CN119242520A - 一种基于pH控制系统的乳酸菌高密度培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于pH控制系统的乳酸菌高密度培养方法，涉及乳酸菌培养技术领域，本发明，对乳酸菌培养阶段进行实时监测，采用pH传感器和PID控制算法，将发酵过程中pH值维持在6.7±0.1范围内，避免乳酸过度积累，避免pH值的大幅波动，使乳酸菌在稳定的酸碱环境中高效生长，大幅提升了发酵效率和菌体产量，提供更有效的pH控制，加快乳酸菌的生长速度，并维持高密度的菌体培养，发酵过程中进行自动调节，为发酵环境提供连续性和稳定性，缩短了发酵时间，在相同的发酵周期内，乳酸菌的生物量显著增加，产量提高，提高了整体的生产效率和经济效益，自动化pH控制系统能够持续监控发酵罐内的环境，并在pH值发生变化时自动调整，降低了人为误差的风险。

Description

一种基于pH控制系统的乳酸菌高密度培养方法

技术领域

本发明涉及乳酸菌培养技术领域，特别是一种基于pH控制系统的乳酸菌高密度培养方法。

背景技术

当前的乳酸菌高密度培养方法面临多个技术难题，特别是在发酵过程中对pH值的控制上，对乳酸菌的生长、代谢以及最终产量有着至关重要的影响。

传统方案在发酵过程中，乳酸菌会产生大量乳酸，导致发酵液的pH值迅速下降，如果pH值下降过多，会抑制乳酸菌的生长和代谢，最终影响产量和质量，在传统的发酵过程中，通常依靠人工手动监测pH值，并通过添加碱溶液(如NaOH)进行调节，手动调节虽然能够部分缓解pH波动，但频繁的人为干预不仅增加了操作复杂度，还容易出现反应不及时或调节不精确的情况，手动调节过程中，pH值会出现大幅波动，无法保证始终处于乳酸菌最佳生长范围内，导致发酵效率下降，最终影响生产的稳定性和产量一致性。

乳酸菌发酵的生产效率受多种因素影响，特别是发酵过程中的pH值、温度等参数控制不稳定时，乳酸菌的生长速率会明显降低，导致发酵周期延长，生产效率低下，因此亟需一种基于pH控制系统的乳酸菌高密度培养方法来解决此类问题。

发明内容

鉴于上述现有存在的问题，提出了本发明。

本发明提供了一种基于pH控制系统的乳酸菌高密度培养方法解决传统方法主要依靠定期监测发酵参数，通过手动调节温度和pH值来维持发酵条件，无法做到实时精确调节，发酵过程中菌体的代谢状态经常受到波动的影响，导致发酵时间过长的问题。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种基于pH控制系统的乳酸菌高密度培养方法，其包括，

步骤S1，进行材料准备，

包括大豆蛋白胨3％、酵母浸提粉2％、乙酸钠0.5％、复合微量元素液0.1％、复合维生素液0.05％、胰蛋白酶0.2％、酸溶蛋白(短肽)0.5％、柠檬酸钠0.2％～0.4％、Mg2+水溶性化合物0.02％～0.04％、Fe2+水溶性化合物0.01％～0.02％、纯水93.64％～94.62％，

配制MRS培养基并调节pH至初始值为7.0，将培养基在高压灭菌器中以121℃进行15分钟灭菌；

步骤S2，发酵罐设置，

将灭菌后的培养基在无菌条件下转移到带温控和pH控制系统的发酵罐中；

步骤S3，启动pH控制系统，校准pH传感器；

步骤S4，实时监控调节，

当发酵开始时，pH传感器实时监测发酵罐内培养液的pH值，

步骤S5，过程维持，

发酵罐内维持温度恒定在37℃，pH控制系统保持pH值在设定范围内，

持续发酵30小时后，结束发酵，收集培养液；

采用pH控制系统实现了对发酵环境的全自动化监控与调节，发酵过程中，pH值是乳酸菌生长的关键因素之一，传统的发酵方法中pH值波动较大，常导致菌体的生长不稳定以及产量和质量的波动，本发明中，pH传感器能够实时、连续地采集发酵液的pH值，避免因pH波动导致的菌体生长抑制。

进一步的，步骤S2中，发酵罐的温度调节为37℃。

进一步的，步骤S3中，将pH控制器设置为6.7±0.1。

进一步的，步骤S4中，当pH值低于预设下限值6.6时，pH控制器发出信号，启动与控制系统连接的泵。

进一步的，步骤S4中，从储液桶中自动添加20％NaOH溶液，泵基于流量控制，添加碱溶液，将pH值恢复至设定范围6.7±0.1。

进一步的，pH控制系统组件包括：

pH传感器，用于实时检测发酵液的pH值，将数据传送至pH控制器，

pH控制器，用于根据pH传感器的输入数据，判断pH值是否在设定范围内，并决定是否启动泵添加酸或碱，采用PID控制算法在pH控制中的进一步提高控制的灵活性和精度，PID控制能够动态调整泵的操作，通过计算pH的误差值，添加NaOH溶液，将pH值保持在预设范围内，使发酵罐内的pH值始终处于乳酸菌适宜范围，减少人为误差，并且能够在pH值发生微小变化时迅速做出反应，有效地提升了乳酸菌的生长速率和发酵效率。

进一步的，pH控制系统组件还包括：

泵和储液桶，与pH控制器相连，根据需要添加酸或碱溶液，保持pH稳定。

进一步的，pH控制系统的乳酸菌高密度培养过程中，pH监控与调节方式包括：

在发酵过程中，pH传感器不断采集发酵液的pH值，采用卡尔曼滤波消除噪声，将处理后的数据实时传输至控制器，

控制器根据传感器传递的pH值信息，采用PID控制算法做出调节判断。

进一步的，pH控制系统的乳酸菌高密度培养过程中，pH监控与调节方式还包括：

PID控制算法计算当前pH值与目标pH值之间的差值，并通过比例、积分和微分项调节控制器输出，控制泵的启动或停止，pH控制系统与发酵罐的结合，提高了整个发酵过程的自动化程度和可控性，基于对温度和pH的联合调控，为乳酸菌的高效生长提供最佳条件，持续自动调节，减少了对人工操作的依赖，提高了生产效率，还降低了操作过程中的污染风险。

进一步的，pH控制系统的乳酸菌高密度培养过程中，pH监控与调节方式还包括：

泵基于控制器的指令，采用流量控制算法计算泵输送的NaOH溶液量，根据pH值的偏差，实时调节泵的流量。

本发明有益效果为：

本发明，对乳酸菌培养阶段进行实时监测，采用pH传感器和PID控制算法，将发酵过程中pH值维持在6.7±0.1范围内，减少了乳酸的过度积累，避免pH值的大幅波动，使乳酸菌可以在稳定的酸碱环境中高效生长，大幅提升了发酵效率和菌体产量。

本发明，提供更有效的pH控制，加快了乳酸菌的生长速度，并维持高密度的菌体培养，发酵过程中进行自动调节，为发酵环境提供连续性和稳定性，缩短了发酵时间，在相同的发酵周期内，乳酸菌的生物量显著增加，产量提高，提高了整体的生产效率和经济效益。

本发明，自动化pH控制系统能够持续监控发酵罐内的环境，并在pH值发生变化时自动调整，通过泵注入NaOH溶液，保持pH值稳定，减少了人为操作的必要性，降低了人为误差的风险。

本发明，集成pH控制和温度控制系统，显著提升发酵过程的可控性，温度和pH联合调控使乳酸菌能够在更适宜的环境下生长。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明的乳酸菌高密度培养方法流程示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1：乳酸菌高密度培养

配制步骤：

根据发酵罐的容量，按比例称取各成分，将各成分溶解于蒸馏水中，使用pH计将培养基的pH值调整至6.7，在高压灭菌器中灭菌，121℃，15分钟，在无菌条件下，将乳酸菌接种到已灭菌的培养基中，

将培养基转移至发酵罐中，将发酵罐温度设置为37℃，启动pH监控系统，实时监测培养液的pH值，当pH值低于6.6时，自动或手动添加20％NaOH溶液，调整并保持pH值在6.7±0.1，

维持上述条件进行发酵，持续30小时，30小时后，停止发酵，收集培养液；

实施例2：乳酸菌高密度培养

配制培养基，3％大豆蛋白胨、2％酵母浸提粉、0.5％乙酸钠、0.1％复合微量元素液、0.05％复合维生素液、0.2％胰蛋白酶、0.5％酸溶蛋白(短肽)，0.2％柠檬酸钠、0.02％Mg2+水溶性化合、0.02％的Fe2+水溶性化合物，其余为纯水；

配制步骤：

根据发酵罐的容量，按比例称取各成分，将各成分溶解于蒸馏水中，使用pH计将培养基的pH值调整至7.0，在高压灭菌器中灭菌，121℃，15分钟，在无菌条件下，将乳酸菌接种到已灭菌的培养基中，

将培养基转移至发酵罐中，将发酵罐温度设置为37℃，启动pH监控系统，实时监测培养液的pH值，当pH值低于6.6时，自动或手动添加20％NaOH溶液，调整并保持pH值在7.0±0.1，

维持上述条件进行发酵，持续30小时，30小时后，停止发酵，收集培养液；

实施例3：乳酸菌高密度培养

配制培养基，3％大豆蛋白胨、2％酵母浸提粉、0.5％乙酸钠、0.1％复合微量元素液、0.05％复合维生素液、0.2％胰蛋白酶、0.5％酸溶蛋白(短肽)，0.2％柠檬酸钠、0.02％Mg2+水溶性化合、0.02％的Fe2+水溶性化合物，其余为纯水；

配制步骤：

根据发酵罐的容量，按比例称取各成分，将各成分溶解于蒸馏水中，使用pH计将培养基的pH值调整至7.5，在高压灭菌器中灭菌，121℃，15分钟，在无菌条件下，将乳酸菌接种到已灭菌的培养基中，

将培养基转移至发酵罐中，将发酵罐温度设置为37℃，启动pH监控系统，实时监测培养液的pH值，当pH值低于6.6时，自动或手动添加20％NaOH溶液，调整并保持pH值在7.5±0.1，

维持上述条件进行发酵，持续30小时，30小时后，停止发酵，收集培养液；

实施例4：乳酸菌高密度培养

配制培养基，3％大豆蛋白胨、2％酵母浸提粉、0.5％乙酸钠、0.1％复合微量元素液、0.05％复合维生素液、0.2％胰蛋白酶、0.5％酸溶蛋白(短肽)，0.2％柠檬酸钠、0.02％Mg2+水溶性化合、0.02％的Fe2+水溶性化合物，其余为纯水；

配制步骤：

根据发酵罐的容量，按比例称取各成分，将各成分溶解于蒸馏水中，使用pH计将培养基的pH值调整至8.0，在高压灭菌器中灭菌，121℃，15分钟，在无菌条件下，将乳酸菌接种到已灭菌的培养基中，

将培养基转移至发酵罐中，将发酵罐温度设置为37℃，启动pH监控系统，实时监测培养液的pH值，当pH值低于6.6时，自动或手动添加20％NaOH溶液，调整并保持pH值在8.0±0.1，

维持上述条件进行发酵，持续30小时，30小时后，停止发酵，收集培养液；

实施例5：乳酸菌高密度培养

配制培养基，3％大豆蛋白胨、2％酵母浸提粉、0.5％乙酸钠、0.1％复合微量元素液、0.05％复合维生素液、0.2％胰蛋白酶、0.5％酸溶蛋白(短肽)，0.2％柠檬酸钠、0.02％Mg2+水溶性化合、0.02％的Fe2+水溶性化合物，其余为纯水；

配制步骤：

根据发酵罐的容量，按比例称取各成分，将各成分溶解于蒸馏水中，使用pH计将培养基的pH值调整至8.5，在高压灭菌器中灭菌，121℃，15分钟，在无菌条件下，将乳酸菌接种到已灭菌的培养基中，

将培养基转移至发酵罐中，将发酵罐温度设置为37℃，启动pH监控系统，实时监测培养液的pH值，当pH值低于6.6时，自动或手动添加20％NaOH溶液，调整并保持pH值在8.5±0.1，

维持上述条件进行发酵，持续30小时，30小时后，停止发酵，收集培养液；

实验例1：pH条件对乳酸菌生长影响实验

1材料与方法

1.1培养基

配制培养基，3％大豆蛋白胨、2％酵母浸提粉、0.5％乙酸钠、0.1％复合微量元素液、0.05％复合维生素液、0.2％胰蛋白酶、0.5％酸溶蛋白(短肽)，0.2％柠檬酸钠、0.02％Mg2+水溶性化合、0.02％的Fe2+水溶性化合物，其余为纯水；

1.2试剂与仪器

1.2.1试剂

革兰氏(Gram)染色液；溴甲酚紫指示剂；格里斯氏(Griess)试剂(亚硝酸盐试剂)；二苯胺-硫酸试剂(硝酸盐试剂)；

1.2.2仪器

LDZX-50KB型立式电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；FA1004型电子天平(上海天平仪器厂)；0.5—10μL和20—200μL型微量加样器(赛默)；ZHJH-2109C型超净工作台(上海智诚分析仪器制造有限公司)；SPX-250B型智能生化培养箱(江苏金坛市正基仪器有限公司)；E-201-C型PHS-BE(pH计)(上海精密科学仪器有限公司)；722型分光光度计(上海第三分析仪器厂)；DMBA300LED型电子显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)；E221LED型光学显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)

1.3样品采集与菌株分离、保存

1.3.1样品的采集

1.3.2乳酸菌的分离纯化

测定样品的温度及pH值以后，进行乳酸菌的分离与纯化：将样品梯度稀释后分别采用划线法和涂布法接种于MRS琼脂培养基和BCP培养基上，37℃培养24～48h，将过氧化氢酶(试验为阴性)、不还原硝酸盐、不液化明胶及糖发酵实验产酸不产气的杆状、球状或链球状革兰氏阳性菌初步鉴定为乳酸菌，并进一步纯化培养保存，

1.4不同pH值的实验与观测

采用pH传感器实时监测溶液的pH值，

采用控制器接收传感器数据并做出反应，可以设定目标pH范围，

采用泵自动添加酸或碱以调整pH，分别设为：pH分别为3.5、4.3、4.5、5.7、6.5、8.5、9.6；

2结果与分析

2.1乳品中乳酸菌的分离与初步鉴定

本实验采集的4份乳品，经分离纯化，pH值的自动调节；

2.2pH变化实验的预处理及结果观察

实验结果表明，灭菌前后培养液的pH值在偏酸条件下差异不明显，略微有所降低，在偏碱时差异较明显，主要表现为降低，根据预处理结果，实验将灭菌前pH值作了适当调整(如表2)，并采取相应灭菌措施。

表2：培养液pH要求值与灭菌前校正值

2.3pH对乳酸菌生长的影响

结合光密度值与培养基浑浊度目测实验结果，从表3、表4可以看出，乳酸菌在pH值为4.3～8.5时有较多菌株生长，最适pH值为6.5，随着培养时间的延长，pH值不断升高，乳酸菌数量不断增加，达到最大值后下降，下降后pH最低值为3.4，在pH值为8.5时，球菌SN2可使pH值降低到4.5，同时由表3、表4可以得出，这10株菌对酸碱的耐受能力各不相同，具有不同的pH范围；

表3：乳酸菌生长前后的pH值

注：pH测定时培养温度为20℃

表4：各菌株生长pH范围

可以看出，长代谢都在低pH的酸性环境中进行，当环境pH降低到一定程度，乳酸菌将在低pH环境中停止生长，同时，pH还影响代谢物的产量；

3.1.2pH值对乳酸菌生长的影响

培养基的pH直接影响乳酸菌的生长.这是因为H+浓度与营养物质进入细胞体内有直接关系，pH影响细菌对营养物质的吸收，pH值的升高，使原来培养基中离子间的化学平衡发生移动，生成沉淀，降低培养基中的有效成份，由实验结果可以看出：乳酸菌生长的最适pH值为6.5，随着pH值的降低或升高，菌体的生长受到一定的抑制作用，

结论：微生物的生长受到环境pH，在不同pH值与温度下，影响程度差异较大，实验分离出的乳酸菌生长的最适pH值在6.7左右，而本发明所设定的pH值则为最适pH值。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种基于pH控制系统的乳酸菌高密度培养方法，其特征在于：包括，

步骤S1，进行材料准备，包括大豆蛋白胨3％、酵母浸提粉2％、乙酸钠0.5％、复合微量元素液0.1％、复合维生素液0.05％、胰蛋白酶0.2％、酸溶蛋白0.5％、柠檬酸钠0.2％～0.4％、Mg2+水溶性化合物0.02％～0.04％、Fe2+水溶性化合物0.01％～0.02％、纯水93.64％～94.62％，

配制MRS培养基并调节pH至初始值为7.0，将培养基在灭菌器中以121°C进行15分钟灭菌；

步骤S2，设置发酵罐，将灭菌后的培养基在无菌条件下转移到带温控和pH控制系统的发酵罐中；

步骤S3，启动pH控制系统，校准pH传感器；

步骤S4，实时监控调节，当发酵开始时，pH传感器实时监测发酵罐内培养液的pH值，

步骤S5，发酵过程维持，发酵罐内维持温度恒定在37℃，pH控制系统保持pH值在设定范围内，持续发酵30小时后，结束发酵，收集培养液。

2.根据权利要求1所述的一种基于pH控制系统的乳酸菌高密度培养方法，其特征在于，步骤S2中，发酵罐的温度调节为37℃。

3.根据权利要求2所述的一种基于pH控制系统的乳酸菌高密度培养方法，其特征在于，步骤S3中，将pH控制器设置为6.7±0.1。

4.根据权利要求3所述的一种基于pH控制系统的乳酸菌高密度培养方法，其特征在于，步骤S4中，当pH值低于预设下限值6.6时，pH控制器发出信号，启动与控制系统连接的泵。

5.根据权利要求4所述的一种基于pH控制系统的乳酸菌高密度培养方法，其特征在于，步骤S4中，从储液桶中自动添加20％NaOH溶液，泵基于流量控制，添加碱溶液，将pH值恢复至设定范围6.7±0.1。

6.根据权利要求5所述的一种基于pH控制系统的乳酸菌高密度培养方法，其特征在于，pH控制系统组件包括：

pH传感器，用于实时检测发酵液的pH值，将数据传送至pH控制器，

pH控制器，用于根据pH传感器的输入数据，判断pH值是否在设定范围内，并决定是否启动泵添加酸或碱。

7.根据权利要求6所述的一种基于pH控制系统的乳酸菌高密度培养方法，其特征在于，pH控制系统组件还包括：

泵和储液桶，与pH控制器相连，根据需要添加酸或碱溶液，保持pH稳定。

8.根据权利要求7所述的一种基于pH控制系统的乳酸菌高密度培养方法，其特征在于，pH控制系统的乳酸菌高密度培养过程中，pH监控与调节方式包括：

在发酵过程中，pH传感器不断采集发酵液的pH值，采用卡尔曼滤波消除噪声，将处理后的数据实时传输至控制器，

控制器根据传感器传递的pH值信息，采用PID控制算法做出调节判断。

9.根据权利要求8所述的一种基于pH控制系统的乳酸菌高密度培养方法，其特征在于，pH控制系统的乳酸菌高密度培养过程中，pH监控与调节方式还包括：

PID控制算法计算当前pH值与目标pH值之间的差值，并通过比例、积分和微分项调节控制器输出，控制泵的启动或停止。

10.根据权利要求9所述的一种基于pH控制系统的乳酸菌高密度培养方法，其特征在于，pH控制系统的乳酸菌高密度培养过程中，pH监控与调节方式还包括：

泵基于控制器的指令，采用流量控制算法计算泵输送的NaOH溶液量，根据pH值的偏差，实时调节泵的流量。