CN120282976A - 一种甲基奥瑞他汀e化合物的制备及纯化方法 - Google Patents

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Abstract

一种MMAE的制备及纯化方法，它主要用甲苯和正庚烷反滴析晶的纯化方法代替了现有技术涉及的方法中柱层析纯化的操作，大大的提高了生产效率，有效的降低了溶剂用量。另外，利用提供的制备及纯化方法制备出的MMAE，收率及纯度较高，能够有效的降低生产成本，且方法稳定性良好，更加适合放大生产。

Description

一种甲基奥瑞他汀E化合物的制备及纯化方法 技术领域
本发明涉及化合物合成方法领域，具体涉及甲基奥瑞他汀E化合物(即MMAE)的制备及纯化方法。
背景技术
MMAE(Monomethyl Auristantin E，也称甲基奥瑞他汀E)，是一种奥瑞他汀类的全合成衍生物，其
能通过抑制微管蛋白聚合而起到有效的有丝分裂抑制作用，目前已广泛用做细胞毒性小分子载荷用于开发抗体药物偶联物(Antibody drug comjugate，简称ADC)以治疗癌症。
公开号为CN105143199A的中国专利在说明书的第29页公开了一种MMAE的制备方法：
其方法为：在惰性气氛中，将化合物a溶解于乙腈和哌啶中，环境温度搅拌过夜，减压蒸发至干。将残余物在硅胶柱上用二氯甲烷和甲醇的混合物纯化以获得白色固体形式的MMAE。该方法的收率较低，仅为68％。除此之外，该方法的纯化方法为硅胶柱层析，该方法成本较高，对设备的要求和操作人员的操作技能要求也非常高，另外，由于硅胶柱的纯化能力有限，生产过程中的工作效率较低。因此生产上亟需一种高收率、高纯度、高效且适合放大生产的合成及纯化方法。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种能够获得纯化方法简单高效、生产效率高、环境友好且最终产物质量高(高纯度、高收率)的MMAE制备和纯化方法。
具体的，本发明提供了一种式(I)所示化合物(即MMAE)的制备及纯化方法：
所述的制备及纯化方法的制备路线如下：
所述的R为氨基保护基团，所述的制备及纯化方法包括以下步骤：
A.将化合物1在碱性条件下脱除氨基保护基R；
B.待步骤A反应结束后，向步骤A的反应体系中加入适量的水，搅拌，过滤，收集滤液；
C.向步骤B收集的滤液中加入适量的第一有机溶剂，萃取，收集有机相并浓缩，得浓缩物a；
D.向步骤C中所得的浓缩物a中加入第二有机溶剂，待溶解后，得溶解液b；
E.将步骤D所得的溶解液b滴加至第三有机溶剂中，待固体大量析出时，抽滤，收集滤饼，即得MMAE；
其中：
所述的氨基保护基R选自Fmoc保护基、三氟乙酰基；
所述的第一有机溶剂选自乙酸乙酯、二氯甲烷、乙酸异丙酯、氯仿、甲苯；
所述的第二有机溶剂选自甲苯、乙酸乙酯、丙酮；
所述的第三有机溶剂选自正庚烷、石油醚、正己烷、环己烷、正戊烷、甲基环己烷、甲基叔丁基醚。
在一些具体的实施例中，所述的氨基保护基R选自如下结构：
在一些具体的实施例中，所述的化合物1选自如下结构：
在一些具体的实施例中，所述的第一有机溶剂为乙酸乙酯；或者在另一些具体的实施例中，所述的第一有机溶剂为二氯甲烷；在另一些具体的实施例中，所述的第一有机溶剂为乙酸异丙酯；在另一些具体的实施例中，所述的第一有机溶剂为氯仿；在另一些具体的实施例中，所述的第一有机溶剂为甲苯。
在一些具体的实施例中，所述的第二有机溶剂为甲苯；或者在另一些具体的实施例中，所述的第二有机溶剂为乙酸乙酯；在另一些具体的实施例中，所述的第二有机溶剂为丙酮。
在一些具体的实施例中，所述的第三有机溶剂为正庚烷；或者在另一些具体的实施例中，所述的第三有机溶剂为石油醚；在另一些具体的实施例中，所述的第三有机溶剂为正己烷；在另一些具体的实施例中，所述的第三有机溶剂为环己烷；在另一些具体的实施例中，所述的第三有机溶剂为正戊烷；在另一些具体的实施例中，所述的第三有机溶剂为甲基环己烷；在另一些具体的实施例中，所述的第三有机溶剂为甲基叔丁基醚。
可以理解的是，所述的第一有机溶剂、第二有机溶剂、第三有机溶剂的选择相互独立，即每一步骤中涉及的有机溶剂(如步骤C中涉及的第一有机溶剂、步骤D中涉及的第二有机溶剂、步骤E中涉及的第三有机溶剂)在溶剂的选择上相互独立。在一个更具体的实施例中，所述的第一有机溶剂、第二有机溶剂、第三有机溶剂可以为以下组合：
在一些具体的实施例中，步骤B中所述水为纯净水。
在一些具体的实施例中，步骤D中所述溶解的方式为通过搅拌方式溶解。
在一些优选的实施例中，步骤A中的化合物1和步骤B中所述的纯化水的重量体积比(g/ml)为1:4～20。在一些具体的实施例中，步骤A中的化合物1和步骤B中所述的纯化水的重量体积比(g/ml)为1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或者1:20。在另一些具体的实施例中，步骤A中的化合物1和步骤B中所述的纯化水的重量体积比还可以为范围内的其他比例，如非限制性的为1:14.1，1:14.2，1:14.3，1:14.4，1:14.5......等。
在一些优选的实施例中，步骤B中所述的搅拌为低温搅拌。在一些更优选的实施例中，步骤B中所述的低温搅拌的温度为0～10℃。在一些具体的实施例中，步骤B中所述的低温搅拌的温度为0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃；或者在一些具体的实施例中，步骤B中所述的低温搅拌的温度可以为范围内的其他温度；又或者在一些具体的实施例中，步骤B中所述的低温搅拌的温度可以在0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃范围内上下浮动1-5℃，如-5℃、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃或者11℃、12℃、13℃、14℃、15℃等。
在一些优选的实施例中，步骤A中的化合物1和步骤C中所述的第一有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:5～25。在一些具体的实施例中，步骤A中的化合物1和步骤C中所述的第一有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24或者1:25；在另一些具体的实施例中，步骤A中的化合物1和步骤C中所述的第一有机溶剂的重量体积比可以为范围内的其他比例。
在一些更优选的实施例中，步骤A中的化合物1和步骤C中所述的第一有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:5～15。在一些具体的实施例中，步骤A中的化合物1和步骤C中所述的第一有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14或者1:15；或者在另一些具体的实施例中，步骤A中的化合物1和步骤C中所述的第一有机溶剂的重量体积比可以为范围内的其他比例。
在一些优选的实施例中，步骤C中的浓缩物a和步骤D中所述的第二有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:3～15。在一些具体的实施例中，步骤C中的浓缩物a和步骤D中所述的第二有机溶剂的重量体 积比(g/ml)为1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14或者1:15；在另一些具体的实施例中，步骤C中的浓缩物a和步骤D中所述的第二有机溶剂的重量体积比也可以为上述范围内的其他比例。
在一些更优选的实施例中，步骤C中的浓缩物a和步骤D中所述的第二有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:5～10。在一些具体的实施例中，步骤C中的浓缩物a和步骤D中所述的第二有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或者1:10；在另一些具体的实施例中，步骤C中的浓缩物a和步骤D中所述的第二有机溶剂的重量体积比也可以为上述范围内的其他比例。
在一些优选的实施例，步骤C中的浓缩物a和步骤E中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:15～45。在一些具体的实施例中，步骤C中的浓缩物a和步骤E中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40、1:41、1:42、1:43、1:44或者1:45。或者在另一些具体的实施例中，步骤C中的浓缩物a和步骤E中所述的第三有机溶剂的重量体积比为上述范围内的其他比例。
在一些更优选的实施例中，步骤C中的浓缩物a和步骤E中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:20～40。在一些具体的实施例中，步骤C中的浓缩物a和步骤E中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39或者1:40。或者在另一些具体的实施例中，步骤C中的浓缩物a和步骤E中所述的第三有机溶剂的重量体积比为上述范围内的其他比例。
或者在一些更更优选的实施例中，步骤C中的浓缩物a和步骤E中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:25～35。在另一些具体的实施例中，步骤C中的浓缩物a和步骤E中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34或者1:35。或者在另一些具体的实施例中，步骤C中的浓缩物a和步骤E中所述的第三有机溶剂的重量体积比为上述范围内的其他比例。
可以理解的是，步骤C中的浓缩物a实际为未纯化的MMAE，步骤C中所述的浓缩是指减压浓缩，即通过减压浓缩的方式将收集到的有机相浓缩至一定的程度，在一些优选的实施例中，步骤C通过减压浓缩的方式将收集到的有机相蒸干，即获得固状的浓缩物a。
在一些优选的实施例中，所述的“在碱性条件下脱除氨基保护基R中”用到的碱包括但不限于哌啶、二乙胺、DBU，在一些具体的实施例中，采用哌啶脱除化合物1的氨基保护基，在另一些具体的实施例中，采用二乙胺脱除化合物1的的氨基保护基，或者在其他另一些具体的实施例中，采用DBU脱除化合物1的的氨基保护基。
在一些具体的实施例中，采用哌啶脱除化合物1的氨基保护基，其具体的过程可以非限制性的为：将化合物1溶解在适量第四有机溶剂(所述的第四有机溶剂可以非限制性的选自乙腈、乙醇、甲醇)中，搅拌溶解后，加入哌啶开始反应。在一些优选的实施例中，所述的化合物1和第四有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:2～12(如1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12,或者其他非整数的比值，如1:2.4、1:2.6、1:2.8、......、1:3.7、......、1:5.5、......、1:10.4、......等)。所述的化合物1和哌啶的当量比为1:2～8(如1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8或者其他非整数的比值，如1:2.4、1:2.6、1:2.8、......、1:3.7、......、1:5.5、......等)。在一些更具体的实施例中，采用哌啶脱除化合物1的氨基保护基的具体过程非限制性的为：将化合物1溶解在适量乙腈中，搅拌溶解后，加入哌啶开始反应，其中，所述的化合物1和哌啶的当量比为1:3，反应结束后，进行下一步反应。在另一些更具体的实施例中，采用哌啶脱除化合物1的氨基保护基的具体过程非限制性的为：将化合物1溶解在适量甲醇中，搅拌溶解后，加入哌啶开始反应，其中，所述的化合物1和哌啶的当量比为1:4，反应结束后，进行下一步反应。又或者在其他另一些更具体的实施例中，采用哌啶脱除化合物1的氨基保护基的具体过程非限制性的为：将化合物1溶解在适量乙醇中，搅拌溶解后，加入哌啶开始反应，其中，所述的化合物1和哌啶的当量比为1:5，反应结束后，进行下一步反应。
在另一些具体的实施例中，采用二乙胺脱除化合物1的氨基保护基，其具体的过程可以非限制性的为：将化合物1溶解在适量第四有机溶剂(所述的第四有机溶剂可以非限制性的选自乙腈、乙醇、甲醇)中，搅拌溶解后，加入哌啶开始反应。在一些优选的实施例中，所述的化合物1和第四有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:2～12(如1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12,或者其他非整数的比值，如1:2.4、1:2.6、1:2.8、......、1:3.7、......、1:5.5、......、1:10.4、......等)。所述的化合物1和二乙胺的当量比为1:2～8(如1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8或者其他非整数的比值，如1:2.4、1:2.6、1:2.8、......、1:3.7、......、1:5.5、......等)。在一些更具体的实施例中，采用二乙胺脱除化合物1的氨基保护基的具体过程非限制性的为：将化合物1溶解在适量甲醇中，搅拌溶解后，加入二乙胺开始反应，其中，所述的化合物1和二乙胺的当量比为1:3，反应结束后，进行下一步反应。 在一些更具体的实施例中，采用二乙胺脱除化合物1的氨基保护基的具体过程非限制性的为：将化合物1溶解在适量乙醇中，搅拌溶解后，加入二乙胺开始反应，其中，所述的化合物1和二乙胺的当量比为1:3，反应结束后，进行下一步反应。在另一些更具体的实施例中，采用二乙胺脱除化合物1的氨基保护基的具体过程非限制性的为：将化合物1溶解在适量乙腈中，搅拌溶解后，加入二乙胺开始反应，其中，所述的化合物1和二乙胺的当量比为1:4，反应结束后，进行下一步反应。
在另一些具体的实施例中，采用DBU脱除化合物1的氨基保护基，其具体的过程可以非限制性的为：将化合物1溶解在适量第四有机溶剂(所述的第四有机溶剂可以非限制性的选自乙腈、乙醇、甲醇)中，搅拌溶解后，加入哌啶开始反应。在一些优选的实施例中，所述的化合物1和第四有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:2～12(如1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12,或者其他非整数的比值，如1:2.4、1:2.6、1:2.8、......、1:3.7、......、1:5.5、......、1:10.4、......等)。所述的化合物1和DBU的当量比为1:2～8(如1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8或者其他非整数的比值，如1:2.4、1:2.6、1:2.8、......、1:3.7、......、1:5.5、......等)。在一些更具体的实施例中，采用DBU脱除化合物1的氨基保护基的具体过程非限制性的为：将化合物1溶解在适量甲醇中，搅拌溶解后，加入DBU开始反应，其中，所述的化合物1和DBU的当量比为1:3，反应结束后，进行下一步反应。在一些更具体的实施例中，采用DBU脱除化合物1的氨基保护基的具体过程非限制性的为：将化合物1溶解在适量乙醇中，搅拌溶解后，加入DBU开始反应，其中，所述的化合物1和DBU的当量比为1:3，反应结束后，进行下一步反应。在另一些更具体的实施例中，采用DBU脱除化合物1的氨基保护基的具体过程非限制性的为：将化合物1溶解在适量乙腈中，搅拌溶解后，加入DBU开始反应，其中，所述的化合物1和DBU的当量比为1:4，反应结束后，进行下一步反应。
本发明还提供了反向滴加法在制备和纯化MMAE中的应用，所述的制备路线为：
所述的R为氨基保护基团；
所述的反向滴加法是指将根据所述的制备路线制备的待纯化的包含MMAE的反应产物先溶解在第二有机溶剂中，再将所得到的溶液反向滴加到第三有机溶剂中，之后过滤，干燥，即获得纯化后的MMAE；其中：
所述的第二有机溶剂选自甲苯、乙酸乙酯、丙酮；
所述的第三有机溶剂选自正庚烷、石油醚、正己烷、环己烷、正戊烷、甲基环己烷、甲基叔丁基醚。
所述的反向滴加法包括如下步骤：
(1)将所述待纯化的包含MMAE的反应产物溶解在第二有机溶剂，得溶液1；
(2)将所得到的溶液1滴加至第三有机溶剂中，有大量固体析出，抽滤，收集滤饼，即得纯化后的MMAE。
上述所述的“根据所述的制备路线制备的待纯化的包含MMAE的反应产物”或“待纯化的包含MMAE的反应产物”顾名思义，是指用上述制备路线制备获得，未经纯化的粗品MMAE。如在本发明的某些特例中，“根据所述的制备路线制备的待纯化的包含MMAE的反应产物”或“待纯化的包含MMAE的反应产物”是指化合物1经过脱除氨基保护基后，经过滤、萃取和减压浓缩后得到的粗品产物，即浓缩物a。
上述所述的“反向滴加法”是相对于常规有机实验操作中将溶剂加入到包含产物的溶液中而言的，具体到本发明是指将“根据所述的制备路线制备的待纯化的包含MMAE的反应产物先溶解在第二有机溶剂中，再将所得到的溶液反向滴加到第三有机溶剂中”。
在一些优选的实施例中，步骤(1)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和第二有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:3～15；优选的，步骤(1)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和第二有机溶剂的重量体积比为(g/ml)为1:5～10。
在一些优选的实施例中，步骤(1)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(2)中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:15～45；优选的，步骤(1)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(2)中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:20～40；优选的，步骤(1)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(2)中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:25～35。
在一些优选的实施例中，步骤(1)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和第二有机溶剂的重量 体积比(g/ml)为1:3～15。在一些具体的实施例中，步骤(1)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和第二有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14或者1:15；在另一些具体的实施例中，步骤(1)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和第二有机溶剂的重量体积比也可以为上述范围内的其他比例。
在一些更优选的实施例中，步骤(1)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和第二有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:5～10。在一些具体的实施例中，步骤(1)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和第二有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或者1:10；在另一些具体的实施例中，步骤(1)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和第二有机溶剂的重量体积比也可以为上述范围内的其他比例。
在一些优选的实施例中，步骤(1)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(2)中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:15～45。在一些具体的实施例中，步骤(1)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(2)中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40、1:41、1:42、1:43、1:44或者1:45。或者在另一些具体的实施例中，步骤(1)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(2)中所述的第三有机溶剂的重量体积比为上述范围内的其他比例。
在一些更优选的实施例中，步骤(1)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(2)中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:20～40。在一些具体的实施例中，步骤(1)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(2)中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39或者1:40。或者在另一些具体的实施例中，步骤(1)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(2)中所述的第三有机溶剂的重量体积比为上述范围内的其他比例。
或者在一些更更优选的实施例中，步骤(1)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(2)中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:25～35。在另一些具体的实施例中，步骤(1)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(2)中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34或者1:35。或者在另一些具体的实施例中，步骤(1)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(2)中所述的第三有机溶剂的重量体积比为上述范围内的其他比例。
本发明还提供了反向滴加法在纯化MMAE中的应用，所述的反向滴加法是指将待纯化的包含MMAE的反应产物先溶解在第二有机溶剂中，再将所得到的溶液反向滴加到第三有机溶剂中，之后过滤，干燥，即获得纯化后的MMAE；其中：
所述的第二有机溶剂选自甲苯、乙酸乙酯、丙酮；
所述的第三有机溶剂选自正庚烷、石油醚、正己烷、环己烷、正戊烷、甲基环己烷、甲基叔丁基醚。
在一些优选的实施例中，所述的反向滴加法包括如下步骤：
(a)将待纯化的包含MMAE的反应产物溶解在第二有机溶剂，得溶液2；
(b)将所得到的溶液2滴加至第三有机溶剂中，有大量固体析出，抽滤，收集滤饼，即得纯化后的MMAE。
在一些优选的实施例中，步骤(a)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和第二有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:3～15；优选的，步骤(a)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和第二有机溶剂的重量体积比为(g/ml)为1:5～10。
在一些优选的实施例中，步骤(a)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(b)中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:15～45；优选的，步骤(a)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(b)中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:20～40；优选的，步骤(a)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(b)中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:25～35。
在一些优选的实施例中，步骤(a)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和第二有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:3～15。在一些具体的实施例中，步骤(a)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和第二有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14或者1:15；在另一些具体的实施例中，步骤(a)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和第二有机溶剂的重量体积比也可以为上述范围内的其他比例。
在一些更优选的实施例中，步骤(a)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和第二有机溶剂的重 量体积比(g/ml)为1:5～10。在一些具体的实施例中，步骤(a)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和第二有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或者1:10；在另一些具体的实施例中，步骤(a)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和第二有机溶剂的重量体积比也可以为上述范围内的其他比例。
在一些优选的实施例，步骤(a)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(b)中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:15～45。在一些具体的实施例中，步骤(a)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(b)中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40、1:41、1:42、1:43、1:44或者1:45。或者在另一些具体的实施例中，步骤(a)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(b)中所述的第三有机溶剂的重量体积比为上述范围内的其他比例。
在一些更优选的实施例中，步骤(a)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(b)中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:20～40。在一些具体的实施例中，步骤(a)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(b)中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39或者1:40。或者在另一些具体的实施例中，步骤(a)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(b)中所述的第三有机溶剂的重量体积比为上述范围内的其他比例。
或者在一些更更优选的实施例中，步骤(a)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(b)中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:25～35。在另一些具体的实施例中，步骤(a)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(b)中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34或者1:35。或者在另一些具体的实施例中，步骤(a)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(b)中所述的第三有机溶剂的重量体积比为上述范围内的其他比例。
上述所述的MMAE制备和/或纯化方法在制备以MMAE为毒素的抗体药物偶联物中的应用。
上述所述的MMAE制备和/或纯化方法在制备以MMAE为毒素的抗体药物偶联物中间体中的应用。
本发明提供的MMAE的制备及纯化方法，用甲苯和正庚烷反滴析晶的纯化方法代替了现有技术涉及的方法中柱层析纯化的操作，大大的提高了生产效率，有效的降低了溶剂用量，降低了生产成本。另外，利用本发明提供的制备及纯化方法制备出的MMAE，收率及纯度有明显提高，且方法稳定性良好，更加适合放大生产。
附图说明
图1为通过实施例1提供的方法制备纯化的MMAE的色谱图；
图2为通过实施例2提供的方法制备纯化的MMAE的色谱图；
图3为通过实施例3提供的方法制备纯化的MMAE的色谱图；
图4为通过实施例4提供的方法制备纯化的MMAE的色谱图；
图5为通过实施例5提供的方法制备纯化的MMAE的色谱图；
图6为通过实施例6提供的方法制备纯化的MMAE的色谱图；
图7为通过实施例7提供的方法制备纯化的MMAE的色谱图；
图8为通过实施例8提供的方法制备纯化的MMAE的色谱图；
图9为通过实施例9提供的方法制备纯化的MMAE的色谱图；
图10为通过实施例10提供的方法制备纯化的MMAE的色谱图；
图11为通过实施例11提供的方法制备纯化的MMAE的色谱图；
图12为通过实施例12提供的方法制备纯化的MMAE的色谱图；
图13为通过实施例13提供的方法制备纯化的MMAE的色谱图；
图14为通过实施例14提供的方法制备纯化的MMAE的色谱图；
图15为通过实施例15提供的方法制备纯化的MMAE的色谱图；
图16为通过实施例16提供的方法制备纯化的MMAE的色谱图；
图17为通过对比例1提供的方法制备纯化的MMAE的色谱图；
图18为通过对比例2提供的方法制备纯化的MMAE的色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步非限制性的详细说明。需要指出的是，下述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让本领域技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
实施例1
采用碱法脱除化合物a中的Fmoc保护基，具体过程如下：向三口瓶中加入100.0g化合物a(即Fmoc-MMAE，下同)和500ml乙腈，搅拌溶解后，加入36.25g哌啶开始反应。
反应完毕后，向反应液中加入500ml纯化水，将反应瓶置于低温槽中，0～5℃搅拌0.5h，过滤。
加入1000ml二氯甲烷萃取，分出有机相。20-25℃下减压浓缩至干，得浓缩物71.03g(即MMAE粗品)。
向上述浓缩物(即MMAE粗品)中加入甲苯710ml溶解，转移至恒压滴液漏斗中。
在搅拌下，将MMAE粗品的甲苯溶液向2131ml正庚烷中滴加，有大量固体析出，抽滤得MMAE纯品67.6g，收率为88.5％，纯度为99.97％，单杂为0.03％，色谱图如1所示。
实施例2
采用碱法脱除化合物a中的Fmoc保护基，具体过程如下：向三口瓶中加入2.0g化合物a和4ml乙腈，搅拌溶解后，加入362mg哌啶开始反应。
反应完毕后，向反应液中加入8ml纯化水，将反应瓶置于低温槽中，0～5℃搅拌0.5h，过滤。
加入10ml二氯甲烷萃取，分出有机相。20-25℃下减压浓缩至干，得浓缩物1.40g(即MMAE粗品)。
向上述浓缩物(即MMAE粗品)中加入甲苯4.2ml溶解，转移至恒压滴液漏斗中。
在搅拌下，将MMAE粗品的甲苯溶液向21ml正庚烷中滴加，有大量固体析出，抽滤得MMAE纯品1.30g，收率为83.7％，纯度为99.60％，单杂为0.21％，色谱图如2所示。
实施例3
采用碱法脱除化合物a中的Fmoc保护基，具体过程如下：向三口瓶中加入2.0g化合物a和4ml乙腈，搅拌溶解后，加入362mg哌啶开始反应。
反应完毕后，向反应液中加入8ml纯化水，将反应瓶置于低温槽中，0～5℃搅拌0.5h，过滤。
加入10ml二氯甲烷萃取，分出有机相。20-25℃下减压浓缩至干，得浓缩物1.42g(即MMAE粗品)。
向上述浓缩物(即MMAE粗品)中加入甲苯4.3ml溶解，转移至恒压滴液漏斗中。
在搅拌下，将MMAE粗品的甲苯溶液向28.4ml正庚烷中滴加，有大量固体析出，抽滤得MMAE纯品1.30g，收率为85％，纯度为99.58％，单杂为0.24％，色谱图如3所示。
实施例4
采用碱法脱除化合物a中的Fmoc保护基，具体过程如下：向三口瓶中加入2.0g化合物a和4ml乙腈，搅拌溶解后，加入362mg哌啶开始反应。
反应完毕后，向反应液中加入8ml纯化水，将反应瓶置于低温槽中，0～5℃搅拌0.5h，过滤。
加入10ml二氯甲烷萃取，分出有机相。20-25℃下减压浓缩至干，得浓缩物1.44g(即MMAE粗品)。
向上述浓缩物(即MMAE粗品)中加入甲苯4.3ml溶解，转移至恒压滴液漏斗中。
在搅拌下，将MMAE粗品的甲苯溶液向36ml正庚烷中滴加，有大量固体析出，抽滤得MMAE纯品1.33g，收率为86.9％，纯度为99.21％，单杂为0.35％，色谱图如4所示。
实施例5
采用碱法脱除化合物a中的Fmoc保护基，具体过程如下：向三口瓶中加入2.0g化合物a和24ml乙腈，搅拌溶解后，加入1.45g哌啶开始反应。
反应完毕后，向反应液中加入40ml纯化水，将反应瓶置于低温槽中，0～5℃搅拌0.5h，过滤。
加入50ml二氯甲烷萃取，分出有机相。20-25℃下减压浓缩至干，得浓缩物1.36g(即MMAE粗品)。
向上述浓缩物(即MMAE粗品)中加入甲苯20.4ml溶解，转移至恒压滴液漏斗中。
在搅拌下，将MMAE粗品的甲苯溶液向61.2ml正庚烷中滴加，有大量固体析出，抽滤得MMAE纯品1.27g，收率为83％，纯度为99.90％，单杂为0.06％，色谱图如5所示。
实施例6
采用碱法脱除化合物a中的Fmoc保护基，具体过程如下：向三口瓶中加入2.0g化合物a和24ml乙腈，搅拌溶解后，加入1.45g哌啶开始反应。
反应完毕后，向反应液中加入20ml纯化水，将反应瓶置于低温槽中，0～5℃搅拌0.5h，过滤。
加入30ml二氯甲烷萃取，分出有机相。20-25℃下减压浓缩至干，得浓缩物1.36g(即MMAE粗品)。
向上述浓缩物(即MMAE粗品)中加入甲苯13.6ml溶解，转移至恒压滴液漏斗中。
在搅拌下，将MMAE粗品的甲苯溶液向54.4ml正庚烷中滴加，有大量固体析出，抽滤得MMAE纯品1.29g，收率为85％，纯度为99.82％，单杂为0.11％，色谱图如6所示。
实施例7
采用碱法脱除化合物a中的Fmoc保护基，具体过程如下：向三口瓶中加入2.0g化合物a和24ml乙腈，搅拌溶解后，加入1.45g哌啶开始反应。
反应完毕后，向反应液中加入20ml纯化水，将反应瓶置于低温槽中，0～5℃搅拌0.5h，过滤。
加入30ml二氯甲烷萃取，分出有机相。20-25℃下减压浓缩至干，得浓缩物1.36g(即MMAE粗品)。
向上述浓缩物(即MMAE粗品)中加入甲苯13.6ml溶解，转移至恒压滴液漏斗中。
在搅拌下，将MMAE粗品的甲苯溶液向47.6ml正庚烷中滴加，有大量固体析出，抽滤得MMAE纯品1.28g，收率为84％，纯度为99.87％，单杂为0.13％，色谱图如7所示。
实施例8
采用碱法脱除化合物a中的Fmoc保护基，具体过程如下：向三口瓶中加入1.0g化合物a和5ml乙醇，搅拌溶解后，加入453mg哌啶开始反应。
反应完毕后，向反应液中加入5ml纯化水，将反应瓶置于低温槽中，0～5℃搅拌0.5h，过滤。
加入10ml乙酸乙酯萃取，分出有机相。20-25℃下减压浓缩至干，得浓缩物704mg(即MMAE粗品)。
向上述浓缩物(即MMAE粗品)中加入乙酸乙酯7ml溶解，转移至恒压滴液漏斗中。
在搅拌下，将MMAE粗品的乙酸乙酯溶液向21.1ml石油醚中滴加，有大量固体析出，抽滤得MMAE纯品634mg，收率为83％，纯度为99.11％，单杂为0.25％，色谱图如8所示。
实施例9
采用碱法脱除化合物a中的Fmoc保护基，具体过程如下：向三口瓶中加入1.0g化合物a和5ml乙腈，搅拌溶解后，加入453mg哌啶开始反应。
反应完毕后，向反应液中加入5ml纯化水，将反应瓶置于低温槽中，0～5℃搅拌0.5h，过滤。
加入10ml乙酸异丙酯萃取，分出有机相。20-25℃下减压浓缩至干，得浓缩物639mg(即MMAE粗品)。
向上述浓缩物(即MMAE粗品)中加入甲苯6.4ml溶解，转移至恒压滴液漏斗中。
在搅拌下，将MMAE粗品的甲苯溶液向19.2ml环己烷中滴加，有大量固体析出，抽滤得MMAE纯品588mg，收率为77％，纯度为99.85％，单杂为0.07％，色谱图如9所示。
实施例10
采用碱法脱除化合物a中的Fmoc保护基，具体过程如下：向三口瓶中加入1g化合物a和5ml乙腈，搅拌溶解后，加入453mg哌啶开始反应。
反应完毕后，向反应液中加入5ml纯化水，将反应瓶置于低温槽中，0～5℃搅拌0.5h，过滤。
加入10ml氯仿萃取，分出有机相。20-25℃下减压浓缩至干，得浓缩物653mg(即MMAE粗品)。
向上述浓缩物(即MMAE粗品)中加入乙酸乙酯6.5ml溶解，转移至恒压滴液漏斗中。
在搅拌下，将MMAE粗品的乙酸乙酯溶液向19.6ml正戊烷中滴加，有大量固体析出，抽滤得MMAE纯品596mg，收率为78％，纯度为99.63％，单杂为0.07％，色谱图如10所示。
实施例11
采用碱法脱除化合物a中的Fmoc保护基，具体过程如下：向三口瓶中加入1.0g化合物a和5ml乙腈，搅拌溶解后，加入453mg哌啶开始反应。
反应完毕后，向反应液中加入5ml纯化水，将反应瓶置于低温槽中，0～5℃搅拌0.5h，过滤。
加入10ml甲苯萃取，分出有机相。20-25℃下减压浓缩至干，得浓缩物649mg(即MMAE粗品)。
向上述浓缩物(即MMAE粗品)中加入丙酮6.5ml溶解，转移至恒压滴液漏斗中。
在搅拌下，将MMAE粗品的丙酮溶液向19.5ml甲基环己烷中滴加，有大量固体析出，抽滤得MMAE纯品580mg，收率为76％，纯度为99.13％，单杂为0.21％，色谱图如11所示。
实施例12
采用碱法脱除化合物a中的Fmoc保护基，具体过程如下：向三口瓶中加入1.0g化合物a和5ml乙腈，搅拌溶解后，加入453mg哌啶开始反应。
反应完毕后，向反应液中加入5ml纯化水，将反应瓶置于低温槽中，0～5℃搅拌0.5h，过滤。
加入10ml二氯甲烷萃取，分出有机相。20-25℃下减压浓缩至干，得浓缩物693mg(即MMAE粗品)。
向上述浓缩物(即MMAE粗品)中加入甲苯6.9ml溶解，转移至恒压滴液漏斗中。
在搅拌下，将MMAE粗品的甲苯溶液向20.8ml甲基叔丁基醚中滴加，有大量固体析出，抽滤得MMAE纯品603mg，收率为79％，纯度为99.77％，单杂为0.12％，色谱图如12所示。
实施例13
向三口瓶中加入10.0g化合物a和乙腈50ml，搅拌溶解后，加入哌啶2.71g开始反应。
反应完毕后，向反应液中加入80ml纯化水，将反应瓶置于低温槽中0～5℃搅拌0.5h。
加入50ml氯仿萃取，分出有机相。20-25℃下减压浓缩至干，得MMAE粗品6.70g。
向上述MMAE粗品中加入67ml甲苯溶解，转移至恒压滴液漏斗中。
在搅拌下，将MMAE粗品的甲苯溶液向201ml正己烷中滴加，有大量固体析出，抽滤得MMAE纯品6.49g，收率为85％，纯度为99.96％，最大单杂为0.04％，色谱图如13所示。
实施例14
向三口瓶中加入1.0g化合物a和5ml乙腈，搅拌溶解后，加入哌啶271mg开始反应。
反应完毕后，向反应液中加入10ml纯化水，将反应瓶置于低温槽中0～5℃搅拌0.5h。
加入15ml二氯甲烷萃取，分出有机相。20-25℃下减压浓缩至干，得MMAE粗品683mg。
向上述MMAE粗品中加入6.8ml丙酮溶解，转移至恒压滴液漏斗中。
在搅拌下，将MMAE粗品的丙酮溶液向20.5ml正庚烷中滴加，有大量固体析出，抽滤得MMAE纯品620mg，收率为81％，纯度为99.44％，最大单杂为0.25％，色谱图如14所示。
实施例15
向三口瓶中加入1200mg化合物a和10ml甲醇，搅拌溶解后，加入544mg哌啶开始反应。
反应完毕后，向反应液中加入9.6ml纯化水，将反应瓶置于低温槽中0～5℃搅拌0.5h。
加入12ml甲苯萃取，分出有机相。20-25℃下减压浓缩至干，得MMAE粗品770mg。
向上述MMAE粗品中加入11.6ml乙酸乙酯溶解，转移至恒压滴液漏斗中。
在搅拌下，将MMAE粗品的乙酸乙酯溶液向30.8ml正己烷中滴加，有大量固体析出，抽滤得MMAE纯品724mg，收率为79％，纯度为99.20％，最大单杂为0.38％，色谱图如15所示。
实施例16
向三口瓶中加入10.0g化合物a和乙腈100ml，搅拌溶解后，加入哌啶9.05g开始反应。
反应完毕后，向反应液中加入100ml纯化水，将反应瓶置于低温槽中0～5℃搅拌0.5h。
加入150ml二氯甲烷萃取，分出有机相。20-25℃下减压浓缩至干，得MMAE粗品6.53g。
向上述MMAE粗品中加入98ml甲苯溶解，转移至恒压滴液漏斗中。
在搅拌下，将MMAE粗品的甲苯溶液向294ml正庚烷中滴加，有大量固体析出，抽滤得MMAE纯品6.31g，收率为82.6％，纯度为99.53％，单杂为0.07％，色谱图如16所示。
对比例1
向三口瓶中加入10.0g化合物a和二氯甲烷70ml，搅拌溶解后，加入二乙胺3.1g开始反应。
反应完毕后，向反应液中加入100ml纯化水和70ml二氯甲烷萃取，分出有机相。20-25℃下减压浓缩至干，得MMAE粗品6.68g。
将上述MMAE粗品柱层析纯化，蒸干溶剂得MMAE纯品5.11g，收率为66.9％，纯度为98.43％，最大单杂为0.22％，色谱图如17所示。
对比例2
向三口瓶中加入1.0g化合物a和二氯甲烷10ml，搅拌溶解后，加入DBU 485mg开始反应。
反应完毕后，20-25℃下减压浓缩至干，得MMAE粗品1.52g。
向上述MMAE粗品中加入15ml甲醇溶解，转移至恒压滴液漏斗中
在搅拌下，将MMAE粗品的甲醇溶液向45.6ml甲基叔丁基醚中滴加，有固体析出，抽滤得MMAE纯品557mg，收率为73％，纯度为89.37％，单杂为7.10％，色谱图如18所示。
表1各实施例与对比例产品收率及纯度比较
通过表1可以看出，本发明提供的MMAE的制备及纯化方法，用反滴析晶的纯化方法代替了现有技术涉及的方法中柱层析纯化的操作，大大的提高了生产效率，降低了生产成本，最主要的是，在提升产品纯度的同时，显著的提高了产品收率，不仅使得最终产品纯度由98.43％跨越到99.97％，更是将收率从66.9％显著提升至88.5％，极大的降低了生产成本。另外，利用本发明提供的制备及纯化方法制备出的MMAE，方法稳定性良好，更加适合放大生产，具有意料不到的技术效果。
本发明已通过各个具体实施例作了举例说明。但是，本领域普通技术人员能够理解，本发明并不限于各个具体实施方式，普通技术人员在本发明的范围内可以作出各种改动或变型，并且在本说明书中各处提及的各个技术特征可以相互组合，而仍不背离本发明的精神和范围。这样的改动和变型均在本发明的范围之内。

Claims (13)

  1. 一种式(I)所示化合物的制备及纯化方法：
    所述的化合物的制备路线如下：
    所述的R为氨基保护基团，其特征在于，所述的制备及纯化方法包括以下步骤：
    A.将化合物1在碱性条件下脱除氨基保护基R；
    B.待步骤A反应结束后，向步骤A的反应体系中加入适量的水，搅拌，过滤，收集滤液；
    C.向步骤B收集的滤液中加入适量的第一有机溶剂，萃取，收集有机相并浓缩，得浓缩物a；
    D.向步骤C中所得的浓缩物a中加入第二有机溶剂，溶解后，得溶解液b；
    E.将步骤D所得的溶解液b滴加至第三有机溶剂中，待固体大量析出，抽滤，收集滤饼，即得MMAE；
    其中：
    所述的氨基保护基R选自Fmoc保护基、三氟乙酰基；
    所述的第一有机溶剂选自乙酸乙酯、二氯甲烷、乙酸异丙酯、氯仿、甲苯；
    所述的第二有机溶剂选自甲苯、乙酸乙酯、丙酮；
    所述的第三有机溶剂选自正庚烷、石油醚、正己烷、环己烷、正戊烷、甲基环己烷、甲基叔丁基醚。
  2. 根据权利要求1所述的制备及纯化方法，其特征在于，所述的化合物1选自如下结构：
  3. 根据权利要求1所述的制备及纯化方法，其特征在于，步骤A中的化合物1和步骤B中所述水的重量体积比(g/ml)为1:4～20；优选的，步骤A中的化合物1和步骤B中所述水的重量体积比(g/ml)为1:4～10；优选的，所述步骤B中所述的搅拌为低温搅拌；进一步优选的，所述低温搅拌的温度为0～10℃。
  4. 根据权利要求1所述的制备及纯化方法，其特征在于，步骤A中的化合物1和步骤C中所述的第一有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:5～25；优选的，步骤A中的化合物1和步骤C中所述的第一有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:5～15。
  5. 根据权利要求1所述的制备及纯化方法，其特征在于，步骤C中的浓缩物a和步骤D中所述的第二有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:3～15；优选的，步骤C中的浓缩物a和步骤D中所述的第二有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:5～10。
  6. 根据权利要求1所述的制备及纯化方法，其特征在于，步骤C中的浓缩物a和步骤E中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:15～45；优选的，步骤C中的浓缩物a和步骤E中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:20～40；优选的，步骤C中的浓缩物a和步骤E中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:25～35。
  7. 根据权利要求1所述的制备及纯化方法，其特征在于，步骤A中所述的将化合物1在碱性条件下脱除氨基保护基R包括如下步骤：将化合物1溶解在适量第四有机溶剂中，搅拌溶解后，加入碱反应，脱除氨基保护基R；优选的，所述第四有机溶剂选自乙腈、乙醇、甲醇；进一步优选的，所述的碱选自哌啶、二乙胺、DBU。
  8. 根据权利要求7所述的制备及纯化方法，其特征在于，所述的化合物1和第四有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:2～12，和/或所述的化合物1和所述碱的当量比为1:2～8。
  9. 根据权利要求1所述的制备及纯化方法，其特征在于，步骤B中所述水为纯净水，和/或所述步骤D中所述溶解的方式为通过搅拌方式溶解。
  10. 反向滴加法在制备和纯化MMAE中的应用，所述的MMAE的制备路线为：
    所述的R为氨基保护基团；
    所述的反向滴加法是指将根据所述的制备路线制备的待纯化的包含MMAE的反应产物先溶解在第二有机溶剂中，再将所得到的溶液反向滴加到第三有机溶剂中，之后过滤，干燥，即获得纯化后的MMAE；其中：
    所述的第二有机溶剂选自甲苯、乙酸乙酯、丙酮；
    所述的第三有机溶剂选自正庚烷、石油醚、正己烷、环己烷、正戊烷、甲基环己烷、甲基叔丁基醚。
  11. 根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的反向滴加法包括如下步骤：
    (1)将所述待纯化的包含MMAE的反应产物溶解在第二有机溶剂，得溶液1；
    (2)将所得到的溶液1滴加至第三有机溶剂中，待固体大量析出，抽滤，收集滤饼，即得纯化后的MMAE。
  12. 根据权利要求11所述的应用，其特征在于，步骤(1)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和第二有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:3～15；优选的，步骤(1)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和第二有机溶剂的重量体积比为(g/ml)为1:5～10。
  13. 根据权利要求12所述的应用，其特征在于，步骤(1)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(2)中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:15～45；优选的，步骤(1)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(2)中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:20～40；优选的，步骤(1)中所述的待纯化的包含MMAE的反应产物和步骤(2)中所述的第三有机溶剂的重量体积比(g/ml)为1:25～35。
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