CN120500529A - 折叠酶用于改善分泌分子的异源表达的用途 - Google Patents

折叠酶用于改善分泌分子的异源表达的用途

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Abstract

本发明涉及一种用于增加分泌蛋白产生的地衣芽孢杆菌宿主细胞。具体地，本发明涉及一种具有遗传改性的地衣芽孢杆菌宿主，该遗传改性导致异源、非天然、分泌型酶的产生增加。具体地，本发明涉及一种地衣芽孢杆菌宿主细胞，其表达a)具有肽基‑脯氨酰顺反异构酶(EC 5.2.1.8)活性的第一多肽，所述第一多肽包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1至少81％相同的氨基酸序列，和b)具有淀粉酶活性的第二多肽，其中所述第二多肽对于所述地衣芽孢杆菌宿主细胞是异源的。

Description

折叠酶用于改善分泌分子的异源表达的用途
技术领域
本发明涉及一种用于增加分泌蛋白产生的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)宿主细胞。具体地，本发明涉及一种具有遗传改性的地衣芽孢杆菌宿主，该遗传改性导致异源、非天然、分泌型酶的产生增加。具体地，本发明涉及一种地衣芽孢杆菌宿主细胞，其表达a)具有肽基-脯氨酰顺反异构酶(EC 5.2.1.8)活性的第一多肽，所述第一多肽包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1至少81％相同的氨基酸序列，和b)具有淀粉酶活性的第二多肽，其中所述第二多肽对于所述地衣芽孢杆菌宿主细胞是异源的。
背景技术
芽孢杆菌属微生物被广泛用作用于生产有价值的化合物的工业主力，该化合物诸如化学品、聚合物和蛋白质、特别是如洗涤和/或清洁活性酶或用于进料和食品应用的酶的蛋白质。这些酶的生物技术生产是经由这种芽孢杆菌菌种的发酵和随后产物的纯化来执行。芽孢杆菌菌种能够将显著量的蛋白质分泌到发酵液中。与细胞内生产相比，这允许简单的产物纯化过程，并解释了芽孢杆菌在工业应用中的成功。因此，对芽孢杆菌细胞进行连续优化以增加这些酶的产生具有高度相关性。特别是在大规模工业生产环境中，即使很小的改进也会对生产成本产生很大影响。
细胞外蛋白质和酶由芽孢杆菌细胞分泌。蛋白质跨细胞膜转运的主要途径是一般分泌″Sec″(SecA-YEG)途径，其中未折叠的多肽链通过SecYEG转位复合物转位到细胞壁相关空间中，在那里信号肽被裂解并且多肽发生折叠。
必需的胞质外折叠酶PrsA是具有肽基-脯氨酰顺反异构酶活性的脂蛋白，其协助多肽折叠成稳定的成熟蛋白质构象。PrsA的表达受分泌应激反应的反馈调节，并且PrsA折叠酶本身是多种胞质外蛋白酶的底物(Krishnappa L，Monteferrante CG，Neef J，Dreisbach A，van Dijl JM.Degradation of extracytoplasmic cata-lysts forprotein folding in Bacillus subtilis.Appl Environ Microbiol.2014年2月；80(4)：1463-8.doi：10.1128/AEM.02799-13.电子公开于2013年12月20日.PMID：24362423；PMCID：PMC3911040.)。
已证明宿主天然的PrsA折叠酶的附加表达会改善分泌蛋白的产生，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(WO94/019471)或地衣芽孢杆菌(WO2021/146411)中的异源枯草杆菌蛋白酶、脂肪酶，尤其是淀粉酶。
WO2020/156903公开了PrsA蛋白和淀粉酶两者应来自相同的菌种，并且至少一些这样的同源组合显示枯草芽孢杆菌中淀粉酶表达的改善。这意味着PrsA折叠酶对于改善来自相同菌种的多肽的产生特别有益。
不一定给出这种同源PrsA蛋白和淀粉酶组合的鉴定。EP 1 307 547 A1公开了来自具有未知基因组序列的芽孢杆菌菌种A7-7(DSM 12368)的淀粉酶。蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)ATCC14579包含三个prsA基因(基因组登录号AE016877)，因此哪个PrsA折叠酶将是用于改善来自蜡状芽孢杆菌的淀粉酶的表达的最佳组合并不明显。
在短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SAFR-032中，一个prsA基因编码在染色体上(Genbank登录号CP000813.4，Stepanov VG，Tirumalai MR，Montazari S，Checinska A，Venkateswaran K，Fox GE.Bacillus pumilus SAFR-032Genome Revisited：SequenceUpdate and Re-Annotation.PLoS One.2016年6月28日；11(6)：e0157331.doi：10.1371/journal.pone.0157331.PMID：27351589；PMCID：PMC4924849)。
此外，淀粉酶已被工程化以满足应用相关的功能，如在较高温度下、在制剂诸如洗涤剂内、变性条件诸如pH下的改进的稳定性，或针对蛋白酶的稳定性，因此淀粉酶的序列偏离天然序列。WO2020/156903的同源PrsA-淀粉酶组合的概念也不能应用于嵌合淀粉酶，例如其中蛋白质的不同结构域衍生自不同菌种的杂合淀粉酶。
然而，用工程化多肽变体改善上述产品性能不一定伴随此类非天然蛋白质的最佳表达。
因此，仍然需要导致感兴趣的多肽，特别是淀粉酶的总体增强生产的宿主系统。
发明内容
有利地，在本发明的基础研究中发现，与对照细胞相比，表达来自短小芽孢杆菌的prsA折叠酶(SEQ ID NO：1，本文中也称为″肽基-脯氨酰顺反异构酶″)的地衣芽孢杆菌宿主细胞导致感兴趣的多肽的产生增加。具体地，显示了具有如SEQ ID NO：29、35、38、40、42、48、50、53、59或61所示的氨基酸序列的淀粉酶或其变体的表达可以通过在地衣芽孢杆菌宿主细胞中共表达来自短小芽孢杆菌的PrsA折叠酶来增加。该作用是令人惊讶的，因为短小芽孢杆菌SAFR-032，即prsA折叠酶所源自的生物体，天然不包含淀粉酶。值得注意的是，短小芽孢杆菌PrsA折叠酶的增产作用仅见于地衣芽孢杆菌细胞，而不见于枯草芽孢杆菌细胞。
因此，本发明涉及一种地衣芽孢杆菌宿主细胞，其表达
a)具有肽基-脯氨酰顺反异构酶(EC 5.2.1.8)活性的第一多肽，所述第一多肽包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1至少81％相同的氨基酸序列，和
b)具有淀粉酶活性的第二多肽，其中所述第二多肽对于所述地衣芽孢杆菌宿主细胞是异源的。
本发明还涉及一种产生具有淀粉酶活性的多肽的方法，该方法包括
a)提供本发明的地衣芽孢杆菌宿主细胞，以及
b)在允许所述具有淀粉酶活性的多肽的表达的条件下培养地衣芽孢杆菌宿主细胞，以及任选地，
c)获得或纯化所述具有淀粉酶活性的多肽。
本发明还涉及一种产生本发明的地衣芽孢杆菌宿主细胞的方法，该方法包括
a)提供地衣芽孢杆菌宿主细胞，以及
b)将以下项引入步骤a)中提供的宿主细胞
b1)编码具有肽基-脯氨酰顺反异构酶(EC 5.2.1.8)活性的第一多肽的第一多核苷酸，所述第一多肽包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1至少81％相同的氨基酸序列，和
b2)编码具有淀粉酶活性的第二多肽的第二多核苷酸。
本发明还涉及以下的用途：
i)具有肽基-脯氨酰顺反异构酶(EC 5.2.1.8)活性的第一多肽，所述第一多肽包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1至少81％相同的氨基酸序列，和/或
ii)编码所述第一多肽的多核苷酸，
用于增加地衣芽孢杆菌宿主细胞中具有α淀粉酶活性的第二多肽的产生。
此外，本发明涉及本发明的地衣芽孢杆菌宿主细胞用于产生第二多肽，诸如具有α淀粉酶活性的多肽的用途。
在本发明的宿主细胞、方法和用途的一个实施方案中，第一多肽包含与SEQ IDNO：1至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％或至少100％相同的氨基酸序列。
在本发明的宿主细胞、方法和用途的一个优选实施方案中，第二多肽具有α淀粉酶活性(EC 3.2.1.1)。
在本发明的宿主细胞、方法和用途的另一个优选实施方案中，第二多肽具有麦芽糖α-淀粉酶活性(EC 3.2.1.133)。
在本发明的宿主细胞、方法和用途的一个优选实施方案中，所述第二多肽包含与SEQ ID NO：29、35、38、40、42、48、50、53、59或61至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。
在本发明的宿主细胞、方法和用途的一个优选实施方案中，所述第二多肽包含如SEQ ID NO：29、35、38、40、42、48、50、53、59或61所示的氨基酸序列。
在本发明的宿主细胞、方法和用途的一个优选实施方案中，所述第二多肽，例如淀粉酶是分泌的。因此，第二多肽是分泌性多肽。因此，第二多肽通常包含信号肽，优选地在N末端。
在本发明的宿主细胞、方法和用途的一个优选实施方案中，宿主细胞包含：
a)所述第一多肽的第一表达盒，所述第一表达盒包含与编码所述第一多肽的第一多核苷酸可操作地连接的第一启动子，以及任选地终止子，和
b)第二多肽的第二表达盒，所述第二表达盒包含与编码所述第二多肽的第二多核苷酸可操作地连接的第二启动子，以及任选地终止子。
在本发明的宿主细胞、方法和用途的一个优选实施方案中，第一启动子和/或第二启动子是诱导剂非依赖性启动子，诸如组成型启动子，例如芽孢杆菌aprE基因的启动子，诸如地衣芽孢杆菌aprE基因的启动子。在一个实施方案中，启动子包含如SEQ ID NO：3所示的核酸序列，或与SEQ ID NO：3具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的所述启动子的变体。
在一个实施方案中，第一启动子和第二启动子都是诱导剂非依赖性启动子，诸如组成型启动子。
在本发明的宿主细胞、方法和用途的另一个优选实施方案中，第一启动子和/或第二启动子是诱导型启动子。
在本发明的宿主细胞、方法和用途的一个实施方案中，第一表达盒和/或第二表达盒存在于宿主细胞中的质粒上，或者稳定整合到宿主细胞的染色体DNA中。
通常，宿主细胞来自选自由以下项组成的组的地衣芽孢杆菌菌株：地衣芽孢杆菌菌株ATCC 14580、ATCC 31972、ATCC 53757、ATCC 53926、ATCC 55768、DSM 13、DSM 394、DSM641、DSM 1913、DSM 11259和DSM 26543。
具体实施方式
应当理解，如说明书和权利要求中使用的″一个(a或an)″可能意味着一个或多个，具体取决于其使用的上下文。因此，例如，提到″一个细胞″可能意味着可以利用至少一个细胞。
此外，应当理解，如本文所用的术语″至少一个″意指根据本发明可以使用该术语之后所提及的一个或多个项目。例如，如果该术语指示应当使用至少一种进料溶液，则这可以理解为一种进料溶液或多于一种进料溶液，即两种、三种、四种、五种或任何其他数量的进料溶液。根据该术语所指的项，技术人员理解该术语可能指的上限(如果有的话)。
如本文使用的术语″约″意指关于在所述术语后引用的任何数字，存在其中可以实现技术效果的区间准确度。因此，如本文所指的约优选地是指精确数值或围绕所述精确数值的范围±20％、优选地±15％、更优选地±10％、甚至更优选地±5％。
如本文使用的术语″包括″不应被理解为限制性的。该术语而是表示可能不止存在所指的实际项，例如，如果该术语是指包括某些步骤的方法，则不应排除存在另外的步骤。然而，术语″包括″还涵盖仅存在所指的项的实施方案，即该术语仅具有″由……组成″的限制性含义。
术语″多核苷酸″、″核酸序列″、″核苷酸序列″、″核酸″、″核酸分子″在本文中可互换使用并且是指任何长度的聚合直链形式的核苷酸、通常是脱氧核苷酸。术语″多肽″和″蛋白质”在本文中可互换使用并且是指任何长度的聚合形式的通过肽键连接在一起的氨基酸。
术语″对……进行编码″和″编码″在本文中可互换使用。通常，该术语是指多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中的特定核苷酸序列充当用于合成其它大分子(诸如所定义的氨基酸序列)的模板的特性。因此，如果与基因相对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因对蛋白质进行编码。
根据本发明，如本文别处定义的第一多肽和第二多肽以及它们的变体应在宿主细胞中表达。
亲本分子的变体可以具有与具有酶活性的相应亲本酶的氨基酸序列至少n百分比相同的氨基酸序列，其中与全长多肽序列相比，n是50与100之间的整数，优选地是50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99。当与亲本酶进行比较时，本文所述的n百分比相同的变体酶具有酶活性。
在一些实施方案中，亲本多肽的变体包含与亲本多肽的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％，但低于100％相同的氨基酸序列。
因此，变体可以由与亲本酶相比时它们的序列同一性来定义。序列同一性通常以″序列同一性％″或″同一性％″提供。为了确定第一步中两个氨基酸序列之间的百分比同一性，在这两个序列之间生成成对序列比对，其中这两个序列在其全长上进行比对(即，成对全局比对)。这种比对是通过实施Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.(1979)48，第443-453页)的程序生成的，优选地通过使用具有程序默认参数(空位开放＝10.0，空位延伸＝0.5以及矩阵＝EBLOSUM62)的程序″NEEDLE″(欧洲分子生物学开放软件套件(EMBOSS))。出于本发明的目的，优选的比对是可以从其确定最高序列同一性的比对。
在比对两个序列后，在第二步中，应根据比对确定同一性值。因此，根据本发明，以下百分比同一性的计算适用：
同一性％＝(相同残基/在其全长上显示本发明的相应序列的比对区域的长度)*100。因此，通过将相同残基的数量除以在其完整长度上显示本发明的相应序列的比对区域的长度来计算与根据此实施例的两个氨基酸序列的比较相关的序列同一性。将此值乘以100，以得到″同一性％″。
为了计算两个DNA序列的百分比同一性，同样适用于计算具有一些规格的两个氨基酸序列的百分比同一性。对于编码蛋白质的DNA序列，成对比对应该在编码区的完整长度上从起始密码子到终止密码子(不包括内含子)进行。对于非蛋白质编码DNA序列，成对比对应该在本发明序列的完整长度上进行，因此将本发明的全序列与另一个序列或另一个序列之外的区域进行比较。此外，实施Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.(1979)48，第443-453页)的优选比对程序是具有程序默认参数(空位开放＝10.0，空位延伸＝0.5以及矩阵＝EDNAFULL)的″NEEDLE″(欧洲分子生物学开放软件套件(EMBOSS))。
变体多肽也可以由它们与另一序列相比时的序列相似性来定义。序列相似性通常以″序列相似性％″或″相似性％″提供。为了在第一步中计算序列相似性，必须如上所述产生序列比对。在第二步中，必须计算百分比相似性，而百分比序列相似性考虑到定义的氨基酸组共享相似性质，例如，通过它们的大小、通过它们的疏水性、通过它们的电荷或通过其它特征。在本文中，一个氨基酸被类似的氨基酸交换被称为″保守突变″。包含保守突变的酶变体似乎对蛋白质折叠具有最小的影响，导致与亲本酶的酶特性相比，某些酶特性基本上得以维持。
对于根据本发明的相似性％的测定，以下适用，其也符合BLOSUM62矩阵，该矩阵是用于数据库搜索和序列比对的最常用的氨基酸相似性矩阵之一：
氨基酸A类似于氨基酸S
氨基酸D类似于氨基酸E；N
氨基酸E类似于氨基酸D；K；Q
氨基酸F类似于氨基酸W；Y
氨基酸H类似于氨基酸N；Y
氨基酸I类似于氨基酸L；M；V
氨基酸K类似于氨基酸E；Q；R
氨基酸L类似于氨基酸I；M；V
氨基酸M类似于氨基酸I；L；V
氨基酸N类似于氨基酸D；H；S
氨基酸Q类似于氨基酸E；K；R
氨基酸R类似于氨基酸K；Q
氨基酸S类似于氨基酸A；N；T
氨基酸T类似于氨基酸S
氨基酸V类似于氨基酸I；L；M
氨基酸W类似于氨基酸F；Y
氨基酸Y类似于氨基酸F；H；W。
保守氨基酸取代可以发生在功能蛋白质(诸如酶)的多肽序列的全长序列上。在一个实施方案中，此类突变不属于酶的功能结构域。在另一个实施方案中，保守突变不属于酶的催化中心。
因此，以下百分比相似性的计算适用：
相似性％＝[(相同残基+相似残基)/在其全长上显示本发明的相应序列的比对区域的长度]*100。因此，通过将相同残基的数量加上相似残基的数量除以在其全长上显示本发明的相应序列的比对区域的长度来计算与本文两个氨基酸序列的比较相关的序列相似性。将该值乘以100，以得到″相似性％″。
特别地，与全长多肽序列相比，包含与相应亲本序列具有至少m百分比相似性的保守突变的变体酶预期具有基本上未改变的酶特性，其中m为50至100，优选50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99的整数。
亲本多肽的变体可以具有亲本酶的活性或功能。因此，淀粉酶的变体应具有淀粉酶活性，通常在相同的EC类别中。因此，当与亲本酶进行比较时，本文所述的具有m百分比相似性的变体酶具有酶活性。
″变体″酶与″亲本″酶的不同之处在于某些氨基酸改变，优选在一个或多个氨基酸位置处的氨基酸取代。
在描述多肽变体时，根据公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写使用单氨基酸的缩写。
如本文所用的″氨基酸改变″是指氨基酸取代、缺失或插入。
通过提供原始氨基酸，之后提供氨基酸序列内的位置编号，之后提供取代原始氨基酸的氨基酸来描述″取代″。举例来说，将位置120处的组氨酸用丙氨酸取代称为″His120Ala″或″H1 20A″。取代也可以通过仅命名变体中的所得氨基酸而不指定该位置处的亲本的氨基酸来描述，例如″X120A″或″120A″或″Xaa120Ala″或″120Ala″。
通过提供原始氨基酸，之后提供氨基酸序列内的位置编号，之后提供*来描述″缺失″。因此，在位置150处的甘氨酸缺失被命名为″Gly150*″或″G150*″。另选地，缺失由例如″D183和G184的缺失″指示。
通过提供原始氨基酸，之后提供氨基酸序列内的位置编号，之后提供原始氨基酸和附加的氨基酸来描述″插入″。例如，在位置180处紧邻甘氨酸的赖氨酸的插入被命名为″Gly180GlyLys″或″G180GK″。当插入多于一个氨基酸残基时，诸如例如在Gly180之后插入Lys和Ala时，这可以表示为：″Gly180GlyLysAla″或″G195GKA″。
在取代和插入发生在相同位置的情况下，这可以表示为″S99SD+S99A″或简称为″S99AD″。包含多个改变的变体由″+″分隔，例如″Arg170Tyr+Gly195Glu″、″R170Y+G195E″或″X170Y+X195E″分别表示在位置170和195处的精氨酸和甘氨酸被酪氨酸和谷氨酸取代。另选地，多个改变可以由空格或逗号分开，例如分别为″R170Y G195E″或″R170Y，G195E″。当可以在一个位置引入不同的替代改变时，不同的改变由逗号分开，例如″Arg1 70Tyr，Glu″和″R170T，E″分别表示在位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。特定位置处的替代取代也可以表示为″X120A，G，H″、″120A，G，H″、″X120A/G/H″或″120A/G/H″。另选地，不同的改变或任选的取代可以在括号中指示，例如″Arg170[Tyr，Gly]″或″Arg170{Tyr，Gly}″或简称为″R170[Y，G]″或″R170{Y，G}″。
宿主细胞
本发明的地衣芽孢杆菌宿主细胞包含
a)如本文别处定义的具有肽基-脯氨酰顺反异构酶(EC 5.2.1.8)活性的第一多肽，和
b)与所述地衣芽孢杆菌宿主细胞异源的第二多肽，例如淀粉酶。
因此，本发明的地衣芽孢杆菌宿主细胞优选地包含
a)编码具有肽基-脯氨酰顺反异构酶(EC 5.2.1.8)活性的第一多肽的第一多核苷酸，和
b)编码与所述地衣芽孢杆菌宿主细胞异源的第二多肽例如淀粉酶的第二多核苷酸。
优选地，第一和第二多核苷酸由表达盒包含。因此，本发明的地衣芽孢杆菌宿主细胞包含
a)所述第一多肽的第一表达盒，所述第一表达盒包含与编码所述第一多肽的第一多核苷酸可操作地连接的第一启动子，以及任选地终止子，和
b)所述第二多肽的第二表达盒，所述第二表达盒包含与编码所述第二多肽的第二多核苷酸可操作地连接的第二启动子，以及任选地终止子。
根据本发明的术语″宿主细胞″是地衣芽孢杆菌宿主细胞。优选地，地衣芽孢杆菌宿主细胞属于地衣芽孢杆菌菌株ATCC 14580，ATCC 31972，ATCC 53757、ATCC 53926、ATCC55768、DSM 13、DSM 394、DSM 641、DSM 1913、DSM 11259或DSM 26543。在一个实施方案中，宿主细胞属于地衣芽孢杆菌菌株，诸如以美国典型培养物保藏号ATCC14580保藏的地衣芽孢杆菌菌株的宿主细胞(与DSM1 3相同，参见Veith等人.″Thecomplete genome sequenceof Bacillus licheniformis DSM13，an organism with great industrial potential.″J.Mol.Microbiol.Biotechnol.(2004)7：204-211)。另选地，宿主细胞是地衣芽孢杆菌菌株ATCC31972的宿主细胞。另选地，宿主细胞是地衣芽孢杆菌菌株ATCC53757的宿主细胞。另选地，宿主细胞是地衣芽孢杆菌菌株ATCC53926的宿主细胞。另选地，宿主细胞是地衣芽孢杆菌菌株ATCC55768的宿主细胞。另选地，宿主细胞是地衣芽孢杆菌菌株DSM394的宿主细胞。另选地，宿主细胞是地衣芽孢杆菌菌株DSM641的宿主细胞。另选地，宿主细胞是地衣芽孢杆菌菌株DSM1913的宿主细胞。另选地，宿主细胞是地衣芽孢杆菌菌株DSM11259的宿主细胞。另选地，宿主细胞是地衣芽孢杆菌菌株DSM26543的宿主细胞。
此外，设想如本文所述的改性的宿主细胞不产生聚-γ-谷氨酸(pga)或产生减少量的pga。因此，至少一个涉及聚-γ-谷氨酸(pga)产生的基因已经失活(诸如缺失)。优选地，至少一个涉及聚-γ-谷氨酸(pga)的基因是选自ywsC(pgsB)、ywtA(pgsC)、ywtB(pgsA)和ywtC(pgsE)的至少一个基因。优选地，所有前述基因，即ywsC(pgsB)、ywtA(pgsC)、ywtB(pgsA)和ywtC(pgsE)已经失活(诸如缺失)。
此外，设想改性的宿主细胞不能形成孢子。这可以通过使参与孢子形成的至少一个基因失活(诸如缺失)来实现。涉及芽孢形成的基因是本领域众所周知的(EP 1391502)，包括但不限于sigE、sigF、spoIIGA、spoIIE、sigG、spoIVCB、yqfD。在一个优选的实施方案中，sigF基因缺失。
此外，设想改性的宿主细胞的蛋白水解活性降低(与对照细胞相比)。这可以通过使至少一种蛋白酶编码基因失活(诸如缺失)来实现，该至少一种蛋白酶编码基因包括但不限于aprE、mpr、bpr、vpr、epr、wprA、ispA、aprX。优选地，aprE和mpr基因缺失，最优选地aprE基因缺失。
此外，设想改性的宿主细胞的糖苷酶活性降低。这可以通过使至少一种编码糖苷酶的基因失活(诸如缺失)来实现，这些糖苷酶包括但不限于α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β淀粉酶(EC 3.2.1.2)和葡聚糖1，4-α-麦芽糖水解酶(EC 3.2.1.133))、纤维素酶(EC 3.2.1.4)、内切-1,3-β-木聚糖酶木聚糖酶(EC 3.2.1.32)、内切-1,4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、乳糖酶(EC 3.2.1.108)、半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23和EC 3.2.1.24)、甘露聚糖酶(EC 3.2.1.24和EC 3.2.1.25)。
在一个优选的实施方案中，编码内源α-淀粉酶多肽(如SEQ ID NO：35所示)的基因缺失。
第一多肽(肽基-脯氨酰顺反异构酶)
如本文所指的第一多肽具有肽基-脯氨酰顺反异构酶活性(EC 5.2.1.8)。因此，第一多肽是肽基-脯氨酰顺反异构酶(通常也称为″折叠酶″、″肽基脯氨酰异构酶″、″肽键异构酶″或″PPIase″)。术语″折叠酶″、″肽基-脯氨酰顺反异构酶″和″PrsA″在本文中可互换使用。
如本文所用，术语″肽基-脯氨酰顺反异构酶″是指与氨基酸脯氨酸相互转化肽键的顺式和反式异构体的酶。因此，它使蛋白质内的肽基-脯氨酰键的顺式和反式异构体相互转化。在芽孢杆菌中，肽基-脯氨酰顺反异构酶是膜结合脂蛋白，这些膜结合脂蛋白被认为协助分泌蛋白的易位后折叠并将它们稳定在细胞质膜与细胞壁之间的区室中。
通常，酶的活性形式是两个单体的二聚体，即由第一多肽的两个单体形成的二聚体。因此，本领域技术人员应当理解，二聚体具有肽基-脯氨酰顺反异构酶活性。通常，肽基-脯氨酰顺反异构酶具有两个结构域，肽基-脯氨酰顺反异构酶(EC 5.2.1.8)结构域和支持蛋白质折叠的分子伴侣结构域。
根据本发明，第一多肽是来自短小芽孢杆菌或其变体的PrsA蛋白(SEQ ID NO：1)。优选地，所述第一多肽包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1至少81％相同的氨基酸序列。更优选地，第一多肽包含与SEQ ID NO：1至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。此外，第一多肽可以包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或由其组成。
此外，第一多肽(即由所述第一多肽的两个单体形成的二聚体)优选地具有肽基-脯氨酰顺反异构酶活性。多肽是否具有该活性可以通过众所周知的测定来评估，例如通过如Jakob等人，2009(Proc Natl Acad Sci U S A.2009年12月1日；106(48)：20282-7.doi：10.1073/pnas.0909544106.电子公开于2009年11月17日.PMID：19920179；PMCID：PMC2787138)和Jakob.2014(J Biol Chem.2015年2月6日；290(6)：3278-92.doi：10.1074/jbc.M114.622910.电子公开于2014年12月17日.PMID：25525259；PMCID：PMC4319002)中所述的测定来评估。
还优选地，第一多肽能够被转运并结合到宿主细胞的细胞膜上。因此，第一多肽包含合适的信号肽，诸如天然酶的信号肽。
因此，第一多肽与宿主细胞的细胞膜结合，即它作为膜结合多肽存在于宿主细胞中。
在一个实施方案中，多肽变体具有亲本多肽(即具有如SEQ ID NO：2所示的序列的多肽)的至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或98％肽基-脯氨酰顺反异构酶活性。
根据本发明，第一多肽协助在宿主中与第一多肽共表达的第二多肽(例如淀粉酶)的折叠。
在本发明的一个实施方案中，宿主细胞表达内源性PrsA多肽，即地衣芽孢杆菌PrsA多肽。地衣芽孢杆菌PrsA多肽的氨基酸序列在SED ID NO：12中示出。
在本发明的一个替代实施方案中，宿主细胞不表达内源性PrsA多肽。因此，内源性prsA基因被删除。内源性prsA基因的氨基酸序列在SED ID NO：13中示出。
第二多肽(″感兴趣的多肽″)
第二多肽在本文中也称为″感兴趣的多肽″。这些术语在本文中可互换使用。
优选地，第二多肽是淀粉酶，即具有淀粉酶活性的多肽。淀粉酶可以是天然存在的淀粉酶或非天然存在的淀粉酶。
如本文所用的术语″淀粉酶″通常是指具有″淀粉分解活性″或″淀粉酶活性″的酶。″淀粉分解活性″或″淀粉酶活性″描述了多糖中糖苷键水解的能力。淀粉酶活性可以通过本领域技术人员已知的用于测量淀粉酶活性的测定来确定。测量淀粉酶活性的测定的示例是Phadebas测定或EPS测定(″Infinity试剂″)。在Phadebas测定中，淀粉酶活性通过使用Phadebas片剂作为底物来测定(Phadebas淀粉酶测试，由Magle Life Science提供)。淀粉被淀粉酶水解，产生可溶性蓝色片段。在620nm处用分光光度法测量的所得蓝色溶液的吸光度是淀粉酶活性的函数。测量的吸光度与在给定的条件下所考虑的淀粉酶的比活性(活性/mg纯淀粉酶蛋白质)成正比。
另选地，淀粉酶活性也可以通过使用亚乙基-4-硝基苯基-α-D-麦芽七糖苷(EPS)的方法来测定。D-麦芽七糖苷是一种封闭的寡糖，其可以被内切淀粉酶裂解。裂解后，试剂盒中包含的α-葡糖苷酶消化底物以释放游离的PNP分子，其具有黄色，因此可以通过405nm处的可见分光光度法测量。含有EPS底物和α-葡糖苷酶的试剂盒例如由Roche CostumBiotech(目录号10880078103)制造。时间依赖性吸收曲线的斜率与在给定的条件下所考虑的淀粉酶的比活性(每mg酶的活性)成正比。
通常，如本文所指的淀粉酶是α淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β淀粉酶(EC3.2.1.2)或麦芽糖α淀粉酶(EC 3.2.1.133)。
在一个优选的实施方案中，淀粉酶是α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)。α-淀粉酶是催化含有三个或更多个(1→4)-α-连接的D-葡萄糖单元的多糖中的(1→4)-α-D-糖苷键的内切水解的酶。该酶以随机方式作用于例如淀粉或糖原；释放α-构型中的还原基团，即释放的游离糖基的初始异头构型。其它名称是糖原酶、内切淀粉酶、4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶和1，4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶。系统名称是″4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶″。例如，具有分别如SEQ IDNO：29、35、38、40、42、48、50、59和61所示的氨基酸序列的多肽具有α-淀粉酶活性(EC3.2.1.1)。这些淀粉酶的变体也应具有α-淀粉酶活性。
在另一个优选的实施方案中，淀粉酶是β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)。β-淀粉酶是催化多糖中的(1->4)-α-D-糖苷键的水解以便从链的非还原端去除连续的麦芽糖单元的酶。该酶通过转化作用于例如淀粉或糖原，从而产生β-麦芽糖。其它名称是糖原淀粉酶、糖原酶、β淀粉酶或1，4-α-D-葡聚糖麦芽糖水解酶。系统名称是″1，4-α-D-葡聚糖麦芽糖水解酶″。
在另一个优选的实施方案中，淀粉酶是麦芽糖α-淀粉酶(EC3.2.1.133)。麦芽糖α-淀粉酶(本文中也称为″葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶″)是催化多糖中的(1→4)-α-D-糖苷键的水解以便从链的非还原端去除连续的α-麦芽糖残基的酶。该酶作用于例如淀粉和相关的多糖和寡糖。产物是α-麦芽糖。其它名称是葡聚糖1，4-α-麦芽糖水解酶或1，4-α-D-葡聚糖α-麦芽糖水解酶。系统名称是″1，4-α-D-葡聚糖α-麦芽糖水解酶″。例如，具有如SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列的多肽具有麦芽糖α-淀粉酶活性(EC 3.2.1.133)。该淀粉酶的变体也应具有麦芽糖α-淀粉酶活性。
在一个优选的实施方案中，如本文所指的淀粉酶包含与如SEQ ID NO：29、35、38、40、42、48、50、53、59或61所示的氨基酸序列至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
例如，如本文所指的淀粉酶包含与如SEQ ID NO：29、35、38、40、42、48、50、53、59或61所示的氨基酸序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
例如，如本文所指的淀粉酶包含如SEQ ID NO：29、35、38、40、42、48、50、53、59或61所示的氨基酸序列。
在一个实施方案中，如本文所指的淀粉酶包含与SEQ ID NO：29至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，如本文所指的淀粉酶包含与SEQ ID NO：35至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述淀粉酶与SEQ ID NO：35具有小于99％的序列同一性，诸如小于98％或小于97％的序列同一性。
在另一个实施方案中，如本文所指的淀粉酶包含与SEQ ID NO：38至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，如本文所指的淀粉酶包含与SEQ ID NO：40至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，如本文所指的淀粉酶包含与SEQ ID NO：42至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，如本文所指的淀粉酶包含与SEQ ID NO：48至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，如本文所指的淀粉酶包含与SEQ ID NO：50至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，如本文所指的淀粉酶包含与SEQ ID NO：59至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，如本文所指的淀粉酶包含与SEQ ID NO：61至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，如本文所指的淀粉酶包含与SEQ ID NO：53至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。
如上所述，淀粉酶可以包含如SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列(或是其变体)。具有SEQ ID NO：35的淀粉酶是来自地衣芽孢杆菌的淀粉酶。该淀粉酶已如WO 95/10603中所述进行了描述(如SEQ ID NO：2)。可以用于本发明的上下文中的合适变体描述于WO 95/10603中，这些变体包含在以下位置中的一个或多个取代：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408和444，这些变体具有淀粉分解活性。变体描述于WO 94/02597、WO 94/018314、WO 97/043424和WO 99/019467的SEQ ID NO：4中。
如上所述，淀粉酶可以包含如SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列(或是其变体)。具有SEQ ID NO：59的淀粉酶是来自盐敏芽孢杆菌(Bacillus halmapalus)的淀粉酶，也称为″SP-722淀粉酶″。在WO 96/23872中，该淀粉酶也被描述为SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：7。可以用于本发明的上下文中的优选变体描述于WO 97/3296、WO 99/194671和WO 2013/001078中。
如上所述，淀粉酶可以包含如SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列(或是其变体)。具有SEQ ID NO：38的淀粉酶是来自芽孢杆菌菌种A 7-7(DSM 12368)的淀粉酶。在一个实施方案中，淀粉酶包含与SEQ ID NO：2至少95％相同的氨基酸序列，特别是在根据如WO 02/10356中所公开的SEQ ID NO：2的氨基酸32至516的区域上。如WO 02/10356中所公开的SEQID NO：2与本发明的SEQ ID NO：38相同。
如上所述，淀粉酶可以包含如SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列(或是其变体)。具有SEQ ID NO：48的淀粉酶是来自芽孢杆菌菌株TS-23的淀粉酶，其具有本发明的SEQ IDNO：48或具有如WO 2009/061380中所公开的SEQ ID NO：2及其变体。
如上所述，淀粉酶可以包含如SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列(或是其变体)。具有SEQ ID NO：40的淀粉酶(有时也称为″染色酶″)是来自芽孢杆菌菌种的淀粉酶，其具有本发明的SEQ ID NO：40或包含如WO 00/60060中所述的SEQ ID NO：2及与其至少95％的变体的氨基酸1至485。
在本发明的一个优选实施方案中，淀粉酶是杂合淀粉酶。
如上所述，淀粉酶可以是如WO 2006/066594中所述的杂合淀粉酶。例如，杂合淀粉酶可以包含如SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列(或是其变体)，或者可以根据WO 2014/183920，其中A和B结构域与WO 2014/183920的SEQ ID NO：2具有至少90％同一性，并且C结构域与WO 2014/183920的SEQ ID NO：6具有至少90％同一性，其中杂合淀粉酶具有淀粉分解活性；优选地，杂合α-淀粉酶与WO 2014/183920的SEQ ID NO：23至少95％相同，并且具有淀粉分解活性。本发明的SEQ ID NO：61与WO 2014/183920的SEQ ID NO：2399.4％相同。
杂合淀粉酶可以根据WO 2014/183921，其中A和B结构域与如WO 2014/183921中所公开的SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：39具有至少75％同一性，并且C结构域与WO 2014/183921的SEQ ID NO：6具有至少90％同一性，其中杂合淀粉酶具有淀粉分解活性；优选地，杂合α-淀粉酶包含与WO 2014/183921的SEQ ID NO：6至少95相同的氨基酸序列。
如上所述，淀粉酶可以是如WO 2021/032881(以引用的方式并入本文)中所公开的杂合淀粉酶，所述淀粉酶包含源自芽孢杆菌菌种A 7-7(DSM 12368)的α淀粉酶的A和B结构域和源自蜡样芽孢杆菌的α-淀粉酶的C结构域；优选地，A和B结构域与SEQ ID NO：42的氨基酸序列至少75％相同，并且C结构域与SEQ ID NO：44的氨基酸序列至少75％相同，两个序列均如WO 2021/032881中所公开；更优选地，杂合淀粉酶与如WO 2021/032881中所公开的SEQID NO：54至少80％相同。WO 2021/032881的SEQ ID NO：54对应于本申请的SEQ ID NO：29。
根据本发明，淀粉酶优选是具有如SEQ ID NO：29所示的序列的淀粉酶的变体，例如命名为Amy031或Amy033的淀粉酶(参见实施例部分)。
在一个优选的实施方案中，淀粉酶变体与包含如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的淀粉酶相比具有以下取代(通常使用SEQ ID NO：30的编号)：G4Q、N25H、R176K、G186E、T251E、L405M和Y482W。
在另一个优选的实施方案中，淀粉酶变体与包含如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的淀粉酶相比具有以下取代(通常使用SEQ ID NO：30的编号)：N25H、W116K、R176K、R181T、G1 86E、N195F、T225A、R320K和Y482W。
如上所述，如本文所指的亲本淀粉酶(即SEQ ID NO：29、35、38、40、42、48、50、53、59或61)的变体应具有淀粉酶活性。此外，设想与由表达第一多肽和亲本淀粉酶的对照细胞产生变体相比，由本发明的宿主细胞产生变体增加。因此，与亲本淀粉酶的产生相比，变体淀粉酶的产生应增加。
根据本发明使用的淀粉酶不限于上述淀粉酶。
在本发明的一些实施方案中，淀粉酶是来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)的淀粉酶，其包含如WO 02/10355中所公开的SEQ ID NO：6的氨基酸序列，或任选地具有超过野生型序列的C末端截短的淀粉酶。SEQ ID NO：6的合适变体包括在位置179和/或181和/或182中包含缺失和/或在位置193中包含取代的那些。
在本发明的一些实施方案中，淀粉酶是来自芽孢杆菌菌种707的淀粉酶，其包含如WO 99/19467中所公开的SEQ ID NO：6和与其至少95％的变体的氨基酸序列。SEQ NO：6的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216和K269。
在本发明的一些实施方案中，淀粉酶是来自芽孢杆菌菌种DSM 12649的淀粉酶，其具有如WO 00/22103中所公开的SEQ ID NO：4和与其至少95％的变体。
在本发明的一些实施方案中，淀粉酶是来自具有如WO 2010/104675中所公开的SEQ ID NO：1和与其至少95％的变体的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)DSM 90的淀粉酶。
在本发明的一些实施方案中，淀粉酶是来自解淀粉芽孢杆菌的淀粉酶或其变体，优选地选自如WO 2016/092009中所述的根据SEQ ID NO：3的淀粉酶。
在本发明的一些实施方案中，淀粉酶包含如WO 2006/002643中所述的如SEQ IDNO：12所示的氨基酸序列或其在所述SEQ ID NO：12内包含取代Y295F和M202LITV的淀粉酶变体。
在本发明的一些实施方案中，淀粉酶包含如WO 2011/098531中所述的如SEQ IDNO：6所示的氨基酸序列或淀粉酶变体，这些淀粉酶变体在所述SEQ ID NO：6内包含在一个或多个选自由以下项组成的组的位置处的取代：193[G，A，S，T或M]、195[F，W，Y，L，I或V]、197[F，W，Y，L，I或V]、198[Q或N]、200[F，W，Y，L，I或V]、203[F，W，Y，L，I或V]、206[F，W，Y，N，L，I，V，H，Q，D或E]、210[F，W，Y，L，I或V]、212[F，W，Y，L，I或V]、213[G，A，S，T或M]和243[F，W，Y，L，I或V]。
淀粉酶可以具有如WO 2013/001078中所述的SEQ ID NO：1，或在对应于所述SEQID NO：1内的位置G304、W140、W189、D 134、E260、F262、W284、W347、W439、W469、G476和G477的两个或更多个(若干个)位置处包含改变的淀粉酶变体。
在本发明的一些实施方案中，淀粉酶包含如WO 2013/001087中所述的如SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列或包含所述SEQ ID NO：2内的位置181+182或182+183或183+184的缺失的淀粉酶变体，任选地包含在对应于所述SEQ ID NO：2内的W140、W159、W167、Q169、W189、E194、N260、F262、W284、F289、G304、G305、R320、W347、W439、W469、G476和G477的任何位置中的一个或两个或更多个改性。
在本发明的一个优选实施方案中，淀粉酶是可商购获得的淀粉酶，其包括但不限于以商品名DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM、StainzymeTM、Stainzyme PlusTM、NatalaseTM、Liquozyme X and BANTM、AmpliftTM、Amplify PrimeTM(来自Novozymes A/S)和RapidaseTM、PurastarTM、PoweraseTM、EffectenzTM(来自DuPont的M100)、PreferenzTM(S1000DuPont)、PrimaGreenTM(ALL；DuPont)、OptisizeTM(DuPont)出售的产品。
本发明不限于淀粉酶作为感兴趣的多肽。在一些实施方案中，感兴趣的多肽(即第二多肽)是除淀粉酶以外的酶，诸如胞外酶(除淀粉酶以外)。在一个具体的实施方案中，酶被分类为氧化还原酶(EC 1)、转移酶(EC 2)、水解酶(EC 3)、裂解酶(EC 4)、异构酶(EC 5)或连接酶(EC 6)。在一个优选的实施方案中，感兴趣的蛋白质是适用于洗涤剂、进料和食品应用中的酶。
更优选地，酶是水解酶(EC 3)，优选糖苷酶(EC 3.2)或肽酶(EC3.4)。尤其优选的酶是选自由以下项组成的组的酶：淀粉酶、纤维素酶(EC 3.2.1.4)、内切-1，3-β-木聚糖酶木聚糖酶(EC 3.2.1.32)、内切-1，4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、乳糖酶(EC 3.2.1.108)、半乳糖苷酶(EC3.2.1.23和EC 3.2.1.24)、甘露聚糖酶(EC 3.2.1.24和EC 3.2.1.25)、脂肪酶(EC 3.1.1.3)、植酸酶(EC 3.1.3.8)、核酸酶(EC 3.1.11至EC 3.1.31)和蛋白酶(EC 3.4)；特别是选自由淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、植酸酶、木聚糖酶、磷酸酶、β-半乳糖苷酶、乳糖酶、葡糖淀粉酶、核酸酶和纤维素酶组成的组的酶，优选淀粉酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶或蛋白酶，优选蛋白酶。
在一些实施方案中，第二多肽是木聚糖酶。
在一些实施方案中，第二多肽是甘露聚糖酶。
信号肽-感兴趣的多肽的分泌信号
如本文所指的感兴趣的多肽，诸如淀粉酶多肽是分泌的，即它由本发明的地衣芽孢杆菌宿主细胞分泌。因此，感兴趣的多肽，优选淀粉酶，通常在N末端包含分泌信号，即允许多肽从宿主细胞分泌到发酵液中的信号肽。通常，信号肽是Sec分泌途径特异性信号肽。因此，感兴趣的多肽经由Sec途径分泌。通常，信号肽存在于目标多肽的N末端。
术语″信号肽″、″分泌序列″、″分泌信号肽″在本文中可互换使用。
信号肽在本领域是众所周知的，并且通常可以在分泌芽孢杆菌蛋白的N末端(诸如AmyB、AmyE、AmyL AmyM、AmyQ、AmyS、AprE、AprH、AspB、BglC、BglS、Bpr、CelA、CelA、Csn、Epr、ForD、GGT、LacZ、LipA、LytB、LytD、Pel、PhoD、PhrK、Vpr、YbdN、YckD、YddT、YfhK、YfjS、YhfM、YjfA、YkwD、YncM、YnfF、YobB、YvcE或YvfO多肽)处被发现。
本发明还涵盖可以通过替换氨基酸或产生嵌合序列来工程化信号肽序列以优化感兴趣的多肽(EP2689015B1)的分泌。
信号肽还可以选自包含Sec分泌途径和TAT分泌途径序列元件的信号肽(Freudl，R.Signal peptides for recombinant protein secretion in bacterial expressionsystems.Microb Cell Fact 17，52(2018))，诸如但不限于WprA、WapA、SpoIIP或YwbN多肽的信号肽。
示例性信号肽如下表A所示。在一个优选的实施方案中，多肽在N末端包含如表A中所示的信号肽。因此，信号肽优选地包含选自SEQ ID NO：67至109的氨基酸序列或由其组成。
表A：来自各种芽孢杆菌多肽的示例性信号肽
*用于实施例部分
在一个实施方案中，信号肽包含如SEQ ID NO：69、73或107所示的氨基酸序列或由其组成。
如上所述，优选地，多肽携带功能性信号肽。
肽是否充当分泌信号肽，可以通过生物信息学方法使用SignalP信号肽预测工具来评估(Almagro Armenteros JJ，Nielsen H.；SignalP 5.0 improves signal peptidepredictions using deep neural networks.Nat Biotechnol.2019年4月；37(4)：420-423)；或者通过测量给定多肽与潜在分泌信号肽融合时的分泌能力，如先前所示(Brockmeier U，Eggert T.Systematic screening of all signal peptides fromBacillus subtilis：a powerful strategy in optimizing heterologous proteinsecretion in Gram-positive bacteria.J Mol Biol.2006年9月22日；362(3)：393-402)。
表达构建体
本发明的宿主细胞优选包含编码第一多肽的多核苷酸和编码第二多肽的多核苷酸。因此，宿主细胞优选包含
a)所述第一多肽的第一表达盒，所述第一表达盒包含与编码所述第一多肽的第一多核苷酸可操作地连接的启动子，以及任选地终止子，和
b)表达所述第二多肽的第二表达盒，所述第二表达盒包含与编码所述第二多肽的第二多核苷酸可操作地连接的启动子，以及任选地终止子。
优选地，两种多核苷酸，即编码第一多肽的多核苷酸和编码第二多肽的多核苷酸，编码至少一种感兴趣的多肽的多核苷酸对于宿主细胞是异源的。术语″异源″(或外源或外来或重组或非天然的)通常是指对于宿主细胞来说不是天然的多核苷酸。在一些实施方案中，″异源″多核苷酸是天然存在于宿主中的基因的附加的拷贝。如在整个说明书中使用的术语″异源的″(或外源性的或外来的或重组的或非天然的)多肽或蛋白质在本文中被定义为对于宿主细胞来说不是天然的多肽或蛋白质。
在一个优选的实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸，以及因此第一表达盒和第二表达盒存在于质粒上。术语″质粒″是指染色体外环状DNA，即在宿主细胞中自主复制的载体。因此，质粒被理解为染色体外载体。
在另一个优选的实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸以及因此第一表达盒和第二表达盒稳定整合到细菌染色体中。
启动子
第一和第二多核苷酸应可操作地连接至启动子。
如本文使用的术语″可操作地连接″是指启动子序列与编码感兴趣的多肽的多核苷酸之间的功能性连接，使得启动子序列能够启动对编码感兴趣的多肽(本文也称为感兴趣的基因)的多核苷酸的转录。
″启动子″或″启动子序列″是位于基因上游的核苷酸序列，该基因与使得该基因能够转录的基因在同一条链上。启动子之后是基因的转录起始位点。启动子被启动转录得RNA聚合酶(以及任何所需的转录因子)识别。启动子的功能片段或功能变体是能够被RNA聚合酶识别并能够启动转录的核苷酸序列。
″活性启动子片段″、″活性启动子变体″、″功能性启动子片段″或″功能性启动子变体″描述了仍具有启动子活性的启动子核苷酸序列的片段或变体。
启动子可以是″诱导剂依赖性启动子″或″诱导剂非依赖性启动子″，该启动子包含组成型启动子或受其他细胞调节因子控制的启动子。
本领域技术人员能够选择合适的启动子来表达第一多核苷酸和第二多核苷酸。例如，编码第一感兴趣的多肽的多核苷酸优选地与″诱导剂依赖性启动子″或″诱导剂非依赖性启动子″可操作地连接。此外，编码第二感兴趣的多肽的多核苷酸优选地与诸如组成型启动子的″诱导剂非依赖性启动子″可操作地连接。
″诱导剂依赖性启动子″在本文中被理解为在向发酵培养基添加″诱导剂分子″时其活性增加以实现对与启动子可操作地连接的基因的转录的启动子。因此，对于诱导剂依赖性启动子来说，诱导剂分子的存在经由信号转导触发与启动子可操作地连接的基因表达的增加。基因表达在被诱导剂分子激活之前不需要是不存在的，而是可以低水平的基线基因表达存在，该基因表达在添加诱导剂分子后会增加。″诱导剂分子″是一种分子，其在发酵培养基中的存在能够通过增加与基因可操作地连接的诱导剂依赖性启动子的活性来影响基因表达的增加。优选地，诱导剂分子是碳水化合物或其类似物。在一个实施方案中，诱导剂分子是芽孢杆菌细胞的次要碳源。在存在碳水化合物的混合物的情况下，细胞选择性地利用为其提供最多能量和生长优势的碳源(主要碳源)。同时，诱导剂分子抑制涉及较不优选的碳源(次要碳源)分解代谢和摄取的各种功能。通常，芽孢杆菌的主要碳源是被芽孢杆菌用作次要碳源的葡萄糖和各种其他糖以及糖衍生物。次要碳源包括但不限于例如甘露糖或乳糖。
下表中参考相应的操纵子给出了诱导剂依赖性启动子的示例：
相比之下，不依赖于诱导剂分子的存在的启动子(本文中称为″诱导剂非依赖性启动子″)的活性是组成型活性的，或者在不考虑添加到发酵培养基的诱导剂分子的存在下可以增加的。
组成型启动子不依赖于其他细胞调节因子，并且转录起始依赖于σ因子A(sigA)。sigA依赖性启动子包括σ因子A特异性识别位点的″-35″-区域和″-10″-区域。
优选地，诱导剂非依赖性启动子的序列选自由组成型启动子组成的组，这些组成型启动子不限于具有不同基因表达强度的启动子Pveg、PlepA、PserA、PymdA、Pfba以及它们的衍生物(Guiziou等人，(2016)：Nucleic Acids Res.44(15)，7495-7508)、编码芽孢杆菌的aprE基因的枯草杆菌蛋白酶的aprE启动子、噬菌体SPO1启动子P4、P5、P15(WO15118126)、来自苏云金芽孢杆菌的cryIIIA启动子(WO 9425612)、来自解淀粉芽孢杆菌的amyQ启动子、来自地衣芽孢杆菌的amyL启动子和启动子变体(US 5698415)以及它们的组合，或它们的活性片段或变体、优选地aprE启动子序列。
″aprE启动子″或″aprE启动子序列″是位于aprE基因上游的核苷酸序列(或其部分或变体)，即编码芽孢杆菌枯草菌溶素(subtilisin Carlsberg)蛋白酶的基因，其与aprE基因在同一条链上，使得aprE基因能够转录。
在本发明的一个实施方案中，启动子是aprE基因的启动子，诸如地衣芽孢杆菌aprE基因的启动子(其用于实施例部分)。例如，启动子包含如SEQ ID NO：3所示的核酸序列或与SEQ ID NO：3至少80％、85％、90％、93％、95％、98％或99％相同的核酸序列。
对于prsA基因在芽孢杆菌属宿主中的共表达，可以使用prsA基因的天然5'prsA基因调控区(WO9419471、WO2021146411)以及异源启动子(WO2020156903)。诱导型启动子诸如IPTG诱导型启动子Pspac和木糖诱导型启动子PxylA已用于滴定细胞内的PrsA表达水平(Chen J等人.Biotechnol Lett.2015年4月；37(4)：899-906.doi：10.1007/s10529-014-1755-3.电子公开于2014年12月17日.PMID：25515799.)。
术语″转录起始位点(transcription start site或transcriptional startsite)″应被理解为转录在基因序列的5′端处开始的位置。在原核生物中，称为+1的第一个核苷酸通常是腺苷(A)或鸟苷(G)核苷酸。在该背景下，术语″位点″和″信号″在本文中可互换使用。
术语″表达″或″基因表达″意指对一个或多个特异性基因或特异性核酸构建体的转录。术语″表达″或″基因表达″特别意指将一个或多个基因或基因构建体转录成结构RNA(例如，rRNA、tRNA)或mRNA，随后该结构RNA或mRNA翻译成或不翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的处理。
还任选地，启动子包括5'UTR。这是位于-1启动子位置下游的转录但未翻译的区域。例如，这种未翻译区应当含有核糖体结合位点，以在靶基因对肽或多肽编码的情况下促进翻译。
关于5'UTR，本发明特别教导了将本发明的启动子与包含一个或多个稳定元件的5'UTR组合。以这种方式，从启动子区域合成的mRNA可以被处理以生成在转录物5′末端处具有稳定序列的mRNA转录物。优选地，在mRNA转录物的5′末端处的这种稳定序列增加了它们的半衰期，如Hue等人，1995，Journal of Bacteriology 177：3465-3471描述的。合适的mRNA稳定元件描述于以下文献中
-WO 8148575、优选地WO08140615的SEQ ID NO.1至5，或保持mRNA稳定功能的这些序列的片段，以及
-WO08140615、优选地苏云金芽孢杆菌CrylllA mRNA稳定序列或噬菌体SP82 mRNA稳定序列、更优选地根据WO 08140615的SEQ ID NO.4或5的mRNA稳定序列、更优选地根据WO08140615的SEQID NO.6的mRNA稳定序列，或保持mRNA稳定功能的这些序列的片段。
优选的mRNA稳定元件选自由prE、grpE、cotG、SP82、RSBgsiB、CrylllA mRNA稳定元件组成的组，或者根据保持mRNA稳定功能的这些序列的片段。优选的mRNA稳定元件是grpEmRNA稳定元件(对应于WO 08148575的SEQ ID NO.2)。
5'UTR还优选地包括位于启动子下游和核糖体结合位点(RB S)上游的改性的rib前导序列。在本发明的上下文中，rib前导序列在此被定义为位于芽孢杆菌细胞、更优选地枯草芽孢杆菌细胞中核黄素生物合成基因(rib操纵子)上游的前导序列。在枯草芽孢杆菌中，包括涉及核黄素生物合成的基因的rib操纵子包括ribG(ribd)基因、ribB(ribE)基因、ribA基因和ribH基因。枯草芽孢杆菌中从rib启动子(Prib)开始对核黄素操纵子的转录由核糖开关控制，该核糖开关涉及位于rib操纵子的5′-区域、在转录起始与操纵子中第一基因ribG的翻译起始密码子之间的几乎300个核苷酸的翻译调节前导区域(rib前导)。WO2015/1181296、特别是第23页至第25页中描述了合适的rib前导序列，其通过引用并入本文。
上文提供的定义和解释以必要的变更适用于下文。
用于产生目的多肽的方法
本发明还涉及一种用于产生感兴趣的多肽(诸如具有淀粉酶活性的多肽)的方法。优选地，所述方法包括以下步骤：
a)提供本发明的地衣芽孢杆菌宿主细胞，以及
b)在允许所述具有淀粉酶活性的多肽的表达的条件下培养地衣芽孢杆菌宿主细胞，以及任选地，
c)获得或纯化所述感兴趣的多肽，诸如具有淀粉酶活性的多肽。
如本文所用，术语″培养″是指将培养物中包括的改性的宿主细胞保持存活和/或增殖至少预定时间。该术语涵盖在接种后生长开始时的指数细胞生长期以及稳定生长期。培养条件应允许表达，即产生感兴趣的多肽。本领域技术人员无需更多麻烦即可选择这种条件。用于培养改性的宿主细胞的示例性条件在WO2020169564A1或实施例部分的实施例1或实施例2中描述。在本发明方法的一个实施方案中，步骤b)中的培养作为进料分批培养执行。
如果应用本发明的方法，则允许增加至少一种感兴趣的多肽的产生。优选地，与未改性的对照细胞，即不表达如本文所指的第一多肽的地衣芽孢杆菌对照细胞中的表达相比，产生增加。在一个优选的实施方案中，与对照细胞中的表达相比，感兴趣的多肽的产生增加至少20％，诸如至少50％，特别是至少100％或至少200％。例如，与对照细胞相比，感兴趣的多肽的产生可以增加20％至300％，诸如100％至300％。可以通过测定宿主细胞和/或培养基中多肽的量来测量表达。此外，可以通过测定酶活性来评估产生。例如，酶测定可用于测定感兴趣多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法获得或纯化感兴趣的多肽。例如，可以通过诸如离心、过滤、提取、喷雾干燥或沉淀的方法从培养基中获得多肽。
感兴趣的多肽可以通过任何认为适当的方法纯化，该方法诸如离子交换色谱、电泳程序、SDS-PAGE或提取。
用于产生本发明的地衣芽孢杆菌宿主细胞的方法
本发明还涉及一种产生本发明的地衣芽孢杆菌宿主细胞的方法，该方法包括
a)提供地衣芽孢杆菌宿主细胞，以及
b)将以下项引入步骤a)中提供的宿主细胞
b1)编码具有肽基-脯氨酰顺反异构酶(EC 5.2.1.8)活性的第一多肽的第一多核苷酸，所述第一多肽包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1至少81％相同的氨基酸序列，和
b2)编码具有淀粉酶活性的第二多肽的第二多核苷酸。
步骤b)中的引入可以通过任何被认为适当的方法进行，该方法诸如通过例如用包含第一多核苷酸和/或第二多核苷酸的一种或多种质粒进行转化。质粒优选包含可选择的标记基因。
本发明还涉及以下的用途：
i)具有肽基-脯氨酰顺反异构酶(EC 5.2.1.8)活性的第一多肽，所述第一多肽包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1至少81％相同的氨基酸序列，和/或
ii)编码所述第一多肽的多核苷酸，
用于增加地衣芽孢杆菌宿主细胞中具有α淀粉酶活性的第二多肽的产生。
最后，本发明涉及本发明的地衣芽孢杆菌宿主细胞用于产生具有α淀粉酶活性的多肽的用途。
在本申请中，参考了各种出版物。所有这些出版物和这些出版物中引用的那些参考文献的公开内容特此以引用的方式整体并入本申请，以便更全面地描述本发明所属领域的状态。
实施例
材料和方法
以下示例仅用于例示本发明。对本领域技术人员来说显而易见的许多可能的变体也落入本发明的范围内。
除非另有说明，否则以下实验是通过应用基因工程化、分子生物学和通过微生物培养发酵产生化合物中使用的标准装备、方法、化学品和生物化学品执行的。还参见Sambrook等人.(Sambrook,J.和Russell,D.W.分子克隆。A laboratory manual，第3版，纽约冷泉港冷泉港实验室出版社.2001)。
电感受态地衣芽孢杆菌细胞和电穿孔
经由电穿孔将DNA转化到地衣芽孢杆菌(US5352604)中。电感受态地衣芽孢杆菌细胞的制备和DNA的转化基本上如Brigidi等人(Brigidi,P.，Mateuzzi,D.(1991).Biotechnol.Techniques 5，5)利用以下修改进行描述：DNA转化后，在1ml LBSPG缓冲液中回收细胞，并在选择性LB-琼脂板上铺板后在37℃下温育60分钟(J.，1989，FEMS Microbio.Lett.，61：165-170)。
为了克服地衣芽孢杆菌菌株的地衣芽孢杆菌特异性限制性改性系统，如下文所述从Ec#098细胞或枯草芽孢杆菌Bs#056细胞中分离质粒DNA。
质粒分离
通过以下中描述的标准分子生物学方法从芽孢杆菌和大肠杆菌细胞中分离质粒DNA：(Sambrook,J.和Russell,D.W.分子克隆。A laboratory manual，第3版，纽约冷泉港冷泉港实验室出版社.2001)或碱裂解法(Birnboim，H.C.，Doly，J.(1979).Nucleic AcidsRes 7(6)：1513-1523)。在细胞裂解之前，将芽孢杆菌细胞与用10mg/ml溶菌酶在37℃下处理30分钟的大肠杆菌进行比较。
质粒
质粒p689-T2A-lac
大肠杆菌质粒p689-T2A-lac包含侧翼为BpiI限制性位点的lacZ-α基因，其5′侧翼又为大肠杆菌rrnB基因的T1终止子并且3′侧翼又为T0λ终止子，并且被排序为基因合成构建体(SEQ ID NO：6)。
质粒pEC 194RS-芽孢杆菌温度敏感缺失质粒(WO2022018260)用于克隆基因缺失和基因整合构建体。
质粒pBIL013：枯草芽孢杆菌整合目的质粒
质粒pBIL013是具有枯草芽孢杆菌的aprE基因的5′和3′区域的同源区域和具有氯霉素抗性基因作为可选择标记的II型克隆盒的基因整合质粒。用寡核苷酸SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19PCR扩增质粒BIL009(WO2019016051)的质粒骨架。分别用寡核苷酸SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23PCR扩增aprE基因的5′同源和3′同源区域。为各类型克隆盒提供基因合成构建体(BioCat GmbH，Heidelberg)SEQ ID NO：24。如所述经由II型克隆和BsaI限制性内切核酸酶组装单独的遗传元件(Radeck等人，2017；Sci.Rep.7：14134)，并且随后将反应混合物转化到大肠杆菌DH10B细胞(Lifetechnologies)中。将转化体铺开并在含有25μg/ml卡那霉素的LB-琼脂板上于37℃下温育过夜。从单独的克隆中分离质粒DNA，并通过限制酶切消化来分析正确性。对所得质粒pBIL013进行序列验证。
基因整合质粒地衣芽孢杆菌-pInt
pInt020-Cat：：PaprE-prsA_Bpu整合质粒：
通过两步克隆策略构建了用于在地衣芽孢杆菌aprE基因启动子(SEQ ID NO：3)控制下将短小芽孢杆菌prsA基因(prsA_Bpu；SEQ ID NO：2)整合到氯霉素-乙酰基转移酶(Cat)基因座的Cat：：PaprE-prsA_Bpu整合质粒。首先，将包含地衣芽孢杆菌aprE基因启动子和短小芽孢杆菌prsA基因的prsA_Bpu表达盒排序为具有侧翼BpiI限制性内切核酸酶位点的基因合成片段(分别为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5)，并如所述在II型组装中与限制性内切核酸酶BpiI亚克隆到p689-T2A-lac中(Radeck等人，2017；Sci.Rep.7：14134)，并且随后将反应混合物转化到大肠杆菌DH10B细胞(Life technologies)中。将转化体铺开并在含有25μg/ml卡那霉素的LB-琼脂板上于37℃下温育过夜。从单独的克隆中分离质粒DNA，并通过限制酶切消化来分析正确性。对所得质粒p689-PaprE-prsA_Bpu进行序列验证。
在第二II型组装反应中，用限制性内切核酸酶BsaI，用质粒pEC 194RS和p 689-PaaR-prsA_Bpu构建用于通过prsA_Bpu表达盒交换氯霉素乙酰转移酶(Cat)基因座(SEQ IDNO：7)的质粒，并且Cat基因座(SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9)的5′和3′同源区域作为基因合成构建体提供，其侧翼为与pEC 194RS和p 689-PaaR-prsA_Bpu相容的BsaI限制性位点，以允许定向克隆。如所述执行具有限制性内切核酸酶BsaI的II型组装，随后将反应混合物转化到大肠杆菌Ec#098中。将转化体铺开并在含有100μg/ml氨苄青霉素和30μg/ml氯霉素的LB-琼脂板上于37℃下温育过夜。从单独的克隆中分离质粒DNA，并通过测序来分析正确性。所得序列验证质粒被命名为pInt020_prsA_Bpu。
如对于质粒pInt20所述构建来自其它菌种的prsA基因的基因整合质粒，并列于表1中。
表1
质粒pUK57：II型组装目的芽孢杆菌质粒
质粒pUK57(描述于WO2022018260中)是质粒pUB110的衍生物，其包含用于组装基因表达载体的II型克隆盒。
淀粉酶表达质粒
淀粉酶表达质粒各自由3-4个遗传元件组成，这些遗传元件分别为pUK57的质粒骨架、来自地衣芽孢杆菌的aprE基因的启动子片段(SEQ ID NO：3)，或信号肽-淀粉酶基因片段或信号肽片段和淀粉酶基因片段。如所述在体外II型组装反应中，用限制性内切核酸酶BpiI组装pUK57载体、启动子片段(SEQ ID NO：4)、信号肽-淀粉酶基因片段或信号肽基因片段和淀粉酶基因片段，每个都包含相容的II型限制性内切核酸酶BpiI位点(参见表2)(Radeck等人，2017；Sci.Rep.7：14134)，并且随后在铺板在含有20μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上之后，根据Spizizen的方法将反应混合物转化为使Bs#056细胞成为感受态的枯草芽孢杆菌(Anagnostopoulos,C.和Spizizen,J.(1961).J.Bacteriol.81，741-746)。通过限制性酶消化和测序来分析最终淀粉酶质粒的正确克隆。表2总结了淀粉酶表达质粒
表2-淀粉酶表达质粒
质粒pAmy031
(*)具有在SEQ ID NO：30的编号中给出的突变的SEQ ID NO：29的淀粉酶变体
质粒pAmy033
(*)具有在SEQ ID NO：30的编号中给出的突变的SEQ ID NO：29的淀粉酶变体
菌株
大肠杆菌菌株Ec#098
大肠杆菌菌株Ec#098是携带编码表达质粒pMDS003 WO2019016051的DNA-甲基转移酶的大肠杆菌INV 110菌株(Life technologies)。
枯草芽孢杆菌菌株Bs#056
根据以下方法使原养型枯草芽孢杆菌菌株KO-7S(BGSCID：1S145；Zeigler D.R)成为感受态：Spizizen(Anagnostopoulos,C.和Spizizen,J.(1961).J.Bacteriol.81，741-746.)并用线性化的DNA-甲基转移酶表达质粒pMIS012转化，以用于将DNA-甲基转移酶整合到amyE基因中，如WO2019/016051中对于产生枯草芽孢杆菌Bs#053所述。将细胞铺开并在含有10μg/ml氯霉素的LB-琼脂板上于37℃下温育过夜。在37℃下温育过夜后，挑取生长的菌落并在含有10μg/ml氯霉素的LB-琼脂板和含有10μg/ml氯霉素和0.5％可溶性淀粉(Sigma)的LB-琼脂板上轻抚。淀粉板用含碘的Lugols溶液覆盖，并且阳性整合克隆用阴性淀粉酶活性鉴定。在用溶菌酶(10mg/ml)在3℃下处理30分钟后，通过标准酚/氯仿提取方法分离阳性克隆的基因组DNA，随后通过PCR分析MTase表达盒的正确整合。所得枯草芽孢杆菌菌株被命名为B s#056。
枯草芽孢杆菌菌株
原养型枯草芽孢杆菌菌株KO-7S(BGSCID：1S145；Zeigler D.R.)用于整合各种prsA基因。如对于枯草芽孢杆菌Bs#056所述，使Bacillussubtilis菌株KO-7S及其衍生物成为感受态。
具有整合的prsA表达盒的枯草芽孢杆菌菌株
经由如所述的用BpiI限制性内切核酸酶的II型克隆，将如表3中所列的prsA基因与地衣芽孢杆菌secA基因(WO2019016051，SEQ ID NO：25)的启动子一起克隆到pBIL013质粒中。如对于Bs#056所述，将组装的质粒用限制性内切核酸酶BsmbI线性化，并且随后将反应混合物转化到感受态枯草芽孢杆菌菌株KO-7S中。筛选正确的基因整合在选择性氯霉素LB-琼脂板上的生长和卡那霉素敏感性。最后，通过PCR扩增和Sanger测序确认prsA基因表达盒的正确整合。所得枯草芽孢杆菌prsA基因整合菌株总结于表3中。
表3
″D″代表缺失
枯草芽孢杆菌淀粉酶表达菌株
如上文对于枯草芽孢杆菌Bs#056所述，使如表3中列出的枯草芽孢杆菌菌株成为感受态的。从枯草芽孢杆菌Bs#056菌株中分离淀粉酶表达质粒pAMY029、pAMY031和pAMY035，并转化到枯草芽孢杆菌菌株PY79 KO-S(对照菌株)和Bs#112-Bs#115中，并铺板在含有20μg/μl卡那霉素的LB-琼脂平板上。通过限制性消化分析单独的克隆的质粒DNA的正确性，并通过将单个克隆转移到具有2％可溶性淀粉的LB板上以清除产淀粉酶菌株的区域形成来评估功能性酶表达。所得枯草芽孢杆菌表达菌株在表4中列出。
表4：枯草芽孢杆菌淀粉酶表达菌株的概述
地衣芽孢杆菌菌株
包含枯草杆菌蛋白酶aprE基因、淀粉酶amyB基因、孢子形成因子sigF基因(spoIIAC)和聚-γ谷氨酸合成基因中的缺失的地衣芽孢杆菌菌株Bli#008(WO2022018260)用于将prsA基因表达盒整合到地衣芽孢杆菌中并由此替换地衣芽孢杆菌的氯霉素抗性基因(SEQ ID NO：7)。
对于地衣芽孢杆菌菌株基因中的基因缺失/整合，在37℃下在含有100μg/ml氨苄青霉素和30μg/ml氯霉素的LB-琼脂板上进行选择之后，根据以下方法将缺失质粒转化为感受态的大肠杆菌菌株Ec#098：Chung(Chung,C.T.、Niemela,S.L和Miller,R.H.(1989).One-step preparation of competent Escherichia coli：transformation and storage ofbacterial cells in the same solution.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 86，2172-2175)。从单独的克隆中分离质粒DNA，并用于随后转移到地衣芽孢杆菌菌株中。分离的质粒DNA分别携带地衣芽孢杆菌的DNA甲基化模式，并且在转移到地衣芽孢杆菌中时被保护免于降解。
具有各种菌种的prsA基因的整合表达盒的地衣芽孢杆菌菌株。
电感受态地衣芽孢杆菌细胞如上所述制备，并在30℃下铺板在含有5μg/ml红霉素的LB琼脂板上之后，用1μg从大肠杆菌Ec#098分离的pInt20_prsA_Bpu整合质粒来转化。
基因整合程序如下所述执行：
携带质粒的地衣芽孢杆菌细胞在含5μg/ml红霉素的LB-琼脂板上于45℃下生长，从而经由坎贝尔重组驱动缺失质粒整合到染色体中，该染色体具有与氯霉素cat基因的序列5′或3′同源的p pInt20_prsA_Bpu同源区域中的一个同源区域。挑取克隆，并在30℃下铺板在含5μg/ml红霉素的LB-琼脂板上温育过夜之后，在无选择压力的LB-培养基中于45℃下培养6小时。挑取单独的克隆，并用寡核苷酸SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11通过菌落PCR分析进行筛选以实现prsA表达构建体在cat基因座处的成功基因组整合。挑取推定的整合阳性单独的克隆，并在45℃下在不含抗生素的LB培养基中连续过夜温育两次，以固化质粒，并铺在LB-琼脂板上，以在37℃下温育过夜。通过菌落PCR分析单克隆，以实现prsA表达盒在cat基因座处的成功基因组整合。分离具有正确整合prsA的单个红霉素敏感性克隆-短小芽孢杆菌表达盒并命名地衣芽孢杆菌Bli#208。
如对于地衣芽孢杆菌Bli#208所述进行其它prsA整合菌株的构建。表5总结了具有整合的prsA表达盒的地衣芽孢杆菌菌株。
表5：具有整合的prsA表达盒的地衣芽孢杆菌菌株
″D″代表缺失
地衣芽孢杆菌淀粉酶表达菌株
如上所述，使如表5中列出的地衣芽孢杆菌菌株成为感受态的。将淀粉酶表达质粒pAMY029、pAMY031、pAMY033和pAMY035从枯草芽孢杆菌Bs#056分离以携带地衣芽孢杆菌特异性DNA甲基化模式。将质粒转化到地衣芽孢杆菌Bli#008对照菌株(仅含天然prsA基因)和地衣芽孢杆菌菌株中，分别另外整合了短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌和嗜热脂肪地芽孢杆菌的prsA基因表达盒。随后将转化的菌株铺在具有20μg/μl卡那霉素的LB琼脂板上。通过限制性消化分析单独的克隆的质粒DNA的正确性，并通过将单个克隆转移到具有2％可溶性淀粉的LB板上以清除产淀粉酶菌株的区域形成来评估功能性酶表达。所得地衣芽孢杆菌表达菌株在表6中列出。
表6：具有不同菌种的prsA基因的地衣芽孢杆菌淀粉酶表达菌株
在下一步骤中，如前所述进一步构建了地衣芽孢杆菌淀粉酶表达菌株。将如下表7中所示的淀粉酶表达质粒转化到地衣芽孢杆菌Bli#008对照菌株和地衣芽孢杆菌Bli#208菌株中，并将短小芽孢杆菌的prsA的附加表达盒整合在染色体中。
表7：具有和不具有短小芽孢杆菌的prsA基因的地衣芽孢杆菌淀粉酶表达菌株。
实施例1：共表达各种菌种prsA基因的枯草芽孢杆菌淀粉酶表达菌株的培养
在基于微量滴定板的进料分批过程中培养如表4中列出的没有附加prsA基因的枯草芽孢杆菌淀粉酶表达菌株(对照菌株)和具有附加psrA基因的枯草芽孢杆菌淀粉酶表达菌株(Habicher等人，2019Biotechnol J.；15(2))。
所有培养都在30℃和400rpm下在直径为25mm的轨道摇床中进行(Innova 42，NewBrunswick Scientific，Eppendorf AG；Hamburg，Germany)。菌株在花盘(MTP-48-OFF，m2p-labs GmbH)中的两个后续预培养物中培养，以用于同步生长。第一预培养物在800μl TB培养基中执行，该培养基接种了来自在LB琼脂板上划线的菌株的新鲜单菌落。在30℃下20小时后，将含有800μl V3基本培养基的第二预培养物(Meissner等人，2015，Journal ofindustrial microbiology&biotechnology 42(9)：1203-1215)用8μl第一预培养物接种，并在30℃下培养24小时。使用48孔圆形和深井微量滴定板进行基于微量滴定板的进料分批主培养，其中每个孔的底部上具有含葡萄糖的聚合物(FeedPlate，商品编号：SMFP08004，Kuhner Shaker GmbH；Herzogenrath，Germany)。使用70μl第二预培养物接种700μl补充有5mM CaCl2的不含葡萄糖的V3-FP基本培养基。将主培养物在35℃下温育72小时。预培养物用无菌透气密封箔(AeraSeal film，Sigma-Aldrich)覆盖以避免污染。用无菌透气减蒸发箔(F-GPR48-10，m2p-labs GmbH)密封进料板以减少蒸发并避免污染。
在发酵过程结束时，取出培养样品，并通过离心和用0.2μm过滤器无菌过滤制备上清液。对于溶解性差的淀粉酶，在过滤或无菌过滤之前需要合适的稀释步骤。淀粉酶活性通过使用底物亚乙基-4-硝基苯基-α-D-麦芽七糖苷(EPS)的方法测定。D-麦芽七糖苷是一种封闭的寡糖，其可以被内切淀粉酶裂解。裂解后，α-葡糖苷酶释放出PNP分子，其具有黄色，因此可通过405nm处的可见分光光度法测量。含有EPS底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由RocheCostum Biotech(目录号10880078103)制造并且描述于Lorentz K.等人(2000)，Clin.Chem.，46/5：644-649中。时间依赖性吸收曲线的斜率与在给定的条件下所考虑的α-淀粉酶的比活性(每mg酶的活性)成正比。
每个菌株培养六次重复，并且酶活性值计算为每个菌株六次重复的平均值。将具有附加prsA基因的枯草芽孢杆菌淀粉酶表达菌株的平均酶活性归一化为对应枯草芽孢杆菌淀粉酶产生″对照菌株″的平均活性值，该值设置为100％。
表8pAMY029表达质粒的淀粉酶
枯草芽孢杆菌表达菌株 菌种prsA基因 相对淀粉酶活性 CV
BES#190 n.a. 100％ 21％
BES#191 短小芽孢杆菌 77％ 15％
BES#192 地衣芽孢杆菌 136％ 13％
BES#193 迟缓芽孢杆菌 307％ 17％
BES#194 嗜热脂肪地芽孢杆菌 220％ 20％
表9：pAMY031表达质粒的淀粉酶
枯草芽孢杆菌表达菌株 菌种prsA基因 相对淀粉酶活性 CV
BES#195 n.a. 100％ 11％
BES#196 短小芽孢杆菌 128％ 14％
BES#197 地衣芽孢杆菌 121％ 7％
BES#198 迟缓芽孢杆菌 80％ 8％
BES#199 嗜热脂肪地芽孢杆菌 133％ 11％
表10：pAMY035表达质粒的淀粉酶
在地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌和嗜热脂肪地芽孢杆菌的prsA基因分别附加表达的情况下，pAMY029的淀粉酶生产能力提高了30％至200％，其中迟缓芽孢杆菌的PrsA对淀粉酶生产能力的提高最大(表8)。短小芽孢杆菌的prsA基因的附加表达对枯草芽孢杆菌中pAMY029淀粉酶的生产能力有负面影响。
在地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和嗜热脂肪地芽孢杆菌的prsA基因附加表达的情况下，pAMY031的淀粉酶的淀粉酶生产能力提高了20％-30％，而与pAMY029的淀粉酶相比，迟缓芽孢杆菌的prsA基因的附加表达对枯草芽孢杆菌中pAMY031的淀粉酶生产能力有负面影响(表9)。
在所有测试菌种(即地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌和嗜热脂肪地芽孢杆菌)的prsA基因附加表达的情况下，枯草芽孢杆菌中pAMY035的地衣芽孢杆菌淀粉酶AmyL的淀粉酶生产能力提高了70％-80％(表10)。
实施例2：共表达各种菌种prsA基因的地衣芽孢杆菌淀粉酶表达菌株的培养
如对于枯草芽孢杆菌所述(实施例1)，在基于微量滴定板的进料分批过程条件下，培养如表6中列出的没有附加prsA基因的地衣芽孢杆菌淀粉酶表达菌株(对照菌株)和具有附加psrA基因的地衣芽孢杆菌淀粉酶表达菌株。
在发酵过程结束时，取出培养样品，并通过离心和用0.2μm过滤器无菌过滤制备上清液。淀粉酶活性如实施例1所述测定。酶活性计算为每种菌株的六次重复的平均值。将具有附加prsA基因的地衣芽孢杆菌淀粉酶表达菌株的平均酶活性归一化为对应地衣芽孢杆菌淀粉酶表达″对照菌株″的平均活性值，该值设置为100％。
表11：pAMY029表达质粒的淀粉酶
表12：pAMY031表达质粒的淀粉酶
地衣芽孢杆菌表达菌株 菌种prsA基因 相对淀粉酶活性 CV
BES#210 n.a. 100％ 7％
BES#211 短小芽孢杆菌 333％ 5％
BES#212 地衣芽孢杆菌 256％ 3％
BES#213 迟缓芽孢杆菌 126％ 4％
BES#214 嗜热脂肪地芽孢杆菌 145％ 6％
表13：pAMY033表达质粒的淀粉酶
地衣芽孢杆菌表达菌株 菌种prsA基因 相对淀粉酶活性 CV
BES#215 n.a. 100％ 8％
BES#216 短小芽孢杆菌 262％ 5％
BES#217 地衣芽孢杆菌 196％ 7％
BES#218 迟缓芽孢杆菌 138％ 10％
BES#219 嗜热脂肪地芽孢杆菌 146％ 9％
表14：pAMY035表达质粒的淀粉酶
地衣芽孢杆菌表达菌株 菌种prsA基因 相对淀粉酶活性 CV
BES#220 n.a. 100％ 12％
BES#221 短小芽孢杆菌 126％ 8％
BES#222 地衣芽孢杆菌 166％ 11％
BES#223 迟缓芽孢杆菌 159％ 7％
BES#224 嗜热脂肪地芽孢杆菌 135％ 10％
在短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌和嗜热脂肪地芽孢杆菌的prsA基因分别附加表达的情况下，地衣芽孢杆菌中pAMY029淀粉酶的生产能力提高了40％至316％以上(表11)。与枯草芽孢杆菌的结果相比，其中短小芽孢杆菌的prsA基因(BES#191)的表达对pAMY029淀粉酶的生产能力有负面影响，令人惊讶的是，地衣芽孢杆菌中短小芽孢杆菌的prsA基因的表达显示出pAMY029淀粉酶生产能力的最高提高。
与pAMY029淀粉酶的结果相似，与其它菌种的prsA基因表达相比，短小芽孢杆菌的prsA基因的表达使pAMY031淀粉酶(表12)和pAMY033淀粉酶(图13)在地衣芽孢杆菌中的淀粉酶生产能力最高。
在所有测试菌种(即地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌和嗜热脂肪地芽孢杆菌)的prsA基因附加表达的情况下，地衣芽孢杆菌中pAMY035的地衣芽孢杆菌淀粉酶AmyL的淀粉酶生产能力提高了26％-66％(表14)。
实施例3：共表达短小芽孢杆菌的prsA基因的地衣芽孢杆菌淀粉酶表达菌株的培 养
为了进一步分析短小芽孢杆菌prsA基因的附加表达对地衣芽孢杆菌异源淀粉酶产生的令人惊讶的强烈影响，分析了具有地衣芽孢杆菌的prsA转基因的附加表达盒的地衣芽孢杆菌Bli#008对照菌株(仅天然prsA基因)或地衣芽孢杆菌Bli#208菌株中各种不同淀粉酶的淀粉酶生产能力。
如实施例2所述进行基于MTP的进料分批培养并测定酶活性。
表15显示了具有短小芽孢杆菌的附加prsA基因的每种地衣芽孢杆菌淀粉酶表达菌株(表7)的六次重复的平均酶活性值，这些值被归一化为对应地衣芽孢杆菌淀粉酶表达″对照菌株″的平均活性值，该值设置为100％。
表15：具有短小芽孢杆菌的附加prsA的地衣芽孢杆菌的淀粉酶产生增加
短小芽孢杆菌的prsA基因在地衣芽孢杆菌中的附加表达令人惊讶地大大提高了淀粉酶表达质粒pAMY031、pAMY038、pAMY040、pAMY042、pAMY048、pAME050、pAMY053、pAMySQL059和pAMY061的各种芽孢杆菌衍生淀粉酶的淀粉酶生产能力。

Claims (15)

1.一种地衣芽孢杆菌宿主细胞，所述地衣芽孢杆菌宿主细胞表达
a)具有肽基-脯氨酰顺反异构酶(EC 5.2.1.8)活性的第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO：1至少81％相同的氨基酸序列，和
b)具有淀粉酶活性的第二多肽，其中所述第二多肽对于所述地衣芽孢杆菌宿主细胞是异源的。
2.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述第一多肽包含与SEQ IDNO：1至少90％相同的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述第二多肽具有α淀粉酶活性(EC 3.2.1.1)或麦芽糖α-淀粉酶活性(EC 3.2.1.133)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO：29、35、38、40、42、48、50、53、59或61至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO：29、35、38、40、42、48、50、53、59或61至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述宿主细胞包含：
a)所述第一多肽的第一表达盒，所述第一表达盒包含与编码所述第一多肽的第一多核苷酸可操作地连接的启动子，以及任选地终止子，和
b)所述第二多肽的第二表达盒，所述第二表达盒包含与编码所述第二多肽的第二多核苷酸可操作地连接的启动子，以及任选地终止子。
7.根据权利要求6所述的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述第一表达盒的启动子和/或所述第二表达盒的所述启动子是诱导剂非依赖性启动子或诱导型启动子。
8.根据权利要求6或7中任一项所述的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述第一表达盒和/或所述第二表达盒存在于所述宿主细胞中的质粒上，或者稳定整合到所述宿主细胞的染色体DNA中。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述第二多肽是分泌的。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述第二多肽包含信号肽。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述宿主细胞是来自选自由以下项组成的组的菌株的宿主细胞：地衣芽孢杆菌菌株ATCC 14580、ATCC31972、ATCC 53757、ATCC 53926、ATCC 55768、DSM 13、DSM 394、DSM 641、DSM 1913、DSM11259和DSM 26543。
12.一种产生具有淀粉酶活性的多肽的方法，所述方法包括
a)提供根据权利要求1至11中任一项所述的地衣芽孢杆菌宿主细胞，以及
b)在允许所述具有淀粉酶活性的多肽的表达的条件下培养所述宿主细胞，以及任选地，
c)获得或纯化所述具有淀粉酶活性的多肽。
13.一种产生根据权利要求1至11中任一项所述的地衣芽孢杆菌宿主细胞的方法，所述方法包括
a)提供地衣芽孢杆菌宿主细胞，以及
b)将编码根据权利要求1或2中所述的第一多肽的第一多核苷酸和b)编码根据权利要求1、3、4和5中任一项所述的第二多肽的第二多核苷酸引入步骤a)中提供的所述宿主细胞中。
14.根据权利要求13所述的方法，其中在步骤b)中，将根据权利要求6至9中任一项所述的所述第一表达盒和所述第二表达盒引入所述宿主细胞中。
15.根据权利要求1或2中所述的具有肽酰-脯氨酰顺反异构酶(EC 5.2.1.8)活性的第一多肽和/或编码所述第一多肽的多核苷酸用于增加地衣芽孢杆菌宿主细胞内根据权利要求1、3、4和5中任一项所述的具有α淀粉酶活性的第二多肽的产生的用途。
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