CN120519468A - Nib1基因在植物抗病虫中的应用 - Google Patents

Nib1基因在植物抗病虫中的应用

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Abstract

本发明涉及NIB1基因在植物抗病虫中的应用，具体提供NIB1基因或其编码多肽或促进剂在增强NVR1在植物中的活性、招募EDS1到细胞核或上调植物抗病虫能力中的用途。本发明通过上调NIB1的表达水平从而加强植物抗病虫的能力。

Description

NIB1基因在植物抗病虫中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术和植物学领域，更具体地，本发明涉及一种水稻RNA结合蛋白在抗病虫中的功能及其应用。
背景技术
在生物中，RNA结合蛋白(RBPs)作为重要的转录后调控因子，通过与RNA结合调节RNA代谢。传统的富含甘氨酸RNA结合蛋白(GR-RBPs)N端包含RNA识别基序(RNArecognition motif,RRM)或冷休克结构域(cold-shock domain)，C端为富含甘氨酸结构域(glycine-rich domain)，参与RNA的剪接、转运和编辑，在植物响应寒冷刺激、紫外辐射、盐碱以及病原体侵染等方面起着非常重要的作用(Ma等，2021a；Sachetto-Martins等，2000)。这一类蛋白组成GRP超家族中的GRPⅣ家族(Ciuzan等，2015)。在植物-病原菌互作方面，GR-RBPs识别病原效应子以及GR-RBPs和NLR受体相互作用的分子机制得到了比较深入的研究。丁香假单胞菌III型效应子HopU1可以靶向拟南芥AtGRP7，通过核糖化修饰AtGRP7中RRM的第49位精氨酸减弱其RNA结合能力，从而减弱其对下游防御反应的促进作用，抑制植物的免疫反应(Fu等，2007；Jeong等，2011)。辣椒(Capsicum annuum)的CaGRP1通过RRM结构域和CaPIK1(receptor-like cytoplasmic protein kinase1)互作负向调控CaPIK1表达，抑制CaPIK1引发的ROS和细胞死亡，而CaGRP1沉默植株上调了CaPIK1，CaPR1和CaDEF1的表达，进而提高辣椒对野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.Vesicatoria,Xcv)的抗性(Kim等，2015)。本氏烟草中NbGRP7和CNL类受体Gpa2互作，提高了对马铃薯白线虫(Globodera pallida)抗性，同时其RRM结构域能够维持Rx1(PVX免疫受体)稳态，与PVX侵染相关的植物免疫有一定联系(Sukarta等，2022)。植物RNA结合蛋白如何识别昆虫分泌型核酸酶及其催化产物在抗病虫中的功能研究尚未见过相关报道。
发明内容
发明人首次提供通过在禾本科植物中调控NIB1基因的表达水平调节植物防御反应的能力，进而调控植物的抗病虫能力的方法。
本发明第一方面提供NIB1基因或其编码多肽或促进剂在增强NVR1在植物中的活性、招募EDS1到细胞核或上调植物抗病虫能力中的用途。
在一个或多个实施方案中，所述抗病虫选自以下的一种或多种：抗稻纵卷叶螟、抗棉铃虫、抗稻瘟菌。
在一个或多个实施方案中，所述促进剂选自下组：小分子化合物、核酸分子或其组合。
在一个或多个实施方案中，所述植物是禾本科植物。
在一个或多个实施方案中，所述禾本科植物是水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦。优选地，禾本科植物是水稻。
在一个或多个实施方案中，所述NIB1基因来自禾本科植物，优选来自水稻。
在一个或多个实施方案中，所述NIB1基因的编码多肽选自下组：
(a)具有SEQ ID NO:2所示序列的多肽；
(b)将SEQ ID NO:2所示序列经过一个或多个(如1-20个；优选地1-10；更优选地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或
(c)与(a)的多肽序列有90％(优选地93％；更优选地95％或98％)以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。
在一个或多个实施方案中，所述NIB1基因的核酸序列选自：
(1)如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列或与其具有80％(优选地90％；更优选地95％或98％)以上同源性的多核苷酸序列；
(2)在SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列的5’端和/或3’端截短或添加1-60个，优选地1-30，更优选地1-10个核苷酸的多核苷酸序列；
(3)与(1)-(2)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
本发明还提供一种使NIB1蛋白失活的方法，包括使其第49位和/或第50位氨基酸突变。所述NIB1蛋白具有SEQ ID NO:2所示序列。
在一个或多个实施方案中，所述突变是取代或缺失突变。
在一个或多个实施方案中，第49位R突变为A。
在一个或多个实施方案中，第50位G突变为A。
本发明第二方面提供一种增强NVR1在植物中的活性、招募EDS1到细胞核、增强植物抗病虫能力的方法，所述方法包括步骤：上调植物中NIB1基因的表达或活性。优选地，所述抗病虫选自以下一种或多种：抗稻纵卷叶螟、抗棉铃虫、抗稻瘟菌。
在一个或多个实施方案中，所述植物是禾本科植物。
在一个或多个实施方案中，所述禾本科植物是水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦。优选地，所述禾本科植物是水稻。
在一个或多个实施方案中，所述NIB1基因的编码多肽选自下组：
(a)具有SEQ ID NO:2所示序列的多肽；
(b)将SEQ ID NO:2所示序列经过一个或多个(如1-20个；优选地1-10；更优选地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或
(c)与(a)的多肽序列有90％(优选地93％；更优选地95％或98％)以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。
在一个或多个实施方案中，所述NIB1基因的核酸序列选自：
(1)如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列或与其具有80％(优选地90％；更优选地95％或98％)以上同源性的多核苷酸序列；
(2)在SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列的5’端和/或3’端截短或添加1-60个，优选地1-30，更优选地1-10个核苷酸的多核苷酸序列；
(3)与(1)-(2)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
在一个或多个实施方案中，所述上调植物中NIB1基因的表达或活性的步骤包括：将NIB1基因转入植物，获得转化的植物。
在一个或多个实施方案中，所述上调植物中NIB1基因的表达或活性的步骤包括：
(1)将植物的细胞或组织或器官与含有NIB1基因的核酸构建物的农杆菌接触，从而使所述核酸构建物转入植物细胞、组织或器官。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是表达载体或重组载体。
在一个或多个实施方案中，所述上调植物中NIB1基因的表达的方法还包括：
(2)选择出转入了NIB1基因的植物细胞、组织、器官或种子；和
(3)将步骤(3)中的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。
本发明还提供NIB1基因作为靶点在筛选潜在试剂中的用途，所述潜在试剂能提高NVR1在植物中的活性、招募EDS1到细胞核、增强植物抗病虫能力。
在一个或多个实施方案中，所述筛选包括步骤：(1)使候选试剂与NIB1蛋白或其编码核酸分子或含有它们的体系接触，和(2)检测所述蛋白或其编码核酸分子的表达或活性的变化，可以指示候选试剂作为目标潜在试剂。若所述候选试剂可提高NIB1蛋白或其编码核酸分子的表达或活性，则表明该候选试剂是提高NVR1在植物中的活性、招募EDS1到细胞核、增强植物抗病虫能力的潜在试剂。在优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选试剂加入到含NIB1蛋白或其编码核酸分子的体系中，步骤(2)包括：检测测试组的体系中NIB1蛋白的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选试剂的相同体系。如果测试组中NIB1蛋白的表达在统计学上高于(优选显著高于，如高20％以上，较佳的高50％以上；更佳的高80％以上)对照组，就表明该候选物是提高NVR1在植物中的活性、招募EDS1到细胞核、增强植物抗病虫能力的潜在试剂。
在一个或多个实施方案中，所述筛选包括步骤：(1)使候选试剂、NIB1蛋白或其编码核酸分子与(a)NVR1蛋白或其编码核酸分子和/或(b)EDS1蛋白或其编码核酸分子，或(c)含有(a)和/或(b)的体系接触，和(2)若检测到以下任一种或多种情况，则指示该候选试剂是提高NVR1在植物中的活性、招募EDS1到细胞核、增强植物抗病虫能力的潜在试剂：(A)增强NIB1蛋白与NVR1蛋白的相互作用，(B)提高NVR1蛋白的活性，(C)增强NIB1蛋白与EDS1蛋白的相互作用，(D)NIB1招募EDS1到凝聚体中的作用增强。
在一个或多个实施方案中，所述筛选包括步骤：(1)在测试组中，将候选试剂加入到含NIB1蛋白或其编码核酸分子和NVR1蛋白或其编码核酸分子的体系中，(2)检测测试组的体系中NVR1蛋白的活性或NIB1蛋白与NVR1蛋白的相互作用，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选试剂的相同体系。如果测试组中NVR1蛋白的活性或NIB1蛋白与NVR1蛋白的相互作用在统计学上高于(优选显著高于，如高20％以上，较佳的高50％以上；更佳的高80％以上)对照组，就表明该候选物是提高NVR1在植物中的活性、招募EDS1到细胞核、增强植物抗病虫能力的潜在试剂。
在一个或多个实施方案中，所述筛选包括步骤：(1)在测试组中，将候选试剂加入到含NIB1蛋白或其编码核酸分子和EDS1蛋白或其编码核酸分子的体系中，(2)检测测试组的体系中NIB1蛋白与EDS1蛋白的相互作用或凝聚体中的EDS1蛋白，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选试剂的相同体系。如果测试组中NIB1蛋白与EDS1蛋白的相互作用或凝聚体中的EDS1蛋白含量在统计学上高于(优选显著高于，如高20％以上，较佳的高50％以上；更佳的高80％以上)对照组，就表明该候选物是提高NVR1在植物中的活性、招募EDS1到细胞核、增强植物抗病虫能力的潜在试剂。
在一个或多个实施方案中，所述的体系选自：细胞体系(如表达NIB1蛋白的细胞)(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
在一个或多个实施方案中，蛋白之间的相互作用通过MST实验、Co-IP或双分子荧光素酶互补实验检测。
在一个或多个实施方案中，蛋白的表达通过检测抗体抗原反应、检测mRNA含量来检测，例如Western、ELISA或Southern。
在一个或多个实施方案中，凝聚体中的EDS1蛋白含量通过显微镜共定位观察检测。例如，分别将NIB1与EDS1连接在具有不同荧光标记的载体上，转化烟草叶片后进行显微镜共定位观察。
附图说明
图1：NIB1与NVR1互作。
A,MST实验表明NIB1与NVR1直接结合，其中NIB1为配体。
B,半体内Pull down实验证实NIB1与NVR1存在相互作用。
C,Co-IP验证NVR1与NIB1互作。
D,NIB1蛋白结构示意图。RNA Recognition Motif，RNA识别基序；Glycine-richregion，富含甘氨酸结构域。
E,双分子荧光素酶互补实验在烟草中验证NIB1和NVR1的互作依赖于RRM结构域。
图2：NIB1的第49位与第50位氨基酸残基对NIB1发挥作用非常重要。
A,NIB1结果示意图，第49位为精氨酸，第50位为甘氨酸。
B,分子对接结果显示NIB1可以结合2’,3’-cAMP，负责识别的氨基酸为R49和G50。
C,结合2’,3’-cGMP的氨基酸为G50。
D,MST实验说明NIB1结合2’,3’-cAMP，NIB1R49A结合能力减弱与NIB1G50A结合能力丢失。
E，荧光共聚焦显微镜显示在NVR1存在情况下，NIB1-YFP细胞核中可以形成凝聚体，NIB1R49与NIB1G50A则不能。
F，荧光共聚焦显微镜显示2’,3’-cAMP促进NIB1-YFP细胞核中可以形成凝聚体，NIB1R49与NIB1G50A丢失这一能力。标尺均为5微米。
G，在烟草叶片中瞬时表达NIB1-YFP能引起植物细胞死亡。NIB1R49A与NIB1G50A不引起植物细胞坏死。
H，棉铃虫饲喂实验表明瞬时表达NIB1正向调控棉铃虫抗性。
图3：NIB1加速NVR1活性。
A,Urea SDS-PAGE检测NIB1-YFP和NIB1ΔIDR对NVR1催化活性的影响。
B-C,HPLC-MS通过检测2’,3’-cAMP/cGMP表征NIB1-YFP和NIB1ΔIDR对NVR1催化活性的影响。
D，利用农杆菌介导的烟草瞬时表达体系，在烟草叶片中表达分别NVR1-HA+YFP、NVR1-HA+NIB1-YFP和NVR1-HA+NIB1ΔIDR-YFP，3天后观察坏死情况，并进行拍照。标尺为1厘米。
E-H分别对A-D进行量化。
I-J，HPLC-MS通过检测2’,3’-cAMP/cGMP表征NIB1-YFP和NIB1R49A与NIB1G50A对NVR1催化活性的影响。
K-L,用农杆菌介导的烟草瞬时转化系统表达NVR1+NIB1、NVR1+NIB1、NVR1+NIB1R49A和NVR1+NIB1G50A，三天后，进行取样拍照。
图4：NIB1能招募EDS1到凝聚体中。
A,双分子荧光素酶互补实验验证NIB1与EDS1互作。红蓝渐变表示互作强弱。
B，半体外Pull-down实验验证His-NIB1与EDS1-Flag互作。使用His和Flag抗体分别进行免疫印迹杂交。
C，在烟草叶片中，利用免疫共沉淀验证NIB1-Flag与EDS1-GFP互作。分别使用Flag和GFP抗体进行杂交。
D，在烟草叶片中，利用双分子荧光互补实验BiFC验证EDS1与NIB1互作。标尺为20微米。
E，共定位结果显示NIB1招募EDS1到凝聚体中。标尺为5微米。
图5：NIB1正向调节植物的抗病虫能力。
A，接种稻瘟病菌(TH12)5天后，ZH11、NIB1-KO和NIB1-OE植株的发病情况。
B，稻瘟病菌侵染5天后病斑长度。共统计11张叶片。
C，qRT-PCR以水稻内参基因ACTIN通过病原菌28S rDNA计算稻瘟病菌的相对量。
D，接种稻纵卷叶螟5天后，ZH11、NIB1-KO和NIB1-OE植株的抗虫情况。
E，取食三天后的稻纵卷叶螟。
F，对稻纵卷叶螟进行称重。
具体实施方式
发明人首次揭示通过在禾本科植物中定向调控NIB1基因的表达水平，可显著调节植物防御反应的能力，进而调控植物的抗病虫能力，包括抗稻纵卷叶螟能力、抗棉铃虫能力和抗稻瘟菌能力。
如本文所用，“禾本科植物”是水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦。
在本发明中，术语“NIB1”指具有NIB1活性的SEQ ID NO:2序列的多肽，或者由ID为LOC_Os03g46770的NIB1基因编码的多肽。该术语还包括具有与NIB1相同功能的、SEQ IDNO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，优选地1-30个、1-20个、1-10个、1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，优选地为10个以内，更优选地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。在本领域中，性能相似的氨基酸往往指具有相似侧链的氨基酸家族，在本领域已有明确定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、乳酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。又比如，在氨基末端和/或羧基末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变多肽或蛋白的功能。对于许多常见已知非遗传性编码氨基酸的保守氨基酸取代本领域已知。其他非编码氨基酸的保守取代可基于其物理性质与遗传上编码的氨基酸的性质的比较来确定。
多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体。
任何与所述NIB1同源性高(比如与SEQ ID NO:2所示的序列的同源性为70％或更高；优选的，同源性为80％或更高；更优选的，同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有NIB1相似或相同功能的多肽也包括在本发明内。所述“相同或相似功能”主要是指调控农作物(如水稻)的抗病虫能力。
本发明还包括所要求保护的多肽的类似物。这些类似物与天然SEQ ID NO:2差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。
本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
此外，任何一种NIB1的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，NIB1的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的NIB1的全部或部分功能。通常情况下，所述生物活性片段至少保持50％的全长NIB1的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长NIB1的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。
本发明还涉及编码本发明NIB1或其变体、类似物、衍生物的多核苷酸序列。所述多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。如本文所用，简并变异体在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质，但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，优选至少70％，更优选至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严谨条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严谨条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
应理解，尽管本发明的实例中提供的基因来源于水稻，但是来源于其它类似的植物(尤其是与水稻属于同一科或属的植物)的、与本发明的序列(优选地，序列如SEQ ID NO:1所示)具有一定同源性(如具有70％以上，如80％，85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的NIB1的基因序列，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该序列。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。
本发明的NIB1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的DNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还提供了一种包括本发明的基因的核酸构建物。作为一种优选的方式，核酸构建物的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达本发明目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的核酸构建物包括(从5’到3’方向)：启动子，目的基因，和终止子。如果需要，所述的核酸构建物还可以包括选自下组的元件：3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。
用于制备核酸构建物的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。
本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的基因的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。使用本发明的基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。
包括本发明基因或核酸构建物可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。所述多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
本文所述多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括(但并不限于)：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
用重组DNA转化宿主可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得性状发生改变的植物。
本发明提供了所述NIB1基因的用途，用于调控NVR1在植物中的活性、招募EDS1到细胞核或调控植物的抗病虫能力。作为一种优选方式，所述NIB1基因可用于增强NVR1在植物中的活性、增加植物的抗病虫能力。
本发明还涉及NIB1促进剂及其用途，由于NIB1的促进剂可提高NIB1的表达和/或活性，因此，所述促进剂可通过对NIB1的影响来调控调控NVR1在植物中的活性以及调控植物防御反应，从而达到植物抗病虫的能力。
在一个方面，任何可提高NIB1的活性、提高其的稳定性、促进其表达、延长其有效作用时间、或促进其基因转录和翻译的物质均可用于本发明，作为NIB1基因的“促进剂”，用于调控植物抗病虫能力。例如提高NIB1基因的转录、表达或活性的表达载体。
本发明还提供一种调控NVR1在植物中的活性、招募EDS1到细胞核或调控植物抗病虫能力的方法，所述方法包括：上调植物中NIB1基因的表达或活性，从而调控NVR1在植物中的活性、调控植物的抗病虫能力。在得知了所述NIB1基因的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来上调所述NIB1基因的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带NIB1基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的NIB1。
作为本发明的一种实施方式，将NIB1基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述带有NIB1基因的核酸构建物导入到植物组织或器官中，使所述植物表达NIB1基因。可通过将所述植物组织或器官再生成植物，获得过量表达NIB1基因的植物。
在一个或多个实施方案中，所述上调NIB1基因的表达的方法包括：
(1)提供携带含有NIB1基因的核酸构建物的农杆菌，
(2)将植物的细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述核酸构建物转入植物组织或器官。
在一个或多个实施方案中，所述上调植物中NIB1基因的表达的方法还包括：
(3)选择出转入了NIB1基因的植物组织、器官或种子；和
(4)将步骤(3)中的植物组织、器官或种子再生成植物。
本发明还提供NIB1基因作为靶点在筛选潜在试剂中的用途，所述潜在试剂能提高NVR1在植物中的活性、招募EDS1到细胞核、增强植物抗病虫能力。
在本文中，所述筛选包括步骤：(1)使候选试剂与NIB1蛋白或其编码核酸分子或含有它们的体系接触，和(2)检测所述蛋白或其编码核酸分子的表达或活性的变化，可以指示候选试剂作为目标潜在试剂。若所述候选试剂可提高NIB1蛋白或其编码核酸分子的表达或活性，则表明该候选试剂是提高NVR1在植物中的活性、招募EDS1到细胞核、增强植物抗病虫能力的潜在试剂。在优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选试剂加入到含NIB1蛋白或其编码核酸分子的体系中，步骤(2)包括：检测测试组的体系中NIB1蛋白的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选试剂的相同体系。如果测试组中NIB1蛋白的表达在统计学上高于(优选显著高于，如高20％以上，较佳的高50％以上；更佳的高80％以上)对照组，就表明该候选物是提高NVR1在植物中的活性、招募EDS1到细胞核、增强植物抗病虫能力的潜在试剂。
在一个或多个实施方案中，所述筛选包括步骤：(1)使候选试剂、NIB1蛋白或其编码核酸分子与(a)NVR1蛋白或其编码核酸分子和/或(b)EDS1蛋白或其编码核酸分子，或(c)含有(a)和/或(b)的体系接触，和(2)若检测到以下任一种或多种情况，则指示该候选试剂是提高NVR1在植物中的活性、招募EDS1到细胞核、增强植物抗病虫能力的潜在试剂：(A)增强NIB1蛋白与NVR1蛋白的相互作用，(B)提高NVR1蛋白的活性，(C)增强NIB1蛋白与EDS1蛋白的相互作用，(D)NIB1招募EDS1到凝聚体中的作用增强。
在一个或多个实施方案中，所述筛选包括步骤：(1)在测试组中，将候选试剂加入到含NIB1蛋白或其编码核酸分子和NVR1蛋白或其编码核酸分子的体系中，(2)检测测试组的体系中NVR1蛋白的活性或NIB1蛋白与NVR1蛋白的相互作用，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选试剂的相同体系。如果测试组中NVR1蛋白的活性或NIB1蛋白与NVR1蛋白的相互作用在统计学上高于(优选显著高于，如高20％以上，较佳的高50％以上；更佳的高80％以上)对照组，就表明该候选物是提高NVR1在植物中的活性、招募EDS1到细胞核、增强植物抗病虫能力的潜在试剂。
在一个或多个实施方案中，所述筛选包括步骤：(1)在测试组中，将候选试剂加入到含NIB1蛋白或其编码核酸分子和EDS1蛋白或其编码核酸分子的体系中，(2)检测测试组的体系中NIB1蛋白与EDS1蛋白的相互作用或凝聚体中的EDS1蛋白，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选试剂的相同体系。如果测试组中NIB1蛋白与EDS1蛋白的相互作用或凝聚体中的EDS1蛋白含量在统计学上高于(优选显著高于，如高20％以上，较佳的高50％以上；更佳的高80％以上)对照组，就表明该候选物是提高NVR1在植物中的活性、招募EDS1到细胞核、增强植物抗病虫能力的潜在试剂。
本文中，“体系”选自：细胞体系(如表达NIB1蛋白的细胞)(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。在一个或多个实施方案中，蛋白之间的相互作用通过MST实验、Co-IP或双分子荧光素酶互补实验检测。在一个或多个实施方案中，蛋白的表达通过检测抗体抗原反应、检测mRNA含量来检测，例如Western、ELISA或Southern。在一个或多个实施方案中，凝聚体中的EDS1蛋白含量通过显微镜共定位观察检测。例如，分别将NIB1与EDS1连接在具有不同荧光标记的载体上，转化烟草叶片后进行显微镜共定位观察。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
实施例1，NIB1与NVR1互作
a:MST检测NIB1与NVR1互作
将纯化NIB1蛋白利用试剂盒(RED-NHS蛋白标记试剂盒(氨基标记-RED Channel)，NT-L111)进行RED-NHS标记，获得NHS-NIB1蛋白，对NHS-NIB1进行检测：检测蛋白是否聚集，是否存在毛细管吸附现象，若无吸附无聚集，可进行后续实验。有吸附和聚集是可以适量加入吐温，但浓度不宜太高。对Ligand(大肠杆菌纯化NVR1蛋白)进行稀释：首先准备20μL蛋白(浓度为Kd的20-50倍)，分别向15个PCR管中加入10μL PBS，依次完成蛋白浓度稀释，分别向以上PCR管中加入NHS-NIB1蛋白，并吹打均匀，使用毛细管吸附样品，进行检测(图1，A)。
b:半体内Pull-down实验
将NIB1构建在pEAQ-flag载体(本实验室保存)上，测序成功后，转化农杆菌：将农杆菌感受态GV3101(唯地生物)置于冰上解冻至冰水混合状态，向感受态细胞中加入1μL带有目的片段的质粒。冰上放置30min，在液氮内冷却30s，放置于37℃水浴锅内5min，冰浴3min，向感受态细胞中加入100μL液体LB培养基，在28℃培养箱内振荡培养3h。取50μL菌液，涂布于相应抗性固体培养基上，28℃培养48h，挑取单克隆即为转化成功的农杆菌。
瞬时转化烟草：提前一晚挑取单克隆到液体RKG培养基中，将培养过夜的菌液离心，5000rpm，5min，小心倒出上清液体培养基，向沉淀中加入1mL重悬液，用枪头吹打重悬得到均一重悬的菌液重悬液。使用Nano Drop测量OD600 nm并且用重悬液调节菌液浓度，单一菌体注射OD600 nm为0.6左右，两种菌液混合注射OD600 nm为1左右，混合后保证单一菌体的OD600 nm在0.5左右，使用去针头后的注射器注射烟草叶片，并做好标记。
两天后提取烟草叶片总蛋白：将0.25g烟草叶片放置于2mL含有钢珠的离心管中，于液氮中速冻，在破碎仪内将叶片完全粉碎，向管内加入1mL IP-lysis buffer，涡旋震荡1min，冰浴5min，重复3～5次，14000rpm离心10min，取上清至新离心管内，14000rpm离心10min，重复两到三次，上清即为烟草总蛋白液，测浓度后以备后续进行不同实验。与此同时需要纯化带His标签的另一个蛋白NVR1。
取50μL已经结合His重组蛋白的镍柱到1.5mL离心管中，同时加入800μL提取的烟草总蛋白，在4℃中旋转孵育3h。将孵育结束后的蛋白液，以2500rpm，4℃离心3min，小心吸走上清液。加入800μL Co-IP buffer(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，20％甘油，0.5％ NP-40，1×PIC(全式金))到离心管中，旋转5min，以2500rpm，4℃离心3min，小心吸走上清液，重复5次，加入40μL 4×蛋白Loading buffer(Tanon，180-8210D)，取20μL之后使用Flag抗体(ZSGB-BIO，TA-05)进行蛋白质免疫印迹实验。同时取结合在镍柱上的His重组蛋白和烟草叶片蛋白作为Input，分别利用His和Flag抗体进行免疫印迹实验(图1，B)。
c:Co-IP验证NVR1与NIB1在体内互作
将需要验证互作的蛋白，NVR1与NIB1分别连接与pCAMBIA1300-YFP(实验室保存)和pEAQ-FLAG载体上，分别转化农杆菌GV3101后，进行两菌液混合烟草瞬时转化步骤。2天以后，提取烟草叶片总蛋白，向总蛋白中加入30μL GFP beads(Chromotek，gta-20)，在4℃条件下，旋转孵育过夜。第二天2500rpm离心3min，轻轻吸走上清液后，加入500μL IP Lysisbuffer(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，20％甘油，0.5％ NP-40，1×PIC(全式金))，旋转孵育5min，再2500rpm离心3min，重复5次，通过蛋白质免疫印迹法使用Flag抗体就能检测到蛋白质的互作情况。同时将总蛋白作为input分别使用Flag抗体和GFP抗体进行检测(图1，C)。
d:双分子荧光素酶互补实验NIB1结合NVR1
将用于验证互作的蛋白NVR1与NIB1分别连接在JW772-35S-cLUC载体(本实验室保存)与JW771-35S-nLUC载体(本实验室保存)上。测序正确后，将两个载体分别转化进农杆菌GV3101，在含有RKG固体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g,胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g(固体)，Thermo Scientific,分别加入25mg/LKanamycin,25mg/L Gentamycin,50mg/L Kanamycin)上28℃培养两天后，挑取单克隆于4mL RKG液体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g)，28℃培养过夜后按照烟草瞬时转步骤，转化烟草叶片。并做好标记。2天后，将荧光素酶底物(D-Luciferin(potassiumsalt)，APExBIO)用1mL无针注射器注入到瞬时转化部位，将叶片放置于曝光仪内进行发光信号检测并添加伪彩(图1，D)。
实施例2，NIB1的第49位与第50位氨基酸残基对NIB1发挥作用非常重要
a:蛋白结构模拟与关键氨基酸位点突变
以烟草RNA结合蛋白NbGRP7晶体结构为参考，对NIB1进行分子模拟，获得了其可能的蛋白结构，并获取其结合2’,3’-cAMP与2’,3’-cGMP的结合位点，包括位于RRM结构域中第49和50位氨基酸残基(图2，A-C)。对这些位点相应进行定点突变(突变方法为取代突变，将基因在突变位点分段，在引物中引入突变核酸碱基，利用多段同源重组的方式进行构建载体)，并微量热泳动(MST)进行检测其结合小分子能力，结果显示，NIB1具有结合2’,3’-cAMP的能力，然而NIB1R49A与NIB1G50A结合能力减弱甚至消失(图2，D)。
b:荧光共聚焦显微镜观察NIB1在植物核中凝聚体形成情况
裁剪一定大小的烟草植物叶片，倒置放在载玻片上，加一滴ddH2O，轻轻盖上盖玻片后，吸去多余的水分；将玻片倒置放在载物台上；先使用低倍镜头找到目的视野，并移到视野中央，切换至高倍镜头，选择相应的荧光激发波长与接收波长，通过调节激发强度以及相关参数，调节Z轴，进行图像的采集。在拍摄过程中，应保证不过曝；本研究中所使用的YFP通过GFP通道采集，激发波长为488nm，接收波长为498～550nm；采集好的图像使用Image J软件进行添加标尺和量化等。对NIB1-YFP烟草叶片，进行显微镜观察，NIB1-YFP能在细胞核中形成明亮的小点，然而NIB1R49A与NIB1G50A则不能(图2，E-F)。
c:烟草表达蛋白
将构建好的载体转化农杆菌GV3101感受态细胞，平板在28℃倒置培养2天。两天后，分别挑取平板上的单克隆转移到4mL RKG液体培养基上，28℃摇床培养过夜，将小量培养的农杆菌，1∶100放大到新鲜的RKG培养基中，28℃摇床培养过夜。4℃，5000g，离心5分钟，倒掉多余的LB，用烟草瞬时重悬液重悬菌体，使得菌液OD600为0.6，在室温静置2～3h，准备注射。分别将NIB1-YFP、NIB1R49A与NIB1G50A注射烟草，两天后，结果显示注射NIB1-YFP的部位能引起植物细胞死亡，然而NIB1R49A与NIB1G50A则不能(图2，G)。
d:棉铃虫饲喂实验
大量注射NIB1-YFP、NIB1R49A与NIB1G50A后，将烟草叶片裁剪为相同大小，取相同位置且相同大小的叶片于6孔培养皿中，挑取大小相同的二龄棉铃虫(购买于河南科云生物公司)放置于培养皿中，并进行称重，期间每隔一天称重一次，并每隔一天放入相同大小的新鲜植物叶片，喂满三天后，进行称重，得到的数据减去饲喂第一天的数据，即为棉铃虫增重。结果显示NIB1提高烟草抵抗棉铃虫的能力，NIB1R49A与NIB1G50A则不能(图2，H)。
农杆菌侵染缓冲液：10mM MgCl2，10mM MES，150μM乙酰丁香酮，KOH调pH至5.8。
实施例3，NIB1加速NVR1活性
a:体外检测NIB1对NVR1活性的影响
在体外以DNA为模板，Cy5-UTP为底物，进行转录，去除DNA模板后即可得到Cy5标记的RNA，随后按照NVR1与底物1∶100，NIB1:NVR1为1:1，在25℃反应25min，加入高盐缓冲液终止酶活反应，使用酚-氯仿，异丙醇进行纯化，复溶后加入2×TBE urea loading buffer(0.5×TBE，6M尿素，0.01％溴酚蓝，15％PM 400)，95℃反应3min，立刻放置在冰上，进行尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用TYPHOON5进行扫描检测信号，利用Image J对条带进行量化。如图3，A与E显示，NIB1能明显促进NVR1催化活性，然而NIB1ΔIDR则不能。
b：高效液相色谱检测催化产物
小分子分离采用色谱柱XSelect HSS T3 XP(沃特世)，其中水相是含有2mM乙酸胺的水，有机相为含有2mM乙酸胺的甲醇。分离条件如下：
结果如图3的B，C，F，G，I与J结果显示NIB1能促进产生更多的活性小分子2’,3’-cAMP与2’,3’-cGMP，然而NIB1ΔIDR与NIB1R49A与NIB1G50A不具有这一能力。
c：烟草细胞中共同转化验证NIB1对NVR1引发坏死的影响
将构建好的载体NVR1-YFP与NIB1-YFP(YFP)共同转化农杆菌GV3101感受态细胞，平板在28℃倒置培养2天。两天后，分别挑取平板上的单克隆转移到4mL RKG液体培养基上，28℃摇床培养过夜，将小量培养的农杆菌，1∶100放大到新鲜的RKG培养基中，28℃摇床培养过夜。4℃，5000g，离心5分钟，倒掉多余的LB，用烟草瞬时重悬液重悬菌体，使得菌液OD600为1，在室温静置2～3h，每两个菌均按等体积混匀，准备注射。结果显示，同NIB1相比，NIB1ΔIDR与NIB1R49A与NIB1G50A加速NVR1坏死能力减弱(图3，D，H，K和H)。
实施实例4：NIB1能招募EDS1到凝聚体中
a：BiFC验证NIB1与EDS1相互作用
将用于验证互作的蛋白EDS1与NIB1分别连接在MSH21-35S-cGFP载体与MSH22-35S-nGFP载体上。待测序正确后，分别将两个载体分别转化农杆菌GV3101，在含有RKG固体培养基上28℃培养两天后，挑取单克隆于4mL RKG液体培养基，28℃培养过夜后按照烟草瞬时转步骤，转化烟草叶片，并做好标记。2天后，置于荧光共聚焦显微镜下观察，并采集图像，结果显示NIB1与EDS1相互作用(图4，D)。
b：共定位观察NIB1招募EDS1到细胞核凝聚体中
分别将NIB1与EDS1连接在具有YFP和mCherry载体上，待测序正确后，分别将两个载体分别转化农杆菌GV3101，在含有RKG固体培养基上28℃培养两天后，挑取单克隆于4mLRKG液体培养基，28℃培养过夜后按照1：1，转化烟草叶片，并做好标记。2天后，进行显微镜观察，结果表明，NIB1-YFP能招募EDS1-mCherry到细胞核中明亮的小体中(图4，E)。
实施实例5：NIB1正向调节植物的抗病虫能力
a：稻瘟菌离体实验
将保存的TH12稻瘟菌种(实验室保存)接种于CM固体培养基中，28°C培养10天，使用无菌水将孢子洗脱，然后利用血球计数板进行计数，将孢子浓度调整为6×105个/mL。取分蘖期的水稻叶片，将水稻嫩叶剪成约10cm长的小段，然后将叶片放入琼脂固体培养皿中，两端注意保湿，防止叶片失水，用1mL注射器针头摩擦划伤叶片表面，随后滴入10μL孢子液，随后放入接种箱中。如图5的A-C所示，NIB1正向调节植物对稻瘟病的抗性。
CM培养基配方：20×Nitrate salts(50mL),1000×Trace elements(1mL),1000×Vitamin solution(1mL),D-glucose 10g,Peptone 2g,Yease extract 1g,Casamino acid1g.10M NaOH调PH＝6.5，加ddH2O至1000mL，115℃高压蒸汽灭菌20min。如需固体培养基，每升加入15g琼脂粉。
NIB1-OE转基因植株，由武汉伯远生物提供，并负责载体、农杆菌、水稻株系、转化、培养、传代等实验过程。
b：稻纵卷叶螟虫试实验
取分蘖期的水稻叶片，将水稻嫩叶剪成约10cm长的小段，置于铺有浸湿纱布的培养皿中，每个培养皿大约铺7片叶子，并将稻纵卷叶螟三龄若虫(采集于上海市松江农场)放置与水稻叶片上，并使用纸块放置于水稻叶片两侧，每日添水补充，防止水稻干枯。三天后，对虫子体重进行称量，如图5的D-F所示，同对照组以及NIB1-OE(过表达NIB1)相比，取食NIB1-KO的植株虫子体重明显增多。
表1：本研究中所使用的引物
本文序列
SEQ ID NO:1-NIB1基因核苷酸序列ATGGCGGCGCCGGATGTCGAGTACCGCTGCTTCGTCGGCGGCCTCGCCTGGGCCACCGACGACCGCTCCCTCGAGGCCGCCTTCTCCACCTACGGCGAGATCCTCGACTCCAAGATCATCAACGACAGGGAGACGGGGAGGTCACGTGGGTTTGGCTTCGTCACCTTCTCCTCCGAGCAGTCGATGCGCGACGCCATCGAGGGCATGAACGGCAAGGAGCTCGACGGCCGCAACATCACCGTCAATGAGGCCCAGTCCCGCCGCTCCGGCGGCGGAGGCGGGGGCTACGGCGGCGGCGGTGGCGGCTACGGCGGCGGTCGTGGAGGCGGCGGCTACGGAGGAGGTGGCGGCGGCGGCTACGGGCGCCGTGAGGGCGGCTACGGCGGCGACTCCGGCGGGAACTGGAGGAAC
SEQ ID NO:2-NIB1基因氨基酸序列
MAAPDVEYRCFVGGLAWATDDRSLEAAFSTYGEILDSKIINDRETGRSRGFGFVTFSSEQSMRDAIEGMNGKELDGRNITVNEAQSRRSGGGGGGYGGGGGGYGGGRGGGGYGGGGGGGYGRREGGYGGDSGGNWRN。

Claims (10)

1.NIB1基因或其编码多肽或促进剂在增强NVR1在植物中的活性、招募EDS1到细胞核或上调植物抗病虫能力中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，
所述抗病虫选自以下的一种或多种：抗稻纵卷叶螟、抗棉铃虫、抗稻瘟菌，和/或
所述促进剂选自下组：小分子化合物、核酸分子或其组合。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述植物是禾本科植物，
优选地，所述禾本科植物是水稻，大麦、小麦、燕麦或黑麦。
4.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述NIB1基因的编码多肽选自下组：
(a)具有SEQ ID NO:2所示序列的多肽，
(b)将SEQ ID NO:2所示序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽，或
(c)与(a)的多肽序列有90％以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。
5.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述NIB1基因的核酸序列选自：
(1)如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列或与其具有80％以上同源性的多核苷酸序列，
(2)在SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列的5’端和/或3’端截短或添加1-60个核苷酸的多核苷酸序列，
(3)与(1)-(2)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
6.一种使NIB1蛋白失活的方法，包括使其第49位和/或第50位氨基酸突变，优选地，所述突变是取代或缺失突变；更优选地，第49位R突变为A，和/或第50位G突变为A。
7.增强NVR1在植物中的活性、招募EDS1到细胞核、调控植物抗病虫能力的方法，所述方法包括步骤：上调植物中NIB1基因的表达或活性，
优选地，所述抗病虫选自以下一种或多种：抗稻纵卷叶螟、抗棉铃虫、抗稻瘟菌。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述植物是禾本科植物，
优选地，所述禾本科植物是水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦，
更优选地，所述禾本科植物是水稻。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述上调植物中NIB1基因的表达或活性的步骤包括：将NIB1基因转入植物，获得转化的植物，
优选地，所述上调植物中NIB1基因的表达或活性的步骤包括：将植物的细胞或组织或器官与含有NIB1基因的核酸构建物的农杆菌接触，从而使所述核酸构建物转入植物细胞、组织或器官，
更优选地，所述核酸构建物是表达载体或重组载体，
更优选地，所述上调植物中NIB1基因的表达的方法还包括：选择出转入了NIB1基因的植物细胞、组织、器官或种子，和将所述植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。
10.NIB1基因作为靶点在筛选潜在试剂中的用途，所述潜在试剂能提高NVR1在植物中的活性、招募EDS1到细胞核、增强植物抗病虫能力。
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