CN120330077A - 植物乳植杆菌jn-7、菌粉、制备方法、益生菌组合物及其用途 - Google Patents

植物乳植杆菌jn-7、菌粉、制备方法、益生菌组合物及其用途

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CN120330077A CN202410775747.8A CN202410775747A CN120330077A CN 120330077 A CN120330077 A CN 120330077A CN 202410775747 A CN202410775747 A CN 202410775747A CN 120330077 A CN120330077 A CN 120330077A
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Abstract

一种植物乳植杆菌JN‑7、菌粉、制备方法、益生菌组合物及其用途。本申请通过筛选，得到一株新的植物乳植杆菌菌株，命名为植物乳植杆菌JN‑7，保藏编号为：CGMCCNo.30605。通过该菌株的基本特性分析(生长曲线、耐酸性、耐胆盐、耐胃肠液)、安全性评价(抗生素敏感性、溶血能力、产毒能力、细胞毒性)、黏附性评价、抗炎作用评价、生产性能评价(发酵产率和冻干产率)和稳定性测试(加速储存稳定性试验)，发现植物乳植杆菌JN‑7是安全菌株，具有优良的生产性能、高稳定性和抗炎功效。由其生产得到的菌粉能够在较长时间内保持稳定及活性。

Description

植物乳植杆菌JN-7、菌粉、制备方法、益生菌组合物及其用途
技术领域
本文总体涉及生物应用技术领域，尤指一种植物乳植杆菌JN-7、菌粉、制备方法、益生菌组合物及其用途。
背景技术
益生菌是通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。通过调节宿主黏膜与系统免疫功能或通过调节肠道内菌群平衡，促进营养吸收保持肠道健康的作用，从而产生有利于健康作用的单微生物或组成明确的混合微生物。
植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)是一类常见的益生菌，广泛地应用于发酵乳制品、肉制品、植物产品和焙烤食品中。其主要作用在于能够产生乳酸、降低pH，防止腐败菌繁殖，改善产品风味和质地等。近年来，研究发现，植物乳植杆菌具有良好的益生菌功能，可抑制包括幽门螺杆菌等胃肠道致病菌、改善胃肠道功能和代谢、增强肠道屏障功能、降低感染风险等。
食品中益生菌的稳定性和活度与益生菌所能达到的保健效果息息相关，亟需开发稳定性好并能长期保存的益生菌。
发明内容
基于以上背景，本申请提供了一种植物乳植杆菌JN-7，其中，所述植物乳植杆菌JN-7的分类命名为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)，保藏编号为CGMCCNo.30605。
在另一方面，本申请还提供了由本文描述的植物乳植杆菌JN-7制备得到的菌粉。
在另一方面，本申请还提供了本文描述的菌粉的制备方法，包括以下步骤：
1)发酵本文描述的植物乳植杆菌JN-7；
2)将发酵产物离心沉淀，冷冻干燥，即得。
在另一方面，本申请还提供了一种益生菌组合物，包含本文描述的植物乳植杆菌JN-7或本文描述的菌粉。
在另一方面，本申请还提供了本文描述的植物乳植杆菌JN-7、本文描述的菌粉或本文描述的益生菌组合物在制备抗炎药物中的用途。
在另一方面，本申请还提供了本文描述的植物乳植杆菌JN-7、本文描述的菌粉或本文描述的益生菌组合物在制备食品或保健品中的用途。
益生菌粉中存活的活细胞与益生菌产品的质量和生产成本密切相关。稳定性好的菌株可以提高益生菌粉中的活细胞数，从而有助于提高益生菌粉的质量并降低成本。
本申请提供了一株在产量，稳定性，安全性，酸、胆盐和胃肠道耐受性，抗生素敏感性方面均较好的植物乳植杆菌，将其命名为植物乳植杆菌JN-7。将其保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2024年05月13日。保藏编号为CGMCC No.30605。
通过该菌株的基本特性分析(生长曲线、耐酸性、耐胆盐、耐胃肠液)、安全性评价(抗生素敏感性、溶血能力、产毒能力、细胞毒性)、黏附性评价、抗炎作用评价、生产性能评价(发酵产率和冻干产率)和稳定性测试(加速储存稳定性试验)，发现植物乳植杆菌JN-7是安全菌株，具有优良的生产性能、高稳定性和抗炎功效。由其生产得到的菌粉能够在较长时间内保持稳定及活性。
本申请的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本申请而了解。本申请的其他优点可通过在说明书以及附图中所描述的方案来实现和获得。
附图说明
附图用来提供对本申请技术方案的理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请技术方案的限制。
图1为本申请的实施例中的植物乳植杆菌JN-7基因组圆图。圆图从外到内显示了七种信息：第一个圆是基因组位置信息，第二个圆是GC含量信息，第三个圆是正链上的编码基因(标记为红色)，第四个圆是负链上的编码基因(标记为绿色)，第五个圆是正链上的ncRNA(标记为蓝色)，第六个圆是负链上的ncRNA信息(标记为紫色)，第七个圆是基因组上的长片段重复序列信息(标记为橙色)。
图2为本申请实施例中植物乳植杆菌JN-7在37℃和200rpm下从OD 0.1开始的生长曲线。
图3为本申请实施例中植物乳植杆菌JN-7的溶血能力结果。
图4示出了本申请实施例中植物乳植杆菌JN-7与肠上皮细胞HT-29的相互作用。其中，(a)植物乳植杆菌JN-7不降低HT-29细胞活力。数据表示植物乳植杆菌JN-7共孵育18小时后细胞与纯培养基组细胞的存活率(n＝6)。(b)鼠李糖乳酪杆菌LGG和植物乳植杆菌JN-7与HT-29细胞的黏附比。数值表示与HT-29孵育4小时后LGG和植物乳植杆菌JN-7的黏附率。数据用Mean±Sem表示，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图5示出了本申请实施例中植物乳植杆菌JN-7调节LPS刺激的THP-1细胞产生炎症因子的抗炎能力。其中，(a)白介素6(IL)-6mRNA；(b)IL-8mRNA；(c)IL-10mRNA。数据用Mean±Sem表示，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图6A-图6D为本申请实施例中植物乳植杆菌JN-7菌粉(图6A)、鼠李糖乳酪杆菌LGG(图6B)及其他15株植物乳植杆菌菌粉(图6C-图6D)在40℃和75％湿度下储存期间的活细胞数和水活度。
具体实施方式
除非另有说明，本文使用的技术和科学术语具有与本申请所属领域技术人员通常所理解的相同的含义。当以范围、优选范围、或者优选的数值上限以及优选的数值下限的形式表述某个量、浓度或其他值或参数的时候，应当理解相当于具体揭示了通过将任意一对范围上限或优选数值与任意范围下限或优选数值结合起来的任何范围，而不考虑该范围是否具体揭示。除非另有说明，本文所列出的数值范围旨在包括范围的端点和该范围内的所有整数和分数(小数)。
术语“约”、“大约”当与数值变量并用时，通常指该变量的数值和该变量的所有数值在实验误差内(例如对于平均值95％的置信区间内)或在指定数值的±10％内，或更宽范围内。
表述“包含”或与其同义的类似表述“包括”、“含有”和“具有”等是开放性的，不排除额外的未列举的元素、步骤或成分。表述“由…组成”排除未指明的任何元素、步骤或成分。表述“基本上由…组成”指范围限制在指定的元素、步骤或成分，加上任选存在的不会实质上影响所要求保护的主题的基本和新的特征的元素、步骤或成分。应当理解，表述“包含”涵盖表述“基本上由…组成”和“由…组成”。
表述“至少一种(个)”或“一种(个)或多种(个)”表示1、2、3、4、5、6、7、8、9种(个)或更多种(个)。
提高功能菌株稳定性的研究大多是通过细菌粉末保护剂的开发来实现的。由于每种菌株固有的稳定性，保护剂在稳定益生菌粉末方面的作用有限。开发稳定性好的菌株用于商业益生菌粉的复合物，是解决益生菌产品在保质期内细菌活性低的问题的另一种途径。
基于此，本申请提供了一种植物乳植杆菌JN-7，其中，植物乳植杆菌JN-7的分类命名为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)，保藏编号为CGMCC No.30605。
在另一方面，本申请还提供了由本文描述的植物乳植杆菌JN-7制备得到的菌粉。
在另一方面，本申请还提供了本文描述的菌粉的制备方法，包括以下步骤：
1)发酵本文描述的植物乳植杆菌JN-7；
2)将发酵产物离心沉淀，冷冻干燥，即得。
在一些实施方案中，本文描述的菌粉的制备方法包括以下步骤：
1)将本文描述的植物乳植杆菌JN-7在生物反应器中发酵培养，pH 4.5-5.3、温度35-40℃、搅拌器速度160-200rpm；
2)将发酵产物离心沉淀，将沉淀与保护剂混合，在真空冷冻干燥机中冷冻干燥并粉碎成粉末，即得。
在另一方面，本申请还提供了一种益生菌组合物，包含本文描述的植物乳植杆菌JN-7或本文描述的菌粉。
在一些实施方案中，益生菌组合物还包含一种或更多种选自以下的益生菌：双歧杆菌属、乳杆菌属、乳酪杆菌属、粘液乳杆菌属、乳植杆菌属、联合乳杆菌属、广布乳杆菌属、链球菌属、乳球菌属、丙酸杆菌属、丙酸菌属、魏茨曼氏菌属、动物球菌属、葡萄球菌属、克鲁维酵母属、明串珠菌属、片球菌属和枯草芽孢杆菌DE111。
在一些实施方案中，益生菌组合物还包含一种或更多种选自以下的益生菌：青春双歧杆菌、动物双歧杆菌动物亚种、动物双歧杆菌乳亚种、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌长亚种、长双歧杆菌婴儿亚种、嗜酸乳杆菌、卷曲乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌乳亚种、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种、干酪乳酪杆菌、副干酪乳酪杆菌、鼠李糖乳酪杆菌、发酵粘液乳杆菌、罗伊氏粘液乳杆菌、植物乳植杆菌、唾液联合乳杆菌、弯曲广布乳杆菌、清酒广布乳杆菌、唾液链球菌嗜热亚种、乳酸乳球菌乳亚种、乳酸乳球菌乳亚种(双乙酰型)、乳脂乳球菌、费氏丙酸杆菌谢氏亚种、产丙酸丙酸菌、肠膜明串珠菌肠膜亚种、乳酸片球菌、戊糖片球菌、凝结魏茨曼氏菌、小牛动物球菌、木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、马克斯克鲁维酵母和枯草芽孢杆菌DE111。
在另一方面，本申请还提供了本文描述的植物乳植杆菌JN-7、本文描述的菌粉或本文描述的益生菌组合物在制备抗炎药物中的用途。在一些实施方案中，药物通过口服施用。
在另一方面，本申请还提供了本文描述的植物乳植杆菌JN-7、本文描述的菌粉或本文描述的益生菌组合物在制备食品或保健品中的用途。
在一些实施方案中，食品或保健品为乳制品、豆制品、肉制品、果蔬制品、饮料或零食。在一些实施方案中，食品或保健品还包含食用辅料。
在一些实施方案中，食品为保健食品；或食品包括乳制品、豆制品、肉制品或果蔬制品；或食品为饮料或零食。在一些实施方案中，食品包含本文描述的植物乳植杆菌JN-7和食用辅料。
本申请描述了多个实施例，但是该描述是示例性的，而不是限制性的，并且对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是，在本申请所描述的实施例包含的范围内可以有更多的实施例和实现方案。尽管在附图中示出了许多可能的特征组合，并在具体实施方式中进行了讨论，但是所公开的特征的许多其它组合方式也是可能的。除非特意加以限制的情况以外，任何实施例的任何特征可以与任何其它实施例中的任何其他特征结合使用，或可以替代任何其它实施例中的任何其他特征。
本申请包括并设想了与本领域普通技术人员已知的特征的组合。本申请已经公开的实施例和特征也可以与任何常规特征组合，以形成由权利要求限定的独特的发明方案。任何实施例的任何特征也可以与来自其它发明方案的特征组合，以形成另一个由权利要求限定的独特的发明方案。因此，应当理解，在本申请中示出和/或讨论的任何特征可以单独地或以任何适当的组合来实现。因此，除了根据所附权利要求及其等同替换所做的限制以外，实施例不受其它限制。此外，可以在所附权利要求的保护范围内进行各种修改和改变。
此外，在描述具有代表性的实施例时，说明书可能已经将方法和/或过程呈现为特定的步骤序列。然而，在该方法或过程不依赖于本文所述步骤的特定顺序的程度上，该方法或过程不应限于所述的特定顺序的步骤。如本领域普通技术人员将理解的，其它的步骤顺序也是可能的。因此，说明书中阐述的步骤的特定顺序不应被解释为对权利要求的限制。此外，针对该方法和/或过程的权利要求不应限于按照所写顺序执行它们的步骤，本领域技术人员可以容易地理解，这些顺序可以变化，并且仍然保持在本申请实施例的精神和范围内。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。下述实施例中未注明出处的实验材料，均为市售原料。下述实施例中的各步骤中采用的设备均为常规设备。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另有定义或说明，本申请中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。
实施例1植物乳植杆菌JN-7的获得与鉴定
本申请提供的植物乳植杆菌JN-7分离自四川成都自家腌制泡菜中。
1.植物乳植杆菌JN-7的16s测序
JN-7细菌基因组DNA使用Takara Mini-BEST细菌基因组DNA提取试剂盒3.0版提取。16S rRNA基因通过通用引物27F：5'-AGAGTTTTGATCCTGTCCAG-3’(SEQ ID NO:1)和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO:2)扩增。PCR循环：94℃初始活化2min；变性步骤在94℃下循环30s；55℃退火1min；72℃延伸1分钟；最后在72℃下循环10分钟。PCR产物经过纯化进行一代测序，测得的16s rRNA序列如SEQ ID NO:3所示。
经过NCBI网站Blast比对植物乳植杆菌后发现其与模式菌株Lactiplantibacillus plantarum SRCM100442的相似性达到99.93％，综合菌株JN-7有关生理生化指标和分子生物学鉴定结果，结合其形态学特征，我们将其命名为Lactiplantibacillus plantarum JN-7，于2024年5月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.30605。
2.植物乳植杆菌JN-7的全基因组测序
为了进行基因组测序，使用MRS肉汤在37℃厌氧条件下培养植物乳植杆菌JN-7 24小时。单菌落在MRS肉汤中培养过夜。将肉汤在8000×g、4℃、5min下离心。沉淀送至GENEWIZ测序公司(中国)进行测序、组装、注释和生物信息学分析。
全基因组测序在illumine PE150平台和PacBio Sequel系统上进行。对于PacBio测序文库，使用g-TUBE装置将5-10μg基因组DNA剪切成10-15Kb的片段。然后使用Express Template Preparation Kit 2.0构建文库。简而言之，DNA剪切片段经过单链突出端去除、DNA损伤修复、末端修复、A加尾、带有条形码的突出端接头连接。使用Qubit 3.0荧光计(Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)对文库进行定量，并使用Agilent2100生物分析仪系统检查文库的大小。按照制造商的说明进行后续步骤来准备SMRTbell库。使用PacBio Sequel平台对文库进行测序。PacBio读段使用Hifiasm/Canu进行组装。然后使用Pilon软件使用之前的Illumina数据重新校正基因组。Prodigal/Augustus基因查找软件已用于查找编码基因。使用程序tRNAscan-SE和默认参数设置在基因组中检测转移RNA(tRNA)。rRNA通过使用Barrnap进行鉴定。其他RNA通过rfam数据库鉴定。编码基因通过Diamond用国家生物技术信息中心(NCBI)nr数据库进行注释。然后通过GO(GeneOntology)数据库注释基因的功能，并使用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes)数据库注释通路。基因编码的蛋白质通过COG(Clusters of OrthologousGroups)数据库进行系统发育分类。使用Diamond在CAZy数据库、Swiss_Prot数据库、Pfam数据库、CARD数据库、VFDB数据库或DFVF数据库中检索E<1e-5的蛋白质序列。
对植物乳植杆菌JN-7的基因组序列进行组装和分析。基本基因组信息序列如表1所示。基因组长度为3255213bp，共有3218个基因，3090个蛋白质编码基因。使用Circos(版本0.69)软件创建显示基因、ncRNA、GC含量和重复序列信息的基因组圆图，见图1。
表1植物乳植杆菌JN-7的基本基因组信息
3.植物乳植杆菌JN-7的鉴定
植物乳植杆菌JN-7的鉴定是通过使用在线ANI计算器(http://enve- omics.ce.gatech.edu/ani/)计算JN-7基因组序列与植物乳植杆菌Lactiplantibacillusplantarum SRCM100442标准菌株之间的平均核苷酸同一性(Average NucleotideIdentity，ANI)来进行的。ANI计算器使用两个基因组数据集之间的最佳命中(单向ANI)和相互最佳命中(双向ANI)来估计平均核苷酸同一性。通过比较JN-7和植物乳植杆菌参考菌株，得到99.21％的ANI结果，表明JN-7菌株属于植物乳植杆菌种。
利用Makeblastdb软件建立了选自NCBI的1215个(检索于2024.2.20)植物乳植杆菌基因组数据库。植物乳植杆菌筛选的标准是已上传至NCBI的完整基因组或者基因组草图。通过Blastn将组装的JN-7基因组与植物乳植杆菌基因组数据库进行比较，生成比较条目中的不匹配区域以及不匹配区域的数量。未查询到和组装结果相比完全一致的或容许至多1000个mismatch的参考，表明植物乳植杆菌JN-7是NCBI中从未报道过的菌株。
实施例2.植物乳植杆菌JN-7的表征
植物乳植杆菌JN-7的特征
对植物乳植杆菌JN-7进行发酵培养，并测定菌株的以下特征
1)植物乳植杆菌JN-7生长曲线
使用Growth profiler 960(Enzyscreen B.V.，Heemstede，Netherlands)在37℃的温度绘制JN-7的生长曲线。具体操作如下：JN-7MRS液体培养16小时后接种到新鲜的MRS肉汤中并调整最终OD600为0.1。将调整好OD的菌液加入无菌96孔板中，确保每孔添加量为250μL，共进行11组平行(A1-A11)。在有氧条件下，以200rpm、37℃培养48小时，每30分钟对OD值进行一次采集。
如图2所示，通过Growth Profiler 960拟合出一条典型的二次曲线。在37℃、200rpm条件下培养，初始OD为0.1的植物乳植杆菌JN-7在18小时内达到指数生长期，并在接下来的48小时内处于稳定期。
2)酸、胆盐和胃肠道耐受性
将在MRS肉汤中培养16h的新鲜菌液12000rpm、4℃离心2分钟，留取沉淀。用无菌PBS缓冲液洗涤沉淀两次，重悬于无菌PBS(pH＝7)中并调节菌体浓度至108CFU/mL。此菌液按照5％的添加量接种到MRS(N0)、pH3.0的MRS(N1)或含0.3％胆盐(w/v，Sigma，美国)的MRS液体培养基中(N1)。37℃放置4h后，对不同培养基中植物乳植杆菌JN-7的活细胞进行计数。
为了检测植物乳植杆菌JN-7的胃肠道耐受性，挑取新鲜单菌落接种到MRS肉汤中并在37℃培养16h。取5mL菌液在12000rpm,4℃条件下离心2分钟。用无菌PBS(pH＝7)洗涤沉淀并重悬至菌体浓度为107CFU/mL。将100μL菌悬液加入900μL模拟胃液中，模拟胃液由125mM NaCl、7mM KCl、45mM NaHCO3和3g/L胃蛋白酶(Sigma，美国)组成，并用HCl调节pH至3.0。在37℃孵育3小时后，将250μL胃液混合物加入6mL模拟肠液中，模拟肠液由45mM NaCl、1g/L胰蛋白酶(Sigma，美国)和3g/L胆盐(Sigma，美国)组成，pH值由NaOH调节为8.0，然后在37℃孵育3小时。
植物乳植杆菌JN-7在酸、胆盐和胃肠道处理下的存活率按下式计算：
存活率(％)＝(N1÷N0)×100％
其中，N1是MRS(pH3.0、0.3％胆盐)、或胃肠液共处理6小时后的活细胞计数；N0是MRS及胃肠液处理0h的活细胞计数。
结果显示，植物乳植杆菌JN-7在pH3.0的MRS和0.3％胆盐的MRS中的存活率分别为28.47％和44.68％。在模拟胃液中评估JN-7在胃肠液中的存活能力3小时，然后在模拟肠液中评估3小时。处理6h后，JN-7的活细胞数减少至处理前的12.32％。
3)对抗生素的敏感性和MIC
选用庆大霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、红霉素和克林霉素7种临床常用抗生素对菌株进行抗生素敏感性分析，分别配制256mg/L的抗生素母液并进行两倍稀释，将培养16h后的新鲜菌液OD稀释至0.0002，最终以1：1的接种量接种至上述不同浓度抗生素溶液中。37℃培养24h后观察结果，确定最小抑制浓度(MIC)，以欧洲食品安全局(EFSA)制定的细菌对抗生素抗性的规定为标准进行比较评定。
氨苄青霉素、庆大霉素、卡那霉素、红霉素、克林霉素、四环素和氯霉素对植物乳植杆菌JN-7的MIC见表2。结果显示，所有7种抗生素的MIC值均低于EFSA指南规定的抗生素临界值，表明该菌株对抗生素是不耐药的，具备抗生素安全性。
表2不同抗生素对植物乳植杆菌JN-7的MIC(mg/L)
4)溶血活性
不存在溶血活性和抗生素耐药性被认为是选择益生菌菌株的安全先决条件(FAO/WHO，2002)。
将活化两代后的植物乳植杆菌JN-7划线于含5％脱纤维羊血的哥伦比亚血琼脂培养基(3400071，Haibo Co.,China)，37℃培养48小时，若出现草绿色溶血环，即为α-溶血；若出现无色透明的溶血环，即为β-溶血；若无溶血环，即为γ-溶血。
结果如图3所示，植物乳植杆菌JN-7在血琼脂上培养后，菌落周围无溶血环出现，为γ-溶血。由此说明，植物乳植杆菌JN-7无溶血能力。
5)D-乳酸、L-乳酸的产生及L-乳酸/D-乳酸比的分析
挑取新鲜单菌落在MRS肉汤中37℃培养18小时。使用D,L-乳酸市售定量试剂盒(Jingmei Co.,中国)按照制造商的方案，通过酶法对培养物上清液进行D,L-乳酸分析。
在37℃的MRS肉汤中培养菌株18小时后，对植物乳植杆菌JN-7产生的D-乳酸和L-乳酸进行了分析。JN-7发酵过程中产生1.2nmol/L D-乳酸和4.28nmol/L L-乳酸。L-乳酸/D-乳酸比为3.57，见表3。
表3D-乳酸、L-乳酸含量及L-乳酸/D-乳酸比
6)生物胺检测
将菌株在MRS液体培养基中培养过夜，分别添加至含有0.1g/L的组氨酸、酪氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和0.05g/L吡哆醛-5-磷酸的MRS液体培养基中至终浓度为OD 0.01并进行传代，每24h传代一次，共五次。上述液体培养基按2％接种量相应地接种于含1％组胺、酪氨酸、尸胺和腐胺的MRS培养基中培养72h并观察培养基的颜色变化。若培养基颜色变为紫色则为阳性，若培养基变为黄色则为阴性。鼠李糖乳酪杆菌LGG为阴性对照，大肠杆菌做为阳性对照。
结果显示，JN-7在四种生物胺检测培养基中生长三天后均呈黄色，则表示该菌株不产生腐胺、尸胺、组胺和酪胺。
7)API 50CH糖发酵实验
将培养16h的新鲜菌液于12000rpm转速下，离心2min。弃上清，将沉淀用无菌PBS进行两次洗涤，后重新悬浮于无菌PBS中，调整OD至0.3，为菌液a。取1mL菌液a至10mL的50CHL培养基(50410,API,法国)，为菌液b。在50CH试条(50300,API,法国)试孔中依次加入150μL菌液b，置于37℃培养48h。通过颜色变化来判定结果，与对照组相比颜色为黄色代表阳性(其中七叶苷阳性为紫色)，未发生变化记录为阴性。
结果显示，植物乳植杆菌JN-7能代谢D-核糖(5)、D-半乳糖(10)、D-葡萄糖(11)、D-果糖(12)、D-甘露醇(13)、甘露醇(18)、山梨醇(19)、甲基-α-D-吡喃甘露糖苷(20)、N-乙酰葡萄糖胺(22)、苦杏仁苷(23)、熊果苷(24)、七叶苷(25)、水杨苷(26)、D-纤维二糖(27)、D-麦芽糖(28)、D-乳糖(29)、D-密二糖(30)、D-蔗糖(31)、D-海藻糖(32)、D-松三糖(34)、D-棉子糖(35)、D-龙胆二糖(39)、D-土伦糖(40)、D-塔格糖(42)和葡萄糖酸钾(47)发酵产酸。
实施例3.植物乳植杆菌JN-7的细胞毒性和黏附性
实验方法：
HT-29细胞的培养
HT-29是人肠上皮细胞系细胞，用来进行细菌的细胞毒性和黏附性测试。HT-29用含10％FBS和1％P/S(青霉素/链霉素)的RPMI 1640培养基培养。在含5％CO2，37℃培养箱中培养约36h-72h，细胞密度达到90％左右，用胰酶消化传代种板。
细胞活性检测
CCK-8是一种通用的检测细胞增殖、毒性的方法。本实验检测HT-29细胞增殖活性使用CCK-8试剂盒(C0037，碧云天)。细胞计数按合适的密度接种到96孔板，加入总体积1/10的CCK-8溶液，避光孵育，在37℃下孵育2小时，排出气泡，酶标仪测量450nm处的OD值。
黏附性检测
将HT-29细胞以5×105个细胞/mL的浓度从培养瓶接种至24孔板中，换成不含抗生素的培养基培养，待细胞贴壁完全后可进行实验。添加细菌之前，用无菌PBS洗涤孔板中细胞两次，再向每个孔中加500μL浓度为108CFU/mL(V0)的细菌。将24孔板转移至37℃的5％CO2培养箱中培养4h使其黏附。PBS溶液洗涤每孔细胞5次，以洗脱没有黏附的细菌和代谢分泌物。每个孔中加入200μL的1％ Triton X-100进行消化，然后收集每孔内溶液进行梯度稀释并计数(V1)。黏附率(％)计算方法如下：
黏附率(％)＝(V1/V2)×100％
为了评估植物乳植杆菌JN-7对HT-29肠上皮细胞的潜在细胞毒性作用，在与植物乳植杆菌JN-7细菌细胞共培养18小时后进行CCK-8测定。该试验的感染倍数(MOI)约为1:200。如图4中的a所示，在该MOI下植物乳植杆菌JN-7对肠上皮细胞的存活无影响。将植物乳植杆菌JN-7的粘附能力与商业益生菌鼠李糖乳杆菌(LGG)的粘附能力进行比较(图4中的b)。结果显示，LGG粘附细胞的效率是JN-7的两倍。
实施例4.植物乳植杆菌JN-7的抗炎作用
实验方法：
THP-1的培养及处理
THP-1是人单核白血病细胞，可在佛波酯(PMA)诱导下分化成为巨噬细胞，用来进行细菌抗炎作用的检测。THP-1用含10％FBS和1％P/S的RPMI 1640培养基培养。在含5％CO2，37℃培养箱中培养，细胞密度达到至8-10×105个细胞/mL时进行传代，细胞正常状态为悬浮生长可进行半培养基传代。
将THP-1细胞以5×105个细胞/mL种于6孔板中，在37℃的CO2培养箱过夜培养。给浓度为100ng/mL的PMA诱导分化细胞，48h后细胞贴壁形状为梭形或多边形，分化成巨噬细胞。
实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
根据制造商的说明，使用Trizol试剂(R701-01-AA，诺唯赞)从细胞中分离总mRNA。使用HiScript II select qRT supermix(R222-01，诺唯赞)在含有1μg RNA的20μL终体积中进行逆转录(Reverse transcription PCR，RT-PCR)。使用基因特异性引物和SYBR Green(Q712-02，诺唯赞)在实时荧光定量PCR(quantitative Real-timePCR,qRT-PCR)检测系统上进行qRT-PCR。所有引物均由我们自己设计并在金唯智生物科技有限公司(中国北京)合成。以β-actin为参考基因，采用2-ΔΔt方法进行数据分析。
具体操作步骤如下：
RNA的提取：(1)收集细胞于1.5mL无酶EP管中，加入200μL Trizol试剂，匀浆充分裂解细胞。室温孵育5min后，4℃，12000rpm离心5min。(2)转移上清至新EP管中，加入4/5体积的异丙醇，上下颠倒摇晃10次以充分混匀后室温下静置10min。(3)4℃，12000rpm离心10min，弃上清，出现白色羽毛状沉淀即为RNA，用800μL含75％乙醇的DEPC水洗涤两次，弃上清，挥干沉淀，用20μL的DEPC水于冰上溶解沉淀即得RNA。(4)用NanoDrop微量分光光度计测定RNA的浓度。
RT-PCR合成cDNA：用诺唯赞的RT-PCR试剂盒(HiScript IIQ RT SuperMix forqPCR)合成cDNA。
表4配制第一链cDNA合成反应液
轻轻混匀后500rpm，离心1min至底部。
表5按下列条件进行第一链cDNA合成反应
得到的20μL产物可立即用于qRT-PCR反应，或者在-20℃保存(半年内可用)；长期存放建议分装后在-80℃保存并避免反复冻融。
qRT-PCR：
表6共20μL反应体系如下：
轻弹混匀后将液体离心至底部，于实时荧光定量PCR仪上扩增。
反应条件为94℃持续30s；94℃持续5s；60℃持续30s，反复40个循环。Bio-Rad CFXManager Software自动记录扩增数据及溶解曲线等，扩增数据以threshold cycle(CT值)表示，采用2-ΔΔt方法进行数据分析。引物序列(SEQ ID NO:4-11)如下表所示。
表7引物序列
JN-7对LPS刺激的PMA分化的THP-1细胞的抗炎作用
JN-7下调LPS刺激的细胞促炎因子mRNA的表达(如图5)。将JN-7和LGG分别与THP-1分化形成的巨噬细胞共培养，通过检测促炎因子IL-6、IL-8和抗炎细胞因子IL-10mRNA的表达水平，评价菌株的抗炎作用。与LPS刺激对照组相比，LPS刺激后含JN-7和LGG的细胞IL-6、IL-8mRNA表达降低，IL-10mRNA表达升高。此外，LGG对LPS刺激的IL-8mRNA表达下调效果优于JN-7。JN-7促进IL-10释放的能力高于LGG，提示JN-7与LGG一样具有抗炎作用。
实施例5.植物乳植杆菌JN-7菌粉生产及稳定性分析
1)JN-7发酵及菌粉生产
将植物乳植杆菌JN-7接种于MRS肉汤中，37℃培养18h，活化两次并在5L生物反应器(320，eppendof)中培养12小时。发酵结束后，在4℃、10000rpm、10min收集菌体。所得菌体与保护剂(1-10g/L多聚糖、20-50g/L二糖、1-20g/L维生素C或其盐类物质、及1-10g/L蛋白胨)混合，并在-80℃条件下预冻24小时。将菌粉经真空冷冻干燥机(PO14416，Telstar LyoQuest-55plus)冷冻干燥并粉碎成粉末后，真空包装于铝箔袋中。
在5L生物反应器中发酵12小时离心后共收集41.5g沉淀，植物乳植杆菌。将沉淀与保护剂混合，并将混合物冷冻干燥，产生6.6g菌粉，其活细胞数为7.07×1011CFU/g。
2)植物乳植杆菌JN-7菌粉稳定性的评价
将包装好的植物乳植杆菌装入铝箔袋中植物乳植杆菌JN-7菌粉保存在40℃、75％湿度的恒湿箱中进行加速试验，同时用市售的鼠李糖乳酪杆菌LGG菌粉及15株同样分离自发酵蔬菜的植物乳植杆菌(菌粉生产过程同JN-7)在同样温度和湿度下储藏做对照，在90天内取样JN-7菌粉、LGG菌粉以及15株植物乳植杆菌菌粉，按照国标GB 4789.35检测菌粉中乳酸菌数量并测定菌粉的水分活度。
储存期间植物乳植杆菌JN-7(图6A)，鼠李糖乳酪杆菌LGG(图6B)及其他15株植物乳植杆菌菌粉(图6C)的活细胞计数和水活度，见图6A-图6C。从图中可知，JN-7菌粉的稳定性要显著高于另外16种菌粉。JN-7 70天内活细胞从7.07×1011减少到1.73×1011CFU/g，相应的水活度从0.024增加到0.053。对照组LGG 70天内活细胞从3.53×1011减少到3.92×108CFU/g，相应的水活度从0.091增加到0.134。通过70天的测试，对JN-7活细菌的减少进行了线性拟合(r2＝0.80)。通过拟合可以预测，在加速稳定性试验条件下，活菌数减少1个log所需时间为136.99天比起拟合预测LGG所需的24.63天，延长了112.36天。
总的来说，本申请从自然发酵产品中分离并鉴定出一种植物乳植杆菌JN-7。经过全基因组测序并与NCBI可检索到的所有植物乳植杆菌基因组进行比较，我们发现菌株植物乳植杆菌JN-7是一个新菌株。通过该菌株的基本特性分析(生长曲线、耐酸性、耐胆盐、耐胃肠液)、安全性评价(抗生素敏感性、溶血能力、产毒能力、细胞毒性)、黏附性评价、抗炎作用评价、生产性能评价(发酵产率和冻干产率)和稳定性测试(加速储存稳定性试验)，发现植物乳植杆菌JN-7是安全菌株，具有优良的生产性能、高稳定性和抗炎功效。

Claims (10)

1.一种植物乳植杆菌JN-7，其中，所述植物乳植杆菌JN-7的分类命名为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)，保藏编号为CGMCC No.30605。
2.由权利要求1所述的植物乳植杆菌JN-7制备得到的菌粉。
3.权利要求2所述的菌粉的制备方法，包括以下步骤：
1)发酵所述植物乳植杆菌JN-7；
2)将发酵产物离心沉淀，冷冻干燥，即得。
4.一种益生菌组合物，包含权利要求1所述的植物乳植杆菌JN-7或权利要求2所述的菌粉。
5.根据权利要求4所述的益生菌组合物，其中，所述益生菌组合物还包含一种或更多种选自以下的益生菌：双歧杆菌属、乳杆菌属、乳酪杆菌属、粘液乳杆菌属、乳植杆菌属、联合乳杆菌属、广布乳杆菌属、链球菌属、乳球菌属、丙酸杆菌属、丙酸菌属、魏茨曼氏菌属、动物球菌属、葡萄球菌属、克鲁维酵母属、明串珠菌属、片球菌属和枯草芽孢杆菌DE111。
6.权利要求1所述的植物乳植杆菌JN-7、权利要求2所述的菌粉或权利要求4或5所述的益生菌组合物在制备抗炎药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述药物通过口服施用。
8.权利要求1所述的植物乳植杆菌JN-7、权利要求2所述的菌粉或权利要求4或5所述的益生菌组合物在制备食品或保健品中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其中，所述食品或保健品为乳制品、豆制品、肉制品、果蔬制品、饮料或零食。
10.根据权利要求8所述的用途，其中，所述食品或保健品还包含食用辅料。
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