CN120309727B - 一种靶向人igfl1的单域抗体及其应用 - Google Patents

一种靶向人igfl1的单域抗体及其应用

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Abstract

本发明涉及抗体工程技术领域，具体涉及一种靶向人IGFL1的单域抗体及其应用，尤其涉及其在制备治疗乳腺癌药物中的应用。本发明的靶向人IGFL1的单域抗体，其重链可变区包括三个互补决定区，即CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示；所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示；所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。本发明成功构建了单域抗体人工合成库，并筛选出了两条抗IGFL1效果较好的单域抗体序列。本发明提供的单域抗体可用于制备治疗IGFL1阳性肿瘤的药物，特别是三阴性乳腺癌。

Description

一种靶向人IGFL1的单域抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗体工程技术领域，具体涉及一种靶向人IGFL1的单域抗体及其应用，尤其涉及其在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
背景技术
IGFL1（胰岛素样生长因子家族相关蛋白1）与某些皮肤病、炎症性疾病和癌症相关，发挥驱动肿瘤增殖、迁移和侵袭的癌基因功能，因此成为肿瘤治疗的潜在靶点。IGFL1在多种疾病中的表达水平与疾病进展密切相关，显示出作为生物标志物的潜力。例如，在肺腺癌中，IGFL1的表达水平与患者的临床病理学特征和预后密切相关，可作为判断患者预后的独立危险因素。此外，IGFL1在甲状腺眼病中的高表达也提示其可作为疾病诊断和治疗监测的潜在标志物。IGFL1在肿瘤和甲状腺眼病等疾病中的作用机制逐渐被揭示，其通过激活IGF-1R信号通路，促进细胞增殖和炎症反应。临床前研究结果表明，IGFL1不仅是一个重要的生物标志物，还具有作为治疗靶点的巨大潜力。未来的研究将进一步探索IGFL1在更多疾病中的作用，并开发基于IGFL1的新型治疗策略。这些研究为IGFL1靶向治疗提供了多种潜在的治疗策略，尽管目前成功的临床结果并不多，但这些研究为未来的肿瘤治疗提供了新的方向和希望。
乳腺癌是临床当中女性比较常见的一种恶性肿瘤，根据雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、HER-2受体和Ki67指标进行分类，包括Luminal A型、Luminal B型、三阴性乳腺癌三类。其中三阴性乳腺癌（TNBC）因缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）的表达，预后较差，治疗手段相对有限。IGFL1是一种胰岛素样生长因子家族相关蛋白，在多种肿瘤中高表达，其在肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等过程中发挥重要作用。单域抗体是一种重链可变抗体片段，具有分子量小、稳定性高、组织穿透力强等优点，在肿瘤靶向治疗中展现出广阔的应用前景。因此，针对IGFL1的靶向治疗乳腺癌的单域抗体成为一种潜在的治疗策略。
现有技术中，尚未公开有针对IGFL1的靶向治疗乳腺癌的单域抗体。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种靶向人IGFL1的单域抗体及其应用。本发明的单域抗体能够特异性结合人IGFL1并封闭其活性，从而抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖和干性维持，为IGFL1阳性肿瘤细胞的治疗提供新的手段。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
在本发明的第一方面，提供了一种靶向人IGFL1的单域抗体，所述单域抗体的重链可变区包括三个互补决定区，即CDR1、CDR2和CDR3，
所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示；
所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示；
所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。
进一步地，所述单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。
本发明的单域抗体可通过基因工程技术在原核或真核表达系统中进行表达，如大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞等，获得具有生物活性的单域抗体蛋白。
在本发明的第二方面，提供了编码如第一方面所述的靶向人IGFL1的单域抗体的核酸分子。
在本发明的第三方面，提供了含有如第二方面所述核酸分子的载体。
在本发明的第四方面，提供了含有如第三方面所述载体的宿主细胞。
在本发明的第五方面，提供了如第一方面所述靶向人IGFL1的单域抗体在制备人IGFL1蛋白检测试剂中的应用。
在本发明的第六方面，提供了如第一方面所述靶向人IGFL1的单域抗体在制备与人IGFL1蛋白结合的产品中的应用。
在本发明的第七方面，提供了如第一方面所述的靶向人IGFL1的单域抗体在制备抗乳腺癌药物中的应用。
进一步地，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
本发明的单域抗体是通过下调IGFL1的表达；通过抑制PI3K/AKT通路激活以下调促癌基因C-myc，CyclinD1的表达，从而抑制肿瘤的进展。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1）本发明发现IGFL1在乳腺癌患者尤其是三阴性乳腺癌患者体内高表达，在此基础上，本发明成功构建了单域抗体人工合成库，并筛选出了7条新的抗IGFL1的单域抗体序列。经过进一步地亲和力和抗肿瘤活性的验证，得到两个抗肿瘤效果最优的单域抗体SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
2）本发明提供的单域抗体能够与人IGFL1特异性结合以封闭IGFL1的活性，可以有效抑制人三阴性乳腺癌细胞的增殖和干性维持。此外，动物实验结果表明，本发明的单域抗体能够显著抑制小鼠三阴性乳腺原位癌的生长，但不影响小鼠体重，进一步证实了其在肿瘤治疗中的潜力和安全性。因此，本发明提供的单域抗体可用于制备治疗IGFL1阳性肿瘤的药物，特别是三阴性乳腺癌。
附图说明
图1为基于isPLA-seq技术筛选IGFL1单域抗体的结果图。其中，A为将293T细胞进行isPLA之后通过流式细胞分选术将阳性细胞分选出来的结果。B为通过PCR将CDR3区域的DNA片段扩增进行的凝胶电泳结果图。
图2为IGFL1单域抗体与抗原结合以及亲和力检测结果图。其中，A-B为GST pull-down实验检测抗原抗体的结合结果。C为在 Co-IP 实验中使用 IGFL1 单域抗体检测IGFL1的相互作用伴侣的结果。D为SPR检测IGFL1单域抗体与IGFL1蛋白的亲和力结果。
图3为IGFL1单域抗体制备及进入胞内的结果图。其中，A，TAT穿膜肽融合表达单域抗体的示意图，以及制备的7个IGFL1单域抗体。B将单域抗体加入HCC1806和HCC1937细胞进行处理后利用IF实验检测细胞内单域抗体的定位和量的结果，比例尺200 μm。
图4为IGFL1单域抗体显著抑制三阴性乳腺癌细胞增殖效果图。其中，A为将不同浓度的IGFL1单域抗体加入HCC1806和MDA-MB-231细胞中处理48小时后利用CCK8实验检测活细胞数目的结果。B为将IGFL1单域抗体加入过表达IGFL1的HCC1806细胞中，对细胞进行克隆形成实验，通过结晶紫染色检测肿瘤克隆形成能力的结果。C为将IGFL1单域抗体加入过表达IGFL1的HCC1806细胞中，对细胞进行计数实验，得到相对细胞生长值的结果。*P<0.05,**P<0.005,***P<0.0005,****P<0.00005。
图5为 IGFL1单域抗体抑制肿瘤细胞干性结果图。其中。A为利用SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8单域抗体处理过表达IGFL1的HCC1806细胞，通过流式分析术检测ALDH阳性细胞群的比例的结果。B为利用SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8单域抗体处理过表达IGFL1的HCC1806细胞，通过mamosphere实验检测肿瘤细胞的干性的结果，比例尺，200 μm。C为SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8单域抗体处理过表达IGFL1的HCC1806细胞，通过WB实验检测肿瘤细胞的干性标记物的表达结果。D为SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8单域抗体处理过表达IGFL1的HCC1806细胞，通过qPCR检测干性标记物的表达结果。*P<0.05,**P<0.005,***P<0.0005,****P<0.00005。
图6为IGFL1单域抗体处理细胞后，WB实验检测IRS1/p85/PI3K/AKT/β-catenin信号通路蛋白的变化结果。
图7为 IGFL1单域抗体抑制小鼠乳腺原位癌生长的结果图。其中。A-D为HCC1806细胞系接种于小鼠乳腺脂肪垫，随后给予单域抗体SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#810 mg/kg治疗，监测小鼠体重，肿瘤体积以及肿瘤的重量的结果。E-H为MDA-MB-23细胞系接种于小鼠乳腺脂肪垫，随后给予单域抗体SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#810 mg/kg 治疗，监测小鼠体重，肿瘤体积以及肿瘤的重量的结果。I-J 分别为将MDA-MB-231和HCC1806细胞移植瘤进行切片和后续HE和IHC（Ki67和Caspase-3）病理学染色的结果图。*P<0.05,**P<0.005,***P<0.0005,****P<0.00005。比例尺100 μm。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。
本发明实施例中涉及的细胞系均购自ATCC细胞库，所用裸鼠购自北京斯贝福生物有限公司，检测型抗体购自CST和Abcam公司，生化试剂以及试剂盒购自碧云天、索莱宝等生物技术有限公司。未作具体说明的分子生物学试验方法，均参照《分子克隆实验指南》进行。
本发明的单域抗体的制备纯化及抗肿瘤活性验证的具体试验详见以下实施例。
实施例1 单域抗体的筛选和纯化
1.构建单域抗体人工合成库
人工合成库的单域抗体由FR1、FR2、FR3、FR4以及CDR1、CDR2和CDR3组成，其中，最关键的抗原互补决定区为CDR3，因此在该人工合成库中，仅合成了CDR3区多样的单域抗体，FR1、FR2、FR3、FR4以及CDR1、CDR2在所有单域抗体中均保持一致。FR1、FR2、FR3、FR4以及CDR1、CDR2均为已知序列，可见文献Yan J., Li G., Hu Y., Ou W., Wan Y.Construction of a synthetic phage-displayed Nanobody library with CDR3regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications. J.Transl. Med. 2014;12:1–12. doi: 10.1186/s12967-014-0343-6.
单域抗体人工合成库的构建方法包括如下步骤：
第一步：构建靶向IGFL1的单域抗体CDR3区可变文库，采用基因合成技术设计并合成一个高度多样化的DNA片段文库。该文库的核心特征是在CDR3区引入20个可变氨基酸位点，采用NNN密码子（N=A/T/G/C）进行优化编码，既保证了序列多样性又有效降低了终止密码子的出现概率。整个CDR3区设计为60个碱基的固定长度，最终获得的文库理论库容不低于1×10^8个克隆，确保涵盖多种可能的氨基酸序列组合。SdAb CDR3 DNA片段混合物如下：CCA TCT ACT ACT gCg CCg CTN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNNNNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNT ggg gAC AAg gAA CAC AAg T N= A/T/C/G。
第二步：构建 pCDH-CMV-sdAb骨架载体：设计并构建一个含有单域抗体骨架的质粒DNA载体。该载体应包含单域抗体的框架区（FR1、FR2、FR3、FR4、CDR1和CDR2）和必要的表达调控元件，如启动子、终止子等。此外，载体的C端应融合一个3×Flag标签，以便于后续的检测和纯化。将SdAb骨架C端标记3 x flag后连接至pCDH-CMV vector，获得pCDH-CMV-sdAb骨架载体。
第三步：通过同源重组的方法将CDR片段混合物连接至pCDH-CMV-sdAb vector，即可得到单域抗体人工合成库。可以使用适当的限制酶或同源重组技术，将CDR3区DNA文库连接到单域抗体骨架载体的相应位置。确保连接后的质粒DNA载体包含完整的单域抗体序列，包括FR1、FR2、FR3、FR4、CDR1、CDR2和CDR3区，以及3×Flag标签。
第四步：验证和扩增单域抗体人工合成文库
通过测序和PCR扩增等方法，验证连接后的质粒DNA载体的正确性。确保CDR3区DNA片段已正确插入单域抗体骨架载体中，并且没有突变或缺失。扩增验证后的质粒DNA载体，形成最终的单域抗体人工合成文库。
上述方法，通过随机组合碱基生成CDR3区DNA片段文库，确保了单域抗体的多样性，涵盖了大量不同序列的单域抗体，为筛选抗IGFL1的单域抗体提供了丰富的候选序列。该单域抗体人工合成文库可用于筛选针对多种疾病相关靶标的单域抗体，不仅限于LGFL1。通过高通量筛选技术，可以快速识别和优化具有高亲和力和特异性的单域抗体，为疾病的诊断和治疗提供新的工具和方法。
2. isPLA-seq筛选单域抗体
isPLA-seq筛选单域抗体方法，具体可以参考中国专利申请CN202110641192.4。
将单域抗体人工合成库的基因片段克隆到pCDH-CMV-sdAb载体中，将IGFL1 cDNA克隆至pCDNA3.1-HA-C表达载体中，共转染HEK293T细胞。转染48小时后固定细胞后进行isPLA，得到带有阳性信号的细胞。通过流式细胞仪分选阳性细胞，对阳性细胞中的质粒进行PCR扩增，将扩增得到的DNA片段回收并进行后续的高通量二代测序，由此可得与IGFL1结合的单域抗体候选因子的CDR3区DNA片段序列及其丰度。将丰度最高的前9个单域抗体重组到蛋白表达载体上，进行亲和力检测，最终获得具有高亲和力和特异性的抗IGFL1的单域抗体。
具体过程如下：
2.1 单域抗体基因片段的克隆与共转染
1）克隆单域抗体基因片段：将单域抗体人工合成库的基因片段克隆到带有3×Flag标签的表达载体中，构建单域抗体表达质粒。
2）克隆IGFL1 cDNA：将IGFL1 cDNA克隆至带有HA标签的表达载体中，构建IGFL1表达质粒。
3）共转染HEK293T细胞：将步骤1）构建好的单域抗体表达质粒和步骤2）构建好的IGFL1表达质粒共转染HEK293T细胞。转染48小时后，固定细胞，进行isPLA实验。
2.2 isPLA实验与阳性细胞分选
isPLA（原位邻近连接实验）是一种高灵敏度的分子检测方法，用于单个细胞水平上可视化的蛋白相互作用研究。该技术使用特异性的抗体来识别并结合目标蛋白，再通过带有一段寡聚脱氧核苷酸（单链DNA）的PLA探针识别一抗并与之结合；当两个目标蛋白靠近时，两个目标蛋白的PLA探针的DNA就会配对互补，然后在连接酶的作用下，PLA探针上的DNA片段被连接在一起，形成环状结构，通过滚环扩增（RCA）产生可检测的信号。
具体过程如下：
1）固定和通透：用4%多聚甲醛固定处理好的细胞爬片，再用0.2% TritonX-100通透。
2）封闭：将封闭液滴加到细胞爬片上，确保封闭液均匀覆盖整个组织区域，37°C孵育1小时。
3）孵育一抗：将稀释好的Flag（1:500）和HA（1:500）一抗均匀滴加在已封闭的细胞爬片上，放入湿盒中，37°C孵育2-3小时。
4）孵育PLA探针：混匀PLUS和MINUS PLA探针，按试剂盒说明书比例稀释，吸干净一抗溶液，用1×洗涤缓冲液A洗涤载玻片2次，每次5分钟。吸干净多余的洗涤缓冲液，然后滴加PLA探针溶液，37°C孵育1小时。
5）连接和扩增：加入与探针互补的寡聚脱氧核苷酸（杂交溶液）和连接酶，形成闭环。加入聚合酶，以其中一条探针作为模板，滚环复制不断形成新的闭环。
6）检测：加入荧光素标记的寡核苷酸（检测溶液）与环化的DNA作用，形成可检测的荧光信号。
7）流式细胞仪分选：使用流式细胞仪分选带有阳性红色荧光信号的细胞。这些阳性细胞表明单域抗体与IGFL1成功结合。
8）PCR扩增与DNA片段回收：对分选得到的阳性细胞中的质粒进行PCR扩增，回收扩增得到的DNA片段。
2.3 高通量二代测序：对回收的DNA片段进行高通量二代测序，由此可得与IGFL1结合的单域抗体候选因子的CDR3区DNA片段序列及其丰度。
3. 单域抗体表达与纯化
3.1 构建表达载体：将筛选得到的单域抗体基因序列克隆到pET-28a表达载体中，构建包含以下元件的表达载体：6个组氨酸（His6）标签，穿膜肽TAT（氨基酸序列如SEQ IDNO.16所示：YGRKKRRQRRR）结构域，识别IGFL1的单域抗体序列，3×Flag标签，该表达载体的分子量为15 kDa。
3.2 转化与表达：将构建好的表达载体转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中。在IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导下，表达出单域抗体蛋白。诱导条件为0.2 mMIPTG，16°C诱导16小时。
3.3 纯化：收集表达后的细菌培养物，通过超声波破碎细胞，收集上清液。使用镍珠（Ni-NTA）亲和层析柱进行纯化，利用His6标签与镍珠的高亲和力，特异性结合单域抗体蛋白。用平衡缓冲液（如20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 20 mM咪唑，pH 8.0）洗涤层析柱，去除杂质。用洗脱缓冲液（如20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 500 mM咪唑，pH 8.0）洗脱目标蛋白。随后通过透析法将蛋白溶液中的溶剂置换成PBS缓冲液。
3.4 纯度检测与保存：通过SDS-PAGE和HPLC等方法检测纯化后的单域抗体蛋白的纯度，确保其纯度达到95%以上。将纯化后的单域抗体蛋白分装，保存于-80°C或冻干保存，以备后续的实验研究和药物开发。
上述方法中，通过使用pET-28a表达载体，能够高效表达单域抗体蛋白，提高蛋白的稳定性和可溶性。通过镍珠亲和层析和洗脱法，能够获得高纯度的单域抗体蛋白，纯度可达95%以上。C端带有TAT穿膜肽结构域和3×Flag标签的单域抗体蛋白，不仅保留了与IGFL1的特异性结合能力，还具有良好的细胞穿透能力，适用于多种生物医学应用。
采用本实施例方法得到的单域抗体蛋白可用于多种生物医学研究，包括细胞实验、动物实验和临床前研究，为IGFL1阳性肿瘤的诊断和治疗提供新的工具和方法。
结果和分析：
通过上述方法，本发明进行了IGFL1的单域抗体的筛选。本发明进行了SdAblibrary建库，根据现有的isPLA-seq方法进行筛选，其中抗原互补决定区CDR3包含20个氨基酸。在isPLA-seq筛选中，首先，在HEK239T细胞中同时瞬时过表达IGFL1-HA与SdAbs-Flag人工合成库。通过isPLA获得细胞内原位的红色荧光信号，通过细胞流式分选将阳性细胞分选出来，对照组阳性率为0，试验组阳性率为23.5%，结果如图1A所示。随后检测荧光显微镜下观察分选出的PLA阳性细胞细胞器膜上发出特异性的红色荧光通过设计 CDR3的forward和reverse引物进行PCR扩增，结果如图1B所示，得到108 bp的CDR3混合物，将其回收后进行二代测序，获得CDR3区的DNA和氨基酸序列，首先挑选出测组丰度最高的前9个的单域抗体SdAb-IGFL1#1-SdAb-IGFL1#9，进行后续的验证和实验。
实施例2 单域抗体亲和力验证
1. GST Pull-Down实验
为了验证测序丰度最高的9个候选单域抗体SdAb-IGFL1#1-SdAb-IGFL1#9是否与IGFL1直接结合，进行了GST Pull-Down实验。
具体实验过程如下：
1）蛋白的抽提与纯化：将IGFL1的cDNA克隆至PGEX-4T-1载体上形成原核表达的GST-IGFL1融合蛋白，利用IPTG诱导表达、收菌体、裂解并去除沉淀后，加入适量体积50%谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B，4℃摇床上缓慢摇动30-60分钟。4℃，4000rpm离心5分钟，弃去上清。用预冷的PBS溶液洗涤珠子，重复此步骤3次。吸走珠子表面的液体，但注意不要吸走珠子，即可获得结合GST-IGFL1的琼脂糖凝胶。
2）体系孵育与Pull-Down：混合含有GST- IGFL1蛋白和候选单域抗体的溶液，将混合物在4℃旋转混匀孵育过夜。4℃，4000rpm离心5分钟，弃去上清液后，用预冷缓冲液进行洗涤，重复三次。吸干琼脂糖凝胶上方的水层后，加入1×蛋白电泳上样缓冲液，将蛋白样本煮好后，分装冻存于-80℃冰箱，用于后续检测。
最终获得与IGFL1结合的7个单域抗体，分别是IGFL1-SdAb#1，IGFL1-SdAb#4，IGFL1-SdAb#5，IGFL1-SdAb#6，IGFL1-SdAb#7，IGFL1-SdAb#8和IGFL1-SdAb#9。7个单域抗体，均包括3个互补决定区CDR1-3和4个框架区FR1、FR2、FR3和FR4，CDR1-3氨基酸序列见表1-表3：
7个单域抗体的FR1的氨基酸序列相同，均如SEQ ID NO.12所示，具体氨基酸序列为MGQVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCTAS。
7个单域抗体的FR2的氨基酸序列相同，均如SEQ ID NO.13所示，具体氨基酸序列为WFRQAPGQEREAVA。
7个单域抗体的FR3的氨基酸序列相同，均如SEQ ID NO.14所示，具体氨基酸序列为RFTISRDNAKNTVTLQMNNLKPEDTAIYYCAA。
7个单域抗体的FR4的氨基酸序列相同，均如SEQ ID NO.15所示，具体氨基酸序列为WGQGTQVTVSS。
2. SPR实验
本发明继续通过表面等离子共振（SPR）实验检测上述9个单域抗体中的获得足够样本量的7个候选单域抗体的亲和力。
具体过程如下：
1）实验设计：至少8个浓度梯度，低偶联、高流速，亲和力K D数值一定要落在浓度范围内。设置至少一个浓度的样品重复（间隔完成），设置零浓度样品。
2）动力学分析：通过拟合所有曲线，获得动力学ka，kd和亲和力K D。K D=kd/ka。
3）测量达到稳态时的响应值，高配体偶联水平（高配体浓度、偶联流速、偶联上样时间）。
结果和分析：
抗体与抗原的特异性结合是其发挥生物学功能的关键机制，单域抗体往往通过其CDR3区域与抗原特异性结合。首先，为了验证9个候选单域抗体是否与IGFL1直接结合， 进行GST pull-down实验，结果证明，其中7个单域抗体与IGFL1直接结合（结果如图2A和图2B所示），包括SdAb-IGFL1#1，SdAb-IGFL1#4，SdAb-IGFL1#5，SdAb-IGFL1#6，SdAb-IGFL1#7，SdAb-IGFL1#8，SdAb-IGFL1#9。此外，SdAb-IGFL1#4还能够从 293T 细胞中共沉淀已知的相互作用蛋白p53（结果如图2C所示）。
进一步地，通过SPR实验检测了这7个候选单域抗体的亲和力，其解离常数（K D ） 分别为150.2 nM，5.925 μM，9.5 μM，170.6 nM，186.7 nM，31.83 nM，1.068 μM。然而SdAb-IGFL1#1存在非特异性结合，因此，根据亲和力顺序挑选出SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8两个候选抗体（结果如图2D所示）。以上结果表明IGFL1单域抗体与IGFL1特异性结合，且具有较强的亲和力。总之，通过isPLA-seq和后续的实验技术获得了特异性结合IGFL1的7个候选单域抗体。
实施例3 单域抗体的制备和处理细胞
IGFL1是一种分泌型蛋白，通过分泌至胞外发挥促进肿瘤的作用。本发明假设IGFL1单域抗体通过抑制胞内IGFL1蛋白的成熟和分泌过程，或通过抑制胞外已分泌的IGFL1，从而发挥作用。因此，本发明中制备了N端融合了TAT穿膜肽的单域抗体，发现其能够最大效率进入细胞内发挥作用。
1. 含有TAT重组蛋白质粒构建
将TAT穿膜肽的DNA序列与候选纳米抗体DNA序列利用(G4S)3进行连接，构建至pET-28a载体中进行融合表达。
构建过程如下：
1.1 融合基因片段的设计与合成
（1）序列设计：
TAT穿膜肽（如：5'TACGGGCGTAAAAAACGTCGTCAACGTCGTCGT3'）序列SEQ ID NO.17
(G4S)3柔性连接子（5'GGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTTCT3'） 序列SEQ IDNO.18
候选单域抗体序列（如VHH片段）
在5'端和3'端分别引入NdeI和XhoI酶切位点（CATATG&CTCGAG）。
（2）合成方式：
通过擎科基因合成公司直接合成完整融合片段（TAT(G4S)3单域抗体），或分段合成后通过重叠PCR拼接。
1.2 融合基因的PCR扩增
1）重叠PCR：
分别扩增TAT、(G4S)3、单域抗体片段，设计重叠区引物。
第一轮PCR：分别扩增各片段。
第二轮PCR：以等摩尔比混合片段为模板，用外侧引物扩增完整融合基因。
2）PCR条件：
预变性：98°C, 30 sec
30个循环：98°C 10 sec, 55°C 15 sec, 72°C 30 sec/kb
终延伸：72°C, 5 min。
3）凝胶电泳验证：
1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小是否正确，切胶回收目标条带。
1.3 载体与插入片段的双酶切
1) pET28a载体酶切：
反应体系（20 μL）：
pET28a 1 μg
NdeI 1 μL
XhoI 1 μL
10× Buffer 2 μL
ddH2O 补至20 μL
37°C 反应2小时，65°C 灭活10分钟。
2)融合基因片段酶切：
同载体酶切条件。
3)纯化酶切产物：
使用凝胶回收试剂盒纯化线性化载体和插入片段。
1.4 连接反应
连接体系（10 μL）：
① 线性化pET28a 50 ng
② 融合基因片段（3:1摩尔比过量）
③ T4 DNA连接酶 1 μL
④ 10× Ligase Buffer 1 μL
⑤ ddH2O 补至10 μL
16°C 连接2小时或室温1小时。
1.5 转化与阳性克隆筛选
1）转化DH5α感受态细胞：
① 取5 μL连接产物加入50 μL DH5α感受态细胞，冰浴30分钟。
② 42°C 热激45秒，冰浴2分钟。
③ 加入500 μL LB（无抗），37°C 复苏1小时。
④ 涂布于含卡那霉素（50 μg/mL）的LB平板，37°C 过夜培养。
2）菌落PCR验证：
① 挑取单菌落，用T7通用引物或基因特异性引物PCR验证。
② 阳性克隆送测序确认序列正确性。
1.6 质粒提取与转化表达菌株
1）提取阳性克隆质粒：
使用质粒小提试剂盒提取重组质粒（pET-28a TAT(G4S)3单域抗体）。
2）转化BL21(DE3)感受态细胞：
同上述转化步骤，获得表达菌株。
2.单域抗体处理细胞
将制备的单域抗体以2 μg/mL的浓度分别加入三阴性乳腺癌细胞系HCC1806和HCC1937细胞培养上清液中，处理48小时后，通过Anti-VHH（488）荧光二抗检测单域抗体的量，以及在细胞中的定位情况。
以单域抗体加入HCC1806细胞为例，具体实验步骤如下：
2.1 细胞铺板与培养
将HCC1806细胞以适当密度（如5×104/孔）接种于24孔板（含无菌爬片）或共聚焦培养皿中。37°C、5% CO2培养至细胞密度达60-70%（24小时）。
2.2 单域抗体处理
将纯化的单域抗体用预热的完全培养基稀释至终浓度 2 μg/mL。
设置对照组：
1）阴性对照：仅培养基（不加抗体）。
2）同型对照：非特异性同型纳米抗体（如AntiRFP VHH）。
处理细胞：
1）吸弃原培养基，加入含单域抗体的新鲜培养基（500 μL/孔）。
2）37°C、5% CO2孵育 48小时。
2.3 细胞固定与透化
1）固定：吸弃培养基，用预冷PBS轻柔洗涤HCC1806细胞3次。加入4% PFA（500 μL/孔），室温固定15分钟。PBS洗涤3次，每次5分钟。
2）通透：加入0.1% Triton X100（PBS配制），室温透化10分钟。PBS洗涤3次，每次5分钟。
2.4 封闭与非特异性结合阻断
封闭：加入1% BSA（PBS配制），室温封闭30分钟。吸弃封闭液，无需洗涤。
2.5 荧光二抗孵育
抗体孵育：用1% BSA稀释AntiVHH（488）二抗（按说明书比例，如1:500）。加入二抗溶液（200 μL/孔），避光室温孵育1小时（或4°C过夜）。PBS洗涤3次，每次5分钟（避光操作）。
2.6 核染色与封片
1）DAPI染色：加入1 μg/mL DAPI（PBS配制），避光孵育5分钟。PBS洗涤3次，每次5分钟。
2）封片：用镊子取出爬片，倒扣于载玻片上，滴加抗荧光淬灭封片剂（ProLongGold）。 避光干燥后，4°C保存待检测。
将HCC1806细胞替换成HCC1937细胞，单域抗体加入HCC1937细胞的实验方法同上。
结果和分析：
通过原核表达获得纯度大于95%的单域抗体，使其最大效率进入细胞内发挥作用（结果如图3A所示）。同时，IGFL1单域抗体的确能够在TAT穿膜肽的作用下进入三阴性乳腺癌细胞系HCC1806和HCC1937（结果如图3B所示）。
实施例4 单域抗体的活性检测
通过CCK8实验、克隆形成实验和细胞干性检测实验这三种细胞实验，验证单域抗体的活性。
1.1 CCK8实验
为了检测IGFL1单域抗体对肿瘤细胞是否具有杀伤活性，本发明通过CCK8实验检测了单域抗体处理条件下HCC1806和MDA-MB-231细胞的增殖情况。
具体方法如下：
1）细胞培养：将HCC1806和MDA-MB-231细胞分别培养在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5% CO2 的培养箱中培养。细胞达到70-80%汇合时，进行实验处理。
2）单域抗体处理：将细胞以5000-10000个细胞/孔的密度接种到96孔板中，每孔100μL培养基。待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的IGFL1单域抗体（0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1000 nM），每个浓度设置3个复孔。对照组加入等体积的PBS。
3）CCK8检测：处理48小时后，每孔加入10μL CCK8试剂，继续培养1-2小时，具体时间根据细胞类型和实验条件优化。使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度（OD值）。
4）数据分析：计算每个浓度下单域抗体处理组的OD值与对照组OD值的比值，绘制浓度-反应曲线。使用非线性回归分析计算半数抑制浓度（IC50）。
1.2 克隆形成实验
为了鉴定出高亲和力且抗肿瘤活性效应最佳的单域抗体，本发明根据其解离常数和IC50选择了SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8单域抗体进行深入研究。
具体方法如下：
1）细胞培养：将HCC1806细胞培养在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。细胞达到70-80%汇合时，进行实验处理。
2）单域抗体处理：将细胞以500个细胞/孔的密度接种到6孔板中，每孔2 mL培养基。待细胞贴壁后，分别加入SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8单域抗体。
3）克隆形成实验：处理后，将细胞培养10-14天，直到形成可见的克隆。用4%多聚甲醛固定细胞，用0.1%结晶紫染色。用显微镜观察并计数克隆数，克隆定义为至少50个细胞的集落。
4）数据分析：计算单域抗体处理组的克隆数与对照组克隆数的比值。
1.3 细胞干性检测实验，包含ALDH，WB，mamosphere检测实验
IGFL1促进三阴性乳腺癌进展的最重要的作用之一是维持肿瘤细胞的干性。因此，开发能够抑制肿瘤细胞干性的单域抗体对于肿瘤治疗药物研发来说尤为重要。本发明检测了IGFL1单域抗体对肿瘤细胞干性的影响。
1.3.1 ALDH检测
本发明检测了SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8对IGFL1过表达的HCC1806细胞中ALDH+ 细胞比例的影响。结果表明，这两个单域抗体降低了ALDH+ 细胞的比例，减少的比例约为20-30%。
具体方法如下：
1）细胞染色
将细胞制备成单细胞悬液，加入活化的BAAA进行染色，同时设置DEAB对照组。在37℃孵育30-60分钟，使ALDH与底物充分反应。
2）流式细胞仪检测
使用流式细胞仪检测细胞荧光强度，通过FL1通道分析ALDH活性。根据荧光强度区分ALDH高活性细胞（ALDHbr）和低活性细胞。
3）数据分析
计算ALDHbr细胞的百分比，分析不同样本或处理条件下的ALDH活性差异。结合细胞表型分析，探讨ALDH活性与细胞功能的关系。
1.3.2 WB实验
具体方法如下：
1）蛋白质分离
进行SDS-PAGE，根据目标蛋白分子量选择合适的凝胶浓度。电泳分离蛋白质，确保条带清晰。
2）转膜
将分离的蛋白质转移到PVDF或硝酸纤维素膜上，确保转膜效率。使用湿转或半干转法，控制转膜时间和电压分别为2小时和120V。
3）抗体孵育
用5%脱脂奶粉封闭膜上的非特异性结合位点。加入一抗孵育，4℃过夜；加入二抗孵育，室温2小时。
4）显色与成像
使用化学发光或荧光成像系统检测目标蛋白条带。调整曝光时间，确保条带清晰可见。
1.3.3 qPCR实验
1）RNA提取
向细胞样本中加入500 μl Trizol试剂，充分裂解细胞，静置5分钟后加入100 μl氯仿，震荡混匀后静置5分钟。12000 rpm、4℃离心10分钟，取上清液加入等体积异丙醇，静置10分钟后再次离心，弃去上清液。用1 ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，4℃、7000 rpm离心5分钟，弃去上清液后室温干燥5-10分钟。加入25 μL DEPC水溶解RNA，-80℃保存备用。
2）RNA浓度及纯度测定
使用核酸蛋白检测仪测定RNA浓度和纯度（A260/A280比值），确保RNA浓度在合适范围内，纯度符合要求。
3）逆转录
按试剂盒说明配制逆转录反应体系，通常包括逆转录酶、反应缓冲液、引物等，将RNA模板加入反应体系中。在适当温度下进行逆转录反应，通常为42℃反应15-30分钟，然后70℃终止反应，得到cDNA模板。
4）引物设计
根据干性标记物的基因序列，使用引物设计软件（如Primer Premier）设计引物，引物长度20-25 bp，Tm值60℃左右，扩增片段长度150-250 bp。避免引物自身或引物间形成二级结构，确保引物特异性。
5）引物验证
使用常规PCR扩增验证引物特异性，观察是否扩增出单一目的条带，无引物二聚体。
通过qPCR扩增曲线和溶解曲线进一步验证引物扩增效率和特异性，确保引物适用于qPCR实验。
6）qPCR反应体系配置
按以下体系配置qPCR反应：2×qPCR Mix 10 μL，2 μM引物F 1 μL，2 μM引物R 1 μL，cDNA模板1 μL，超纯水补足至20 μL。每个样本设置3个技术重复，同时设置无模板对照（NTC）和内参基因对照。
7）扩增程序
95℃预变性2分钟；95℃ 15秒，60℃ 30秒，40个循环；扩增结束后进行溶解曲线分析，65℃至95℃，每0.5℃停留5秒。根据仪器和试剂不同，可适当调整扩增程序。
8）数据分析
通过qPCR仪器软件收集荧光信号，计算Ct值，采用2^-ΔΔCt方法分析目标基因相对表达量。对比不同处理组与对照组的Ct值，计算相对表达量变化。
9）结果解读
若目标基因Ct值较低且与内参基因Ct值差异较小，说明该基因表达量较高；反之则表达量较低。
1.3.4 Mamosphere检测
本发明检测了SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8对HCC1806细胞干性肿瘤球形成的影响。
具体方法如下：
1）细胞接种
将细胞制备成单细胞悬液，按适当密度接种到低附着培养皿中。每个培养皿加入适量的无血清培养基。
2）mamosphere形成
在37℃、5% CO2条件下培养，定期更换培养基。观察mamosphere的形成过程，记录其大小和数量。
3）数据分析
计算mamosphere形成效率（MFE），分析不同处理条件下的干细胞活性差异。结合细胞表型分析，探讨mamosphere与肿瘤发生、耐药等的关系。
结果和分析：
2.1 CCK8实验结果
为了检测IGFL1单域抗体对肿瘤细胞是否具有杀伤活性，通过CCK8实验检测了单域抗体处理48 h条件下HCC1806和MDA-MB-231细胞的增殖情况，如图4所示。结果显示7个IGFL1单域抗体（SdAb-IGFL1#1、SdAb-IGFL1#4、SdAb-IGFL1#5、SdAb-IGFL1#6、SdAb-IGFL1#7、SdAb-IGFL1#8和SdAb-IGFL1#9）均展现了较强的细胞毒性，并以浓度依赖的方式杀伤肿瘤细胞。其在HCC1806细胞中的IC50分别为：SdAb-IGFL1#1：134.26 nM ，SdAb-IGFL1#4：237.63 nM，SdAb-IGFL1#5：160.89 nM ，SdAb-IGFL1#6：212.21 nM ，SdAb-IGFL1#7：21.90nM ，SdAb-IGFL1#8：83.32 nM 和SdAb-IGFL1#9：76.68 nM。在MDA-MB-231细胞中的IC50分别为：SdAb-IGFL1#1：374.79 nM，SdAb-IGFL1#4：206.95 nM，SdAb-IGFL1#5：680.53 nM，SdAb-IGFL1#6：461.21 nM，SdAb-IGFL1#7：533.68 nM，SdAb-IGFL1#8：383.63 nM和SdAb-IGFL1#9：785.26 nM（图4A）。结果显示7个单域抗体具有较强的细胞毒性，并以浓度依赖的方式杀伤肿瘤细胞。其中，SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8，它们在两种细胞系中均表现出较高的抗肿瘤活性，具有较低的IC50值和较高的亲和力。这些单域抗体为IGFL1阳性肿瘤的治疗提供了新的候选药物。
2.2 克隆形成实验结果
IGFL1单域抗体如何抑制肿瘤细胞的活性是本发明的核心之一。为了鉴定出具有抗肿瘤活性效应最佳的单域抗体，根据其解离常数选择了IGFL1单域抗体SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8单域抗体进行深入研究。首先，克隆形成实验结果显示，IGFL1过表达显著增强HCC1806细胞的克隆形成能力，SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8两个单域抗体均可以抑制IGFL1导致的克隆形成（如图4B所示）。其次，细胞计数实验结果显示，IGFL1过表达显著促进了HCC1806细胞的增殖，SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8两个单域抗体均可显著抑制IGFL1介导的细胞增殖（如图4C所示）。综上可得，IGFL1单域抗体对三阴性乳腺癌细胞具有较强的细胞毒性。
结论：这些结果表明，SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8可通过封闭IGFL1活性显著抑制三阴性乳腺癌细胞HCC1806的克隆形成，表明它们具有较强的抗肿瘤活性。这进一步证实了这两个单域抗体在抑制肿瘤细胞增殖和克隆形成方面具有显著效果，为后续的机制研究和临床前实验提供了有力的证据。
2.3 细胞干性检测实验结果（包含ALDH，WB，mamosphere检测实验，qPCR）
IGFL1促进三阴性乳腺癌的进展的最重要的作用之一是维持肿瘤细胞的干性。因此，开发能够抑制肿瘤细胞干性的单域抗体对于肿瘤治疗药物研发来说尤为重要。本发明检测了IGFL1单域抗体对肿瘤细胞干性的影响。首先，IGFL1过表达增加了HCC1806ALDH+ 细胞，同时加入SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8处理显著降低了ALDH+ 细胞比例，其减少的比例约为20-30%（如图5A所示）。其次，SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8显著抑制了IGFL1过表达的HCC1806细胞干性肿瘤球的形成（如图5B所示）。在分子机制上，SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8显著降低过表达IGFL1的肿瘤细胞中IGFL1和干性标记物的表达，包括SOX2，SOX9，Nanog和OCT4等（如图5C所示）。qPCR结果显示，SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8降低了IGFL1和干性标记物mRNA的表达（如图5D所示）。综上所述，IGFL1单域抗体SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8通过封闭IGFL1的活性，从而显著抑制了三阴性乳腺癌细胞干性特征的维持。
为了探究IGFL1单域抗体抑制肿瘤的分子机制，本发明利用SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8处理了乳腺癌肿瘤细胞，WB实验结果显示，在过表达IGFL1的细胞系中，SdAb-IGFL1#6和 SdAb-IGFL1#8均降低了IGFL1的表达。其次，SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8显著抑制IGFL1介导的β-catenin，IRS-1，PI3K和AKT的磷酸化。除此之外，SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8显著抑制PI3K/AKT通路的下游基因的表达，包括C-myc，CyclinD1等（如图6所示）。以上结果表明IGFL1单域抗体SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8：1）通过下调IGFL1的表达；2）通过抑制PI3K/AKT通路激活以下调促癌基因C-myc，CyclinD1的表达；从而抑制肿瘤的进展。
实施例5 体内抑瘤作用的验证
通过动物实验验证抗肿瘤活性：建立三阴性乳腺癌裸鼠皮下移植瘤模型（模型建立方法可参考文献：Wang H, Shi Y, Chen CH, Wen Y, Zhou Z, Yang C, Sun J, Du G,Wu J, Mao X, Liu R, Chen C. KLF5-induced lncRNA IGFL2-AS1 promotes basal-likebreast cancer cell growth and survival by upregulating the expression ofIGFL1. Cancer Lett. 2021 Sep 1;515:49-62. doi: 10.1016/j.canlet.2021.04.016.Epub 2021 May 27. MID: 34052325.），将单域抗体通过腹腔脉注射的方式给药。定期测量肿瘤体积，结果显示单域抗体能够显著抑制肿瘤的生长。
用HCC1806细胞建立原位瘤模型，检测单域抗体的体内抑瘤作用实验方法如下：
1）细胞株准备：将HCC1806细胞培养在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。细胞达到70-80%汇合时，进行实验处理。
2）原位瘤模型建立：将HCC1806细胞悬液（1×10^6个细胞/100 μL）注射到小鼠乳腺脂肪垫中，建立原位瘤模型。
3）待肿瘤开始生长6天后，开始单域抗体处理。分别用SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8进行腹腔脉注射给药。10 mg/kg注射10次，随机分组后第6天给药，隔天一次。
4）治疗效果评估：每隔一天，通过卡尺测量肿瘤的长径和短径，计算肿瘤体积（V =0.5 × 长径×短径2）。治疗结束后，收集肿瘤组织，称量肿瘤重量，结果如图7所示。
将HCC1806细胞替换成MDA-MB-231细胞，重新建立原位瘤模型，实验方法同上。
结果与分析：
本实施例基于IGFL1单域抗体SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8在三阴性乳腺癌中的抑制作用，进行了小鼠乳腺原位瘤动物实验。与体外试验结果一致，单域抗体SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8显著减小了HCC1806和MDA-MB-231细胞在小鼠乳腺形成的原位瘤的体积和重量（图7A-C和图7E-G），并且，SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8对小鼠体重并无显著影响（图7D和图7H）。除此之外，免疫组化实验显示，小鼠肿瘤中，IGFL1单域抗体治疗显著促进凋亡相关标记物Caspase-3的表达，相反，抑制增殖标记物Ki67的表达（图7I和图7J）。说明在体内，单域抗体SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8能够通过抑制IGFL1，进而促进肿瘤凋亡并抑制肿瘤增殖，最终对三阴性乳腺癌起到有效的治疗效果。
以上结果表明，单域抗体SdAb-IGFL1#6和SdAb-IGFL1#8在体内能够通过抑制IGFL1对三阴性乳腺癌起到有效的治疗效果，且对小鼠体重无显著影响，说明其具有良好的安全性和治疗效果。这进一步证实了单域抗体在抑制肿瘤细胞增殖方面具有显著效果，为后续的机制研究和临床前实验提供了有力的证据。
以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种靶向人IGFL1的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体的重链可变区包括三个互补决定区，即CDR1、CDR2和CDR3，
所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示；
所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示；
所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的靶向人IGFL1的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。
3.编码如权利要求1或2所述的靶向人IGFL1的单域抗体的核酸分子。
4.含有如权利要求3所述核酸分子的载体。
5.含有如权利要求4所述载体的宿主细胞。
6.如权利要求1或2所述靶向人IGFL1的单域抗体在制备人IGFL1蛋白检测试剂中的应用。
7.如权利要求1或2所述靶向人IGFL1的单域抗体在制备抗乳腺癌药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
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