CN120683022A - 一株高产h2o2的嗜热淀粉芽孢杆菌c-50-11及其应用 - Google Patents

一株高产h2o2的嗜热淀粉芽孢杆菌c-50-11及其应用

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高产H2O2的嗜热淀粉芽孢杆菌及其应用。本发明中的嗜热淀粉芽孢杆菌C‑50‑11，其能够在堆肥高温期持续生成H2O2，H2O2自由基可氧化分解复杂有机物介导促进腐殖质缩合，进而有效提高了高温期堆肥中腐殖质的含量，相比于未接种堆肥中腐殖质的含量，接种后腐殖质含量提升高于20%。本发明通过结合嗜热菌的内源性H2O2强化作用，利用生物产生的氧化剂实现化学降解，充分利用了堆肥高温期的条件，为堆肥中腐殖质含量的提升提供了一种新的方法途径。

Description

一株高产H2O2的嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高产H2O2的嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11及其应用。
背景技术
传统好氧堆肥高温期50°C~65°C存在腐熟时间长、臭气排放多、抗生素抗性基因（ARGs）残留反弹等问题。现有微生物强化手段如的SBI菌剂虽缩短腐熟时间，但未系统利用高温下活跃的过氧化氢促进有机质矿化和腐殖质形成。
目前堆肥过程中，腐殖质形成效率有待提高，部分堆肥技术可能无法充分利用堆肥高温期的条件促进腐殖质的有效合成。现有技术主要是通过物理调控如超高温发酵或外加抑制剂，可以看出现有技术仅关注物理吸附或调理剂添加，未利用生物产生的氧化剂实现化学降解。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一株高产H2O2的嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11及其应用。
本发明的技术方案如下。
本发明第一方面提供了一株高产H2O2积累的嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11，所述嗜热淀粉芽孢杆菌（Caldibacillus thermoamylovorans）C-50-11的保藏编号为CGMCCNo.33544，保藏日期为2025年2月17日。
本发明从中国农业大学有机循环研究院（苏州）食堂餐厨垃圾和木屑以3:1的质量比、25:1的碳氮比混合后，加水使含水率达到65%，再添加0.25wt%过一硫酸盐用于提供活性氧环境，进行堆肥发酵，待堆肥升温至50℃以上进入高温期时，从中筛分出一株具有高产H2O2的细菌，命名为C-50-11，对其进行鉴定该细菌为嗜热淀粉芽孢杆菌。本发明中的嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11能够在50°C~65°C下持续生成H2O2，H2O2自由基可氧化分解复杂有机物介导促进腐殖质缩合，进而有效提高了高温期堆肥中腐殖质的含量，从而充分利用了堆肥高温期，利用嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11的H2O2作为氧化剂实现化学降解，进而加快了腐熟速度。
本发明第二方面提供了所述的嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11在促进堆肥中H2O2生成中的应用。
在另一个优选实施例中，所述嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11用于堆肥高温期中H2O2的生成。
在另一个优选实施例中，所述堆肥高温期是指温度为50°C~65°C的堆肥。
本发明第三方面提供所述的嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11在提高堆肥中腐殖质含量中的应用。
在另一个优选实施例中，所述提高堆肥中腐殖质是指促进堆肥高温期中腐殖质的形成。
在另一个优选实施例中，所述堆肥高温期是指温度达到50°C~65°C时的堆肥。
本发明第四方面提供了一种提高堆肥中腐殖质含量的方法，包括以下步骤：
当堆肥温度达到50°C~65°C时，接种所述的嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11；
所述嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11的接种量为1×108CFU/g~ 1×109CFU/g。
在另一个优选实施例中，接入嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11进行堆肥发酵的时间为4天~12天。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过从中国农业大学有机循环研究院（苏州）食堂餐厨垃圾和木屑以3:1的质量比、25:1的碳氮比混合后，加水使含水率达到65%，再添加0.25wt%过一硫酸盐用于提供活性氧环境，进行堆肥发酵，待堆肥升温至50℃以上进入高温期时，从中筛分出一株在50°C~65°C下高产H2O2的细菌，命名为C-50-11，对其进行鉴定该细菌为嗜热淀粉芽孢杆菌。本发明中嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-1生产的H2O2可氧化分解复杂有机物，并通过自由基介导促进腐殖质缩合。本发明通过将嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11接种于堆肥高温期中，能够有效提高堆肥中腐殖质的含量，相比于未接种堆肥中腐殖质的含量，接种后腐殖质含量提升高于20%。
本发明中的嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11能够提高堆肥产品的质量，使其更有利于土壤改良和植物生长。并且方法具有操作简单、成本低廉等优点，易于在实际堆肥生产中推广应用。
附图说明
图1为本发明中嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11的菌落形态图。
图2为本发明中嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11生长48h的生长曲线图。
图3为本发明中嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11生长48h的OD600值结果图。
图4为本发明中嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11生长48h的H2O2产量结果图。
图5为本发明中嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11生长48h对于堆肥中腐殖质产量的结果图；其中，HA代表胡敏酸，FA代表富里酸，DP代表聚合度，表征腐殖酸结构的稳定程度；OH为接种C-50-11处理组，CK为对照组。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
目前堆肥过程中，腐殖质形成效率有待提高，部分堆肥技术可能无法充分利用堆肥高温期的条件促进腐殖质的有效合成。现有技术主要是通过物理调控如超高温发酵或外加抑制剂，未结合嗜热菌的内源性H2O2强化作用。可以看出现有技术仅关注物理吸附或调理剂添加，未利用生物产生的氧化剂实现化学降解。
现有技术中，嗜热淀粉芽孢杆菌通常用于有机固废厌氧发酵过程中有效提高甲烷产量和有机物转化率，或是具有蛋白水解功能。本发明通过从高温期堆肥筛选出的68株细菌进行胞外产过氧化氢能力鉴定，发现其中一株细菌具在60℃高温下高产H2O2的能力，并对其进行分子生物学鉴定，该菌株为嗜热淀粉芽孢杆菌（Caldibacillus thermoamylovorans），命名为C-50-11，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.33544，保藏日期：2025年02月17日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明中的嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11能够在堆肥高温期持续生成H2O2，H2O2自由基可氧化分解复杂有机物介导促进腐殖质缩合，进而有效提高了高温期堆肥中腐殖质的含量，相比于未接种堆肥中腐殖质的含量，接种后腐殖质含量提升高于20%。本发明通过结合嗜热菌的内源性H2O2强化作用，利用生物产生的氧化剂实现化学降解，充分利用了堆肥高温期的条件，为堆肥中腐殖质含量的提升提供了一种新的方法途径。
根据公开号为CN108339828B发明名称为餐厨废弃物处理系统中的常规认知，餐厨废弃物俗称泔水，是餐饮单位(包括家庭)产生的餐饮及制作过程废弃物。餐厨废弃物有气液固三种形态：即固态——餐桌废弃物和厨房下角料；液态——刷锅水、刷碗水等含油污水；气态——厨房及餐饮油烟，本发明实施例中的餐厨废弃物为固态。
实施例1
嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11的分离培养与鉴定
（1）嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11的分离培养
取60℃高温期堆肥样品10g于灭菌100mL 0.85wt%的NaCl中进行浸提，得到浸提液，使用倍比稀释获得耐60℃高温的细菌共68株，对68株细菌进行胞外产过氧化氢能力鉴定，发现其中一株能够在60℃下产生过氧化氢，命名为C-50-11。其中，高温堆肥样品是由中国农业大学有机循环研究院（苏州）食堂餐厨垃圾和市售木屑以3:1的质量比、25:1的碳氮比混合后，加水使含水率达到65%，再添加0.25wt%过一硫酸盐用于提供活性氧环境，进行堆肥发酵，待堆肥升温至50℃以上后进行采集得到。
将上述分离得到的C-50-11进行的培养，具体过程如下：
培养基配方：酵母提取物5g、胰化蛋白胨10g、氯化钠10g、蒸馏水1000mL，pH值调至7.0，121℃、20min高压灭菌。
取单菌落至培养基中进行培养，培养条件为55℃，摇床转速160r/min，培养时间16h。
（2）菌株的分子生物学鉴定
收集C-50-11菌体进行细菌全基因组测序，平均核酸相似度（ANI）是鉴定细菌基因组亲缘关系远近最强有力的测量指标之一。基于基因组质检所有直系同源蛋白序列的比较的平均值来反映基因组质检的进化距离，当ANI>95%时表示两个基因组属于同一个物种。基因组同参考基因组的ANI分析结果如表1所示。
表1 ANI分析结果
注：ANI表示平均核苷酸同一性，Mapped_fragment表示映射片段，Query_fragment表示查询片段，Taxon分类群。
实施例2：嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11的生长特性检测
将实施例1中筛选出的嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11在LB液体培养基中活化，于55℃、150pm下培养至对数生长期，OD600约为0.5，其中生长曲线以及OD600如图1和图2所示。
在培养过程中对H2O2的产量进行测定，结果如图3所示，从图3可以看出，随着时间的增长H2O2量也随着递增，当培养至40h时，H2O2量达到最大。
实施例3：嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11的促进腐殖质合成
将分离出的嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11接种至实施例1中的培养基中，在55℃，摇床转速160r/min，培养时间16h，备用。
以餐厨废弃物和木屑作为堆肥原料进行混合，其中餐厨废弃物的质量占堆肥原料质量的75%，木屑质量占堆肥原料质量的25%；调节堆肥原料中的含水率为65%时，置于500mL的微型智能堆肥反应器中进行好氧发酵，当堆肥温度达到50℃以上，表明堆肥已经进行高温期，此时将嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11以108CFU/g的接种量接入高温期堆肥中，记为OH组，并以不接种嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11作为对照组记为CK组，定期检测堆肥中腐殖质的含量，结果如图5所示。
从图5可以看出，随着时间的增长，OH组的堆肥中胡敏酸整体上高于CK组。在堆肥4天~8天时，OH组胡敏酸含量要明显高于CK组。这表明嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11促进了胡敏酸的形成。胡敏酸是腐殖酸的主要成分之一，能够改善土壤结构，增加土壤肥力，接种该嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11有利于提高堆肥产物中腐殖酸的含量，从而提升堆肥产品的质量。
OH组的富里酸含量在大部分时间点也高于CK组。在堆肥4天~8天时，OH组富里酸含量要明显高于CK组。富里酸同样对土壤质量和植物生长有重要作用，如调节土壤酸碱度、促进植物对营养元素的吸收等。因此，接种嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11有助于增加富里酸的含量，说明该嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11在堆肥过程中能够促进有机物质转化的结果。
腐殖酸聚合度DP的走势可以反映腐殖酸结构的稳定性。从图中可以看出，OH组的DP值在大部分时间高于CK组，尤其是在4天~12天（堆肥高温期）时，OH组DP值明显高于CK组。这说明接种嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11有助于提高腐殖酸的聚合度，使腐殖酸结构更稳定，更有利于其在土壤中的长期保存和发挥作用。
此外，从图5结果可以看，当堆肥时间长于12天后，胡敏酸和富里酸的含量明显降低，并且腐殖酸聚合度也明显降低，这主要是由于在4天~12天，嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11快速繁殖和代谢，分解了大量的有机物质，包括胡敏酸、富里酸等组分。到了第10天，代谢可能从快速分解有机物质的阶段转变为利用分解后的中间产物进行其他代谢活动的阶段，并且此时易分解有机物的大量消耗，使得可用于形成胡敏酸和富里酸的前体物质减少，导致胡敏酸和富里酸含量下降，同时，腐殖酸聚合度的下降也可能是由于参与腐殖酸聚合反应的酶或相关物质的活性变化引起的。因此，当堆肥进行高温期后，接种嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11继续发酵10天后，此时堆肥中腐殖质含量最高，相比未接种嗜热淀粉芽孢杆菌的对照堆肥，腐殖质含量提高了20%。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形在内。

Claims (9)

1.一株高产H2O2的嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11，其特征在于，所述嗜热淀粉芽孢杆菌（Caldibacillus thermoamylovorans）C-50-11的保藏编号为CGMCC No.33544，保藏日期为2025年2月17日。
2.一种权利要求1所述的嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11在促进堆肥中H2O2生成中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11用于堆肥高温期中H2O2的生成。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述堆肥高温期是指温度为50°C~65°C的堆肥。
5.一株权利要求1所述的嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11在提高堆肥中腐殖质含量中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述提高堆肥中腐殖质是指促进堆肥高温期中腐殖质的形成。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述堆肥高温期是指温度达到50°C~65°C时的堆肥。
8.一种提高堆肥中腐殖质含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
当堆肥温度达到50°C~65°C时，接种权利要求1所述的嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11进行堆肥发酵；
所述嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11的接种量为108CFU/g~ 109CFU/g。
9.根据权利要求8所述的提高堆肥中腐殖质含量的方法，其特征在于，接入嗜热淀粉芽孢杆菌C-50-11进行堆肥发酵的时间为4天~12天。
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