CN120519528A - 生产色胺的方法 - Google Patents

生产色胺的方法

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CN120519528A
CN120519528A CN202510643283.XA CN202510643283A CN120519528A CN 120519528 A CN120519528 A CN 120519528A CN 202510643283 A CN202510643283 A CN 202510643283A CN 120519528 A CN120519528 A CN 120519528A
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cell
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瑞恩·普罗茨科
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Compass Pathfinder Ltd
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Abstract

本申请涉及生产色胺的方法。本文公开了经遗传改变以生物合成色胺和色胺衍生物的原核和真核微生物，包括大肠杆菌和酿酒酵母。可以对本公开的微生物进行工程改造以使之包含质粒和稳定的基因整合，所述基因整合含有足以将邻氨基苯甲酸或吲哚转化为色胺的遗传信息。在全细胞生物催化剂的存在下发酵生产取代色胺可用于经济有效地生产这些化合物以用于治疗用途。

Description

生产色胺的方法
本申请是申请日为2019年3月8日，申请号为201980031159.0，发明名称为“生产色胺的方法”的申请的分案申请。
交叉引用
本申请要求2018年3月8日提交的第62/640,443号美国临时申请的权益，该临时申请通过引用整体并入本文。
序列表
本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且通过引用整体并入本文。创建于2019年3月8日的所述ASCII副本被命名为54033-701_601_SL.txt，大小为201,114个字节。
背景技术
色胺是单胺生物碱。它包含吲哚环结构，并且在结构上类似于其名称所源自的氨基酸色氨酸。在哺乳动物的大脑中发现了痕量的色胺，据推测它起到神经调质或神经递质的作用。色胺是统称为取代色胺的一组化合物中的共同官能团。这组化合物包括许多生物活性化合物，包括神经递质和精神治疗药物。
发明内容
在一方面，提供了一种产生色胺的微生物细胞，该微生物细胞中含有一种或多种异源核酸序列，所述异源核酸序列编码一种或多种参与将邻氨基苯甲酸转化为色胺的生物合成途径的酶。
在另一方面，提供了一种产生色胺的微生物细胞，该微生物细胞中含有一种或多种异源核酸序列，所述异源核酸序列编码一种或多种参与将吲哚转化为色胺的生物合成途径的酶。
在另一方面，提供了一种产生色胺的微生物细胞，该微生物细胞中含有一种或多种异源核酸序列，所述异源核酸序列编码一种或多种参与将色氨酸转化为色胺的生物合成途径的酶。
在一些情况下，所述邻氨基苯甲酸是取代的邻氨基苯甲酸。在一些情况下，所述邻氨基苯甲酸是：
其中：
-每个R独立地为氢、卤素、-OH、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、NO2、NH、COOH、CN、硫、SO3、SO4或PO4。
在一些情况下，所述吲哚是取代的吲哚。在一些情况下，所述吲哚是：
其中：
-每个R独立地为卤素、-OH、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、NO2、NH、COOH、CN、硫、SO3、SO4或PO4。
在一些情况下，所述色胺是取代色胺。在一些情况下，所述色胺是：
其中：
-每个R独立地为氢、卤素、-OH、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、NO2、NH、COOH、CN、硫、SO3、SO4或PO4。
在一些情况下，所述一种或多种酶包括以下一种或多种：trpD、trpB、trpC和trpA。在一些情况下，所述一种或多种异源核酸序列包含编码trpD、trpB、trpC和trpA中的至少两个的多顺反子操纵子。在一些情况下，所述多顺反子操纵子具有与SEQ ID NO:1-4中的任一个具有至少80％序列同一性的核酸序列。在一些情况下，所述trpD包含与SEQ ID NO:5-7中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所述trpC包含与SEQ IDNO:8和9中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所述trpB包含与SEQ ID NO:10和11中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所述trpA包含与SEQ ID NO:12和13中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所述一种或多种酶包括脱羧酶。在一些情况下，所述脱羧酶是色氨酸脱羧酶。在一些情况下，所述色氨酸脱羧酶包含与SEQ ID NO:14-20中的任一个具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所述一种或多种酶包括转移酶。在一些情况下，所述转移酶选自：色胺N-甲基转移酶、色胺苯甲酰基转移酶、5-羟色胺N-乙酰基转移酶、多巴胺N-乙酰基转移酶、芳基烷基胺N-乙酰基转移酶和色胺羟基肉桂酰基转移酶。在一些情况下，所述转移酶包含与SEQ ID NO:21-31或46中的任一个具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所述一种或多种酶包括色胺4-羟化酶。在一些情况下，所述色胺4-羟化酶包含与SEQ ID NO:32-35中的任一个具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所述一种或多种酶包括P450还原酶。在一些情况下，所述P450还原酶包含与SEQ ID NO:36-40中的任一个具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所述一种或多种酶包括激酶。在一些情况下，所述激酶包含与SEQID NO:41-44中的任一个具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所述邻氨基苯甲酸是由所述微生物细胞生物合成产生的。在一些情况下，将所述邻氨基苯甲酸进料至所述工程化微生物细胞。在一些情况下，所述邻氨基苯甲酸是5-溴邻氨基苯甲酸、6-羟基邻氨基苯甲酸、5-羟基邻氨基苯甲酸、6-氯邻氨基苯甲酸或5-氯邻氨基苯甲酸。在一些情况下，所述吲哚是由所述微生物细胞生物合成产生的。在一些情况下，将所述吲哚进料至所述工程化微生物细胞。在一些情况下，所述吲哚选自：5-羟基吲哚、4-羟基吲哚、7-羟基吲哚和4-氯吲哚、5-溴吲哚或4-氟吲哚。在一些情况下，所述微生物细胞在培养液中分泌所述色胺。在一些情况下，所述色胺选自图4、图6或图8所述的任何色胺。在一些情况下，所述色胺选自：色胺、5-羟基色胺、5-羟基甲基色胺、5-羟基-N,N-二甲基色胺、5-磷酰氧基甲基色胺、5-磷酰氧基-N,N-二甲基色胺、4-羟基色胺、4-羟基-N,N-二甲基色胺、4-磷酰氧基色胺、4-磷酰氧基-N,N-色胺、7-羟基色胺、7-磷酰氧基甲基色胺、7-磷酰氧基-N,N-二甲基色胺、4-氯-色胺、4-氯-N,N-二甲基色胺、5-溴色胺、5-溴-甲基色胺、5-溴-N-甲基色胺、5-溴-N,N-二甲基色胺、N-乙酰基-色胺、4-羟基-N-乙酰基-色胺。在一些情况下，所述微生物细胞是真核细胞。在一些情况下，所述微生物细胞是酵母细胞。在一些情况下，所述酵母细胞是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)种的细胞。在一些情况下，所述酵母细胞不表达芳香族氨基转移酶I(aro8)和苯丙酮酸脱羧酶(aro10)中的一种或多种。在一些情况下，所述酵母细胞过表达磷酸核糖基邻氨基苯甲酸异构酶(TRP1)、邻氨基苯甲酸合酶(TRP2)、吲哚-3-甘油磷酸合酶(TRP3)、邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶(TRP4)和色氨酸合酶(TRP5)中的一种或多种。在一些情况下，所述酵母细胞过表达磷酸核糖基邻氨基苯甲酸异构酶(TRP1)、邻氨基苯甲酸合酶(TRP2)、吲哚-3-甘油磷酸合酶(TRP3)、邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶(TRP4)和色氨酸合酶(TRP5)中的一种或多种的突变体。在一些情况下，所述酵母细胞具有所述一种或多种异源核酸序列的两个或更多个拷贝，并且它们协同作用。在一些情况下，所述微生物细胞是原核细胞。在一些情况下，所述微生物细胞是细菌细胞。在一些情况下，所述细菌细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)种的细胞。在一些情况下，所述细菌细胞不表达色氨酸酶(tna)、色氨酸阻抑元件(trpR)或邻氨基苯甲酸合酶(trpE)基因中的一种或多种。在一些情况下，所述一种或多种异源核酸序列的至少一个拷贝稳定地整合到所述微生物细胞的基因组中。在一些情况下，所述一种或多种异源核酸序列的两个或更多个拷贝稳定地整合到所述微生物细胞的基因组中。在一些情况下，所述一种或多种异源核酸序列的所述两个或更多个拷贝来自相同的序列。在一些情况下，所述一种或多种异源核酸序列的所述两个或更多个拷贝来自不同的序列。
在另一方面，提供了一种合成色胺的方法，该方法包括：在邻氨基苯甲酸的存在下培养根据前述任一项的微生物细胞，从而合成色胺。在一些情况下，该方法进一步包括将邻氨基苯甲酸进料至所述微生物细胞。在一些情况下，所述邻氨基苯甲酸是由所述微生物细胞生物合成产生的。在一些情况下，所述邻氨基苯甲酸是取代的邻氨基苯甲酸。
在另一方面，提供了一种合成色胺的方法，该方法包括：在吲哚的存在下培养根据前述任一项的微生物细胞，从而合成色胺。在一些情况下，该方法进一步包括将吲哚进料至所述微生物细胞。在一些情况下，所述吲哚是由所述微生物细胞生物合成产生的。在一些情况下，所述吲哚是取代的吲哚。
在另一方面，提供了一种合成色胺的方法，该方法包括：在色氨酸的存在下培养前述任一项的微生物细胞，从而合成色胺。在一些情况下，该方法进一步包括将色氨酸进料至所述微生物细胞。在一些情况下，所述色氨酸是由所述微生物细胞生物合成产生的。
在一些情况下，前述的任何方法进一步包括从培养物中纯化色胺。
在另一方面，提供了一种微生物细胞，其中含有一种或多种异源核酸序列，所述异源核酸序列编码一种或多种参与将色胺转化为色胺衍生物的生物合成途径的酶。在一些情况下，所述一种或多种酶包括色胺4-羟化酶。在一些情况下，所述色胺4-羟化酶包含与SEQID NO:32-35中的任一个具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所述一种或多种酶包括色胺5-羟化酶。在一些情况下，所述色胺5-羟化酶包含与SEQ ID NO:47具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所述一种或多种酶包括4-羟基色胺激酶。在一些情况下，所述4-羟基色胺激酶包含与SEQ ID NO:41-44中的任一个具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所述色胺是取代色胺。在一些情况下，所述色胺选自：5-甲氧基-N,N-二甲基-色胺、N,N-二异丙基-色胺、N-甲基-N-异丙基色胺、N,N-二甲基色胺、N,N-四亚甲基色胺、N,N-二丙基色胺、4-羟基-N,N-二甲基色胺、色胺、4-羟基色胺、5-羟基色胺、伊波加明(ibogamine)、4-羟基伊波加明和5-羟基伊波加明。在一些情况下，所述色胺衍生物是图16所述的任何色胺衍生物。在一些情况下，所述色胺衍生物选自：5-羟基-N,N-二异丙基-色胺、5-羟基-N-甲基-N-异丙基色胺、5-羟基-N,N-二甲基色胺、5-羟基-N,N-四亚甲基色胺、5-羟基-N,N-二丙基色胺、4,5-甲氧基-N,N-二甲基-色胺、4-羟基-N,N-二异丙基-色胺、4-羟基-N-甲基-N-异丙基色胺、4-羟基-N,N-二甲基色胺、4-羟基-N,N-四亚甲基色胺、4-羟基-N,N-二丙基色胺、4-磷酰氧基-N,N-二丙基色胺、4-羟基色胺、5-羟基色胺、4-甲氧基色胺、5-甲氧基色胺、4-磷酰氧基色胺、5-磷酰氧基色胺、4-羟基伊波加明、5-羟基伊波加明、4-磷酰氧基伊波加明和5-磷酰氧基伊波加明。
在另一方面，提供了一种从色胺合成色胺衍生物的方法，该方法包括：在色胺的存在下培养根据前述任一项的微生物细胞，从而合成色胺衍生物。在一些情况下，该方法进一步包括从培养物中纯化色胺衍生物。
在又一方面，提供了一种载体，其包含一种或多种编码一种或多种酶的异源核酸序列，所述酶包含与SEQ ID NO:5-49中的任一个具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在又一方面，提供了一种微生物细胞，其中含有一种或多种编码来自色胺合成途径的酶或其功能片段的异源核酸序列，所述酶或其功能片段包含与SEQ ID NO:5-49中的任一个具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在另一方面，提供了一种针对前述任何微生物细胞内的4-羟基色胺的水平进行筛选的方法，该方法包括：检测所述微生物细胞内的4-羟基色胺的颜色或荧光产物。在一些情况下，所述4-羟基色胺在所述微生物细胞内被氧化，从而产生氧化的4-羟基色胺。在一些情况下，所述氧化的4-羟基色胺与所述微生物细胞内合成的4-羟基色胺的水平成正比。在一些情况下，所述氧化的4-羟基色胺的氧化是由硫酸铁催化的。在一些情况下，所述氧化的4-羟基色胺的氧化是由所述微生物细胞表达的酶所催化的。在一些情况下，所述酶包含与SEQID NO:45具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在另一方面，提供了一种将邻氨基苯甲酸转化为色胺的方法，该方法包括在一种或多种参与将邻氨基苯甲酸转化为色胺的生物合成途径的酶的存在下孵育所述邻氨基苯甲酸。
在又一方面，提供了一种将吲哚转化为色胺的方法，该方法包括在一种或多种参与将吲哚转化为色胺的生物合成途径的酶的存在下孵育所述吲哚。
在又一方面，提供了一种将色氨酸转化为色胺的方法，该方法包括在一种或多种参与将色氨酸转化为色胺的生物合成途径的酶的存在下孵育所述色氨酸。
在又一方面，提供了一种将色胺转化为衍生色胺的方法，该方法包括在一种或多种参与将色胺转化为衍生色胺的生物合成途径的酶的存在下孵育所述色胺。
在一些情况下，前述方法在不存在生物细胞的情况下进行。在一些情况下，前述方法在体外条件下进行。在一些情况下，前述方法在无细胞条件下进行。在一些情况下，前述方法在细胞裂解物中进行。
援引并入
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度犹如具体地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
附图说明
本发明的一些新颖特征在所附权利要求书中阐述。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会对本发明的特征和优点获得更好的理解，在这些附图中：
图1描绘了根据本公开的实施方案，适于在细菌中过表达细菌色氨酸操纵子的质粒图谱的非限制性实例。质粒是中等拷贝(p15a)，并且含有氨苄青霉素抗性。TrpD、trpC、trpB和trp A在多顺反子操纵子中表达(例如，SEQ ID NO:1)。
图2描绘了根据本公开的实施方案，适于在细菌中过表达裸盖菇素(psilocybin)合酶(例如，SEQ ID NO:21)、色氨酸脱羧酶(例如，SEQ ID NO:14)和4-羟基色胺蛋白酶(例如，SEQ ID NO:41)的质粒图谱的非限制性实例。
图3描绘了根据本公开的实施方案，适于通过色氨酸脱羧酶(例如，SEQ ID NO:19)和乙醇胺甲基转移酶(例如，SEQ ID NO:25)的过表达而在细菌中产生N-甲基衍生物的质粒图谱的非限制性实例。
图4描绘了根据本公开的实施方案，由进料取代的邻氨基苯甲酸或吲哚化合物的工程化细菌细胞产生的取代色胺的非限制性实例。
图5描述了根据本公开的实施方案，适于通过色氨酸脱羧酶(例如，SEQ ID NO:19)、4-羟基色胺激酶(例如，SEQ ID NO:41)、裸盖菇素合酶(例如，SEQ ID NO:21)和色胺4-羟化酶(例如，SEQ ID NO:33)的过表达而在酵母中产生N-甲基色胺衍生物的质粒图谱的非限制性实例。
图6描绘了根据本公开的实施方案，通过pRJP1608中编码的酶将酵母代谢中存在的邻氨基苯甲酸转化为色胺的生物合成途径的非限制性实例。
图7描绘了根据本公开的实施方案，通过色氨酸脱羧酶(例如，SEQ ID NO:19)、色胺4-羟化酶(例如，SEQ ID NO:33)和N-乙酰基转移酶(例如，SEQ ID NO:28)的过表达而在酵母中产生N-乙酰基色胺衍生物的质粒图谱的非限制性实例。
图8描绘了根据本公开的实施方案，通过pRJP1618中编码的酶将酵母代谢中存在的邻氨基苯甲酸转化为色胺的生物合成途径的非限制性实例。
图9描绘了根据本公开的实施方案，来源于工程化酵母细胞的4-羟基-N,N-二甲基-色胺的串联质谱分析(MS/MS)的非限制性实例。
图10描绘了根据本公开的实施方案，来源于工程化酵母细胞的裸盖菇素的串联质谱分析(MS/MS)的非限制性实例。
图11描绘了根据本公开的实施方案，来源于工程化酵母细胞的N-乙酰基色胺的串联质谱分析(MS/MS)的非限制性实例。
图12描绘了根据本公开的实施方案，来源于工程化酵母细胞的4-羟基-N-乙酰基色胺的串联质谱分析(MS/MS)的非限制性实例。
图13描绘了根据本公开的实施方案，用于在酵母中过表达色胺4-羟化酶(例如，SEQ ID NO:33)的质粒图谱的非限制性实例。
图14描绘了根据本公开的实施方案，用于在酵母中过表达色胺5-羟化酶(例如，SEQ ID NO:47)的质粒图谱的非限制性实例。
图15描绘了根据本公开的实施方案，用于在酵母中过表达4-羟基色胺激酶(例如，SEQ ID NO:41)的质粒图谱的非限制性实例。
图16描绘了根据本公开的实施方案，使用工程化酵母从进料的色胺产生取代色胺的非限制性实例。
图17描绘了根据本公开的实施方案，作为酵母中羟化酶活性的指标的比色筛选测定的非限制性实例。
图18A描绘了将色胺转化为色胺衍生物的生物合成途径的非限制性实例。
图18B描绘了将伊波加明转化为伊波加明衍生物的生物合成途径的非限制性实例。
具体实施方式
本公开涉及含有异源DNA的微生物，其可用于生产具有4-、5-、6-或7-吲哚取代和/或R1或R2胺取代的色胺。此外，本公开涉及用于优化生产、进行生产和回收这类取代色胺的方法。本文提供的公开内容提供了用于生产各种化合物如色胺的方法。本公开进一步提供了原核和真核微生物，包括细菌(例如，大肠杆菌)和酵母(例如，酿酒酵母)，其可以被遗传改变以包含编码可提供用于在体内合成色胺和/或取代色胺的生物合成途径的生物分子的异源序列。在一些方面，本公开提供了可以被工程改造为包含质粒和稳定的基因整合的微生物，所述稳定的基因整合含有足以将邻氨基苯甲酸或取代的邻氨基苯甲酸和/或吲哚或取代的吲哚转化为各自的色胺或取代色胺的遗传信息。在全细胞生物催化剂的存在下发酵生产取代色胺可用于经济有效地生产这些化合物以用于治疗用途。
色胺是从其名称所源自的色氨酸衍生而来的天然存在的单胺生物碱。色胺家族中的类似物在吲哚环结构和胺基团处含有取代。该化合物家族包含精神活性成员，包括N,N-二甲基色氨酸(DMT)、5-甲氧基-N,N-二甲基色胺(5-MeO-DMT)、4-羟基二甲基色氨酸(psilocin)及其4-O-磷酸酯——裸盖菇素(Hofmann等人.1959)。Psilocin可充当5HT1a、5HT2a和5HT2c受体的部分激动剂(Hasler等人.2004)。裸盖菇属(Psilocybe)和其他属的几种担子菌真菌以生物合成方式产生取代色胺，包括裸盖菇素、psilocin、norpsilocin、baeocystin、norbaeocystin和aeruginascin(Lenz,Wick和Hoffmeister 2017)。化合物N,N-二甲基色胺在自然界中普遍存在，并由许多植物和动物产生(Carbonaro和Gatch2016)。取代色胺也可以是合成产生的，包括曲普坦类(tryptans)(例如，佐米曲普坦(Zolmitriptan)和舒马曲普坦(Sumatriptan))，它们是化学合成的，并用作用来治疗偏头痛和丛集性头痛的药物(Derry,Derry和Moore 2014)。
诸如psilocin等色胺可导致人类受试者的知觉和情绪发生深刻变化。已发现施用高剂量的裸盖菇素可靠地引发神秘的经历，从而导致生活质量的显著且持久的改善(Griffiths等人.2006)。结论是，对于9名重度、难治性强迫症患者，裸盖菇素给药是安全且良好耐受的，并且可能与核心症状的“强有力的急性减轻”相关(Moreno等人.2006)。
由于其复杂的结构，即使大规模生产，也难以在商业上以经济上可行的价格获得色胺及其各自的取代类似物。存在几种有机化学方法用于生产取代色胺，包括裸盖菇素。Albert Hoffmann博士最初于1958年发表了裸盖菇素的有机合成(Hofmann等人.1958)。然而，其使用了危险的试剂对吲哚环-4位置处的磷酸进行磷酸化，后来对该合成进行了改进(Hofmann,A.&Troxler,F.1963.Esters of Indoles(美国专利3,075,992)，Basel,Switzerland:Sandoz Ltd.)。David E Nichols博士采用了这种生产方法进行早期临床试验，但是生产成本很高(Nichols 2014)。
从天然产生所述化合物的担子菌真菌组织中提取色胺不适合于大规模生产。据报道，蘑菇古巴光盖伞(Psilocybe cubensis)中裸盖菇素的浓度低于干细胞重量的1％(J.Gartz 1994)，对提取和纯化提出了挑战。此外，这种真菌组织的培养需要长达一个月的时间规模，并且会引起供应挑战(Jochen Gartz,Allen和Merlin 1994)。此外，天然组织的使用排除了产生具有治疗性质的新颖且非天然色胺化合物的能力。
本公开提供了从廉价的培养基组分以高产率产生取代色胺的方法和材料。本公开的方法导致产生自然界中非天然存在的色胺衍生物或合成化学无法获得的色胺衍生物。在一些情况下，所公开的色胺衍生物可具有有利的药理作用(例如，半衰期、适应症等)。本文所述方法的其他优点包括使用用于产生几种取代色胺类似物的单一生物催化剂，以及在发酵中稳健并且可以自我再生以便易于在生产过程中使用的全细胞催化剂。
因此，本发明的目的是提供生物合成产生4-、5-、6-或7-吲哚取代的和/或R1或R2胺取代的色胺的新方法。
在本公开的一些情况下，可以通过工程化微生物细胞从相应的取代的邻氨基苯甲酸和吲哚生物合成产生4-、5-、6-或7-吲哚取代的和/或R1或R2胺取代的色胺。取代的邻氨基苯甲酸和吲哚与它们各自的取代色胺相比，可广泛获得，种类繁多，且价格便宜。
在本公开的其他方面，提供了一种将邻氨基苯甲酸转化为色胺的方法，该方法包括在一种或多种参与将邻氨基苯甲酸转化为色胺的生物合成途径的酶的存在下孵育邻氨基苯甲酸。在本公开的其他方面，提供了一种将吲哚转化为色胺的方法，该方法包括在一种或多种参与将吲哚转化为色胺的生物合成途径的酶的存在下孵育吲哚。在本公开的其他方面，提供了一种将色氨酸转化为色胺的方法，该方法包括在一种或多种参与将色氨酸转化为色胺的生物合成途径的酶的存在下孵育色氨酸。在本公开的其他方面，提供了一种将色胺转化为衍生色胺的方法，该方法包括在一种或多种参与将色胺转化为衍生色胺的生物合成途径的酶的存在下孵育色胺。在一些情况下，该方法可以在生物细胞内进行(例如，通过本文所述的工程化微生物细胞)。在其他情况下，该方法可以在不存在生物细胞的情况下进行。在一些情况下，该方法可以在体外条件下进行。在一些情况下，该方法可以在无细胞条件下进行。在一些情况下，该方法可以在细胞裂解物中进行。
在工程化微生物细胞中由取代的邻氨基苯甲酸合成取代色胺。
在本公开的一个方面，本文所述的方法导致产生在胺处具有R1或R2取代的4-、5-、6-或7-吲哚取代的色胺。在一些情况下，邻氨基苯甲酸或3-、4-、5-或6-取代的邻氨基苯甲酸可用来制备具有R1或R2取代的4-、5-、6-或7-吲哚取代的色胺。在一些情况下，该过程可以在全细胞微生物发酵中进行。在一些情况下，可以在邻氨基苯甲酸或取代的邻氨基苯甲酸的存在下培养工程化微生物细胞(例如，可以将邻氨基苯甲酸或取代的邻氨基苯甲酸进料至微生物细胞或以其他方式与微生物细胞一起孵育)。在其他情况下，可由微生物细胞生物合成地产生邻氨基苯甲酸或取代的邻氨基苯甲酸。例如，微生物细胞可天然地产生邻氨基苯甲酸或取代的邻氨基苯甲酸(例如，作为中心碳代谢的一部分)。在其他情况下，可以工程改造微生物细胞以产生邻氨基苯甲酸或取代的邻氨基苯甲酸(例如，通过过表达用于产生取代的邻氨基苯甲酸的酶)。
下面的方案1描绘了在工程化微生物细胞中由邻氨基苯甲酸或取代的邻氨基苯甲酸合成取代色胺的非限制性实例。
方案1：
在一些方面，本公开提供了一种通过在邻氨基苯甲酸或取代的邻氨基苯甲酸的存在下培养工程化微生物来产生取代色胺的方法，
其中-R为但不限于卤素(-Br、-F、-Cl、-I等)、-OH、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、NO2、NH、COOH、CN、硫、SO3、SO4或PO4。所得的取代色胺
可以从培养液中回收。在一些情况下，利用在发酵生物合成过程中并入到色胺支架中的化学离去基团或保护基，所得的色胺可以在进一步的下游化学反应中使用。
在本公开的另一方面，可以使用吲哚或4-、5-、6-或7-取代的吲哚来制备具有R1或R2取代的4-、5-、6-或7-吲哚取代的色胺。在一些情况下，该过程可以在全细胞微生物发酵中进行。在一些情况下，工程化微生物细胞可以在吲哚或取代的吲哚的存在下培养(例如，可以将吲哚或取代的吲哚进料至微生物细胞或以其他方式与微生物细胞一起孵育)。在其他情况下，吲哚或取代的吲哚可以由微生物细胞生物合成产生。例如，微生物细胞可以天然地产生吲哚或取代的吲哚。在其他情况下，可以工程改造微生物细胞以产生吲哚或取代的吲哚(例如，通过过表达用于产生取代的吲哚的酶)。
在工程化微生物细胞中由吲哚或取代的吲哚合成取代色胺。
方案2描绘了在工程化微生物细胞中由吲哚或取代的吲哚合成取代色胺的非限制性实例。
方案2
在一些方面，本公开提供了一种通过在吲哚或取代的吲哚的存在下培养工程化微生物来产生取代色胺的方法，
其中-R为但不限于卤素(-Br、-F、-Cl、-I等)、-OH、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、NO2、NH、COOH、CN、硫、SO3、SO4或PO4。所得的取代色胺
可以从培养液中回收。在一些情况下，利用在发酵生物合成过程中并入到色胺支架中的化学离去基团或保护基，所得的色胺可以在进一步的下游化学反应中使用。
在工程化微生物细胞中由邻氨基苯甲酸或取代的邻氨基苯甲酸合成取代色胺。
方案3
在一些方面，本文所述的过程可以包括使用工程化微生物从邻氨基苯甲酸或取代的邻氨基苯甲酸产生取代色胺。方案3描绘了在工程化微生物细胞中由取代的邻氨基苯甲酸产生取代色胺的非限制性实例。在一些情况下，该工程化微生物细胞可以是细菌细胞。在一些情况下，该细菌可以是大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。在一些情况下，该细菌可包含修饰的宿主遗传学，包括tna(色氨酸酶)、trpR(色氨酸阻抑元件)和trpE(邻氨基苯甲酸合酶)的敲除。在一些情况下，该工程化微生物细胞可以是酵母细胞。在一些情况下，该酵母细胞可以是酿酒酵母种的细胞。在一些情况下，可以进一步修饰该微生物细胞以使之表达或过表达一种或多种基因。在一些情况下，可以通过内源或异源trpDCBA操纵子的质粒或基因组整合来工程改造该微生物细胞，以使其含有额外的DNA拷贝。在一些情况下，该trpDCBA操纵子可包含SEQ ID NO:1-4中的任一个。在一些情况下，该trpDCBA操纵子可以包含与SEQ ID NO:1-4中的任一个具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的核酸序列。在一些情况下，该工程化微生物细胞可以产生一种或多种酶，所述酶具有根据SEQ ID NO:5-13中的任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5-13中的任一个具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，该工程化微生物细胞可以产生trpD、trpB、trpC或trpA中的一种或多种，其中该酶已被修饰或突变以显示更高水平的活性。
在一些情况下，可以进一步工程改造微生物细胞以使之表达或过表达一种或多种另外的基因。在一些方面，这样的微生物细胞可以进一步表达色胺脱羧酶(参见方案3，“脱羧酶”)。在一些情况下，可以通过DNA的基因组整合或质粒在微生物细胞中的表达来表达色胺脱羧酶。色胺脱羧酶可以不依赖于磷酸吡哆醛(PLP)，或者可以依赖于PLP。在一些情况下，色胺脱羧酶可包含根据SEQ ID NO:14-20(参见表2)的氨基酸序列中的任一个，或与SEQID NO:14-20中的任一个氨基酸序列具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，工程化微生物细胞可表达已被修饰或突变以显示较高活性水平的色胺脱羧酶。
在一些情况下，发酵产生的色胺或取代色胺的R1和R2氨基位置可以通过转移酶进行修饰，作为非限制性实例，产生N-甲基、N,N-二甲基、N-乙酰基或N-羟基肉桂酰基官能团。因此，在一些情况下，工程化微生物细胞可进一步表达或过表达转移酶(参见方案3)。在一些情况下，转移酶可包含SEQ ID NO:21-31(参见表2)中所示的任一个氨基酸序列，或与SEQID NO:21-31中的任一个氨基酸序列具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，工程化微生物细胞可表达已被修饰或突变以显示更高活性水平的转移酶。
在一些情况下，可以表达另外的转移酶，诸如但不限于磷酸转移酶(激酶)、乙酰基转移酶、葡糖基转移酶或磺基转移酶，以进一步修饰色胺的吲哚环上的羟基。例如，当在6-羟基邻氨基苯甲酸或4-羟基吲哚的存在下培养工程化细胞以产生4-羟基-N,N-二甲基色胺时，可以表达激酶，从而生成4-羟基-N,N-二甲基色胺的磷酸酯——裸盖菇素。合适的激酶可包括但不限于SEQ ID NO:41-44(参见表2)中的任一个所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:41-44中的任一个氨基酸序列具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，所述取代的邻氨基苯甲酸可以是5-溴邻氨基苯甲酸、6-羟基邻氨基苯甲酸、5-羟基邻氨基苯甲酸、6-氯邻氨基苯甲酸和5-氯邻氨基苯甲酸中的任何一种。在一些情况下，所述色胺可以是色胺、5-羟基色胺、5-羟基甲基色胺、5-羟基-N,N-二甲基色胺、5-磷酰氧基甲基色胺、5-磷酰氧基-N,N-二甲基色胺、4-羟基色胺、4-羟基-N,N-二甲基色胺、4-磷酰氧基色胺、4-磷酰氧基-N,N-色胺、7-羟基色胺、7-磷酰氧基甲基色胺、7-磷酰氧基-N,N-二甲基色胺、4-氯-色胺、4-氯-N,N-二甲基色胺、5-溴色胺、5-溴-甲基色胺、5-溴-N-甲基色胺、5-溴-N,N-二甲基色胺、N-乙酰基-色胺和4-羟基-N-乙酰基-色胺中的任何一种。
在工程化微生物细胞中由吲哚或取代的吲哚合成取代色胺。
方案4
在一些方面，本文所述的过程可包括使用工程化微生物从吲哚或取代的吲哚产生取代色胺。方案4描绘了在工程化微生物细胞中由取代的吲哚产生取代色胺的非限制性实例。在一些情况下，该工程化微生物可以是细菌细胞。在一些情况下，该细菌细胞可以是大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌种的细胞。在一些情况下，该细菌细胞可包含修饰的宿主遗传学，包括tna(色氨酸酶)、trpR(色氨酸阻抑元件)和trpE(邻氨基苯甲酸合酶)的敲除。在一些情况下，该微生物细胞可以是酵母细胞。在一些情况下，该酵母细胞可以是酿酒酵母种的细胞。
在一些情况下，可以进一步修饰所述微生物细胞以使之表达或过表达一种或多种基因。在一些情况下，可以通过内源或异源trpB和trp A的质粒或基因组整合来工程改造该微生物细胞，以使其含有额外的DNA拷贝(参见，例如方案4)。在一些情况下，trpB和trpA可包含根据SEQ ID NO:5-13(参见表2)中的任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5-13所示的任何氨基酸序列具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，工程化微生物细胞可以表达已被修饰或突变以显示更高活性水平的trpB和/或trpA。
在一些情况下，可以进一步工程改造微生物细胞以使之表达或过表达一种或多种另外的基因。在一些方面，这样的微生物细胞可以进一步表达色胺脱羧酶(参见，例如方案4，“脱羧酶”)。在一些情况下，可以通过DNA的基因组整合或质粒在微生物细胞中的表达来表达色胺脱羧酶。色胺脱羧酶可以不依赖于磷酸吡哆醛(PLP)，或者可以依赖于PLP。在一些情况下，色胺脱羧酶可包含根据SEQ ID NO:14-20(参见表2)的任一个氨基酸序列，或与SEQID NO:14-20中的任一个氨基酸序列具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，工程化微生物细胞可表达已被修饰或突变以显示较高活性水平的色胺脱羧酶。
在一些情况下，发酵产生的色胺或取代色胺的R1和R2氨基位置可以通过转移酶进行修饰，作为非限制性实例，产生N-甲基、N,N-二甲基、N-乙酰基或N-羟基肉桂酰基官能团。因此，在一些情况下，工程化微生物细胞可进一步表达或过表达转移酶(参见，例如方案4)。在一些情况下，转移酶可包含SEQ ID NO:21-31(参见表2)中所示的任一个氨基酸序列，或与SEQ ID NO:21-31中的任一个氨基酸序列具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，工程化微生物细胞可表达已被修饰或突变以显示更高活性水平的转移酶。在一些情况下，可以表达另外的转移酶，诸如但不限于磷酸转移酶(激酶)、乙酰基转移酶、葡糖基转移酶或磺基转移酶，以进一步修饰色胺的吲哚环上的羟基。例如，当在6-羟基邻氨基苯甲酸或4-羟基吲哚的存在下培养工程化细胞以产生4-羟基-N,N-二甲基色胺时，可以表达激酶，从而生成4-羟基-N,N-二甲基色胺的磷酸酯——裸盖菇素。合适的激酶可包括但不限于SEQ ID NO:41-44(参见表2)中的任一个所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:41-44中的任一个氨基酸序列具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，所述取代的吲哚可以是5-羟基吲哚、4-羟基吲哚、7-羟基吲哚以及4-氯吲哚、5-溴吲哚和4-氟吲哚中的任何一种。在一些情况下，所述色胺可以是色胺、5-羟基色胺、5-羟基甲基色胺、5-羟基-N,N-二甲基色胺、5-磷酰氧基甲基色胺、5-磷酰氧基-N,N-二甲基色胺、4-羟基色胺、4-羟基-N,N-二甲基色胺、4-磷酰氧基色胺、4-磷酰氧基-N,N-色胺、7-羟基色胺、7-磷酰氧基甲基色胺、7-磷酰氧基-N,N-二甲基色胺、4-氯-色胺、4-氯-N,N-二甲基色胺、5-溴色胺、5-溴-甲基色胺、5-溴-N-甲基色胺、5-溴-N,N-二甲基色胺、N-乙酰基-色胺和4-羟基-N-乙酰基-色胺中的任何一种。
通过工程化微生物细胞从色氨酸合成4-羟基取代的和/或R1或R2胺取代的色胺
方案5
在另一方面，根据方案5，可以通过工程化微生物细胞从色氨酸生物合成产生4-羟基取代的和/或R1或R2胺取代的色胺。
在一些情况下，微生物细胞可以在质粒上或通过整合到基因组中包含异源DNA，该异源DNA表达将L-色氨酸转化为色胺的酶(例如，脱羧酶)和/或将色胺转化为4-羟基色胺的酶(例如，色氨酸4-羟化酶)。脱羧酶可以不依赖于磷酸吡哆醛(PLP)或依赖于PLP。
在一些情况下，可以工程改造微生物细胞以使之表达或过表达脱羧酶。在一些情况下，该脱羧酶可具有SEQ ID NO:14-20(参见表2)中的任一个的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:14-20中的任一个氨基酸序列具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，工程化微生物细胞可表达已被修饰或突变以显示更高活性水平的脱羧酶。
在一些情况下，可以工程改造微生物细胞以使之表达或过表达色胺4-羟化酶。色胺4-羟化酶是P450酶，其需要P450还原酶对通过从NADPH转移电子来提供还原能力。在一些情况下，该色胺4-羟化酶可具有根据SEQ ID NO:32-35(参见表2)中的任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:32-35中的任一个氨基酸序列具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，工程化微生物细胞可表达已被修饰或突变以显示更高活性水平的色胺4-羟化酶。
在一些情况下，可以工程改造微生物细胞以使之表达或过表达P450还原酶。在一些情况下，该P450还原酶可具有根据SEQ ID NO:36-40(参见表2)中的任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:36-40中的任一个具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，工程化微生物细胞可表达已被修饰或突变以显示更高活性水平的P450还原酶。
在一些情况下，可以表达另外的转移酶，诸如但不限于磷酸转移酶(激酶)、乙酰基转移酶、葡糖基转移酶或磺基转移酶，以进一步修饰色胺的吲哚环上的羟基。当目标生产化合物是4-羟基-N,N-二甲基色胺时，可以表达激酶，从而生成4-羟基-N,N-二甲基色胺的磷酸酯——裸盖菇素。在一些情况下，可以进一步工程改造微生物细胞以使之表达或过表达激酶。在一些情况下，该激酶可具有根据SEQ ID NO:41-44(参见表2)中的任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:41-44中的任一个具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，工程化微生物细胞可表达已被修饰或突变以显示更高活性水平的激酶。
在工程化微生物细胞中由取代色胺合成色胺衍生物
在另一方面，可通过工程化微生物细胞从取代色胺生物合成产生色胺的衍生物。
在一些情况下，微生物细胞可以在质粒上或通过整合到基因组中包含异源DNA，该异源DNA表达将取代色胺转化为色胺衍生物的酶。在一些情况下，可以工程改造微生物细胞以使之表达或过表达色胺4-羟化酶。在一些情况下，该色胺4-羟化酶可具有SEQ ID NO:32-35(参见表2)中的任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:32-35中的任一个氨基酸序列具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，工程化微生物细胞可表达已被修饰或突变以显示更高活性水平的色胺4-羟化酶。在一些情况下，可以工程改造微生物细胞以使之表达或过表达色胺5-羟化酶。在一些情况下，该色胺5-羟化酶可具有根据SEQ ID NO:47(参见表2)的氨基酸序列，或与根据SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，工程化微生物细胞可表达已被修饰或突变以显示更高活性水平的色胺5-羟化酶。在一些情况下，可以工程改造微生物细胞以使之表达或过表达4-羟基色胺激酶。在一些情况下，该4-羟基色胺激酶可具有根据SEQ ID NO:41-44(参见表2)中的任一个的氨基酸序列，或与根据SEQ ID NO:41-44中的任一个氨基酸序列具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，工程化微生物细胞可表达已被修饰或突变以显示更高活性水平的4-羟基色胺激酶。
图18A描绘了用于将色胺转化为色胺衍生物的生物合成途径的非限制性实例。例如，色胺可以被4-羟化酶(例如，SEQ ID NO:32-35)转化为4-羟基色胺。4-羟基色胺可以被甲基转移酶(例如，SEQ ID NO:48或49)转化为4-甲氧基色胺，或者被激酶(例如，SEQ IDNO:41-44)转化为4-磷酰氧基色胺。在另一个实例中，色胺可以被5-羟化酶(例如，SEQ IDNO:47)转化为5-羟基色胺。5-羟基色胺可以被甲基转移酶(例如，SEQ ID NO:48或49)转化为5-甲氧基色胺，或者被激酶(例如，SEQ ID NO:41-44)转化为5-磷酰氧基色胺。
图18B描绘了将伊波加明转化为伊波加明衍生物的生物合成途径的非限制性实例。例如，伊波加明可以被4-羟化酶(例如，SEQ ID NO:32-35)转化为4-羟基伊波加明。4-羟基伊波加明可以被甲基转移酶(例如，SEQ ID NO:48或49)转化为4-甲氧基伊波加明，或者被激酶(例如，SEQ ID NO:41-44)转化为4-磷酰氧基伊波加明。在另一个实例中，伊波加明可以被5-羟化酶(例如，SEQ ID NO:47)转化为5-羟基伊波加明。5-羟基伊波加明可以被甲基转移酶(例如，SEQ ID NO:48或49)转化为5-甲氧基伊波加明，或者被激酶(例如，SEQ IDNO:41-44)转化为5-磷酰氧基伊波加明。
在一些情况下，所述工程化微生物细胞可以在一种或多种色胺的存在下培养。在一些情况下，该色胺选自：5-甲氧基-N,N-二甲基-色胺、N,N-二异丙基-色胺、N-甲基-N-异丙基色胺、N,N-二甲基色胺、N,N-四亚甲基色胺、N,N-二丙基色胺、伊波加明以及12-甲氧基伊波加明、色胺、4-羟基色胺、5-羟基色胺、伊波加明、4-羟基伊波加明和5-羟基伊波加明。
在一些情况下，所述工程化微生物细胞可将色胺转化为色胺衍生物。在一些情况下，该色胺衍生物是图16中描述的任何色胺衍生物。在一些情况下，该色胺衍生物选自：5-羟基-N,N-二异丙基-色胺、5-羟基-N-甲基-N-异丙基色胺、5-羟基-N,N-二甲基色胺、5-羟基-N,N-四亚甲基色胺、5-羟基-N,N-二丙基色胺、4,5-甲氧基-N,N-二甲基-色胺、4-羟基-N,N-二异丙基-色胺、4-羟基-N-甲基-N-异丙基色胺、4-羟基-N,N-二甲基色胺、4-羟基-N,N-四亚甲基色胺、4-羟基-N,N-二丙基色胺、4-磷酰氧基-N,N-二丙基色胺、伊波加明、12-甲氧基伊波加明、4-羟基色胺、5-羟基色胺、4-甲氧基色胺、5-甲氧基色胺、4-磷酰氧基色胺、5-磷酰氧基色胺、4-羟基伊波加明、5-羟基伊波加明、4-磷酰氧基伊波加明和5-磷酰氧基伊波加明。
用于检测宿主细胞中4-羟基色胺水平的测定
方案6
在另一方面，本公开提供了一种用于检测宿主细胞中4-羟基色胺水平的方法。在一些情况下，该方法包括在经过遗传修饰以产生4-羟基色胺的宿主细胞中检测4-羟基色胺的有色或荧光产物。在一些情况下，4-羟基色胺的有色或荧光产物可通过细胞中产生的氧化机制的作用而产生。在一些情况下，细胞中产生的4-羟基色胺的水平可以与细胞中产生的4-羟基色胺或4-羟基色胺的有色产物的水平成正比(参见，例如方案6)。此类体内筛选方法可用来在工程化生产宿主细胞中快速筛选具有高活性的色胺4-羟化酶突变体(DeLoache等人.2015)。
氧化机制可由硫酸铁或宿主细胞表达的酶催化，该酶包括但不限于多铜氧化酶(Blaschko和Levine 1960)。合适的氧化酶的非限制性实例显示于SEQ ID NO:45(参见表2)。在一些情况下，包含编码变异色氨酸4-羟化酶的核酸序列的遗传修饰细胞可产生的4-羟色胺或其有色或荧光产物的水平高于在不包含编码变异色胺4-羟化酶的核酸序列的对照细胞中4-羟色胺或其有色或荧光产物的水平。这可表明变异酶增加了通过生物合成途径的通量，从而导致4-羟基色胺的滴度和产生速率更高。如本文所述，含有更高4-羟基色胺产量的遗传修饰的宿主细胞可含有针对4-羟基吲哚位置或氨基位置的酶，如甲基、磺酰基(sulphono-)、葡糖基和/或磷酸转移酶。
在一些情况下，可以对修饰的宿主细胞进行修饰，以增加通过色氨酸的通量并增加色氨酸的产生。这可以通过敲除aro8和aro10以及过表达TRP1、TRP2、TRP3、TRP4和TRP5来实现。另外，可以采用包含TRP2反馈抗性突变等位基因。
在非限制性实施例中(参见实施例1)，可以在表达脱羧酶、羟化酶、P450还原酶、甲基转移酶和激酶的修饰的微生物宿主细胞中将1-色氨酸转化为O-磷酰基-4-羟基-N,N-二甲基色胺。
培养条件和产物的产生
在一些情况下，遗传修饰的宿主细胞可以在有氧条件下培养。在一些情况下，遗传修饰的宿主细胞可以在厌氧条件下培养。
在一些情况下，培养基可以是基本培养基，包括但不限于M9、MOPS、YNB、氨盐或含有例如酵母提取物、酪蛋白氨基酸、蛋白胨或胰蛋白胨的复合培养基。在一些情况下，培养基可以用例如磷酸盐、HEPES或Tris缓冲。在一些情况下，培养基可含有还原剂，例如L-抗坏血酸、二硫苏糖醇或巯基乙醇。在一些情况下，可以在培养基中补充其他氨基酸，如L-甲硫氨酸、组氨酸、精氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、硒代半胱氨酸、苏氨酸、吡咯赖氨酸、色氨酸或缬氨酸。在一些情况下，可以添加其他维生素和辅因子，例如L-抗坏血酸、硫胺素、磷酸吡哆醛、烟酸、吡哆醇、生物素、叶酸、四氢叶酸、核黄素、泛酸、铜盐、镁盐、锰盐、钼盐、铁盐、锌盐、镍盐、谷胱甘肽、血红素或D-氨基乙酰丙酸。
在一些情况下，可以通过单次添加、分批补料或在培养物中不断稀释来向遗传修饰的宿主细胞进料取代的邻氨基苯甲酸。在一些情况下，可以通过单次添加、分批补料或在培养物中不断稀释来向遗传修饰的宿主细胞进料取代的吲哚。
在一些情况下，可以产生下游产物。在一些情况下，可以纯化下游产物，例如，从培养基、细胞裂解物或两者中分离并纯化。在一些情况下，下游产物的纯度可以是至少或大约25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％或99％(重量)。可以通过任何已知的方法或方法的组合进行纯化，所述方法包括，例如，柱色谱法、相分离、沉淀、结晶、倾析、气提、膜增强的分离、分馏、吸附/解吸、全蒸发、从固相的热或真空解吸、固定化或吸附至固相的产物的溶剂萃取等。纯度可以通过任何适当的方法来评估，例如，柱色谱法、高效液相色谱(HPLC)分析或气相色谱-质谱(GC-MS)分析。
在一些情况下，培养中的细胞可以将细胞培养基中超过或约为0.0015％、0.002％、0.005％、0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％或8.0％的进料前体转化为所需产物。在一些情况下，培养中的细胞可以在液体培养基中产生至少2g/L、至少3g/L、至少4g/L、至少5g/L、至少7g/L、至少10g/L或超过50g/L的所需产物。
在一些情况下，培养中的细胞可以将细胞培养基中超过或约为0.0015％、0.002％、0.005％、0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％或8.0％的碳转化为所需产物。在一些情况下，培养中的细胞可以在液体培养基中产生至少2g/L、至少3g/L、至少4g/L、至少5g/L、至少7g/L、至少10g/L或超过50g/L的所需产物。
宿主细胞
合适的宿主细胞包括可以在培养基中培养的细胞，例如，作为单细胞生物体。合适的宿主细胞包括酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、藻类细胞和细菌细胞。合适的宿主细胞可进一步包括丝状真菌细胞；合适的丝状真菌细胞包括，例如，曲霉属(Aspergillus)、脉孢菌属(Neurospora)等。
宿主细胞可以是原核细胞。合适的原核细胞包括但不限于大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳杆菌属(Lactobacillus)的种、沙门氏菌属(Salmonella)的种、志贺氏菌属(Shigella)的种、柠檬酸杆菌(Citrobacter)、肠杆菌(Enterobacter)、梭菌(Clostridium)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、气杆菌(Aerobacter)等多种实验室菌株中的任一种。参见，例如，Carrier等人.(1992)J.Immunol.148:1176-1181；美国专利6,447,784；和Sizemore等人.(1995)Science 270:299-302。可用于本发明的沙门氏菌菌株的实例包括但不限于伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)。合适的志贺氏菌菌株包括但不限于弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、索氏志贺氏菌(Shigellasonnei)和痢疾志贺氏菌(Shigella disenteriae)。通常，实验室菌株是非致病性的菌株。其他合适的细菌的非限制性实例包括但不限于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas pudita)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、Pseudomonasmevalonii、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、红球菌属(Rhodococcus)的种等。在一些情况下，宿主细胞是大肠杆菌。
合适的酵母宿主细胞的非限制性实例是选自假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)和耶氏酵母属(Yarrowia)的种的细胞的菌株。在一些情况下，该酵母宿主细胞可以选自：卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉斯酵母(Saccharomycesdouglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomycesnorbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、克鲁弗毕赤酵母(Pichia kluyveri)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、可可假丝酵母(Candida cacaoi)和发酵地霉(Geotrichum fermentans)。其他有用的酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、解脂耶氏酵母、粟酒裂殖酵母、玉蜀黍黑粉菌(Ustilgo maylis)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltose)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guillermondii)和Pichia methanoliol。合适的酵母宿主细胞可包括但不限于巴斯德毕赤酵母、Pichia finlandica、喜海藻糖毕赤酵母(Pichiatrehalophila)、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、Pichiaopuntiae、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、Pichia guercuum、皮杰普毕赤酵母(Pichia pijperi)、树干毕赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、毕赤酵母属的种、酿酒酵母、酵母属的种、多形汉逊酵母等。在一些情况下，酵母宿主细胞可以是酿酒酵母；例如，本公开的遗传修饰的细胞可以是遗传修饰的酿酒酵母细胞。
丝状真菌的特征可以在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复合多糖组成的菌丝壁。营养生长可以是由于菌丝的延长，而碳分解代谢可以是专性需氧的。合适的丝状真菌菌株包括但不限于枝顶孢属(Acremonium)、蘑菇属(Agaricus)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、金小孢子属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、隐球酵母属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、稻温病菌(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新丽鞭毛菌(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、平革菌属(Phanerochaete)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)和木霉属(Trichoderma)的菌株。合适的丝状真菌细胞的非限制性实例包括，例如，黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和米曲霉(Aspergillus oryzae)。合适的真菌细胞的另一个实例是粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)细胞。
修饰的宿主细胞中的异源蛋白质表达
在一些情况下，编码异源多肽的核苷酸序列可以可操作地连接至转录控制元件。
适合在细菌中表达的启动子可以包括但不限于pT7、ptac、pLac、pLacUV5、pTet、pBAD和Anderson启动子文库的BBa系列组成型启动子(Kelly等人,“Measuring theactivity of BioBrick promoters using an in vivo reference standard”Journal ofBiological Engineering 2009 3:4)。适合在酵母中表达的启动子可以包括但不限于TDH3、CCW12、CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO和TP1；以及AOX1(例如，用于毕赤酵母)。
表达载体还可包含用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体还可包含用于扩增表达的合适的序列。
在一些情况下，氨基酸序列的表达可以被密码子优化或偏向于增加体内蛋白质的表达。这可以通过几种算法来实现(Hanson和Coller,Nature Reviews Molecular CellBiology volume 19,第20-30页(2018))，(Quax等人Molecular Cell Review volume 59,2015年7月16日)。在一些情况下，天然氨基酸序列可以用于在体内编码氨基酸序列。
在一些情况下，本公开的遗传修饰的微生物细胞可包含一种或多种根据SEQ IDNO:1-4(参见表1)中的任一个的核酸序列，或与SEQ ID NO:1-4中的任一个具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的核酸序列。
在一些情况下，本公开的遗传修饰的微生物细胞可以表达或过表达一种或多种酶，所述酶具有根据SEQ ID NO:5-49中的任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5-49中的任一个具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。
表1：DNA序列
表2：酶
实施例
提供这些实施例仅仅是为了说明性目的，而并非限制本文提供的权利要求书的范围。
实施例1：工程化细胞中4-羟基色胺的检测
4-羟基色胺可以被氧化为蓝色产物，以针对通过上游途径(蓝色框)的高生物合成通量进行筛选。或者，可以通过表达甲基转移酶或激酶，将4-羟基色胺用于转化为O-磷酰基-4-羟基-N,N-二甲基色胺或裸盖菇素。
实施例2.酵母和细菌菌株及生长条件
将单基因表达质粒转化到化学感受态TG1大肠杆菌中，并将多基因质粒转化到TransforMaxTM EPI300TM(Epicentre)电感受态大肠杆菌中。使用化学或电感受性构建菌株。如所示，在含有氨苄青霉素(25mg/L)和卡那霉素(25mg/L)的LB上进行选择。具有λDE3(在lacUV5启动子的控制下表达T7 RNA聚合酶的噬菌体构建体)的背景菌株MG1655用作宿主菌株并在37℃下增殖。酿酒酵母菌株BY4741(MATa his3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0)用于本研究中的实验，并在30℃下增殖。
大肠杆菌培养物在LB肉汤(1升培养基含有10克胰蛋白胨、5克酵母提取物和10克氯化钠)中生长。酵母培养物在YPD(10g/L Bacto Yeast Extract；20g/L Bacto Peptone；20g/L D-葡萄糖)中生长。使用乙酸锂转化法用含有相应营养缺陷型标记的质粒转化酵母。在合成的撤除成分(dropout)培养基(6.7g/L不含氨基酸的Difco酵母氮源；2g/L合成的限定氨基酸混合物减去相应的自养型，不含酵母氮源(US Biological)；20g/L D-葡萄糖或相应的碳源；20g/L BD Difco琼脂用于平板)上进行选择。适当时用NaOH或HCl调节pH。
质粒和克隆
使用分层Golden Gate克隆方案装配编码序列部分质粒、酵母蛋白表达盒和多基因质粒。合成或PCR扩增所有蛋白质编码序列，以省略用于Golden Gate克隆的内部BsaI和BsmBI位点。真菌途径酶的蛋白质编码序列针对大肠杆菌或酿酒酵母进行了密码子优化，并由Integrated DNA Technologies(Coralville,IA)合成。
实施例3.通过进料取代的吲哚和邻氨基苯甲酸产生取代色胺
具有λDE3的背景菌株MG1655是一种噬菌体构建体，其在lacUV5启动子的控制下表达T7 RNA聚合酶，并用作宿主菌株。对该菌株进行修饰，以使其色氨酸生物合成途径(例如，trpE、trpD、trpC、trpB和trpA)和色氨酸脱氨酶(tnaA)被敲除。如Datsenko和Wanner(2000)所述，通过改良的λred系统除去该遗传物质。将所得菌株命名为bNAB001。
将色氨酸生物合成途径trpDCBA(SEQ ID NO:1)在LacI操纵子控制下克隆到具有p15a来源的氨苄青霉素抗性质粒中，并将其命名为pRJP1376(图1)。将该质粒引入bNAB001中并产生菌株bNAB002。因此，在异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导下，bNAB002菌株允许在加入取代的邻氨基苯甲酸和取代的吲哚后表达trpDCBA操纵子，用于取代的色氨酸生物合成。为了进一步将所得的取代的色氨酸化合物转化为下游色胺，克隆了两个质粒。将用于将取代的色氨酸转化为色胺的来自古巴光盖伞的色氨酸脱羧酶(psiD，SEQ IDNO:14)、来自古巴光盖伞的4-羟基色胺激酶(psiK，SEQ ID NO:41)以及来自古巴光盖伞的色胺N-甲基转移酶(psiM，SEQ ID NO:21)的编码序列克隆到含有卡那霉素抗性基因和BR322复制起点的质粒中，并将其命名为pRJP1460(图2)。编码序列在T7启动子序列下游的多顺反子操纵子中定向。将该质粒转化到bNAB002中，将得到的菌株命名为bNAB003。将来自萎缩芽孢杆菌的色氨酸脱羧酶的编码序列(SEQ ID NO:19)和来自智人的芳香族乙醇胺甲基转移酶的编码序列(SEQ ID NO:25)克隆到启动子和具有卡那霉素抗性基因和BR322复制起点序列的核糖体结合序列的下游，以形成质粒pRJP1625(图3)。将pRJP1625质粒转化到bNAB002中，并将所得菌株命名为bNAB004。
使用bNAB003的过夜培养物以0.1OD600接种1L的LB(加卡那霉素和氨苄青霉素)培养物。培养物生长至OD600为0.5，并在冰上冷却至18℃，然后用0.5mM IPTG诱导以表达trpDCBA途径蛋白质和psiMDK途径蛋白质。将培养物转移到18℃的摇床上，以200RPM摇动16小时。收获细胞，用无菌水洗涤，并重悬于M9培养基(0.2％葡萄糖，40mM Na2HPO4，20mMKH2PO4，1mM MgSO4，0.1mM CaCl2，0.5mM IPTG，添加100mg/L的L-丝氨酸、2g/L柠檬酸钠和2g/L酵母提取物)中。将培养物在无菌培养管中分成10mL培养物。将4mM的5-羟基吲哚、4-羟基吲哚、7-羟基吲哚和4-氯吲哚添加到单独的管中。在30℃下孵育3天后，通过以18000rpm离心1mL培养物并将澄清化的培养基转移到样品小瓶中，对来自培养物的培养基进行采样。使用连接到6120Quadrupole Mass Spectrometer(Agilent Technologies)的1260Infinity LC System，通过色谱/质谱法(LCMS)进行分析。使用0.5mL/min的流速，在20℃下将Zorbax Eclipse Plus C18保护柱(4.6cm×12.5cm，5μm填充，AgilentTechnologies)连接到Zorbax Eclipse Plus C18柱(4.6mm×100mm，3.5μm填充，AgilentTechnologies)。水和乙腈流动相含有0.1％甲酸作为pH调节剂。洗脱梯度(水:乙腈体积比)如下：98:2(0-2min)，从98:2到5:95的线性渐变(2-17min)，5:95(17-22min)，从5:95到98:2的线性渐变(22-23min)，和98:2(23-28min)。使用二极管阵列检测器测量吸光度以进行UV-Vis分析。MS在大气压电离阳性电喷雾(API-ES阳性)模式和100-V碰撞电压下进行，离子检测设置为全扫描模式(50-1200m/z)。通过提取未进料的对照样品中未发现的相应色胺的离子质量，进行色胺的检测。在5-羟基吲哚进料的培养物中，检测到5-羟基色胺。在4-羟基吲哚培养物中，检测到4-羟基色胺、4-磷酰氧基色胺和4-磷酰氧基-N,N-二甲基色胺。在7-羟基吲哚进料的培养物中，检测到7-羟基色胺、7-磷酰氧基色胺和7-磷酰氧基-N,N-二甲基色胺。在4-氯吲哚进料的培养物中，检测到4-氯-N,N-二甲基色胺(见图4)。
使用bNAB004的过夜培养物以0.1OD600接种1L的LB(加卡那霉素和氨苄青霉素)培养物。培养物生长至OD600为0.5，并在冰上冷却至18℃，然后用0.5mM IPTG诱导以表达trpDCBA途径蛋白质和psiMDK途径蛋白质。将培养物转移到18℃的摇床上，以200RPM摇动16小时。收获细胞，用无菌水洗涤，并重悬于M9培养基(0.2％葡萄糖，40mM Na2HPO4，20mMKH2PO4，1mM MgSO4，0.1mM CaCl2，0.5mM IPTG，添加100mg/L的L-丝氨酸、2g/L柠檬酸钠和2g/L酵母提取物)中。将培养物在无菌培养管中分成10mL培养物。将4mM的5-羟基吲哚、4-氯吲哚和5-溴邻氨基苯甲酸添加到单独的管中。在30℃下孵育3天后，通过以18000rpm离心1mL培养物并将澄清化的培养基转移到样品小瓶中，对来自培养物的培养基进行采样。使用连接到6120Quadrupole Mass Spectrometer(Agilent Technologies)的1260Infinity LCSystem，通过色谱/质谱法(LCMS)进行分析。使用0.5mL/min的流速，在20℃下将ZorbaxEclipse Plus C18保护柱(4.6cm×12.5cm，5μm填充，Agilent Technologies)连接到Zorbax Eclipse Plus Cl 8柱(4.6mm×100mm，3.5μm填充，Agilent Technologies)。水和乙腈流动相含有0.1％甲酸作为pH调节剂。洗脱梯度(水:乙腈体积比)如下：98:2(0-2min)，从98:2到5:95的线性渐变(2-17min)，5:95(17-22min)，从5:95到98:2的线性渐变(22-23min)，和98:2(23-28min)。使用二极管阵列检测器测量吸光度以进行UV-Vis分析。MS在大气压电离阳性电喷雾(API-ES阳性)模式和100-V碰撞电压下进行，离子检测设置为全扫描模式(50-1200m/z)。通过提取未进料的对照样品中未发现的相应色胺的离子质量，进行色胺的检测。在5-羟基吲哚进料的培养物中，检测到5-羟基色胺、5-羟基甲基色胺和5-羟基-N,N-二甲基色胺。在4-氯吲哚进料的培养物中，检测到4-氯色胺和4-氯-N,N-二甲基色胺。在5-溴邻氨基苯甲酸进料的培养物中，检测到5-溴色胺、5-溴-N-甲基色胺和5-溴-N,N-二甲基色胺(见图4)。
实施例4.由工程化酵母产生取代色胺。
由中心碳代谢生物合成产生的邻氨基苯甲酸(即，氢取代的邻氨基苯甲酸)可以被代谢以形成具有遗传修饰的取代色胺。研究了色胺和吲哚环的胺位置的取代。克隆了具有CEN6/ARS4复制序列、URA3表达盒和卡那霉素抗性的多基因质粒，使之在高活性酵母启动子和终止子对(例如，启动子pCCW12、pTDH3和pPGK1，或终止子tADH1、tPGK1和tENO1)的控制下含有来自萎缩芽孢杆菌的色氨酸脱羧酶(SEQ ID NO:19)、来自暗蓝光盖伞的色氨酸4-羟化酶(SEQ ID NO:33)、来自古巴光盖伞的4-羟基色胺激酶(psiK，SEQ ID NO:41)和来自古巴光盖伞的色胺N-甲基转移酶(psiM，SEQ ID NO:21)的编码序列，并被命名为质粒pRJP1608(图5)。图6概述了通过在pRJP1608中编码的酶将酵母代谢中存在的邻氨基苯甲酸转化为色胺的生物合成途径。克隆了具有CEN6/ARS4复制序列、URA3表达盒和卡那霉素抗性的第二多基因质粒，使之在高活性酵母启动子和终止子对(例如，启动子pCCW12、pTDH3和pPGK1，或终止子tADH1、tPGK1和tENO1)的控制下含有来自萎缩芽孢杆菌的色氨酸脱羧酶(SEQ ID NO:19)、来自暗蓝光盖伞的色氨酸4-羟化酶(SEQ ID NO:33)和来自家牛的芳烷基胺N-乙酰基转移酶(SEQ ID NO:46)的编码序列，并被命名为质粒pRJP1618(图7)。图8概述了通过在pRJP1618中编码的酶将酵母代谢中存在的邻氨基苯甲酸转化为色胺的生物合成途径。
酿酒酵母菌株BY4741(MATa his3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0)用于本研究中的实验，并在30℃下增殖。通过乙酸锂方案将pRJP1608质粒转化到BY4741中，并在缺乏尿嘧啶的合成完全培养基上进行选择。分离所得到的菌株yNAB001并进行基因型分型。通过乙酸锂方案将pRJP1618质粒转化到BY4741中，并在缺乏尿嘧啶的合成完全培养基上进行选择。分离所得到的菌株yNAB002并进行基因型分型。
使用yNAB001和yNAB002的菌落接种5mL合成完全培养基的培养物，并在30℃下在225rpm旋转摇床上生长。通过将1mL培养物以18000rpm离心并将澄清化的培养基转移到样品小瓶中，对来自培养物的培养基进行采样。使用连接到6120Quadrupole MassSpectrometer(Agilent Technologies)的1260Infinity LC System，通过色谱/质谱法(LCMS)进行分析。使用0.5mL/min的流速，在20℃下将Zorbax Eclipse Plus C18保护柱(4.6cm×12.5cm，5μm填充，Agilent Technologies)连接到Zorbax Eclipse Plus C18柱(4.6mm×100mm，3.5μm填充，Agilent Technologies)。水和乙腈流动相含有0.1％甲酸作为pH调节剂。洗脱梯度(水:乙腈体积比)如下：98:2(0-2min)，从98:2到5:95的线性渐变(2-17min)，5:95(17-22min)，从5:95到98:2的线性渐变(22-23min)，和98:2(23-28min)。使用二极管阵列检测器测量吸光度以进行UV-Vis分析。MS在大气压电离阳性电喷雾(API-ES阳性)模式和100-V碰撞电压下进行，离子检测设置为全扫描模式(50-1200m/z)。
通过提取未进料的对照样品中未发现的相应色胺的离子质量，进行色胺的检测。另外，进行了串联MS/MS。在yNAB001的培养物中，检测到色胺、4-羟基色胺、4-磷酰氧基色胺、4-羟基-N,N-二甲基色胺和4-磷酰氧基-N,N-二甲基色胺的离子质量(图6)。对于4-羟基-N,N-二甲基色胺在205.1335m/z的正离子质量处(图9)，而对于4-磷酰氧基-N,N-二甲基色胺在285.0999m/z的正离子质量处(图10)收集串联MS/MS碎片数据。在yNAB002的培养物中，检测到色胺、4-羟基色胺、N-乙酰基-色胺和4-羟基-N-乙酰基-色胺的离子质量(图8)。对于N-乙酰基-色胺在203.1179m/z的正离子质量处(图11)，而对于4-羟基-N-乙酰基-色胺在219.1128的正离子质量处(图12)收集串联MS/MS碎片数据。来自未转化的BY4741菌株的培养基仅检测到痕量水平的色胺，而未检测到来自yNAB001和yNAB002培养基的其他上述色胺。
实施例5.使用工程化细胞从进料的色胺产生色胺衍生物。
可以对微生物进行遗传修饰，使之表达能够衍生色胺的代谢酶。通过在酵母中表达异源酶并进料具有各种胺取代的色胺，研究了色胺的吲哚位置的羟基和磷酰氧基取代。克隆具有CEN6/ARS4复制序列、URA3表达盒和卡那霉素抗性的单基因表达质粒，使之含有来自暗蓝光盖伞的色胺4-羟化酶的编码序列(SEQ ID NO:33)，并将其命名为pRJP1639(图13)。克隆具有CEN6/ARS4复制序列、URA3表达盒和卡那霉素抗性的单基因表达质粒，使之含有来自曼森血吸虫的色胺5-羟化酶的编码序列(SEQ ID NO:47)，并将其命名为pRJP1640(图14)。克隆具有CEN6/ARS4复制序列、LEU2表达盒和卡那霉素抗性的单基因表达质粒，使之含有来自古巴光盖伞的4-羟基色胺激酶的编码序列(SEQ ID NO:41)，并将其命名为pRJP1641(图15)。
酿酒酵母菌株BY4741(MATa his3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0)用于本研究中的实验，并在30℃下增殖。通过乙酸锂方案将pRJP1639质粒转化到BY4741中，并在缺乏尿嘧啶的合成完全培养基上进行选择。分离所得到的菌株yNAB003并进行基因型分型。通过乙酸锂方案将pRJP1640质粒转化到BY4741中，并在缺乏尿嘧啶的合成完全培养基上进行选择。分离所得到的菌株yNAB004并进行基因型分型。通过NotI消化将质粒pRJP1641线性化，并通过乙酸锂方案将其转化到菌株yNAB003中，并在缺乏亮氨酸的合成完全培养基上进行选择。分离所得到的菌株yNAB005并进行基因型分型。
使用yNAB003、yNAB004和yNAB005的过夜生长培养物接种合成完全培养基的250mL培养物，并在30℃下在225rpm旋转摇床中生长。将培养物浓缩至25mL缺乏尿嘧啶的合成完全培养基中，并转移至5mL培养管中。将5mM的各种色胺(包括5-甲氧基-N,N-二甲基色胺、N,N-二异丙基-色胺、N-甲基-N-异丙基色胺、N,N-二甲基色胺、N,N-四亚甲基色胺和N,N-二丙基色胺)添加到单独的试管中(图16)。在30℃下孵育3天后，通过以18000rpm离心1mL培养物并将澄清化的培养基转移到样品小瓶中，对来自培养物的培养基进行采样。使用连接到6120Quadrupole Mass Spectrometer(Agilent Technologies)的1260Infinity LCSystem，通过色谱/质谱法(LCMS)进行分析。使用0.5mL/min的流速，在20℃下将ZorbaxEclipse Plus C18保护柱(4.6cm×12.5cm，5μm填充，Agilent Technologies)连接到Zorbax Eclipse Plus C18柱(4.6mm×100mm，3.5μm填充，Agilent Technologies)。水和乙腈流动相含有0.1％甲酸作为pH调节剂。洗脱梯度(水:乙腈体积比)如下：98:2(0-2min)，从98:2到5:95的线性渐变(2-17min)，5:95(17-22min)，从5:95到98:2的线性渐变(22-23min)，和98:2(23-28min)。使用二极管阵列检测器测量吸光度以进行UV-Vis分析。MS在大气压电离阳性电喷雾(API-ES阳性)模式和100-V碰撞电压下进行，离子检测设置为全扫描模式(50-1200m/z)。通过提取未进料的对照样品或原始色胺化学储备物中未发现的相应色胺的离子质量，进行色胺的检测。对于yNAB003培养物鉴定了进料的色胺的4-羟基衍生物。对于yNAB004培养物鉴定了进料的色胺的5-羟基衍生物。在进料N,N-二丙基色胺的yNAB005培养基中鉴定了4-羟基-N,N-二丙基色胺和4-磷酰氧基-N,N-二丙基色胺的离子质量(见图16)。
实施例6.针对高羟基化活性的比色筛选
在4-羟基-色胺和4-羟基色氨酸的羟基位置处不添加保护基的情况下，这些化合物将氧化成有色化合物。因此，随后对色胺和色氨酸的羟化酶和氧化活性可以用作羟化酶活性的指标。为了证明该活性，将具有来自暗蓝光盖伞的高色胺4-羟化酶(SEQ ID NO:33)的菌株yNAB003的颜色形成与WT BY4741的活性进行了比较。对于WT BY4741和yNAB003，在750rpm高频率摇动下，在添加4mM色胺的合成完全培养基中，四个单独的3mL培养物于30℃下开始3天。培养后，将这些培养物离心以沉淀细胞，以便观察色素形成。在yNAB003培养物中观察到蓝色产物的形成，其作为色胺4-羟化酶活性的指示，而在WT BY4741培养物中未观察到蓝色产物的形成(图17)。
虽然本文已经显示并描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。并非打算用本说明书中提供的具体实例来限制本发明。尽管已经参照上述说明书对本发明进行了描述，但并不意味着对本文实施方案的描述和说明以限制性的意义来解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面均不限于本文所阐述的具体描述、配置或相对比例，其取决于多种条件和变量。应当理解，在实施本发明的过程中可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。因此可以预期，本发明还应涵盖任何这类替代、改变、变化或等同物。旨在以所附权利要求书限定本发明的范围，由此涵盖在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (11)

1.一种合成色胺衍生物的方法，所述方法包括：
在存在被取代的色胺的情况下，培养工程化微生物细胞，以产生所述色胺衍生物，所述工程化微生物细胞含有一种或多种核酸序列，所述核酸序列编码以下一种或多种：
(i)色胺4-羟化酶，所述色胺4-羟化酶包含与SEQ ID NO:32-35中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
(ii)色胺5-羟化酶，所述色胺5-羟化酶包含与SEQ ID NO:47具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
(iii)激酶，所述激酶包含与SEQ ID NO:41-44中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
(iv)P450还原酶，所述P450还原酶包含与SEQ ID NO:36-40中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和
(v)转移酶，所述转移酶包含与SEQ ID NO:21-31或46中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述工程化微生物细胞是真核细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述真核细胞是酵母细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述酵母细胞是酿酒酵母种的细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述工程化微生物细胞是原核细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述原核细胞是细菌细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述所述细菌细胞是大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌种的细胞。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述被取代的色胺是由所述工程化微生物细胞生物合成产生的。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述工程化微生物细胞将所述色胺衍生物分泌到培养液中。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述工程化微生物细胞是所述工程化微生物细胞的裂解物。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述色胺衍生物是：
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Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2571696B (en) 2017-10-09 2020-05-27 Compass Pathways Ltd Large scale method for the preparation of Psilocybin and formulations of Psilocybin so produced
US12459965B2 (en) 2017-10-09 2025-11-04 Compass Pathfinder Limited Preparation of psilocybin, different polymorphic forms, intermediates, formulations and their use
CA3093301A1 (en) 2018-03-08 2019-09-12 New Atlas Biotechnologies Llc Processes for the production of tryptamines
FI129102B (en) * 2018-03-19 2021-07-15 Teknologian Tutkimuskeskus Vtt Oy Heterological production of psilosybin
JP2022529781A (ja) 2019-04-17 2022-06-24 コンパス パスファインダー リミテッド サイロシビンによるうつ病及び他の様々な障害の治療
AU2020351033A1 (en) * 2019-09-16 2022-04-07 Danmarks Tekniske Universitet Yeast cells and methods for production of tryptophan derivatives
CN114787363A (zh) * 2019-10-01 2022-07-22 恩派瑞安神经科学公司 对真菌进行遗传工程化以调节色胺表达
JP2022552903A (ja) * 2019-10-28 2022-12-20 マイアミ ユニバーシティ シロシビンおよび中間体または副産物の産生方法
US11441164B2 (en) * 2019-11-15 2022-09-13 Cb Therapeutics, Inc. Biosynthetic production of psilocybin and related intermediates in recombinant organisms
WO2021110992A1 (en) * 2019-12-04 2021-06-10 Synbionik Gmbh Non-naturally occurring bacteria modified able to produce tryptophan derived compounds
CN111187785B (zh) * 2020-02-12 2021-07-16 浙江中医药大学 一种短小蛇根草色氨酸脱羧酶基因OpTDC2的克隆表达及应用
EP4146198A4 (en) 2020-05-08 2024-05-15 Psilera Inc. Novel compositions of matter and pharmaceutical compositions
US12240813B2 (en) 2020-05-19 2025-03-04 Cybin Irl Limited Deuterated tryptamine derivatives and methods of use
KR20230024378A (ko) 2020-06-12 2023-02-20 벡클리 싸이테크 리미티드 5-메톡시-n, n-디메틸트립타민의 벤조에이트 염을 포함하는 조성물
AU2021311493A1 (en) 2020-07-24 2023-03-16 Mindset Pharma Inc. Scalable synthetic route for psilocin and psilocybin
WO2022047580A1 (en) * 2020-09-01 2022-03-10 Magicmed Industries Inc. Hydroxylated psilocybin derivatives and methods of using
AU2021337466A1 (en) 2020-09-01 2023-03-30 Enveric Biosciences Canada Inc. Halogenated psilocybin derivatives and methods of using
US20230416794A1 (en) * 2020-11-16 2023-12-28 Algae-C Inc. Engineered Microorganisms for Producing Substituted Tryptamines
MX2023006997A (es) * 2020-12-18 2023-08-29 Compass Pathfinder Ltd Alcaloides de indol modificados para usos terapeuticos.
CN117120415A (zh) * 2020-12-18 2023-11-24 指南针探路者有限公司 用于治疗用途的经修饰的吲哚生物碱
US12534441B2 (en) 2021-01-15 2026-01-27 Beckley Psytech Limited Tryptamine analogues
WO2022226493A1 (en) * 2021-04-19 2022-10-27 Miami University Optimized methods for the production of psilocybin and intermediates or side products
CA3218110A1 (en) 2021-05-25 2022-12-01 Majed Fawaz New n,n-dimethyltryptamine salts and crystalline salt forms
CN113186211A (zh) * 2021-05-26 2021-07-30 中国农业大学 猪asmt基因及其特异性引物对和检测试剂盒
EP4347856A2 (en) 2021-05-27 2024-04-10 Octarine Bio ApS Methods for producing tryptamine derivatives
US20230041584A1 (en) 2021-06-09 2023-02-09 ATAI Life Sciences AG Novel prodrugs and conjugates of dimethyltryptamine
US20240117394A1 (en) * 2021-08-03 2024-04-11 Atx Pharmers Llc Low Dose Psilocybin in Foodstuff and Microbes for Same
WO2023015279A1 (en) * 2021-08-05 2023-02-09 Miami University Methods for the production of methylated tryptamine derivatives, intermediates or side products
US20230099972A1 (en) * 2021-09-30 2023-03-30 ATAI Life Sciences AG Compositions and methods for treating headaches
WO2023069575A1 (en) * 2021-10-21 2023-04-27 Parow Entheobiosciences Llc Method for producing 5-methoxy-n,n-dimethyltryptamine (5-meo-dmt) in vitro
US20240417764A1 (en) * 2021-11-05 2024-12-19 Miami University Methods for the production of tryptophans, tryptamines, intermediates, side products and derivatives
EP4457214A4 (en) 2021-12-30 2025-12-03 Atai Therapeutics Inc DIMETHYLTRYPTAMINE ANALOGUES USED AS NITRIC OXIDE ADMINISTRATION MEDICINES
WO2023130078A2 (en) * 2021-12-31 2023-07-06 Empyrean Neuroscience, Inc. Genetically modified mycelium for producing psychotropic alkaloids
WO2023130191A1 (en) * 2022-01-10 2023-07-13 Core One Labs Inc. Production of psychedelic compounds
EP4223883A1 (en) 2022-02-02 2023-08-09 Infinit Biosystems Process for producing tryptamines
EP4486448A1 (en) 2022-03-04 2025-01-08 Reset Pharmaceuticals, Inc. Co-crystals or salts comprising psilocin
CN115261365B (zh) * 2022-06-22 2024-01-30 南通紫琅生物医药科技有限公司 色氨酸合成酶突变体及其应用
US12264131B2 (en) 2022-08-19 2025-04-01 Beckley Psytech Limited Pharmaceutically acceptable salts and compositions thereof
GB202212116D0 (en) 2022-08-19 2022-10-05 Beckley Psytech Ltd Pharmaceutically acceptable salts and Compositions thereof
CN116179524B (zh) * 2022-11-18 2025-08-26 河北维达康生物科技有限公司 一种新的色氨酸脱羧酶突变体、重组基因工程菌的构建及其应用
AU2023395940A1 (en) * 2022-12-15 2025-06-19 Atai Therapeutics, Inc. Prodrugs of dimethyltryptamine and derivatives thereof
WO2024130326A1 (en) * 2022-12-20 2024-06-27 Natural MedTech Pty Ltd Methods for the production of tryptophan derivatives
CN116836959B (zh) * 2023-06-05 2025-07-29 山东大学 一种用于合成创新霉素衍生物的酶组合物及其应用
US12246005B2 (en) 2023-06-13 2025-03-11 Beckley Psytech Limited 5-methoxy-n,n-dimethyltryptamine (5-MeO-DMT) formulations
CN117106825B (zh) * 2023-08-28 2024-11-01 康霖生物科技（杭州）有限公司 用于治疗帕金森病的基因治疗载体及其用途
CN119685274B (zh) * 2023-09-22 2026-04-21 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种非天然吲哚类氨基酸的合成方法
WO2025073360A1 (en) 2023-10-04 2025-04-10 Enzyan Biocatalysis Gmbh Biocatalytic cascade for the production of tryptamine derivatives
WO2025096941A1 (en) * 2023-11-03 2025-05-08 Miami University Biosynthesis of tryptamines and related compounds

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3075992A (en) 1958-09-12 1963-01-29 Sandoz Ltd Esters of indoles
WO1995034657A2 (en) * 1994-06-10 1995-12-21 Genencor International, Inc. Microbial production of 4-, 5-, 6- and 7-substituted indole and tryptophan analogs via fermentation
US6080849A (en) 1997-09-10 2000-06-27 Vion Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence
US20030096379A1 (en) * 2001-03-28 2003-05-22 Kilgore James L. Method for producing tryptamine derivatives
ZA200803368B (en) * 2005-10-07 2009-09-30 Univ California Nucleic acids encoding modified cytochrome P450 enzymes and methods of use thereof
EP2788003A4 (en) 2011-12-09 2015-05-27 Demerx Inc PHOSPHATESTER OF NORIBOGAIN
EP2820121A1 (en) * 2012-02-29 2015-01-07 Danmarks Tekniske Universitet Microorganisms for the production of melatonin
US20160230200A1 (en) * 2013-09-05 2016-08-11 Danmarks Tekniske Universitet Microorganisms for efficient production of melatonin and related compounds
EP3143153A4 (en) * 2014-05-16 2018-01-03 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Microbial approach for the production of 5-hydroxytryptophan
WO2017123418A1 (en) * 2016-01-11 2017-07-20 Synlogic, Inc. Bacteria engineered to treat metabolic diseases
CA3093301A1 (en) 2018-03-08 2019-09-12 New Atlas Biotechnologies Llc Processes for the production of tryptamines
FI129102B (en) * 2018-03-19 2021-07-15 Teknologian Tutkimuskeskus Vtt Oy Heterological production of psilosybin
JP2022552903A (ja) 2019-10-28 2022-12-20 マイアミ ユニバーシティ シロシビンおよび中間体または副産物の産生方法
US11441164B2 (en) 2019-11-15 2022-09-13 Cb Therapeutics, Inc. Biosynthetic production of psilocybin and related intermediates in recombinant organisms

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