毛综合征的药物，它是以Teriflunomide为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的药物制剂。
进一步地，所述的药物制剂为口服制剂或注射制剂。
进一步地，所述口服制剂为片剂、颗粒剂、胶囊剂。
进一步地，所述注射制剂为粉针剂。
本发明首次发现Teriflunomide可以有效恢复纤毛运动功能，在制备预防和/或治疗原发性不动纤毛综合征的药物中具有广阔的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1. A. Dnah10 KO气管类器官敲除策略的设计方案；B. Sanger 测序验证目标序列的敲除；C. Dnah10 KO气管类器官的基因分型（野生型小鼠条带 622bp，纯合小鼠778bp，杂合小鼠则二者兼有）；D. Western blot 结果测试图；E. RT-PCR 结果测试图；N=3， *表示p<0.05。
图2. A. 免疫荧光验证类器官中Dnah10 的敲除。红色：Dnah10，绿色：P63(上皮细胞Marker)。 B. Dnah10 敲除小鼠类器官纤毛形态及数量观察。红色：KRT5（基底细胞Marker），绿色：Ace-Tubulin(纤毛细胞Marker)。 C. Dnah10 敲除小鼠类器官纤毛形态及数量观察。红色：KRT5，绿色：ARL13B(纤毛细胞Marker)。D.Dnah10 敲除小鼠类器官分泌细胞观察。红色：KRT5（红色），绿色：CC-10(分泌细胞-Club cell Marker)。E. Dnah10 敲除小鼠类器官分泌细胞观察。红色：KRT5（红色），绿色：Muc5ac(杯状细胞 Marker)。
图3. Dnah10气管类器官药筛实验。A. 药物处理示意图。B. 加药处理后Dnah10敲除气管类器官纤毛摆动频率的测定。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1：Teriflunomide治疗原发性纤毛不动综合征的效果
I.实验方法
本发明参照现有技术（Dynein axonemal heavy chain 10 deficiency causesprimary ciliary dyskinesia in humans and mice. Frontiers of medicine, 17(5),957–971. ）第959页左栏“Mouse models”部分记载的方法构建了一种由内动力蛋白臂缺陷导致的PCD体外模型-Dnah10 KO小鼠的肺类器官，基于该类器官为PCD的治疗提供体外模型，研究了Teriflunomide治疗原发性纤毛不动综合征的效果。
具体实验步骤如下：
1.类器官原代培养铺板
在1.5mlEP管内，配置2管1ml消化液备用（Protease E 0.25 mg/ml、Collagense I400U/ml、Y27632 10um、DNase10U/ml），准备2个含4℃PBS的培养皿备用。
小鼠采用眼球放血，断颈处死，固定4肢，打开胸腔，分离小鼠肺叶、气管和食管后，分部置于PBS中。
在装有无菌PBS培养皿内，分别对气管和肺组织进行清洗，用眼科剪和镊子剪碎肺和气管组织，直径大小约2mm左右。
将组织块转移至消化液中，37℃摇床，100r/min，消化60min。
60min后，用1ml移液枪，机械吹打，所有组织块均能无阻力通过枪头见消化液中大量悬浮细胞可停止消化，否则延长消化时间。
加入300ul FBS中和，终止消化，机械吹打后，气管组织过40um滤网，获得滤液。肺叶组织过40um滤网，弃滤液，用PBS反向洗脱滤网上未过滤部分保留。
离心150G，3min，再用PBS清洗两次。
清洗后，去上清，保留沉淀，根据铺孔数量决定液体残余量，并和沉淀混匀制成细胞悬液。
用液化的Matrigel与悬液混匀（24孔：Matrigel 30ul，48孔Matrigel 15ul，96孔6ul 浓度大于80%）。铺孔时注意混匀组织和Matrigel，使其在Matrigel中均匀分布，完成后放于37℃培养箱，凝固Matrigel 15min。
后加入培养基（24孔：500ul 48孔：200ul 96孔：100ul），4天或者培养基变黄时更换培养基。
2.类器官传代
用移液枪刮下底部类器官和基质胶，吸出混悬液到EP管中，200G离心3min。
去上清液，加入1mlcell recovery吹打混匀，冰上放置20min，离心。
洗涤：去上清液，加入1ml WASH（洗涤液），吹打混匀，200G离心3min。
消化：去上清液，向EP管中加入1ml Tryple，吹打混匀，放入37摄氏度培养箱中消化5-10min（期间每5min取出吹打一次，观察消化状态），取出EP管，吹打，至无白色沉淀（若消化不完全，可适当延长消化时间），加入适量WASH终止消化， 200G离心3min。
洗涤2次：倒掉上清液，加入1ml WASH，吹打混匀，200G离心3min。
铺胶：去上清液，加入适量matrigel胶（30ul/孔），吹打混匀，铺在24孔板上（30ul/孔），放入37摄氏度培养箱中15min。（注意：基质胶提前放在冰上融化；加基质胶动作要快，加以后剩余样本都立刻放在冰上否则会凝。）
取出培养板，加入适量培养液（0.5ml/孔），放入37摄氏度培养箱中。
3.类器官为平台进行药筛
肺气管类器官被消化成单细胞后重铺在48孔板中，将药物Teriflunomide（简称Teri）按照不同的浓度稀释到培养基中，再加到每个孔，对照组用PBS代替，每组重复4次，药物处理一周。以NADPH-oxidase的抑制剂Diphenyleneiodonium（简称DPI，即二苯基氯化碘盐）作为阴性对照，以ATP（腺苷三磷酸）作为阳性对照。4.纤毛摆动评估
将野生型（WT）和Dnah10 基因敲除（Dnah10 KO）小鼠的类器官放到正置光学显微镜（Olympus，CKX41）（连接高速摄像机（Optronis GmbH，Sprinter）下，用100×油镜镜头进行观察拍摄。拍摄时以每秒200帧的速度，拍摄10秒，再转换成0.1倍的速度进行分析。
II．实验结果
1. PCD模型验证
（1）建立了Dnah10敲除的类器官。本发明采用Crispar Cas9的方法构建了Dnah10敲除的类器官，模式图如图1A，B所示。本发明采用PCR后琼脂糖凝胶电泳的方法进行基因分型，证明本发明已经拿到了纯合敲除的类器官（图1C）。Western blot 和RT-PCR表明从核酸水平和蛋白水平实现了DNAH10的敲除（图1D，E）。Western blot 结果显示，相比于野生气管类器官，杂合气管类器官中 DNAH10 表达降低，KO气管类器官检测不到 DNAH10 的表达。RT-PCR 结果显示纯合气管类器官中检测不到 Dnah10 的表达。
（2）本发明通过免疫荧光染色进一步确定了Dnah10敲除成功（图2A）。通过对纤毛细胞进行染色，本发明观察到DNAH10敲除的类器官的纤毛数目减少，长度变短（图2B，C）。尽管分泌型细胞和杯状细胞数量形态没有发生变化，但是Muc5ac作为呼吸道粘膜的杯状细胞产生的黏蛋白，其蛋白水平在DNAH10敲除的类器官中明显升高（图2D，E），这符合PCD病人的临床表征。
上述实验结果表明，本发明成功构建了PCD模型。
2. Teriflunomide治疗PCD效果
本发明将Dnah10 敲除类器官作为药物筛选平台，将Teriflunomide，Diphenyleneiodonium，ATP设置三个浓度梯度，分别加入Dnah10 敲除类器官，每个梯度做4个副孔， 连续加药10天，之后进行纤毛摆动的测定（图3A）。
从图3B可以看到，NADPH-oxidase的抑制剂Diphenyleneiodonium加入Dnah10 敲除类器官后，纤毛停止了运动，由此可见NADPH-oxidase对于纤毛的运动至关重要。
相较于不加药的Dnah10 敲除类器官组，加入Teriflunomide和ATP组的纤毛摆动功能都显著提高。并且，与阳性药物ATP组相比， Teriflunomide组纤毛摆动频率明显更高。
上述结果显示，Teriflunomide具有显著恢复纤毛运动功能的作用，能够用于有效治疗原发性纤毛不动综合征。
综上，本发明首次发现Teriflunomide可以有效恢复纤毛运动功能，在制备预防和/或治疗原发性不动纤毛综合征的药物中具有广阔的应用前景。
Claims (6)
1.Teriflunomide在制备预防和/或治疗原发性不动纤毛综合征的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物是恢复纤毛运动功能的药物。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物是以Teriflunomide为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的药物制剂。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的药物制剂为口服制剂或注射制剂。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述口服制剂为片剂、颗粒剂、胶囊剂。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述注射制剂为粉针剂。
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