CN120419528A - 小鼠尾部远端缺血预处理肾脏保护模型的构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小鼠尾部远端缺血预处理肾脏保护模型的构建方法及应用，属于缺血预处理技术领域，其目的在于解决现有技术中肾脏保护实验结果稳定性、可靠性较差的技术问题。其通过分别构建尾部远端缺血预处理组、脓毒症急性肾损伤模型组和尾部对照组；构建尾部远端缺血预处理组时，在小鼠尾部绑扎止血带，并通过阻断血流‑恢复血流并重复循环；并采集每组中小鼠的血液、肾脏组织进行检测，测定血清肌酐、血清尿素氮指标、评估肾小管病理损伤情况、评估肾脏活性氧表达水平。本方法证明了尾部缺血再灌注预处理可以改善脓毒症急性肾损伤的肾脏病理损伤及减轻肾小管损伤，可抑制脓毒症急性肾损伤的肾脏氧化应激、减轻脓毒症急性肾损伤的炎症反应。

Description

小鼠尾部远端缺血预处理肾脏保护模型的构建方法及应用

技术领域

本发明属于缺血预处理技术领域，涉及基于小鼠缺血预处理的肾脏保护模型的构建，尤其涉及一种小鼠尾部远端缺血预处理肾脏保护模型的构建方法及应用。

背景技术

缺血预处理（IPC）是一种通过短暂、非致命的缺血刺激增强器官或组织对后续更严重缺血损伤耐受性的保护机制。它的核心原理是激发内源性适应反应，通过激活细胞信号通路、减少氧化应激和炎症反应，能够使器官抵御后续的缺血-再灌注损伤，从而减轻长期缺血导致的损伤，广泛应用于心脏、大脑、肝脏等重要器官的保护。但是，缺血预处理（IPC）是直接作用于靶器官，这样将引发应激反应，损害血管结构，造成不良预后，限制了其临床应用。

现有技术中，对靶器官（即肾脏）进行缺血再灌注时，通常需要对应的实验装置。申请号为202021983041.4的实用新型专利就公开了一种动物缺血再灌注实验用实验台，其包括平板，平板顶面固定安装有平行的两条沿前后方向的滑轨，左右侧滑轨上分别配合安装有两个第一滑块，第一滑块上方均固定安装有上端开口的筒体，筒体前后内侧壁之间转动连接有转轴，转轴上套装有圆轮，圆轮下方开设一段弧形齿，弧形齿下方相互啮合有轴线相互垂直的蜗杆，筒体侧壁外侧均对应蜗杆开设第一通孔，蜗杆外端均穿过第一通孔并固定安装有同轴线的转盘。申请号为202120170725.0的实用新型专利也公开了一种动物缺血再灌注实验装置，其，包括弹簧夹和气泵，弹簧夹由第一夹持板和第二夹持板通过扭簧连接而成，第一夹持板和第二夹持板的右侧分别固定连接有第一手柄和第二手柄，第一夹持板内壁的底部和第二夹持板内壁的顶部均固定连接有安装框架，两个安装框架的内部分别固定连接有第一气囊和第二气囊。

对于缺血再灌注，除了需要对应的实验装置外，其构建动物模型也至关重要。通过构建缺血动物模型的目的是在动物体内生成肾脏缺血再灌注损伤，从而观测可修复肾脏损伤的细胞在动物体内的生长状况与修复肾脏损伤的效果。

现有技术中，缺少对动物体肾脏缺血再灌注的动物模型构建，但存在其他动物模型的构建。如，申请号为202110816267.8的发明专利申请就公开了一种经腹膜后入路构建大鼠肾下腹主动脉瘤模型及构建方法，其通过充分游离并用慕丝线结扎灌注段腹主动脉分支，用乳突撑开器充分暴露手术视野，先用显微血管夹阻断腹主动脉近端，接着用显微止血钳将灌注段血管内血液挤向远端，再用显微血管夹阻断腹主动脉远端，血管完全塌陷，表明血管密闭性好，然后用一次性胰岛素注射器抽取0.2mL含10U弹性蛋白酶,并用血管钳将注射器针头稍折弯，使其略呈“L”型后穿刺腹主动脉，穿刺成功后缓慢注入含5U的弹性蛋白酶0.1mL，使灌注段腹主动脉充分充盈，固定穿刺针，保留20min，期间若有少许弹性蛋白酶外渗及时补充，使灌注段腹主动脉始终保持充分充盈状态，术毕回抽血管内药物，拔针，明胶海绵覆盖穿刺点，棉球加压，先取远端血管夹，再取近端血管夹，观察数分钟，未见活动性出血，将浸泡在1.0mol/L无菌氯化钙中的小纱条敷在灌注段腹主动脉表面，10min后取出小纱条，清洗腹膜后间隙，检查若无出血，逐层关闭切口。该方案可缩短灌注时间至20min，灌注结束后局部压迫便可止血。以及，申请号为202411332193.0的发明专利申请也公开了一种用于心肌缺血动物模型的构建方法，其包括：计算预处理图像中对照间充质干细胞的形态学特征，对形态学特征进行主成分分析，通过活性分析模型输出分析主成分对应的细胞活性；构建心肌损伤动物的动物三维模型，并采集实验间充质干细胞的培养环境；利用培养环境选取心肌损伤动物中的生长环境，采集生长环境的环境图像，从环境图像中选取心肌损伤动物的移植位置；从动物三维模型中确定移植位置的三维位置，构建动物三维模型的表面位置至三维位置的移植路径，将实验间充质干细胞移植至移植位置处，得到原位移植动物模型。

参照上述动物模型构建方式，在构建缺血再灌注的动物模型时，其会采用基于腹主动脉缺血、下肢股动脉缺血等进行建模实现，其虽然可以通过止血带诱导腹/下肢缺血和直接腹主动脉缺血/下肢股动脉缺血两种模型来观察、研究肾脏保护机理与筛选相关治疗药物；但是，该中方式仍存在一定的缺陷，主要体现在：1、创伤与损伤方面，两种方法都会对动物腹/下肢造成较大创伤，不利于动物后续生存和恢复。2、神经损伤方面：止血带诱导腹/下肢缺血会压迫神经，长时间缺血可能致使神经缺血、缺氧，引起神经纤维损伤和坏死，造成腹/下肢肌肉无力、瘫痪；腹/下肢股动脉缺血的手术操作也可能损伤周围神经，导致受压神经支配区域出现麻木、刺痛、感觉减退等症状。3、操作及稳定性方面：这类方法对手术技巧及术后护理要求较高，增加实验难度和工作量，否则易造成不良后果、增加实验复杂性。4、稳定性和可重复性：这类方法对动物创伤较大，导致动物状态不稳定，不同实验间结果差异较大，实验的稳定性和可重复性较差。因此，有必要构建一种对动物创伤更小、操作更为便捷的动物模型，提高实验的可靠性和科学性。

发明内容

本发明的目的在于：为了解决现有技术中构建的模型对动物创伤大、手术难度大、动物不易固定致使实验结果稳定性、可靠性较差的技术问题，提供一种小鼠尾部远端缺血预处理肾脏保护模型的构建方法及应用。

本发明为了实现上述目的具体采用以下技术方案：

一种小鼠尾部远端缺血预处理肾脏保护模型的构建方法，包括以下步骤：

步骤1，选材并分组；

选择雄性C56BL/6J、体重为23~25g、周龄为6~8周的健康小鼠若干，并随机均分为尾部对照组、脓毒症急性肾损伤模型组和尾部远端缺血预处理组。

步骤2，诱导麻醉；

对尾部远端缺血预处理组的小鼠均使用浓度为15~25%的乌拉坦（其用量标准为1.5~2.0mg/kg）经腹腔缓慢注射，使小鼠麻醉；而对脓毒症急性肾损伤模型组和尾部对照组的小鼠则不进行麻醉处理。

步骤3，构建动物模型；

构建尾部远端缺血预处理组：待尾部远端缺血预处理组的小鼠麻醉后，使用止血带捆绑小鼠尾巴，阻断血流4~8min，随后松开止血带恢复血流4~8min（阻断血流时间=恢复血流时间），重复此“缺血-再灌注”过程，共进行3~6个循环；缺血再灌注循环结束12~20min后，再通过腹腔注射浓度为8~12mg/kg的脂多糖LPS（其用量标准为80~120ul/只）。需要说明的是，小鼠麻醉后到注射脂多糖LPS时的时间间隔为T。

构建脓毒症急性肾损伤模型组：经与尾部远端缺血预处理组相同时长后通过腹腔对小鼠注射等浓度、等用量标准的脂多糖LPS（即，从尾部远端缺血预处理组的小鼠麻醉后，过了时间T后再注射脂多糖LPS）。

构建尾部对照组：将止血带套在小鼠尾巴上但不进行捆绑，保持小鼠尾巴的血流正常；经与尾部远端缺血预处理组相同时长后通过腹腔对小鼠注射等量的生理盐水（即，从尾部远端缺血预处理组的小鼠麻醉后，过了时间T后再注射生理盐水，且生理盐水的注射量（ul）与脂多糖LPS的注射量（ul）相同）。

在注射脂多糖LPS时，其具体注射方法为：

左手抓取并固定小鼠，使小鼠腹部朝上，头部低于尾部，以避免内脏器官损伤；使用酒精棉球消毒小鼠腹部，将注射器刺入小鼠腹白线任一侧约0.3~0.7cm处，针头沿皮下推进3~5mm后，与皮肤呈40°~48°角刺入小鼠腹腔，刺入时有落空感；若回抽针栓时无液体回流，则缓慢注射药液；待注射完毕后，旋转针头并缓慢拔出，防止液体外漏。

步骤4，采集与检测，用于模型效果评价；

在腹腔注射脂多糖LPS、生理盐水12~20h后，同步采集小鼠的血液和肾脏组织。

采集的血液经离心处理后，取上清液并测定血清肌酐、血清尿素氮指标（根据上清液测定血清肌酐、血清尿素氮指标的具体方法，可直接适用现有技术，无需付出创造性劳动），用于评估各组的小鼠肾功能。

采集的肾脏组织分为三部分：

第一部分用于提取蛋白质与RNA，检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）、肾损伤分子-1（KIM-1）等肾小管损伤标志物，以及检测细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子的表达水平（其中，利用肾脏组织检测肾小管损伤标志物、炎症因子的表达水平的具体方法，可直接适用现有技术，无需付出创造性劳动）：

利用肾脏组织提取蛋白质时，所需的组织匀浆制备条件为：将20~30mg的肾脏组织置于2~5ml的研磨管中，加入450~600ul的蛋白裂解液，放入1~2颗4mm的不锈钢研磨钢珠及2~4颗3mm的不锈钢研磨钢珠，置于3~6℃的高速组织研磨仪中进行研磨，研磨条件为60~70Hz、50~75s，研磨3~4次。

利用肾脏组织提取RNA时，所需的组织匀浆制备条件为：将15~20mg的肾脏组织置于2~5ml的研磨管中，加入300~380ul的裂解液，放入1~2颗4mm的不锈钢无酶研磨钢珠及2~4颗3mm的不锈钢无酶研磨钢珠，置于常温的高速组织研磨仪中进行研磨，研磨条件为60~70Hz、50~75s，研磨3~4次。

第二部分用于制作石蜡切片，经苏木精-伊红（H&E）染色后进行肾小管损伤评分，评估肾小管病理损伤情况（其中，利用肾脏石蜡切片进行肾小管损伤评分、评估肾小管病理损伤的具体方法，可直接适用现有技术，无需付出创造性劳动）；

第三部分用于经OCT包埋制备肾脏冰冻切片，通过二氢乙锭（DHE）染色，评估肾脏活性氧（ROS）表达水平（其中，利用肾脏冰冻切片评估肾脏活性氧表达水平的具体方法，可直接适用现有技术，无需付出创造性劳动）。

进一步地，还包括步骤5；

步骤5，分析比对；

先将脓毒症急性肾损伤模型组与尾部对照组进行比较，分析血清肌酐和血清尿素氮水平；若脓毒症急性肾损伤模型组的血清肌酐升高幅度超过2倍，且经统计学检验显示两组间差异具有统计学意义，则判定脓毒症急性肾损伤模型组构建成功，否则构建失败；

再将脓毒症急性肾损伤模型组与尾部远端缺血预处理组进行比较，分析两组的血清肌酐和血清尿素氮水平，验证对脓毒症急性肾损伤肾功能的改善效果；检测肾小管损伤标志物和炎症因子的RNA及蛋白表达水平是否被远端缺血预处理抑制；结合肾脏病理损伤情况、肾小管损伤评分、肾脏活性氧表达水平，判断远端缺血预处理是否可以减轻肾脏病理损伤及抑制肾脏ROS的表达水平。

更进一步地，步骤3中还构建有双下肢远端缺血预处理组、下肢对照组；

构建双下肢远端缺血预处理组：待双下肢远端缺血预处理组的小鼠麻醉后，将小鼠双下肢用止血带捆绑并阻断血流4~8min后，再松开止血带恢复血流相同时间，重复此“缺血-再灌注”过程3~6个循环；缺血再灌注循环结束12~20min后，再通过腹腔注射浓度为8~12mg/kg的脂多糖LPS（其用量标准为80~120ul/只）。

构建下肢对照组：，将止血带套在小鼠双下肢上但不进行捆绑，保持小鼠尾巴的血流正常；经与尾部远端缺血预处理组相同时长后通过腹腔对小鼠注射等量的生理盐水（即，从尾部远端缺血预处理组或双下肢远端缺血预处理组的小鼠麻醉后，过了时间T后再注射生理盐水，且生理盐水的注射量（ul）与脂多糖LPS的注射量（ul）相同）。

步骤5中，先将脓毒症急性肾损伤模型组与尾部对照组、下肢对照组进行比较；再将脓毒症急性肾损伤模型组分别与双下肢远端缺血预处理组、尾部远端缺血预处理组进行比较。

根据上述的构建方法构建得到的模型在小鼠尾部远端缺血预处理对肾脏保护机理研究或筛选肾病治疗/保护药物中的应用。

本发明的有益效果如下：

1、经试验，采用本申请的方法进行模型构建，模型构建成功率高，且能有效验证：尾部缺血再灌注预处理可以改善脓毒症急性肾损伤的肾脏病理损伤及减轻肾小管损伤，可抑制脓毒症急性肾损伤的肾脏氧化应激、减轻脓毒症急性肾损伤的炎症反应。

2、相比于现有的下肢缺血模型，本发明选用小鼠尾部血管，小鼠尾部血管分布丰富，供血来源明确，以此部位构建的尾部远端缺血预处理组，建模相对简单，对动物创伤小，手术与护理难度低，动物更易适应和恢复，不易出现严重并发症，能在有效实现远端缺血预处理的同时，降低对实验动物的伤害；通过采用对动物影响更小的尾部血管模型，减少了动物应激等因素对实验结果的干扰，能更稳定、准确模拟远端缺血预处理过程，不同实验间结果差异小，提高了模型稳定性和可重复性，更利于准确评估远端缺血预处理对肾脏的保护作用，同时也更好地符合动物伦理要求，体现了对实验动物福利的关注。

3、本发明中，合理设置对照组、脓毒症急性肾损伤模型组、双下肢远端缺血预处理组、尾部远端缺血预处理组，并在预处理及模型构建过程中，对不同组设置了标准化且相互对照的操作流程（如明确规定麻醉药物剂量、缺血-再灌注循环次数、时间间隔，以及腹腔注射LPS的时机和剂量等），通过严谨的分组和规范处理流程，能更科学准确地验证尾部远端缺血预处理与双下肢远端缺血预处理对脓毒症急性肾损伤的肾脏保护等效性。

4、本发明中，在模型评估阶段，不仅检测血清肌酐、血清尿素氮等传统肾功能指标，还检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）、肾损伤分子-1（KIM-1）等小管损伤标志物，以及白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子的表达水平；同时结合肾脏病理切片（石蜡切片H&E染色进行肾小管损伤评分、冰冻切片DHE染色评估肾脏活性氧表达水平）观察，从多个维度综合评估体系，能更全面、深入地评价尾部远端组织缺血预处理对肾脏的保护作用，更具科学性和可靠性。

附图说明

图1是本发明中缺血组与对照组对血流影响示意图；

其中，A为尾部缺血组与尾部对照组中小鼠尾部的血液流动情况，B为尾部缺血组与尾部对照组中小鼠尾部的血流速率；C为下肢缺血组与下肢对照组中小鼠下肢的血液流动情况，D为下肢缺血组与下肢对照组中小鼠下肢的血流速率；

图2是本发明中下肢对照组、模型组与下肢缺血组对小鼠肾功能及肾损伤的影响示意图；

其中，A为下肢缺血组的构建示意图，B为肌酐与尿素氮的影响示意图，C为染色分析对比示意图，D为肾小管损伤评分及小管损伤标志物水平的影响示意图；

图3是本发明中尾部对照组、模型组与尾部缺血组对小鼠肾功能及肾损伤的影响示意图；

其中，E为尾部缺血组的构建示意图，F为肌酐与尿素氮的影响示意图，G为染色分析对比示意图，H为肾小管损伤评分及小管损伤标志物水平的影响示意图；

图4是本发明中下肢对照组、模型组与下肢缺血组对炎症因子表达水平的影响示意图；

其中，A为氧化应激（ROS）的影响示意图，B为白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA的影响示意图，C为白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）蛋白的影响示意图，D为白细胞介素和肿瘤坏死因子的蛋白丰度示意图；

图5是本发明中尾部对照组、模型组与尾部缺血组对炎症因子表达水平的影响示意图；

其中，E为氧化应激（ROS）的影响示意图，F为白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA的影响示意图，G为白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）蛋白的影响示意图，H为白细胞介素和肿瘤坏死因子的蛋白丰度示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种小鼠尾部远端缺血预处理肾脏保护模型的构建方法，目的在于探究尾部缺血再灌注对肾损伤的影响。具体包括以下步骤：

步骤1，选材并分组；

选择雄性C56BL/6J、体重为23g、周龄为6周的健康小鼠若干，并随机均分为尾部对照组、脓毒症急性肾损伤模型组和尾部远端缺血预处理组。

步骤2，诱导麻醉；

对尾部远端缺血预处理组的小鼠使用浓度为18%的乌拉坦（其用量标准为1.6mg/kg）经腹腔缓慢注射，使小鼠麻醉。而对于脓毒症急性肾损伤模型组和尾部对照组的小鼠，则不进行麻醉处理。

在本步骤中，考虑到尾部远端缺血预处理组需对小鼠进行缺血、再灌注处理，为减少该过程对小鼠造成的疼痛、减少小鼠因疼痛产生的过激反应影响试验结果以及伦理问题，因而就只对缺血预处理组（包括本实施例中的尾部远端缺血预处理组、以及下面实施例中的双下肢远端缺血预处理组）的小鼠进行麻醉处理，而对模型组和对照组的小鼠不做麻醉处理。且经前期研究，对小鼠是否打麻药，其对最终的试验影响没有影响、或者影响非常小，影响微乎其微，其完全可忽略不计。

步骤3，构建动物模型；

构建尾部远端缺血预处理组：待尾部远端缺血预处理组的小鼠麻醉后，使用止血带捆绑小鼠尾巴，阻断血流5min，随后松开止血带恢复血流5min（阻断血流时间=恢复血流时间），重复此“缺血-再灌注”过程，共进行4个循环；缺血再灌注循环结束15min后，再通过腹腔注射浓度为9mg/kg的脂多糖LPS（其用量标准为90ul/只）。

构建脓毒症急性肾损伤模型组：经与尾部远端缺血预处理组相同时长后通过腹腔对小鼠注射等浓度、等用量标准的脂多糖LPS（即，从尾部远端缺血预处理组的小鼠麻醉后，过了时间T后再注射脂多糖LPS）。

构建尾部对照组：将止血带套在小鼠尾巴上但不进行捆绑，保持小鼠尾巴的血流正常；经与尾部远端缺血预处理组相同时长后通过腹腔对小鼠注射等量的生理盐水（即，从尾部远端缺血预处理组的小鼠麻醉后，过了时间T后再注射生理盐水，且生理盐水的注射量（ul）与脂多糖LPS的注射量（ul）相同）。

在注射脂多糖LPS时，其具体注射方法为：

左手抓取并固定小鼠，使小鼠腹部朝上，头部低于尾部，以避免内脏器官损伤；使用酒精棉球消毒小鼠腹部，将注射器刺入小鼠腹白线任一侧约0.4cm处，针头沿皮下推进4mm后，与皮肤呈42°角刺入小鼠腹腔，刺入时有落空感；若回抽针栓时无液体回流，则缓慢注射药液；待注射完毕后，旋转针头并缓慢拔出，防止液体外漏。

步骤4，采集与检测，用于模型效果评价；

在腹腔注射脂多糖LPS、生理盐水14h后，同步采集小鼠的血液和肾脏组织。

采集的血液经离心处理后，取上清液并测定血清肌酐、血清尿素氮指标（根据上清液测定血清肌酐、血清尿素氮指标的具体方法，可直接适用现有技术，无需付出创造性劳动），用于评估各组的小鼠肾功能。

采集的肾脏组织分为三部分：

第一部分用于提取蛋白质与RNA，检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）、肾损伤分子-1（KIM-1）等肾小管损伤标志物，以及检测细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子的表达水平（其中，利用肾脏组织检测肾小管损伤标志物、炎症因子的表达水平的具体方法，可直接适用现有技术，无需付出创造性劳动）：

利用肾脏组织提取蛋白质时，所需的组织匀浆制备条件为：将24mg的肾脏组织置于3ml的研磨管中，加入480ul的蛋白裂解液，放入1颗4mm的不锈钢研磨钢珠及2颗3mm的不锈钢研磨钢珠，置于4℃的高速组织研磨仪中进行研磨，研磨条件为62Hz、55s，研磨3次。

利用肾脏组织提取RNA时，所需的组织匀浆制备条件为：将16mg的肾脏组织置于3ml的研磨管中，加入320ul的裂解液，放入1颗4mm的不锈钢无酶研磨钢珠及2颗3mm的不锈钢无酶研磨钢珠，置于常温的高速组织研磨仪中进行研磨，研磨条件为63Hz、56s，研磨3次。

第二部分用于制作石蜡切片，经苏木精-伊红（H&E）染色后进行肾小管损伤评分，评估肾小管病理损伤情况（其中，利用肾脏石蜡切片进行肾小管损伤评分、评估肾小管病理损伤的具体方法，可直接适用现有技术，无需付出创造性劳动）；

第三部分用于经OCT包埋制备肾脏冰冻切片，通过二氢乙锭（DHE）染色，评估肾脏活性氧（ROS）表达水平（其中，利用肾脏冰冻切片评估肾脏活性氧表达水平的具体方法，可直接适用现有技术，无需付出创造性劳动）。

步骤5，分析比对；

先将脓毒症急性肾损伤模型组与尾部对照组进行比较，分析血清肌酐和血清尿素氮水平；若脓毒症急性肾损伤模型组的血清肌酐升高幅度超过2倍，且经统计学检验显示两组间差异具有统计学意义，则判定脓毒症急性肾损伤模型组构建成功，否则构建失败；

再将脓毒症急性肾损伤模型组与尾部远端缺血预处理组进行比较，分析两组的血清肌酐和血清尿素氮水平，验证对脓毒症急性肾损伤肾功能的改善效果；检测肾小管损伤标志物和炎症因子的RNA及蛋白表达水平是否被远端缺血预处理抑制；结合肾脏病理损伤情况、肾小管损伤评分、肾脏活性氧表达水平，判断远端缺血预处理是否可以减轻肾脏病理损伤及抑制肾脏ROS的表达水平。

采用本实施例的方法进行构建，经试验、分析，模型构建成功，且结论为：尾部缺血再灌注预处理可以改善脓毒症急性肾损伤的肾脏病理损伤及减轻肾小管损伤，可抑制脓毒症急性肾损伤的肾脏氧化应激、减轻脓毒症急性肾损伤的炎症反应。

实施例2

本实施例提供一种小鼠尾部远端缺血预处理肾脏保护模型的构建方法，目的在于探究下肢缺血再灌注对肾损伤的影响。具体包括以下步骤：

步骤1，选材并分组；

选择雄性C56BL/6J、体重为24g、周龄为7周的健康小鼠若干，并随机均分为下肢对照组、脓毒症急性肾损伤模型组和双下肢远端缺血预处理组。

步骤2，诱导麻醉；

对双下肢远端缺血预处理组的小鼠使用浓度为20%的乌拉坦（其用量标准为1.8mg/kg）经腹腔缓慢注射，使小鼠麻醉。而对于脓毒症急性肾损伤模型组和尾部对照组的小鼠，则不进行麻醉处理。

步骤3，构建动物模型；

构建双下肢远端缺血预处理组：待双下肢远端缺血预处理组的小鼠麻醉后，将小鼠双下肢用止血带捆绑并阻断血流6min后，再松开止血带恢复血流相同时间，重复此“缺血-再灌注”过程5个循环；缺血再灌注循环结束16min后，再通过腹腔注射浓度为10mg/kg的脂多糖LPS（其用量标准为100ul/只）。

构建脓毒症急性肾损伤模型组：经与双下肢远端缺血预处理组相同时长后通过腹腔对小鼠注射等浓度、等用量标准的脂多糖LPS（即，从尾部远端缺血预处理组的小鼠麻醉后，过了时间T后再注射脂多糖LPS）。

构建下肢对照组：将止血带套在小鼠双下肢上但不进行捆绑，保持小鼠尾巴的血流正常；经与双下肢远端缺血预处理组相同时长后通过腹腔对小鼠注射等量的生理盐水（即，从尾部远端缺血预处理组或双下肢远端缺血预处理组的小鼠麻醉后，过了时间T后再注射生理盐水，且生理盐水的注射量（ul）与脂多糖LPS的注射量（ul）相同）。

在注射脂多糖LPS时，其具体注射方法为：

左手抓取并固定小鼠，使小鼠腹部朝上，头部低于尾部，以避免内脏器官损伤；使用酒精棉球消毒小鼠腹部，将注射器刺入小鼠腹白线任一侧约0.5cm处，针头沿皮下推进4mm后，与皮肤呈44°角刺入小鼠腹腔，刺入时有落空感；若回抽针栓时无液体回流，则缓慢注射药液；待注射完毕后，旋转针头并缓慢拔出，防止液体外漏。

步骤4，采集与检测，用于模型效果评价；

在腹腔注射脂多糖LPS、生理盐水15h后，处死小鼠，同步采集小鼠的血液和肾脏组织。

采集的血液经离心处理后，取上清液并测定血清肌酐、血清尿素氮指标（根据上清液测定血清肌酐、血清尿素氮指标的具体方法，可直接适用现有技术，无需付出创造性劳动），用于评估各组的小鼠肾功能。

采集的肾脏组织分为三部分：

第一部分用于提取蛋白质与RNA，检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）、肾损伤分子-1（KIM-1）等肾小管损伤标志物，以及检测细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子的表达水平（其中，利用肾脏组织检测肾小管损伤标志物、炎症因子的表达水平的具体方法，可直接适用现有技术，无需付出创造性劳动）：

利用肾脏组织提取蛋白质时，所需的组织匀浆制备条件为：将25mg的肾脏组织置于4ml的研磨管中，加入520ul的蛋白裂解液，放入2颗4mm的不锈钢研磨钢珠及3颗3mm的不锈钢研磨钢珠，置于4℃的高速组织研磨仪中进行研磨，研磨条件为65Hz、62s，研磨4次。

利用肾脏组织提取RNA时，所需的组织匀浆制备条件为：将18mg的肾脏组织置于3ml的研磨管中，加入340ul的裂解液，放入2颗4mm的不锈钢无酶研磨钢珠及3颗3mm的不锈钢无酶研磨钢珠，置于常温的高速组织研磨仪中进行研磨，研磨条件为65Hz、62s，研磨4次。

第二部分用于制作石蜡切片，经苏木精-伊红（H&E）染色后进行肾小管损伤评分，评估肾小管病理损伤情况（其中，利用肾脏石蜡切片进行肾小管损伤评分、评估肾小管病理损伤的具体方法，可直接适用现有技术，无需付出创造性劳动）；

第三部分用于经OCT包埋制备肾脏冰冻切片，通过二氢乙锭（DHE）染色，评估肾脏活性氧（ROS）表达水平（其中，利用肾脏冰冻切片评估肾脏活性氧表达水平的具体方法，可直接适用现有技术，无需付出创造性劳动）。

步骤5，分析比对；

先将脓毒症急性肾损伤模型组与下肢对照组进行比较，分析血清肌酐和血清尿素氮水平；若脓毒症急性肾损伤模型组的血清肌酐升高幅度超过2倍，且经统计学检验显示两组间差异具有统计学意义，则判定脓毒症急性肾损伤模型组构建成功，否则构建失败；

再将脓毒症急性肾损伤模型组与双下肢远端缺血预处理组进行比较，分析两组的血清肌酐和血清尿素氮水平，验证对脓毒症急性肾损伤肾功能的改善效果；检测肾小管损伤标志物和炎症因子的RNA及蛋白表达水平是否被远端缺血预处理抑制；结合肾脏病理损伤情况、肾小管损伤评分、肾脏活性氧表达水平，判断双下肢远端缺血预处理是否可以减轻肾脏病理损伤及抑制肾脏ROS的表达水平。

采用本实施例的方法进行构建，经试验、分析，模型构建成功，且结论为：下肢缺血再灌注预处理可以改善脓毒症急性肾损伤的肾脏病理损伤及减轻肾小管损伤，可抑制脓毒症急性肾损伤的肾脏氧化应激、减轻脓毒症急性肾损伤的炎症反应。

实施例3

本实施例提供一种小鼠尾部远端缺血预处理肾脏保护模型的构建方法，目的在于探究、对比尾部/下肢缺血再灌注对肾损伤的影响差异性。具体包括以下步骤：

步骤1，选材并分组；

选择雄性C56BL/6J、体重为25g、周龄为8周的健康小鼠若干，并随机均分为下肢对照组、尾部对照组、脓毒症急性肾损伤模型组、双下肢远端缺血预处理组和尾部远端缺血预处理组。

步骤2，诱导麻醉；

对双下肢远端缺血预处理组和尾部远端缺血预处理组两个组的小鼠均使用浓度为24%的乌拉坦（其用量标准为1.8mg/kg）经腹腔缓慢注射，使小鼠麻醉。而对于脓毒症急性肾损伤模型组、下肢对照组和尾部对照组的小鼠，则不进行麻醉处理。

步骤3，构建动物模型；

构建尾部远端缺血预处理组：待尾部远端缺血预处理组的小鼠麻醉后，使用止血带捆绑小鼠尾巴，阻断血流7min，随后松开止血带恢复血流7min（阻断血流时间=恢复血流时间），重复此“缺血-再灌注”过程，共进行6个循环；缺血再灌注循环结束18min后，再通过腹腔对小鼠注射浓度为10mg/kg的脂多糖LPS（其用量标准为110ul/只）。

构建双下肢远端缺血预处理组：待双下肢远端缺血预处理组的小鼠麻醉后，将小鼠双下肢用止血带捆绑并阻断血流7min后，再松开止血带恢复血流相同时间，重复此“缺血-再灌注”过程6个循环；缺血再灌注循环结束18min后，再通过腹腔对小鼠注射浓度为10mg/kg的脂多糖LPS（其用量标准为110ul/只）。

构建脓毒症急性肾损伤模型组：经与尾部远端缺血预处理组相同时长后通过腹腔对小鼠注射等浓度、等用量标准的脂多糖LPS（即，从尾部远端缺血预处理组的小鼠麻醉后，过了时间T后再注射脂多糖LPS）。

构建尾部对照组：将止血带套在小鼠尾巴上但不进行捆绑，保持小鼠尾巴的血流正常；经与尾部远端缺血预处理组相同时长后通过腹腔对小鼠注射等量的生理盐水（即，从尾部远端缺血预处理组的小鼠麻醉后，过了时间T后再注射生理盐水，且生理盐水的注射量（ul）与脂多糖LPS的注射量（ul）相同）。

构建下肢对照组：将止血带套在小鼠双下肢上但不进行捆绑，保持小鼠尾巴的血流正常；经与尾部远端缺血预处理组相同时长后通过腹腔对小鼠注射等量的生理盐水（即，从尾部远端缺血预处理组或双下肢远端缺血预处理组的小鼠麻醉后，过了时间T后再注射生理盐水，且生理盐水的注射量（ul）与脂多糖LPS的注射量（ul）相同）。

在注射脂多糖LPS时，其具体注射方法为：

左手抓取并固定小鼠，使小鼠腹部朝上，头部低于尾部，以避免内脏器官损伤；使用酒精棉球消毒小鼠腹部，将注射器刺入小鼠腹白线任一侧约0.6cm处，针头沿皮下推进5mm后，与皮肤呈46°角刺入小鼠腹腔，刺入时有落空感；若回抽针栓时无液体回流，则缓慢注射药液；待注射完毕后，旋转针头并缓慢拔出，防止液体外漏。

步骤4，采集与检测，用于模型效果评价；

在腹腔注射脂多糖LPS、生理盐水18h后，处死小鼠，同步采集小鼠的血液和肾脏组织。

采集的血液经离心处理后，取上清液并测定血清肌酐、血清尿素氮指标（根据上清液测定血清肌酐、血清尿素氮指标的具体方法，可直接适用现有技术，无需付出创造性劳动），用于评估各组的小鼠肾功能。

采集的肾脏组织分为三部分：

第一部分用于提取蛋白质与RNA，检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）、肾损伤分子-1（KIM-1）等肾小管损伤标志物，以及检测细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子的表达水平（其中，利用肾脏组织检测肾小管损伤标志物、炎症因子的表达水平的具体方法，可直接适用现有技术，无需付出创造性劳动）：

利用肾脏组织提取蛋白质时，所需的组织匀浆制备条件为：将28mg的肾脏组织置于4ml的研磨管中，加入580ul的蛋白裂解液，放入2颗4mm的不锈钢研磨钢珠及4颗3mm的不锈钢研磨钢珠，置于6℃的高速组织研磨仪中进行研磨，研磨条件为68Hz、70s，研磨4次。

利用肾脏组织提取RNA时，所需的组织匀浆制备条件为：将18mg的肾脏组织置于5ml的研磨管中，加入370ul的裂解液，放入2颗4mm的不锈钢无酶研磨钢珠及4颗3mm的不锈钢无酶研磨钢珠，置于常温的高速组织研磨仪中进行研磨，研磨条件为68Hz、70s，研磨4次。

第二部分用于制作石蜡切片，经苏木精-伊红（H&E）染色后进行肾小管损伤评分，评估肾小管病理损伤情况（其中，利用肾脏石蜡切片进行肾小管损伤评分、评估肾小管病理损伤的具体方法，可直接适用现有技术，无需付出创造性劳动）；

第三部分用于经OCT包埋制备肾脏冰冻切片，通过二氢乙锭（DHE）染色，评估肾脏活性氧（ROS）表达水平（其中，利用肾脏冰冻切片评估肾脏活性氧表达水平的具体方法，可直接适用现有技术，无需付出创造性劳动）。

步骤5，分析比对；

先将脓毒症急性肾损伤模型组与尾部对照组、下肢对照组进行比较，分析血清肌酐和血清尿素氮水平；若脓毒症急性肾损伤模型组的血清肌酐升高幅度超过2倍（即脓毒症急性肾损伤模型组的血清肌酐均大于两对照组的血清肌酐的2倍），且经统计学检验显示两组间差异具有统计学意义，则判定脓毒症急性肾损伤模型组构建成功，否则构建失败；

再将脓毒症急性肾损伤模型组分别与双下肢远端缺血预处理组、尾部远端缺血预处理组进行比较，分析两组的血清肌酐和血清尿素氮水平，验证对脓毒症急性肾损伤肾功能的改善效果；检测肾小管损伤标志物和炎症因子的RNA及蛋白表达水平是否被远端缺血预处理抑制；结合肾脏病理损伤情况、肾小管损伤评分、肾脏活性氧表达水平，判断远端缺血预处理是否可以减轻肾脏病理损伤及抑制肾脏ROS的表达水平。

采用本实施例的方法进行构建，经试验、分析，模型构建成功，且结论为：尾部远端缺血预处理、下肢缺血再灌注预处理均可以改善脓毒症急性肾损伤的肾脏病理损伤及减轻肾小管损伤，可抑制脓毒症急性肾损伤的肾脏氧化应激、减轻脓毒症急性肾损伤的炎症反应；且下肢缺血再灌注预处理与尾部缺血再灌注预处理对肾脏的保护效果相似。

试验例：

一种小鼠尾部远端缺血预处理肾脏保护模型的构建方法，包括以下步骤：

步骤1，选材并分组；

选择购置于成都集萃药康有限公司的雄性C56BL/6J、体重为25g、周龄为8周的健康小鼠36只，并随机均分为尾部对照组、下肢对照组、脓毒症急性肾损伤模型组、双下肢远端缺血预处理组和尾部远端缺血预处理组。

步骤2，诱导麻醉；

对双下肢远端缺血预处理组和尾部远端缺血预处理组两个小组的小鼠使用浓度为25%的乌拉坦（其用量标准为1.75mg/kg）经腹腔缓慢注射，使小鼠麻醉。而对于脓毒症急性肾损伤模型组、下肢对照组和尾部对照组的小鼠，则不进行麻醉处理。

步骤3，构建动物模型；

本试验例共构建了两批动物模型，每批有三组，两批共计有6各组，每个组有6只健康小鼠。两批动物模型分别为：第一批构建的动物模型有下肢对照组、脓毒症急性肾损伤模型组、双下肢远端缺血预处理组，第二批构建的动物模型有尾部对照组、脓毒症急性肾损伤模型组、尾部远端缺血预处理组。各组的构建方式分别为：

构建尾部远端缺血预处理组（附图中简述为尾部缺血组）：待尾部远端缺血预处理组的小鼠麻醉后，使用止血带捆绑小鼠尾巴，阻断血流5min，随后松开止血带恢复血流5min，重复此“缺血-再灌注”过程，共进行4个循环；缺血再灌注循环结束15min后，再通过腹腔对小鼠注射浓度为10mg/kg的脂多糖LPS（其用量标准为100ul/只）。

构建双下肢远端缺血预处理组（附图中简述为下肢缺血组）：待双下肢远端缺血预处理组的小鼠麻醉后，将小鼠双下肢用止血带捆绑并阻断血流5min后，再松开止血带恢复血流5min，重复此“缺血-再灌注”过程4个循环；缺血再灌注循环结束15min后，再通过腹腔对小鼠注射等浓度、等用量标准的脂多糖LPS。

构建脓毒症急性肾损伤模型组（附图中简述为模型组）：经与尾部远端缺血预处理组相同时长（即麻醉后55min）后通过腹腔对小鼠注射等浓度、等用量标准的脂多糖LPS。

构建尾部对照组（附图中简述为尾部对照组）：将止血带套在小鼠尾巴上但不进行捆绑，保持小鼠尾巴的血流正常；经与尾部远端缺血预处理组相同时长（即麻醉后55min）后通过腹腔对小鼠注射等量的生理盐水（即，且生理盐水的注射量（ul）与脂多糖LPS的注射量（ul）相同）。

构建下肢对照组（附图中简述为下肢对照组）：将止血带套在小鼠上下肢上但不进行捆绑，保持小鼠尾巴的血流正常；经与尾部远端缺血预处理组相同时长（即麻醉后55min）后通过腹腔对小鼠注射等量的生理盐水。

在注射脂多糖LPS时，其具体注射方法为：

左手抓取并固定小鼠，使小鼠腹部朝上，头部低于尾部，以避免内脏器官损伤；使用酒精棉球消毒小鼠腹部，将注射器刺入小鼠腹白线任一侧约0.5cm处，针头沿皮下推进3~5mm后（针头推进尺寸，以刺入时有落空感为准），与皮肤呈约45°角刺入小鼠腹腔，刺入时有落空感；若回抽针栓时无液体回流，则缓慢注射药液；待注射完毕后，旋转针头并缓慢拔出，防止液体外漏。

在构建各组时，随时关注尾部对照组、下肢对照组、双下肢远端缺血预处理组和尾部远端缺血预处理组各组中对应的小鼠尾部、小鼠双下肢的血流情况，得到如图1所示的图表。

步骤4，采集与检测，用于模型效果评价；

在腹腔注射脂多糖LPS、生理盐水16h后，处死小鼠，同步采集小鼠的血液和肾脏组织。

采集的血液经离心处理后，取上清液并测定血清肌酐、血清尿素氮指标，用于评估各组的小鼠肾功能。

采集的肾脏组织分为三部分：

第一部分用于提取蛋白质与RNA，检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）、肾损伤分子-1（KIM-1）等肾小管损伤标志物，以及检测细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子的表达水平：

利用肾脏组织提取蛋白质时，所需的组织匀浆制备条件为：将30mg左右的肾脏组织置于2ml的研磨管中，加入500ul的蛋白裂解液，放入1颗4mm的不锈钢研磨钢珠及2颗3mm的不锈钢研磨钢珠，置于4℃的高速组织研磨仪中进行研磨，研磨条件为60Hz、60s，研磨4次。

利用肾脏组织提取RNA时，所需的组织匀浆制备条件为：将20mg左右的肾脏组织置于2ml的研磨管中，加入350ul的裂解液，放入1颗4mm的不锈钢无酶研磨钢珠及2颗3mm的不锈钢无酶研磨钢珠，置于常温的高速组织研磨仪中进行研磨，研磨条件为60Hz、60s，研磨4次。

第二部分用于制作石蜡切片，经苏木精-伊红（H&E）染色后进行肾小管损伤评分，评估肾小管病理损伤情况；

第三部分用于经OCT包埋制备肾脏冰冻切片，通过二氢乙锭（DHE）染色，评估肾脏活性氧（ROS）表达水平。

步骤5，分析比对；

先将脓毒症急性肾损伤模型组分别与尾部对照组、下肢对照组进行比较，分析血清肌酐和血清尿素氮水平；若脓毒症急性肾损伤模型组的血清肌酐升高幅度超过2倍，且经统计学检验显示两组间差异具有统计学意义，则判定脓毒症急性肾损伤模型组构建成功，否则构建失败；

再将脓毒症急性肾损伤模型组分别与双下肢远端缺血预处理组、尾部远端缺血预处理组进行比较，分析、对比三组的血清肌酐和血清尿素氮水平，验证对脓毒症急性肾损伤肾功能的改善效果；检测肾小管损伤标志物和炎症因子的RNA及蛋白表达水平是否被远端缺血预处理抑制；结合肾脏病理损伤情况、肾小管损伤评分、肾脏活性氧表达水平，判断远端缺血预处理是否可以减轻肾脏病理损伤及抑制肾脏ROS的表达水平。

试验结果：

一、血液流速分析：

在构建好各组后，分别对尾部对照组与尾部远端缺血预处理组之间、下肢对照组与双下肢远端缺血预处理组之间进行血液速率对比，如图1所示，从图A、图C可以看出，通过止血带捆绑住小鼠的尾部、下肢后，小鼠的尾部、下肢未有明显的血液经过；从图B、图D中可以看出，未捆绑的小鼠的尾部、下肢血流速度较快，而捆绑后的小鼠的尾部、下肢血流速度明显降低，其血流速度约为未捆绑时血流速率的一半。

二、肾功能及肾损伤分析：

对各组的小鼠的血液、肾脏组织进行肾功能及肾损伤分析，得到图2、图3所示的图表。

对于下肢缺血再灌注的分析，如图2所示；从图B可以看出，模型组的血清肌酐超过下肢对照组的血清肌酐2倍，因此脓毒症急性肾损伤模型组构建成功；从图C可以看出，在脓毒症急性肾损伤模型组中，肾小管上皮细胞肿胀、坏死，空泡变性，肾小管管腔扩张，下肢缺血再灌注预处理明显减轻上述肾小管的病理损伤；从图D可以看出，在脓毒症急性肾损伤模型组中，肾小管损伤指标KIM-1和NGAL的mRNA表达水平明显升高，下肢缺血再灌注预处理明显下调KIM-1和NGAL的mRNA的表达水平。因此，图2证明下肢缺血再灌注预处理可以改善脓毒症急性肾损伤的肾脏病理损伤及减轻肾小管损伤。

对于尾部缺血再灌注的分析，如图3所示；从图F可以看出，模型组的血清肌酐超过尾部对照组的血清肌酐2倍，因此再一次证明脓毒症急性肾损伤模型组构建成功；从图G可以看出，在脓毒症急性肾损伤模型组中，肾小管上皮细胞肿胀、坏死，空泡变性，肾小管管腔扩张，尾部缺血再灌注预处理明显减轻上述肾脏病理损伤；从图H可以看出，在脓毒症急性肾损伤模型组中，肾小管损伤指标KIM-1和NGAL的mRNA表达水平明显升高，尾部缺血再灌注预处理明显下调KIM-1和NGAL的mRNA的表达水平。因此，图3证明尾部缺血再灌注预处理可以改善脓毒症急性肾损伤的肾脏病理损伤及减轻肾小管损伤。

三、氧化应激及炎症分析：

对各组的小鼠肾脏组织进行氧化应激及炎症分析，得到图4、图5所示的图表。

对于下肢缺血再灌注的分析，如图4所示；从图A可以看出，在脓毒症急性肾损伤模型组中，肾组织的DHE染色显示肾脏氧化水平显著升高，下肢缺血再灌注预处理明显抑制肾脏的氧化应激水平，下肢缺血再灌注预处理可抑制脓毒症急性肾损伤的肾脏氧化应激；从图B-D可以看出，在脓毒症急性肾损伤模型组中，肾组织炎症因子（IL-6、TNF-α）的mRNA和蛋白的表达水平显著升高，下肢缺血再灌注预处理明显抑制肾脏的炎症因子的表达水平。因此，图4证明下肢缺血再灌注预处理可抑制脓毒症急性肾损伤的肾脏氧化应激、减轻脓毒症急性肾损伤的炎症反应。

对于尾部缺血再灌注的分析，如图5所示；从图E可以看出，在脓毒症急性肾损伤模型组中，肾组织的DHE染色显示肾脏氧化水平显著升高，尾部缺血再灌注预处理明显抑制肾脏的氧化应激水平，证明尾部缺血再灌注预处理可抑制脓毒症急性肾损伤的肾脏氧化应激；从图F-G可以看出，在脓毒症急性肾损伤模型组中，肾组织炎症因子（IL-6、TNF-α）的mRNA和蛋白的表达水平显著升高，尾部缺血再灌注预处理明显抑制肾脏的炎症因子的表达水平。因此，图5证明尾部缺血再灌注预处理可抑制脓毒症急性肾损伤的肾脏氧化应激、减轻脓毒症急性肾损伤的炎症反应。

另外，将图4的下肢缺血组与图5的尾部缺血组进行对比分析，从肾脏氧化应激指标看，下肢缺血再灌注预处理及尾部缺血再灌注预处理均可抑制脓毒症急性肾损伤的肾脏氧化应激；从肾脏炎症层面，两组均显著低于脓毒症急性肾损伤模型组。上述数据证明，下肢缺血再灌注预处理及尾部缺血再灌注预处理均可抑制脓毒症急性肾损伤的肾脏氧化应激及炎症反应，即下肢缺血再灌注预处理与尾部缺血再灌注预处理对肾脏的保护效果相似；但是，相比于下肢缺血再灌注预处理，尾部缺血再灌注预处理对动物创伤更小、手术与护理难度更低、动物更易适应和恢复、更不易出现严重并发症，降低对实验动物的伤害；此外，尾部缺血再灌注能有效减少动物应激反应，降低动物应激反应等因素对实验结果的干扰，能更稳定、准确模拟远端缺血预处理过程，不同实验间结果差异小，提高了模型稳定性和可重复性，更利于准确评估远端缺血预处理对肾脏的保护作用。

试验结果分析：

本试验例中，通过分析下肢缺血再灌注预处理和尾部缺血预处理对肾功能（肌酐、尿素氮）、氧化应激及炎症因子的影响，研究发现尾部缺血预处理可显著降低脓毒症急性肾损伤的血清肌酐、血清尿素氮，改善肾功能，减轻脓毒症急性肾损伤的氧化应激及炎症反应，与现存的下肢缺血预处理相比，具有同等的保护效果。然而下肢缺血再灌注预处理存在一定的缺陷：一是会对动物腹/下肢造成较大创伤，不利后续生存恢复；二是易引发神经损伤，如止血带压迫或手术操作致神经缺血坏死、支配区域出现感觉异常；三是操作及术后护理要求高，增加实验难度与工作量；四是动物创伤大、状态不稳，实验稳定性和可重复性差。通过采用对动物影响更小的尾部血管模型，减少了动物应激等因素对实验结果的干扰，能更稳定、准确模拟远端缺血预处理过程，不同实验间结果差异小，提高了模型稳定性和可重复性，更利于准确评估远端缺血预处理对肾脏的保护作用。

Claims (6)

1.一种小鼠尾部远端缺血预处理肾脏保护模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，选材并分组；

选择雄性健康小鼠若干，并随机分为尾部对照组、脓毒症急性肾损伤模型组和尾部远端缺血预处理组；

步骤2，诱导麻醉；

对尾部远端缺血预处理组的小鼠使用乌拉坦经腹腔缓慢注射，使小鼠麻醉；脓毒症急性肾损伤模型组和尾部对照组的小鼠不进行麻醉处理；

步骤3，构建动物模型；

构建尾部远端缺血预处理组：待尾部远端缺血预处理组的小鼠麻醉后，使用止血带捆绑小鼠尾巴，阻断血流min后再松开止血带恢复血流min，重复此“缺血-再灌注”过程若干个循环；缺血再灌注循环结束min后，再通过腹腔注射脂多糖LPS；

构建脓毒症急性肾损伤模型组：经与尾部远端缺血预处理组相同时长后通过腹腔对小鼠注射等浓度、等用量标准的脂多糖LPS；

构建尾部对照组：将止血带套在小鼠尾巴上但不进行捆绑，保持小鼠尾巴的血流正常；经与尾部远端缺血预处理组相同时长后通过腹腔对小鼠注射等量的生理盐水。

2.如权利要求1所述的一种小鼠尾部远端缺血预处理肾脏保护模型的构建方法，其特征在于，步骤2中，注射的乌拉坦浓度为15~25%乌拉坦，且乌拉坦按照1.5~2.0mg/kg的用量标准进行注射。

3.如权利要求1所述的一种小鼠尾部远端缺血预处理肾脏保护模型的构建方法，其特征在于，步骤3中，构建尾部远端缺血预处理组时，使用止血带捆绑小鼠尾巴阻断血流4min后，再松开止血带恢复血流4min，重复此“缺血-再灌注”过程4个循环；缺血再灌注循环结束15min后，再通过腹腔注射等浓度、等用量标准的脂多糖LPS。

4.如权利要求1所述的一种小鼠尾部远端缺血预处理肾脏保护模型的构建方法，其特征在于，步骤3中还构建有双下肢远端缺血预处理组、下肢对照组；

构建双下肢远端缺血预处理组：待双下肢远端缺血预处理组的小鼠麻醉后，将小鼠双下肢用止血带捆绑并阻断血流min后，再松开止血带恢复血流min，重复此“缺血-再灌注”过程相同数量的循环；缺血再灌注循环结束min后，再通过腹腔注射脂多糖LPS；

构建下肢对照组：将止血带套在小鼠双下肢上但不进行捆绑，保持小鼠尾巴的血流正常；经与尾部远端缺血预处理组相同时长后通过腹腔对小鼠注射等量的生理盐水（即，从尾部远端缺血预处理组或双下肢远端缺血预处理组的小鼠麻醉后，过了时间T后再注射生理盐水，且生理盐水的注射量（ul）与脂多糖LPS的注射量（ul）相同）。

5.如权利要求4所述的一种小鼠尾部远端缺血预处理肾脏保护模型的构建方法，其特征在于，步骤3中，尾部远端缺血预处理组、脓毒症急性肾损伤模型组、双下肢远端缺血预处理组在通过腹腔注射脂多糖LPS时，注射的脂多糖LPS浓度为8~12mg/kg脂多糖LPS，且脂多糖LPS按照80~120ul/只的用量标准进行注射。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的构建方法构建得到的模型在小鼠尾部远端缺血预处理对肾脏保护机理研究或筛选肾病治疗/保护药物中的应用。