CN118852182A - 一种类卟啉-白杨素偶合物及其合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种类卟啉‑白杨素偶合物及其合成方法和应用，属于药物合成技术领域。将类卟啉(如焦脱镁叶绿酸a)与白杨素通过酯化反应或碳碳双键加成反应进行偶联，得到具有光动力和化疗双重生物活性的类卟啉‑白杨素偶合物，可用于制备抗肿瘤药物。

Description

一种类卟啉-白杨素偶合物及其合成方法和应用
技术领域
本发明涉及一种类卟啉-白杨素偶合物及其合成方法，还涉及类卟啉-白杨素偶合物在制备光动力疗法结合化疗法抗肿瘤试剂中的应用，属于药物合成技术领域。
背景技术
癌症在世界上仍然是造成人类非正常死亡的主要原因，恶性肿瘤严重威胁着人类的生命健康。目前外科手术切除、放射治疗、化学治疗和免疫治疗虽取得了一定的成效，但也存在着创伤性大、毒副作用大、肿瘤易复发等诸多问题。
光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)作为一种新兴的高效治疗方式，利用激光使富集在病灶处的光敏剂发生系统间交叉并迅速形成其三重态激发态，将能量转移到基态氧(3O2)以产生具有细胞毒性的单线态氧(1O2)。因此上PDT具有毒性低、创伤小、选择性好等优点。PDT已应用于皮肤癌、鳞状细胞癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌及其他许多癌症的治疗。
光动力疗法-化疗联合抗肿瘤可以在光照下发挥光动力疗法和化疗双重效果，增强其对癌细胞的杀伤能力，减弱化疗药物对人体的副作用，这在研究上具有很大的意义和价值。
白杨素为黄酮类化合物，在体外研究中对乳腺癌、宫颈癌、恶性胶质瘤、食管癌、结肠癌、前列腺癌等均显示出强大的抗肿瘤效应。但白杨素等化疗药物通常在使用中存在生物利用度低或毒副作用大等问题。而卟啉类化合物具有大环共轭结构，是最常见的光敏剂，且卟啉类光敏剂具有易在肿瘤病灶中蓄积、细胞暗毒性低，在近红外窗口周围吸收强、单线态产氧率高等优点。
中国专利(CN109912607A)公开了一类新型的卟啉-白杨素衍生物，该专利是以化学合成的羟基卟啉为母体，以不同碳原子数的二溴代烷烃为衔接链，将白杨素酚羟基和卟啉酚羟基以醚键的形式偶合，得到一类新型的抗肿瘤化合物，但是这类卟啉化合物含有对称性骨架结构，其在Q段的吸收波长相对较小，且其主要通过稳定性好的键合方式进行偶合，难以在癌细胞降解释放出载体和抗肿瘤药物。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的是在于提供一种类卟啉-白杨素偶合物，该偶合物以具有光敏性质的类卟啉作为载体，具有抗癌活性的白杨素作为化疗药物，两者的偶合物在可见光400～750nm有吸收，可作为光动力与化疗相结合的抗癌药物。
本发明的第二个目的是在于提供一种类卟啉-白杨素偶合物的新合成方法，该方法采用的类卟啉来源广，条件温和，偶合效率高，目标偶合物收率高，有利于大规模生产。
本发明的第三个目的是在于提供一种类卟啉-白杨素偶合物的应用，该偶合物具有光动力和化疗的双重生物活性，可作为抗肿瘤药物应用。
本发明的第四个目的是在于提供一种类卟啉的制备方法，简化了类卟啉原料焦脱镁叶绿酸a的获得工艺和提高收率，可以降低类卟啉-白杨素偶合物的合成成本。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种类卟啉-白杨素偶合物，其具有
式1、式2、式3或式4结构式：
其中，
R1和R3选自R选自或C1～C10的烷基；R2、R8和R9独立选自H、或C1～C10的烷基；
R4和R5选自H或R6和R7独立选自R10、R11、R12和R13独立选自H或且式1～式4中均至少包含一个
作为一个优选的方案，类卟啉-白杨素偶合物具有以下结构式：
本发明还提供了一种类卟啉-白杨素偶合物的合成方法，该方法是：
将含羧基的类卟啉与白杨素的酚羟基通过酯化反应进行偶联，即得；或者，
将含乙烯基的类卟啉与白杨素的酚羟基通过间接加成反应进行偶联，即得；或者，
将含羧基和乙烯基的类卟啉与白杨素的酚羟基通过酯化反应和/或间接加成反应进行偶联，即得；
所述类卟啉具有式5、式6、式7或式8结构：
其中，
R15和R16选自R0选自C1～C10的烷基；
R14、R17和R18独立选自H或C1～C10的烷基。
作为一个优选的方案，所述酯化反应的条件为：以DCM为溶剂，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和/或N,N'-二环己基碳酰亚胺为缩合剂，4-二甲氨基吡啶和/或1-羟基苯并三唑为催化剂，在0～25℃反应12～24小时。溶剂还可以选择氯仿和四氢呋喃(THF)，但是效果要差于二氯甲烷(DCM)。优选的催化剂为4-二甲氨基吡啶(DMAP)。优选的反应温度为15～25℃。
作为一个优选的方案，含羧基的类卟啉或含羧基和乙烯基的类卟啉中羧基含量与缩合剂、白杨素及催化剂的物质的量之比为1:(1.5～2):(1.5～2):0.5，且缩合剂和白杨素的投料比例相同。
作为一个优选的方案，所述间接加成反应的过程为：含乙烯基的类卟啉或含羧基和乙烯基的类卟啉先与溴化氢进行加成反应，再与白杨素进行亲核取代反应。
作为一个优选的方案，所述加成反应的条件为：以溴化氢-醋酸混合溶液作为加成试剂，在0～25℃反应8～16小时。所述溴化氢-醋酸混合溶液为33％溴化氢-醋酸混合溶液，及溴化氢质量浓度为33％。
作为一个优选的方案，所述亲核取代反应的条件为：以K2CO3为碱试剂，18-冠醚-6为助溶剂，在0～25℃反应8～16小时。
本发明还提供了一种类卟啉-白杨素偶合物的应用，用于制备光动力疗法结合化疗法抗肿瘤试剂。本发明以焦脱镁叶绿酸a(PPA)与白杨素(Chrysin)酯化偶联产物PPA-C为例验证了其对黑色素瘤的光动力和化疗双重抗肿瘤效果。
本发明还提供了一种类卟啉的制备方法，该方法是将蚕沙泥与酸降解溶剂混合进行酸解反应，待酸解反应完成后，反应混合液通过减压蒸馏回收醋酸后倒入饱和食盐水中，析出类卟啉粗品；所述酸降解溶剂由浓盐酸与醋酸按照体积比1:8～10组成；所述酸降解溶剂与蚕沙泥的液固比为2.5～5mL:1g。所述酸解反应在室温下进行，反应时间为8～16小时。
本发明涉及的类卟啉可以来源于叶绿素a的降解产物，例如以含叶绿素a的蚕沙泥为原料通过酸降解提取得到：
叶绿素a的酸降解路线如下：
由叶绿素a经酸降解制备化合物1和化合物2通常采用盐酸乙醚法，所用盐酸通常为乙醚的1～5倍量(参考文献：“蚕沙中叶绿素a降解过程的化学研究”，姚建忠等，中草药，1999，(08):568-571)。
本发明中用醋酸代替乙醚，并且极大降低了所用盐酸的比例(盐酸与醋酸体积比为1：8～10)，经减压旋蒸可回收大部分醋酸，剩余醋酸和盐酸加入10倍量冷的饱和食盐水，即可析出叶绿素a酸降解粗品。
本发明的类卟啉与白杨素通过酯化反应偶合(以焦脱镁叶绿酸a为例进行说明)：
本发明以EDCI为脱水缩合剂，DMAP为亲核催化剂，将焦脱镁叶绿酸a与白杨素在DCM中进行酯化偶联，条件温和，且因白杨素不溶于DCM，这便减少了白杨素与脱水缩合剂直接反应的副产物，得到纯度更高的酯化偶联产物。
类卟啉与白杨素加成偶联(以焦脱镁镁叶绿酸a甲酯为例进行说明)：
本发明通过两步法来制备叶绿素a衍生物与白杨素的加成偶联产物，在室温反应，减少了溴代卟啉中间体在碱性条件下发生消除反应，以此得到白杨素亲核取代产物，以及水解副产物，提升了原料转化率。
本发明制备的部分类卟啉-白杨素偶合物的分子结构如下：
本发明的类卟啉包含羧基或乙烯基，如叶绿素a酸降解衍生物、血红素衍生物及人工合成的卟啉化合物，包括但不局限于下列化合物：
相对现有技术，本发明技术方案带来的有益技术效果：
本发明提供的类卟啉-白杨素偶合物以具有光敏性质的类卟啉作为载体，具有抗癌活性的白杨素作为化疗药物，特别是两者的偶合物在可见光400～750nm有吸收，可作为光动力与化疗相结合的抗癌药物，同时类卟啉-白杨素偶合物中类卟啉和白杨素可以利用具有生物活性的酯基键合，其在癌细胞外稳定性好，而在癌细胞内易于降解释放抗肿瘤药物。
本发明提供的类卟啉-白杨素偶合物的合成方法原料来源广，条件温和，偶合效率高，目标偶合物收率高，有利于大规模生产。
本发明提供的类卟啉原料的合成方法简单，收率高，大大降低了类卟啉-白杨素偶合物的原料成本。
附图说明
图1为PPIX-C2质谱检测图(ESI+)。
图2为TCPP-C4质谱检测图(ESI+)。
图3为TCPP-C3质谱检测图(ESI+)。
图4为TCPP-C2质谱检测图(ESI+)。
图5为TCPP-C2和TCPP-C1质谱检测图(ESI+)。
图6为类卟啉-白杨素偶合物的光动力与化疗联合抗肿瘤示意图。
图7为类卟啉-白杨素偶合物在DCM中的紫外可见光吸收光谱。
图8为PPA和CHRYSIN与PPA-C的红外光谱图。
图9为PPA-C及其对照品抗黑色素瘤活性测试(细胞活/死染色分析)。
图10为PPA、NPC、PPA-C抗黑色素瘤待测样品(PBS溶液)紫外可见光吸收光谱。
具体实施方式
为使本发明方案更加清楚，更加突出本发明方案的技术优点，下面结合具体实施例予以进一步说明。
本发明所用叶绿素a衍生物通过以下方法自制而得。
以蚕沙泥为原料制备焦脱镁叶绿酸a甲酯和焦脱镁叶绿酸a及其己基醚衍生物。
实施例1
原料药焦脱镁叶绿酸a(PPA)的制备：
取蚕沙泥50g，加入160mL乙酸溶解后，冰浴下加入20mL浓盐酸，室温继续搅拌12h以上，抽滤，滤液减压蒸出大部分乙酸，加入150mL冷的饱和食盐水，静置1h后过滤，滤饼干燥后，粗品以体积比二氯甲烷:甲醇＝10：1作为展开剂，经硅胶柱层析得到焦脱镁叶绿酸a(PPA)489mg，高效液相色谱法(HPLC)检测纯度83％，经乙醇-石油醚重结晶得到带有金属光泽的紫色棒状晶体178mg，高效液相色谱法(HPLC)检测纯度>95％。
PPA分子结构表征：1H-NMR(400MHz，DMSO-d6，ppm)δ12.08(s，1H，37-OH)，9.66(s，1H，10-CH)，9.40(s，1H，5-CH)，8.88(s，1H，20-CH)，8.16-8.23(dd，1H，26-CH)，6.35-6.4(dd，1H，27-CH)，6.18-6.22(dd，1H，27’-CH)，5.09-5.24(q，2H，33-CH2)，4.56-4.61(m，1H，18-CH)，4.30-4.33(m，1H，17-CH)，3.64-3.69(q，2H，29-CH2)，3.59(s，3H，31-CH3)，3.43(s，3H，28-CH3)，3.19(s，3H，25-CH3)，2.53-2.60(m，2H，35-CH2)，2.29-2.35(m，H，34-CH)，2.07-2.15(m，H，34’-CH)，1.77-1.79(d，3H，38-CH3)，1.59-1.63(t，3H，30-CH3)，0.21(s，1H，21-NH)，-2.00(s，1H，23-NH)。
MS(ESI+)m/z:535.27[M+H]+(100％)。
实施例2
原料药焦脱镁叶绿酸a甲酯(MPPA)的制备：
取蚕沙泥50g，加入200mL甲醇溶解后，冰浴下边搅拌边加入5mL浓硫酸，室温继续搅拌12h以上，减压蒸出大部分甲醇，加入100mL超纯水，用浓NaOH溶液调pH为4-6，硅藻土助滤，滤饼干燥后用二氯甲烷洗涤，滤液减压蒸馏得黑色粘稠物。用少量乙酸乙酯溶解后加入10倍的石油醚超声1-5min后抽滤，得到带有金属光泽的黑色固体4.5g(含脱镁叶绿酸a甲酯和焦脱镁叶绿酸a甲酯)。
以上粗品用80mL吡啶溶解，氩气保护，加热回流8h，脱掉33号位甲氧羰基(-COOCH3)，减压蒸出吡啶，用pH＝1的稀盐酸超声1min，用二氯甲烷萃取，有机相水洗后，减压旋蒸得到焦脱镁叶绿酸a甲酯粗品3.8g，高效液相色谱法(HPLC)检测含量13.82％。以体积比乙酸乙酯：石油醚＝1：2为展开剂硅胶柱层析，得到焦脱镁叶绿酸a甲酯精品504mg。高效液相色谱法(HPLC)检测纯度91.7％。
MPPA分子结构表征：1H-NMR(400MHz，CDCl3，ppm)δ9.52(s，1H，10-CH)，9.40(s，1H，5-CH)，8.56(s，1H，20-CH)，7.97-8.05(dd，1H，26-CH)，6.26-6.31(dd，1H，27-CH)，6.16-6.19(dd，1H，27’-CH)，5.09-5.29(q，2H，33-CH2)，4.46-4.52(m，1H，18-CH)，4.29-4.31(m，1H，17-CH)，3.68-3.73(q，2H，29-CH2)，3.68(s，3H，37-OCH3)，3.61(s，3H，31-CH3)，3.41(s，3H，28-CH3)，3.21(s，3H，25-CH3)，2.53-2.72(m，2H，35-CH2)，2.25-2.36(m，H，34-CH2)，1.80-1.82(d，3H，38-CH3)，1.68-1.72(t，3H，30-CH3)，0.46(s，1H，21-NH)，-1.68(s，1H，23-NH)。
MS(ESI+)m/z:549.29[M+H]+(100％)。
实施例3
原料药焦脱镁叶绿酸a-己基醚(HPPA)的制备：
取焦脱镁叶绿酸a(PPA)100mg，用10mL无水二氯甲烷溶解后，加入1ml33％HBr-CH3COOH溶液，冰浴0-15℃反应12h，减压蒸除溶剂和醋酸，氩气吹干后加入10mL无水二氯甲烷重新溶解，加入0.5mL正己醚。室温(15～20℃)反应12h，减压除去溶剂，用含少量NaOH的乙醇溶解超声1～5min后，加入过量石油醚析出HPPA钠盐，水溶后通过调pH得到HPPA粗品。以二氯甲烷：甲醇＝15：1硅胶柱层析，得到焦脱镁叶绿酸a-己基醚纯品58mg。高效液相色谱法(HPLC)检测纯度93.9％。
HPPA分子结构表征：1H-NMR(400MHz，CDCl3，ppm)δ9.76(s，1H，10-CH)，9.48(s，1H，5-CH)，8.50(s，1H，20-CH)，5.86-5.91(q，1H，26-CH)，5.09-5.29(q，2H，33-CH2)，4.45-4.48(m，1H，18-CH)，4.30-4.32(m，1H，17-CH)，3.68-3.72(q，2H，29-CH2)，3.65(s，3H，37-OCH3)，3.61(s，3H，31-CH3)，3.55-3.59(t，2H，38-CH2)，3.36(s，3H，28-CH3)，3.25(s，3H，25-CH3)，2.57-2.70(m，2H，35-CH2)，2.295-2.35(m，H，34-CH2)，2.09-2.11(d，3H，27-CH3)，1.28-1.71(d，37-CH3，30-CH3，39-CH2，40-CH2，41-CH2，42-CH2)，0.74-0.78(t，3H，43-CH3)，-1.68(s，1H，23-NH)。
MS(ESI+)m/z:637.38[M+H]+(100％)。
叶绿素a衍生物与白杨素偶联物的制备：
实施例4
焦脱镁叶绿酸a(PPA)与白杨素(chrysin)酯化偶联产物(PPA-C)的制备：
在25mL烧瓶中加入PPA53.4mg(0.1mmol)，白杨素38.1mg(0.15mmol)，EDCI 28.8mg(0.15mmol),DMAP 6.1mg(0.05mmol)，加入无水二氯甲烷(DCM)10mL，室温避光反应约24h。减压蒸出溶剂，先后用1％的稀盐酸和超纯水洗涤，二氯甲烷萃取，减压旋蒸除去有机相得到PPA-C酯化产物粗品，以展开剂体积比二氯甲烷:甲醇＝20：1硅胶柱层析，得到PPA-C酯化产品66.3mg，产率85％。
PPA-C分子结构表征：1H-NMR(400MHz，CDCl3，ppm)δ12.46(s，1H，-OH)，9.44(s，1H，10-CH)，9.36(s，1H，5-CH)，8.59(s，1H，20-CH)，7.98-8.05(dd，1H，26-CH)，7.77(s，1H)，7.75(s，1H)，7.50-7.57(m，3H)，6.60(s，1H)，6.28-6.33(dd，1H，27-CH2)，6.17-6.22(dd，1H，27’-CH2)，6.13(dd，1H)，5.13-5.34(q，2H，33-CH2)，4.55-4.60(m，H，18-CH)，4.42-4.44(m，H，17-CH)，3.66(s，3H，31-CH3)，3.61-3.65(q，2H，29-CH2)，3.43(s，3H，28-CH3)，3.20(s，3H，25-CH3)，2.58-2.79(m，2H，35-CH2)，2.44-2.51(m，2H，34-CH2)，1.84-1.86(d，3H，37-CH3)，1.66-1.70(t，30-CH3)，0.42(s，1H，21-NH)，-1.74(s，1H，23-NH)。
MS(ESI+)m/z:771.32[M+H]+(100％)。
通过对比原料PPA和CHRYSIN与其酯化偶联产物(PPA-C)的红外吸收光谱图可知；原料焦脱镁叶绿酸a(PPA)的羧基O-H伸缩振动峰(3293cm-1)和白杨素(CHRYSIN)7号位酚羟基O-H伸缩振动峰(2632cm-1)在偶联产物(PPA-C)中均消失，其余特征峰基本吻合。
实施例5
焦脱镁叶绿酸a-己基醚(HPPA)与白杨素(chrysin)酯化偶联产物(HPPA-C)的制备：
在25mL圆底烧瓶中加入63.7mg(0.1mmol)HPPA，白杨素38.1mg(0.15mmol)，EDCI38.4mg(0.2mmol),DMAP 6.1mg(0.05mmol)，加入无水二氯甲烷(DCM)8mL，超声分散后室温避光反应约24h。减压蒸出溶剂，先后用1％的稀盐酸和超纯水洗涤，二氯甲烷萃取，减压旋蒸除去有机相得到HPPA-C酯化产物粗品，以展开剂体积比二氯甲烷:甲醇＝30：1硅胶柱层析，得到HPPA-C酯化产品82mg，产率92％。
HPPA-C分子结构表征：1H-NMR(400MHz，CDCl3，ppm)δ12.52(s，1H，-OH)，9.75(s，1H，10-CH)，9.45(s，1H，5-CH)，8.55(s，1H，20-CH)，
7.77(s，1H)，7.75(s，1H)，7.46-7.55(m，3H)，6.58(s，1H)，6.38-6.39(d，1H)，6.15(dd，1H)，5.89-5.94(q，H，26-CH)，5.12-5.32(q，2H，33-CH2)，4.53-4.38(m，H，17-CH)，4.40-4.43(m，H，18-CH)，3.67-3.71(q，2H，29-CH2)，3.64(s，3H，31-CH3)，3.59-3.62(t，2H，38-CH2)，3.39(s，3H，28-CH3)，3.24(s，3H，25-CH3)，2.68-2.78(m，2H，35-CH2)，2.39-2.60(m，H，34-CH2)，2.11-2.13(d，3H，27-CH3)，1.84-1.86(d，37-CH3)，1.72-1.76(m，39-CH2)，1.66-1.70(t，30-CH3)，1.35-1.41(m，6H，40，41，42-CH2)，0.76-0.79(t，3H，43-CH3)，0.42(s，1H，21-NH)，-1.75(s，1H，23-NH)。
MS(ESI+)m/z:873.42[M+H]+(100％)。
实施例6
焦脱镁叶绿酸a甲酯(MPPA)与白杨素(chrysin)间接加成偶联产物(MPPA-C)的制备：
取MPPA 54.9mg(0.1mmol)，用5mL无水二氯甲烷溶解后，加入
0.5ml33％HBr-CH3COOH溶液，冰浴0-15℃反应12h，减压蒸除溶剂和醋酸，氩气吹干后加入50.8mg(0.2mmol)白杨素，200mg新焙烧的无水K2CO3，200mg18-冠醚-6，10mL无水四氢呋喃烷重新溶解，室温(15～20℃)反应12h，减压除去溶剂，用二氯甲烷溶解后抽滤，滤液用pH＝1的稀盐酸，超纯水先后洗涤，有机相旋蒸除去溶剂得到紫黑色固体，以体积比石油醚：丙酮＝3：1硅胶柱层析，得到焦脱镁叶绿酸a甲酯(MPPA)与白杨素(chrysin)间接加成偶联产物(MPPA-chrysin)26.1mg，产率32.5％。
MPPA-C分子结构表征：
1H-NMR(400MHz，CDCl3，ppm)δ12.56(s，0.5H，-OH)，12.54(s，0.5H，-OH)，9.66(s，0.5H，10-CH)，9.65(s，0.5H，10-CH)，9.50(s，0.5H，5-CH)，9.49(s，0.5H，5-CH)，8.55(s，1H，20-CH)，7.61(s，1H)，7.59(s，1H)，7.31-7.41(m，3H)，6.83-6.87(m，1H，26-CH)，6.72-6.73(d，1H)，6.64-6.65(t，1H)，6.41(d，H)，5.07-5.27(q，2H，34-CH2)，4.42-4.48(m，H，17-CH)，4.26-4.28(m，H，18-CH)，3.67-3.73(q，2H，30-CH2)，3.64(s，3H，38-CH3)，3.58(s，3H，32-CH3)，3.46(d，3H，29-CH3)，3.33(s，3H，25)，2.48-2.57(m，H，36-CH2)，2.19-2.27(m，H，365-CH2)，2.34-2.36(dd，2H，35-CH2)，1.76-1.81(q，3H，39-CH3)，1.68-1.72(m，3H，31-CH3)，-1.85(s，1H，23-NH)。
MS(ESI+)m/z:803.34.42[M+H]+(100％)(MPPA-C及副产物质谱检测图)。
白杨素(chrysin)同样也可与原卟啉(PPIX)以及四羧基苯基卟啉(TCPP)通过酯化的方式进行偶联，得到双功能产物(包括但不局限于下列化合物)。
实施例7
多羧基卟啉化合物与白杨素酯化偶联物的制备：
取原卟啉(PPIX)56.3mg(0.1mmol)，N,N'-二环己基碳酰亚胺(DCC)40.6mg(0.2mmol)，用25mL四氢呋喃超声溶解，室温活化1h后，加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)6mg(0.05mmol)，白杨素50.8mg(0.2mmol)，少许吡啶，继续反应12h后，可通过质谱检测到PPIX-C2(图1)。用同样的方法可将四羧基苯基卟啉与白杨素进行酯化偶联，质谱检测到不同偶联产物(图2～5)。
单羧基卟啉化合物尤其是叶绿素a酸降解产物，如焦脱镁叶绿酸a，与白杨素通过Steglich酯化反应进行偶联，选取EDCI为缩合剂，DMAP为催化剂，残留EDCI和DMAP可通过稀盐酸和水洗涤除去，因白杨素不溶于DCM，因此上，过量的白杨素可通过DCM分离。本发明得到的PPA-C，PA-C，HPPA-C产率均高于80％，纯度均高于90％。
多羧基卟啉化合物，因在DCM中的溶解性不好，因此需要选择THF等继续较大的溶剂，因EDCI不溶于THF，因此上需要选择DCC作缩合剂，DMAP催化，吡啶作碱，提高酯化效率。
卟啉化合物乙烯基与白杨素间接加成反应，因中间体溴代卟啉容易水解，且温度高于30℃时，在有机碱如三乙胺存在下也容易发生消去反应，因此上原料与所用溶剂含水量以及温度对产率和纯度影响很大。本发明所用原料均在真空下用五氧化二磷干燥48h，溶剂为无水二氯甲烷和无水四氢呋喃，选用新焙烧的K2CO3作碱，18-冠醚-6为碱的助溶剂，室温反应12h以上，得到MPPA与白杨素的间接加成产物。
实施例8
以PPA-C为例评价卟啉-白杨素偶合物的抗肿瘤细胞活性：
本次PPA-C抗黑色素瘤细胞的活性实验共设置10组，每组3个平行实验。1～5号为光照组，6～10号不进行光照。其中，NPC表示PPA与Chrysin的共组装纳米粒子。
编号 药品名称 条件
1 空白对照 光照(660nm，0.1W/cm2)
2 PPA 光照(660nm，0.1W/cm2)
3 Chrysin 光照(660nm，0.1W/cm2)
4 PPA-C 光照(660nm，0.1W/cm2)
5 NPC 光照(660nm，0.1W/cm2)
6 空白对照 暗黑
7 PPA 暗黑
8 Chrysin 暗黑
9 PPA-C 暗黑
10 NPC 暗黑
待测药品PPA，Chrysin，PPA-C，NPC按下列方法配置：
PPA：称取1mgPPA溶于1mLDMSO，取上述10μLPPA的DMSO溶液，用10mLPBS稀释，最终将100μLPBS稀释后的样品加入1mL含黑色素瘤的培养基中，最终浓度0.19μmol/L。
同理：
Chrysin：0.5mg/1mLDMSO，10μl/10mLPBS，100μL/1mL培养基，0.18μmol/L。
PPA-C：1.5mg/1mLDMSO，10μL/10mLPBS，100μL/1mL培养基，0.19μmol/L。
NPC的制备：
称取1mg Chrysin，溶于2mLTHF，取400μL滴加到10mL0.1M NaOH水溶液中，称取1mgPPA，用1mLTHF溶解后，取400μL滴加到上述10mL 0.1MNaOH水溶液中，剧烈搅拌下用1M的盐酸调pH为6～7，继续搅拌4h，氩气鼓泡除去THF即得NPC。取250μLNPC用10mLPBS稀释后，最终将100μLPBS稀释后的样品加入1mL含黑色素瘤的培养基中，最终浓度0.19μmol/L。
PPA-C的体外抗黑色素瘤瘤活性检测：
首先，将黑色素瘤细胞接种到24孔板中，密度为5×103细胞/孔，并将板孵育24小时。然后，除去每个孔中的培养基，加入1mL新培养基和100μL待测样品，孵育4小时。用660nm激光(0.1W/cm2)照射5min分钟。孵育3h，弃去培养基，用100～150μL胰酶消化细胞，收集并离心，用PBS洗去残留的胰酶，按使用说明加入Calcein AM/PI检测工作液进行活死细胞染色(绿色标记活细胞，红色标记死细胞)，避光孵育30min并使用使用奥林巴斯倒置荧光显微镜对黑色素瘤细胞进行成像。
实验结果如图9所示，在同等浓度(0.19μmol/L)下，白杨素光照与否都具有一定的体外抗黑色素瘤活性，并且光照下活性略强。PPA只有在光照下才显示出其光动力抗黑色素瘤活性，NPC相比Chrysin和PPA活性更强，PPA-C在光照下显示出很强的抗黑色素瘤活性，并且要远高于同等条件下的NPC和PPA。结合PPA、NPC和PPA-C待测样的紫外可见光吸收光谱分析可得，PPA的DMSO溶液分散到PBS缓冲溶液中有一部分会自组装成纳米颗粒，其PBS的紫外可见光区域Q段(650～750)有两个吸收峰，分别归属为游离PPA和PPA纳米粒子可见光吸收峰。而PPA-C由于没有羧基，自组装能力变差，在进入细胞前主要以单分子形式存在。在进入细胞后PPA-C可能被细胞内的酯酶水解，从而释放出白杨素，这便使PPA-C在没有光照下也显示出一定活性。而PPA和NPC由于分子互相包裹，进入细胞的数量有限，使得其在光照下的光动力活性要弱于PPA-C。
因此上本发明制备的羧基卟啉与白杨素酯化偶合物其在光动力疗法抗肿瘤方面是有实际应用价值的。

Claims (10)

1.一种类卟啉-白杨素偶合物，其特征在于：具有式1、式2、式3或式4结构式：
其中，
R1和R3选自R选自或C1～C10的烷基；
R2、R8和R9独立选自H、或C1～C10的烷基；
R4和R5选自H或
R6和R7独立选自
R10、R11、R12和R13独立选自H或且式1～式4中均至少包含一个
2.根据权利要求1所述的一种类卟啉-白杨素偶合物，其特征在于：具有以下结构式：
。
3.权利要求1或2所述的一种类卟啉-白杨素偶合物的合成方法，其特征在于：将含羧基的类卟啉与白杨素的酚羟基通过酯化反应进行偶联，即得；
或者，
将含乙烯基的类卟啉与白杨素的酚羟基通过间接加成反应进行偶联，即得；
或者，
将含羧基和乙烯基的类卟啉与白杨素的酚羟基通过酯化反应和/或间接加成反应进行偶联，即得；
所述类卟啉具有式5、式6、式7或式8结构：
其中，
R15和R16选自R0选自C1～C10的烷基；
R14、R17和R18独立选自H或C1～C10的烷基。
4.根据权利要求3所述的一种类卟啉-白杨素偶合物的合成方法，其特征在于：所述酯化反应的条件为：以DCM为溶剂，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和/或N,N'-二环己基碳酰亚胺为缩合剂，4-二甲氨基吡啶和/或1-羟基苯并三唑为催化剂，在0～25℃反应12～24小时。
5.根据权利要求3或4所述的一种类卟啉-白杨素偶合物的合成方法，其特征在于：含羧基的类卟啉或含羧基和乙烯基的类卟啉中羧基含量与缩合剂、白杨素及催化剂的物质的量之比为1:(1.5～2):(1.5～2):(0.4～0.6)，且缩合剂和白杨素的投料比相同。
6.根据权利要求3所述的一种类卟啉-白杨素偶合物的合成方法，其特征在于：所述间接加成反应的过程为：含乙烯基的类卟啉或含羧基和乙烯基的类卟啉先与溴化氢进行加成反应，再与白杨素进行亲核取代反应。
7.根据权利要求6所述的一种类卟啉-白杨素偶合物的合成方法，其特征在于：所述加成反应的条件为：以溴化氢-醋酸混合溶液作为加成试剂，在0～25℃反应8～16小时。
8.根据权利要求6所述的一种类卟啉-白杨素偶合物的合成方法，其特征在于：所述亲核取代反应的条件为：以K2CO3为碱试剂，18-冠醚-6为助溶剂，在0～25℃反应8～16小时。
9.一种类卟啉的制备方法，其特征在于：将蚕沙泥与酸降解溶剂混合进行酸解反应，待酸解反应完成后，反应混合液通过减压蒸馏回收醋酸后倒入饱和食盐水中，析出类卟啉粗品；
所述酸降解溶剂由浓盐酸与醋酸按照体积比1:8～10组成；所述酸降解溶剂与蚕沙泥的液固比为2.5～5mL:1g。
10.权利要求1或2所述的一种类卟啉-白杨素偶合物的应用，其特征在于：用于制备光动力疗法结合化疗法抗肿瘤试剂。
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