CN120683027A - 一种高产l-色氨酸的重组微生物及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于代谢工程技术领域，具体涉及一种高产L‑色氨酸的重组微生物及其构建方法和应用。本发明通过筛选敲除或添加的基因，经基因工程技术构建了一种高产L‑色氨酸的重组产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。本发明的重组产酸克雷伯氏菌以葡萄糖为底物，在发酵条件下可以用于高效生产L‑色氨酸，产量达到60g/L，得率为0.23g/g。本发明提供了一种通过将2,3‑丁二醇合成代谢通量通过丙酮酸重定向至L‑色氨酸合成以实现微生物高效生产L‑色氨酸的方法，该方法生产过程简便，成本低，产量高，具有重要的经济效益，前景良好。

Description

一种高产L-色氨酸的重组微生物及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于代谢工程技术领域，具体涉及一种高产L-色氨酸的重组微生物及其构建方法和应用。

背景技术

色氨酸(Tryptophan,L-Trp)，即D,L-α-氨基-β-吲哚基丙酸，属芳香族氨基酸，分子式为C₁₁H₁₂O₂N₂，相对分子质量为204.21。色氨酸有3种异构体:L型、D型及消旋体DL型，其中左旋光体即L-Trp，具有生物活性，是人体的必需氨基酸之一。L-Trp在常温条件下呈白色晶体或结晶性粉末，无味，熔点为289℃，常温下在水中溶解度为11.4g/L，微溶于乙醇，不溶于氯仿，在碱性溶液中比较稳定。

色氨酸是植物体内生长素生物合成重要的前体物质，其结构与IAA(吲哚-3-乙酸，Indole-3-Acetic Acid)相似，在高等植物中普遍存在。作为8种必需氨基酸之一，L-色氨酸无法在哺乳动物体内合成，必须从外界摄取。因此L-色氨酸被广泛应用于食品、医药以及饲料等不同行业的各个领域。在食品工业中，L-色氨酸被用作营养增补剂、食品强化剂和防腐剂等。此外，L-色氨酸还可作为发酵生产食用色素靛蓝色素的前体。在医药制造行业中，L-色氨酸通常用于保健品、生物医药以及医药原料等领域。另外L-色氨酸作为神经递质5-羟色胺和褪黑素的前体，还被用来合成抗抑郁类药物和安神药物。在饲料行业中，L-色氨酸作为饲料添加剂使用，对家禽家畜的生长生产、营养代谢以及免疫等诸多方面均有积极作用。截至目前，L-色氨酸的市场需求已经超过了28,000t/年，且该产品的市场规模仍然不断扩大。但是较为落后的生产技术导致L-色氨酸的生产成本高、产量较低，进而限制了其更大规模的应用。

在传统工业生产中，L-色氨酸的发酵方法主要分为化学合成法和蛋白质水解法。但是，这种以化学合成生产L-色氨酸的方法存在诸多弊端，例如生产成本高、工艺条件苛刻和环境污染等。随着基因重组技术的发展和模式生物代谢网络的不断解析，利用基因工程手段改造微生物合成L-色氨酸受到了广泛关注。

大肠杆菌(Escherichia coli)是目前发酵法生产L-色氨酸的主要菌株。随着代谢工程技术的不断发展，微生物发酵生产L-色氨酸的产量和得率不断提升。Guo等人在诱变菌株E.coli TRP0的基础上，通过解除负反馈效应、加强色氨酸转运和增强前体供应等代谢工程手段获得重组菌株E.coli TRP12，经过5L罐的发酵培养，L-色氨酸浓度达到52.1g/L，转化率达到0.171g/g(Guo L et al.,Biotechnol Bioeng.,2022,119(3):983-993)。Xiong等人在色氨酸生产菌株的基础上，通过引入磷酸解酮酶途径、非PTS系统和草酰乙酸羧激酶途径增加前体供应，在5L发酵罐中，构建的重组菌株L-色氨酸转化率达到0.227g/g(Xiong Bet al.,Biotechnol Bioeng.,2021,118(3):1393-1404)。此外，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)也被开发用于l-色氨酸生产。Dong等人通过增强L-色氨酸生物合成途径、中心代谢流重编、挖掘代谢瓶颈、增强运输系统和前体供应、抑制竞争途径等系统代谢工程改造C.glutamicum，获得的重组菌株在摇瓶发酵中可实现16.2g/L的L-色氨酸积累，转化率达到0.160g/g(Dong YF et al.,BioRxiv.,2024,11.04.621991)。

尽管现有的微生物发酵方法已在L-色氨酸的产量和得率方面取得了显著成效，但进一步拓展发酵方法、提升其产量或得率，依然是本领域不懈追求的目标。产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)等微生物代谢碳水化合物如葡萄糖等可高效合成2,3-丁二醇或乙偶姻(Jantama K.,Metab Eng.,2015,30:16-26)，2,3-丁二醇与乙偶姻合成途径的前体为丙酮酸，这就意味着K.oxytoca具有强大的糖酵解通量。基于此，采取代谢流重定向策略有望将强大的2,3-丁二醇与乙偶姻合成途径代谢流重定向至L-色氨酸合成。

基于此，设计一种高产L-色氨酸的菌株构建策略并应用于L-色氨酸的发酵生产，仍是本领域面临的挑战。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明提供一种高产L-色氨酸的重组微生物及其构建方法，目的在于高效制备L-色氨酸。

本发明提供一种生产L-色氨酸的重组微生物，所述重组微生物的出发菌株选自克雷伯氏菌属菌株；所述重组微生物过表达包括磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因ppsA、色氨酸操纵子部分基因簇trpE^fbrD基因。

优选的，所述色氨酸操纵子部分基因簇trpE^fbrD基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.15所示。

优选的，所述出发菌株选自产酸克雷伯氏菌、土生克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌或肺炎克雷伯氏菌中的至少一种。

本发明提供上述任一项所述的生产L-色氨酸的重组微生物，所述重组微生物是在出发菌株的基础上，失活副产物和/或2,3-丁二醇合成途径中的酶基因，增强L-色氨酸合成通量相关的基因构建的；所述副产物选自乙酸、甲酸、琥珀酸、乳酸中的至少一种；所述L-色氨酸合成通量相关的基因选自L-色氨酸合成相关酶基因、代谢通路相关基因、外排蛋白基因、内源强启动子基因中的至少一种。

优选的，所述失活包括敲除或敲降，所述增强包括过表达。

优选的，所述副产物和/或2,3-丁二醇合成途径中的酶基因选自丙酮酸激酶编码基因pykF、色氨酸酶编码基因tnaA、色氨酸操纵子的转录抑制因子trpR、色氨酸操纵子的衰减子trpL、丙酮酸氧化酶基因pox、磷酸转乙酰基酶基因pta、乙酸激酶ackA、富马酸还原酶亚基A基因frdA、乳酸脱氢酶基因ldhD、丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB、乙醇脱氢酶基因adhE、α-乙酰乳酸合酶基因budB、α-乙酰乳酸脱羧酶基因budA、2,3-丁二醇脱氢酶基因budC、甘油脱氢酶基因gldA、1,3-丙二醇脱氢酶基因dhaT中的至少一种到十六种。

优选的，所述L-色氨酸合成通量相关的基因选自2,3-丁二醇合成基因簇的启动子P_budABC、3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶突变蛋白编码基因aroG^fbr，3-磷酸甘油酸脱氢酶突变蛋白编码基因serA^fbr、3-脱氢奎尼酸合酶编码基因aroB、莽草酸脱氢酶编码基因aroE、分支酸合酶编码基因aroC、色氨酸操纵子部分基因簇trpDC、色氨酸操纵子部分基因簇trpBA、转酮酶编码基因tktA，芳香族氨基酸外排蛋白编码基因ywkB、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pck、谷氨酰胺合酶编码基因glnA、L-色氨酸外排蛋白基因yddG中的至少一种到十三种。

本发明提供上述任一项所述生产L-色氨酸的重组微生物的构建方法，所述构建方法包括在出发菌株的基础上，失活副产物和/或2,3-丁二醇合成途径中的酶基因，增强L-色氨酸合成通量相关的基因构建的；所述副产物选自乙酸、甲酸、琥珀酸、乳酸中的至少一种；所述L-色氨酸合成通量相关的基因选自L-色氨酸合成相关酶基因、代谢通路相关基因、外排蛋白基因、内源强启动子基因中的至少一种。

本发明提供上述任一项所述生产L-色氨酸的重组微生物在用于生产L-色氨酸中的应用。

优选的，取过表达包括磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因ppsA、色氨酸操纵子部分基因簇trpE^fbrD基因的重组微生物，使用含葡萄糖的发酵培养基培养，即得。

优选的，所述发酵培养基中葡萄糖的浓度为80-100g/L；

和/或，所述重组微生物进行培养时的接种量为体积比5-10％；

和/或，所述培养时的搅拌转速为500-1000转/分钟；和/或，所述培养时的pH为6.8±0.1；和/或，所述培养时的温度为37±0.5℃；和/或，所述培养期间维持葡萄糖浓度在0-5g/L；和/或，所述培养的时间为40-60小时。

本发明提供了一种高产L-色氨酸的重组微生物及其构建方法和应用。本发明通过筛选敲除或添加的基因，优选了一种高产L-色氨酸的重组产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)。本发明的重组产酸克雷伯氏菌可以用于高效生产L-色氨酸。本发明的特点和突出效果如下：

(1)本发明设计了一种高产L-色氨酸工程菌株的构建策略，通过对2,3-丁二醇或乙偶姻生产菌株进行系统代谢重构，在敲除副产物合成相关基因以抑制2,3-丁二醇、乙酸、甲酸、琥珀酸和乳酸合成的基础上，引入外源L-色氨酸生物合成途径，将胞内丙酮酸合成代谢流从2,3-丁二醇合成重定向至L-色氨酸产生，构建L-色氨酸生产菌株；进一步通过增强L-色氨酸合成通量、加强L-色氨酸外排等策略，获得可高效生产L-色氨酸的工程菌株。

(2)本发明最优的产酸克雷伯氏菌工程菌株以葡萄糖为底物，在本发明给出的发酵条件下生产L-色氨酸，产量达到60g/L，得率为0.23g/g。

(3)本发明构建的重组菌株要求的培养基简单、发酵底物及培养成本低，同时工程菌株的L-色氨酸产量高，产物成分单一且易于分离。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为本发明重组产酸克雷伯氏菌的L-色氨酸合成代谢途径。

具体实施方式

以下实施例和实验例中，未特别说明的试剂和材料均为市售品。

以下实施例中，所使用的材料、试剂、质粒、专用试剂盒、菌株等，如无特殊说明，均从商业途径得到。

本发明涉及的基因的核苷酸序列信息如下：

基因ppsA核苷酸序列(SEQ ID NO.1)：

ATGTCCAACAATGGCTCGTCACCGCTGGTGCTTTGGTATAACCAACTCGGCATGAATGATGTAGACAGGGTTGGGGGCAAAAATGCCTCCCTGGGTGAAATGATTACTAATCTTTCCGGAATGGGTGTTTCCGTTCCGAATGGTTTCGCCACAACCGCCGACGCGTTTAACCAGTTTCTGGACCAAAGCGGCGTAAACCAGCGCATTTATGAACTGCTGGATAAAACGGATATTGACGATGTTACTCAGCTTGCGAAAGCGGGCGCGCAAATCCGCCAGTGGATTATCGACACTCCCTTCCAGCCTGAGCTGGAAAACGCCATCCGCGAAGCCTATGCACAGCTTTCCGCCGATGACGAAAACGCCTCTTTTGCGGTGCGCTCCTCCGCCACCGCAGAAGATATGCCGGACGCTTCTTTTGCCGGTCAGCAGGAAACCTTCCTCAACGTTCAGGGTTTTGACGCCGTTCTCGTGGCAGTGAAACATGTATTTGCTTCTCTGTTTAACGATCGCGCCATCTCTTATCGTGTGCACCAGGGTTACGATCACCGTGGTGTGGCGCTCTCCGCCGGTGTTCAACGGATGGTGCGCTCTGACCTCGCATCATCTGGCGTGATGTTCTCCATTGATACCGAATCCGGCTTTGACCAGGTGGTGTTTATCACTTCCGCATGGGGCCTTGGTGAGATGGTCGTGCAGGGTGCGGTTAACCCGGATGAGTTTTACGTGCATAAACCGACACTGGCGGCGAATCGCCCGGCTATCGTGCGCCGCACCATGGGGTCGAAAAAAATCCGCATGGTTTACGCGCCGACCCAGGAGCACGGCAAGCAGGTTAAAATCGAAGACGTACCGCAGGAACAGCGTGACATCTTCTCGCTGACCAACGAAGAAGTGCAGGAACTGGCAAAACAGGCCGTACAAATTGAGAAACACTACGGTCGCCCGATGGATATTGAGTGGGCGAAAGATGGCCACACCGGTAAACTGTTCATTGTGCAGGCGCGTCCGGAAACCGTGCGCTCACGCGGTCAGGTCATGGAGCGTTATACGCTGCATTCACAGGGTAAGATTATCGCCGAAGGCCGTGCTATCGGTCATCGCATCGGTGCGGGTCCGGTGAAAGTCATCCATGACATCAGCGAAATGAACCGCATCGAACCTGGCGACGTGCTGGTTACTGACATGACCGACCCGGACTGGGAACCGATCATGAAGAAAGCATCTGCCATCGTCACCAACCGTGGCGGTCGTACCTGTCACGCGGCGATCATCGCTCGTGAACTGGGCATTCCGGCGGTAGTGGGCTGTGGAGATGCAACAGAACGGATGAAAGACGGTGAGAACGTCACTGTTTCTTGTGCCGAAGGTGATACCGGTTACGTCTATGCGGAGTTGCTGGAATTTAGCGTGAAAAGCTCCAGCGTAGAAACGATGCCGGATCTGCCGTTGAAAGTGATGATGAACGTCGGTAACCCGGACCGTGCTTTCGACTTCGCCTGCCTACCGAACGAAGGCGTGGGCCTTGCGCGTCTGGAATTTATCATCAACCGTATGATTGGCGTCCACCCACGCGCACTGCTTGAGTTTGACGATCAGGAACCGCAGTTGCAAAACGAAATCCGCGAGATGATGAAAGGTTTTGATTCTCCGCGTGAATTTTACGTTGGTCGTCTGACTGAAGGGATCGCGACGCTGGGTGCCGCGTTTTATCCGAAGCGCGTCATTGTCCGTCTCTCTGATTTTAAATCGAACGAATATGCCAACCTGGTCGGTGGTGAGCGTTACGAGCCAGATGAAGAGAACCCGATGCTCGGCTTCCGTGGCGCGGGCCGCTATGTTTCCGACAGCTTCCGCGACTGTTTCGCGCTGGAGTGTGAAGCAGTGAAACGTGTGCGCAACGACATGGGACTGACCAACGTTGAGATCATGATCCCGTTCGTGCGTACCGTAGATCAGGCGAAAGCGGTGGTTGAAGAACTGGCGCGTCAGGGGCTGAAACGTGGCGAGAACGGGCTGAAAATCATCATGATGTGTGAAATCCCGTCCAACGCCTTGCTGGCCGAGCAGTTCCTCGAATATTTCGACGGCTTCTCAATTGGCTCAAACGATATGACGCAGCTGGCGCTCGGTCTGGACCGTGACTCCGGCGTGGTGTCTGAATTGTTCGATGAGCGCAACGATGCGGTGAAAGCACTGCTGTCGATGGCTATCCGTGCCGCGAAGAAACAGGGCAAATATGTCGGGATTTGCGGTCAGGGTCCGTCCGACCACGAAGACTTTGCCGCATGGTTGATGGAAGAGGGGATCGATAGCCTGTCTCTGAACCCGGACACCGTGGTGCAAACCTGGTTAAGCCTGGCTGAACTGAAGAAATAA

基因budA核苷酸序列(SEQ ID NO.2)：

ATGAACCATTCTGCTGAATGCTCTTGTGAAGAGAGCCTGTGTGAAACTCTACGAGGGTTTTCCGCGCAACATCCCGATAGCGTCATCTACCAGACCTCTCTGATGAGCGCGCTGTTGAGCGGCGTTTATGAAGGTAATACCACCATCGCTGATTTACTCACCCACGGCGATTTTGGCCTGGGAACCTTTAATGAACTGGACGGCGAGCTGATCGCGTTTAGCAGCGAGGTATACCAGCTGCGCGCCGACGGCAGCGCCCGTAAAGCCCGAATGGAACAGCGCACGCCGTTTGCGGTGATGACCTGGTTTCAGCCGCAGTATCGTAAAACGTTCGATAAACCGGTGAGCCGCCAGCAGTTGCACGACATTATCGACCAGCAAATACCCTCCGATAATCTCTTCTGCGCCTTGCGCATTAACGGTCATTTTCGTCATGCGCATACCCGCACCGTACCGCGCCAGACCCCGCCCTACCGGGCGATGACCGACGTGCTCGACGACCAGCCGGTATTCCGCTTCAACCAGCGCGAAGGGGTACTGGTCGGCTTCCGTACCCCGCAGCATATGCAGGGCATTAACGTTGCCGGCTACCACGAACATTTCATCACCGATGACCGTCAGGGCGGCGGTCATCTGCTCGATTATCAGCTCGACCACGGCGTGCTGACCTTTGGCGAAATCCACAAATTGATGATTGACCTTCCTGCCGATAGCGCCTTCCTGCAGGCGGATCTGCACCCGGACAATCTAGATGCCGCTATTCGCTCAGTCGAAAACTAA

突变蛋白基因aroG^fbr(D146N)核苷酸序列(SEQ ID NO.3)：

ATGAATTATCAGAACGACGATTTACGCATCAAAGAAATCAAAGAGTTACTTCCTCCTGTCGCATTGCTGGAAAAATTCCCCGCTACTGAAAATGCCGCGAATACGGTTGCCCATGCCCGAAAAGCGATCCATAAGATCCTGAAAGGTAATGATGATCGCCTGTTGGTTGTGATTGGCCCATGCTCAATTCATGATCCTGTCGCGGCAAAAGAGTATGCCACTCGCTTGCTGGCGCTGCGTGAAGAGCTGAAAGATGAGCTGGAAATCGTAATGCGCGTCTATTTTGAAAAGCCGCGTACCACGGTGGGCTGGAAAGGGCTGATTAACGATCCGCATATGGATAATAGCTTCCAGATCAACGACGGTCTGCGTATAGCCCGTAAATTGCTGCTTGATATTAACGACAGCGGTCTGCCAGCGGCAGGTGAGTTTCTCAATATGATCACCCCACAATATCTCGCTGACCTGATGAGCTGGGGCGCAATTGGCGCACGTACCACCGAATCGCAGGTGCACCGCGAACTGGCATCAGGGCTTTCTTGTCCGGTCGGCTTCAAAAATGGCACCGACGGTACGATTAAAGTGGCTATCGATGCCATTAATGCCGCCGGTGCGCCGCACTGCTTCCTGTCCGTAACGAAATGGGGGCATTCGGCGATTGTGAATACCAGCGGTAACGGCGATTGCCATATCATTCTGCGCGGCGGTAAAGAGCCTAACTACAGCGCGAAGCACGTTGCTGAAGTGAAAGAAGGGCTGAACAAAGCAGGCCTGCCAGCACAGGTGATGATCGATTTCAGCCATGCTAACTCGTCCAAACAATTCAAAAAGCAGATGGATGTTTGTGCTGACGTTTGCCAGCAGATTGCCGGTGGCGAAAAGGCCATTATTGGCGTGATGGTGGAAAGCCATCTGGTGGAAGGCAATCAGAGCCTCGAGAGCGGGGAGCCGCTGGCCTACGGTAAGAGCATCACCGATGCCTGCATCGGCTGGGAAGATACCGATGCTCTGTTACGTCAACTGGCGAATGCAGTAAAAGCGCGTCGCGGGTAA

基因budB核苷酸序列(SEQ ID NO.4)：

GTGGATAATCAACATCAACCTCGCCAGTGGGCGCATGGCGCCGACCTGATCGTCAGCCAGCTGGAGGCCCAGGGCGTTCGCCAGGTCTTCGGCATTCCGGGGGCAAAAATCGATAAGGTATTTGATTCGCTACTGGACTCCTCAATTCGCATTATCCCGGTACGCCACGAGGCCAACGCCGCCTTTATGGCCGCTGCGGTTGGCCGCATCACAGGGAAAGCGGGCGTCGCGCTGGTCACTTCCGGCCCCGGCTGCTCCAATCTGATTACCGGTATGGCCACCGCTAACAGCGAAGGCGATCCGGTGGTGGCGCTGGGCGGTGCGGTAAAACGCGCCGACAAGGCCAAACAAGTGCACCAGAGTATGGATACGGTGGCGATGTTCAGCCCGGTAACCAAATACTCGGTGGAAGTCACTGCATCCGATGCGCTGGCGGAGGTCGTGTCTAACGCATTTCGCGCCGCCGAGCAGGGACGGCCGGGAAGCGCCTTCGTCAGTCTGCCGCAGGACGTCGTCGATGAGCCAGTCCACGCCAGGGTGCTGCCCGCCAGCGAAGCCCCGCAGACCGGCGCGGCCCCGGACGACGCCATTGAGCGAGTGGCGAAGATGATTGCCGGGGCAAAAAATCCGGTATTCCTGCTCGGTCTGATGGCCAGCCAGACGGAAAACAGCGCGGCGCTCCGCGAATTGCTGAAAAAAAGCCATATCCCGGTCACCAGTACCTATCAGGCCGCCGGCGCGGTAAATCAGGACCACTTTACGCGCTTTGCCGGACGGGTTGGGCTGTTCAATAACCAGGCCGGGGATCGGCTATTGCATCTCGCCGACCTGGTCATCTGCATTGGCTATAGCCCGGTGGAGTATGAACCGGCGATGTGGAATAACGGTAACGCCGCGCTGGTGCATATCGACGTACTGCCCGCTTATGAAGAGCGCAACTATACCCCGGATATCGAGCTGGTCGGCGATATCGCTGCCACGCTGCACAAACTCTCCGGGCGTATTGACCACCAGCTGGTTCTGTCGCCGCAGGCCGCGGAGATTCTTGTTGACCGCCAGCACCAGCGGGAACTGCTCGATCGCCGCGGCGCGCAGCTAAACCAGTTTGCGCTTCATCCGCTGCGCATCGTTCGCGCCATGCAGGATATCGTCAACAGCGACGTAACGCTGACCGTCGATATGGGGAGCTTTCATATCTGGATCGCCCGCTATCTCTACAGCTTCCGCGCTCGTCAGGTCATGATTTCCAACGGTCAACAGACCATGGGGGTGGCACTGCCGTGGGCGATTGGCGCCTGGCTGGTGAACCCGCAGCGCAAAGTGGTTTCGGTTTCCGGCGATGGCGGTTTCCTGCAATCCAGTATGGAGCTGGAGACCGCCGTAAGGCTAAAAGCTAACGTCCTGCATATCATCTGGGTCGATAACGGCTACAACATGGTGGCAATTCAGGAAGAGAAAAAATATCAGCGGCTATCCGGCGTTGAGTTCGGCCCGGTGGATTTTAAAGCCTATGCCGAAGCCTTCGGCGCCAGAGGGTTCGCGGTCGAGAGCGCCGCCGCCCTTGAGCCGACGCTGCGGGCGGCGATGGACGTCGATGGCCCCGCCGTGGTCGCCATCCCCGTCGATTACAGCGACAACCCGCTGCTGATGGGCCAGCTTCATCTCAGTCAACTACTTTGA

基因tnaA核苷酸序列(SEQ ID NO.5)：

ATGAAACGTATCCCTGAGCCGTTCCGCATTAAAATGGTCGAAAATATTCGTATGACCACCTTTGACGATCGCGTCAAAGCGCTGGAAGAGGCGGGCTATAACCCGTTTTTGCTCAATAGCCAGGACGTGTATATCGACCTGCTGACCGACTCCGGCACCGGCGCGATGAGCGACCATCAATGGGCCGGGCTGATGATGGGCGACGAAGCCTACGCCGGGTCGCGTAACTATCAGCATCTGTGTGAAAAGGTCAAAGAGATTATCGGCTATCCGTATACCATTCCCACCCACCAGGGGCGCGGCGCGGAGCAGATTCTGTTCCCAAGCCTGATTGCTCGCCGCAAGTCGGCGCATCCGGTGTTTATTTCCAACTTCCACTTCGATACTACCGCCGCTCACGTGGAGCTTAACGGCGCAAAAGCCATTAACGTGGTGACGCCGAAAGCCTTCGACACGACCTCGTGGTACGACTGGAAAGGCAACTTTGATATTGATTTACTGAAAGCGACCATCGCCGAGCACGGCGCGGAAAACGTGGCGGCGATTATTACTACCGTCACCTGTAACAGTTCCGGCGGCCAGCCGGTATCGCTGGCGAATATGCGCGAGGTGTATCAAATTGCGCGCCAGAACAATATTCCGGTGGTAATCGACTCGGCCCGCTTCTGCGAAAACGCCTGGTTTATTAAACAGCGCGAAGAGGGCTATGCCGATAAATCGGTGAAAGAGATTATTCTCGAGATGTACCAGTACGGCGATATGCTGACCATGTCCGCCAAGAAAGACCCGATGGTGAATATTGGCGGACTGTGCTGCTTCCGCGATGACGAAGAGCTCTTCAACGAAGTGCGCATTCGCTGCGTGCCGATGGAAGGCTTTGTCACCTACGGCGGCCTGGCGGGGCGCGATATGGAGGCGCTGGCTATCGGTCTGGAAGAAGGGACCAACGAGGATTACCTCGCTTATCGCATCAATCAGGTGGAGTACCTCGGTGAACGCCTGCGCGAAGGCGGCATTCCGATTCAGTATCCGACCGGCGGTCATGCGGTGTTCGTCGATGCTAAGCTGCTGCTGCCGCATATTCCGCCGGAGCAGTTCCCGGCGCACGCGCTAAACAACGAGCTGTATCTGGAAGCGGGCATTCGCAGCGTGGAAATCGGCTCCCTGCTGCTGGGACGCGACCCGGAAACCGGTAAGCAGAAGGCGTCGCCGATGGAGCTGCTGCGCCTGACCATTCCGCGTCGGGTTTATACCAACGATCATATGGACTATATCGCTGATGCGCTGATCGCCGTTAAGGCGCGCGCCGCCACGATTAAGGGCCTGACCTTTACCTATGAACCGCCGGTACTGCGCCACTTCGTCGCCAGACTGAAACCGGTGAAATAA

启动子P_budABC核苷酸序列(SEQ ID NO.6)：

ATCGAAAACGTCTCAAACAATCATAGATTCTATATTGGAACTGTGAGCTGAATCG CGTCAACATTTATTTAACCTTTCTGATATTCGTTGAACGAGGAAGCGGGTA

基因trpL核苷酸序列(SEQ ID NO.7)：

GATGACTCCTGCTGGACATGAACCTGTACCCGTCATACTTTAAGTCACAAGCAGATTGACTGATGTTCTGCAGCTTAAGGGATTAAGGATAGTGATAAGCGCATCATCATACCGACTGATAGAGAAAATCTGCAAACGGGGGTTGACTTTAATCTCTCGGACTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACATGAAGGGGTATCATCAATGAAAACGCAACTCATCACTCTGCACGGCTGGTGGCGCACCTCCTGTTATCGGGCGGCGTGATCGCGTTTTGCACTCAGCATACAGATACCCGGCCCGCCAATGAGCGGGCTTTTTATTGGACAAATTATTACAGCGAACAGGCGACAACAAATA

基因trpR核苷酸序列(SEQ ID NO.8)：

ATGACCCAACAATCCCCCTATTCAGCAGCGGTAGCCGAACAGCGTCATCAGGAGTGGCTGCGTTTTGTCGCGCTCTTACAGCAGGCGTACGCCGACGATCTTCATCTGCCGCTTTTACAGCTTATGCTGACCCCCGACGAGCGCGAGGCGCTGGGTACGCGGGTACGTATTATTGAAGAGCTGCTGCGCGGTGAGATGAGCCAGCGCGAGCTAAAAAATGAACTCGGCGCCGGCATCGCGACCATCACCCGCGGTTCGAACAGCCTCAAATCAGCGCCGCCGGAGCTGCGTTTATGGCTGGAGCAGTCGTTGTTTAACGCTGGCGATAAATAG

基因aroB核苷酸序列(SEQ ID NO.9)：

ATGGAGAGGATTGTCGTTACTCTCGGGGAACGTAGTTACCCAATTACCATCGCATCTGGTTTGTTTAATGAACCAGCTTCATTCTTACCGCTGAAATCGGGCGAGCAGGTCATGTTGGTCACCAACGAAACCCTGGCTCCTCTGTATCTCGATAAGGTCCGCGGCGTACTTGAACAGGCGGGTGTTAACGTCGATAGCGTTATCCTCCCTGACGGCGAGCAGTATAAAAGCCTGGCTGTACTCGATACCGTCTTTACGGCGTTGTTACAAAAACCGCATGGTCGCGATACTACGCTGGTGGCGCTTGGCGGCGGCGTAGTGGGCGATCTGACCGGCTTCGCGGCGGCGAGTTATCAGCGCGGTGTCCGTTTCATTCAAGTCCCGACGACGTTACTGTCGCAGGTCGATTCCTCCGTTGGCGGCAAAACTGCGGTCAACCATCCCCTCGGTAAAAACATGATTGGCGCGTTCTACCAACCTGCTTCAGTGGTGGTGGATCTCGACTGTCTGAAAACGCTTCCCCCGCGTGAGTTAGCGTCGGGGCTGGCAGAAGTCATCAAATACGGCATTATTCTTGACGGTGCGTTTTTTAACTGGCTGGAAGAGAATCTGGATGCGTTGTTGCGTCTGGACGGTCCGGCAATGGCGTACTGTATTCGCCGTTGTTGTGAACTGAAGGCAGAAGTTGTCGCCGCCGACGAGCGCGAAACCGGGTTACGTGCTTTACTGAATCTGGGACACACCTTTGGTCATGCCATTGAAGCTGAAATGGGGTATGGCAATTGGTTACATGGTGAAGCGGTCGCTGCGGGTATGGTGATGGCGGCGCGGACGTCGGAACGTCTCGGGCAGTTTAGTTCTGCCGAAACGCAGCGTATTATAACCCTGCTCAAGCGGGCTGGGTTACCGGTCAATGGGCCGCGCGAAATGTCCGCGCAGGCGTATTTACCGCATATGCTGCGTGACAAGAAAGTCCTTGCGGGAGAGATGCGCTTAATTCTTCCGTTGGCAATTGGTAAGAGTGAAGTTCGCAGCGGCGTTTCGCACGAGCTTGTTCTTAACGCCATTGCCGATTGTCAATCAGCGTAA

基因ldhD核苷酸序列(SEQ ID NO.10)：

ATGAAAATCGCTGTGTACAGTACGAAACAGTACGACAAGAAGTATCTGCAGCATGTCAATGATGCATACGGCTTTGAACTGGAATTTTTTGACTTCCTGCTCACCGAAAAGACCGCCAAAACCGCCAACGGCTGTGAAGCGGTATGCATTTTCGTTAACGATGACGGTAGCCGCCCGGTACTTGAAGAACTGAAAGCCCACGGCGTGAAGTACATCGCGCTGCGCTGCGCCGGGTTCAACAACGTTGACCTCGACGCCGCGAAAGAGCTGGGCCTGCGGGTAGTACGCGTCCCGGCCTACTCGCCGGAAGCGGTCGCTGAGCACGCAATCGGCATGATGATGTCGCTGAACCGCCGCATTCATCGCGCCTATCAGCGCACTCGCGATGCTAACTTCTCCCTTGAGGGGCTGACCGGCTTCACTATGCACGGTAAAACCGCTGGCGTTATCGGCACCGGTAAGATTGGCGTTGCCGCGCTGCGCATCCTTAAAGGTTTCGGTATGCGCCTGCTGGCGTTTGATCCCTATCCAAGCGCCGCCGCGCTGGATATGGGCGTGGAGTATGTCGATCTGGAAACGCTATACCGGGAGTCCGATGTTATCTCCCTGCACTGCCCGCTGACCGATGAGAACTATCATTTGCTGAACCATGCCGCGTTCGATCGGATGAAAGATGGGGTGATGATCATCAACACCAGTCGCGGCGCGCTTATCGATTCGCAGGCAGCGATCGATGCCCTGAAGCACCAGAAAATTGGCGCGCTGGGGATGGACGTGTATGAGAACGAACGCGATCTGTTCTTTGAAGATAAGTCTAACGACGTTATTCAGGACGATGTCTTCCGCCGTCTTTCCGCCTGCCACAACGTTCTGTTTACCGGTCACCAGGCGTTTTTGACCGCAGAGGCGTTGATCAGTATCTCGCAGACCACCCTCGACAACCTGCGTCAGGTGGATGCTGACGAAACCTGCCCTAACGCACTGGTCTGA

基因aroE核苷酸序列(SEQ ID NO.11)：

ATGGAAACCTATGCTGTTTTTGGTAATCCGATAGCCCACAGCAAATCGCCATTCATTCATCAGCAATTTGCTCAGCAACTGAATATTGAACATCCCTATGGGCGCGTGTTGGCACCCATCAATGATTTCATCAACACACTGAACGCTTTCTTTAGTGCTGGTGGTAAAGGTGCGAATGTGACGGTGCCTTTTAAAGAAGAGGCTTTTGCCAGAGCGGATGAGCTTACTGAACGGGCAGCGTTGGCTGGTGCTGTTAATACCCTCATGCGGTTAGAAGATGGACGCCTGCTGGGTGACAATACCGATGGTGTAGGCTTGTTAAGCGATCTGGAACGTCTGTCTTTTATCCGCCCTGGTTTACGTATTCTGCTTATCGGCGCTGGTGGAGCATCTCGCGGCGTACTACTGCCACTCCTTTCCCTGGACTGTGCGGTGACAATAACTAATCGGACGGTATCCCGCGCGGAAGAGTTGGCTAAATTGTTTGCGCACACTGGCAGTATTCAGGCGTTGAGTATGGACGAACTGGAAGGTCATGAGTTTGATCTCATTATTAATGCAACATCCAGTGGCATCAGTGGTGATATTCCGGCGATCCCGTCATCGCTCATTCATCCAGGCATTTATTGCTATGACATGTTCTATCAGAAAGGAAAAACTCCTTTTCTGGCATGGTGTGAGCAGCGAGGCTCAAAGCGTAATGCTGATGGTTTAGGAATGCTGGTGGCACAGGCGGCTCATGCCTTTCTTCTCTGGCACGGTGTTCTGCCTGACGTAGAACCAGTTATAAAGCAATTGCAGGAGGAATTGTCCGCGTGA

基因adhE核苷酸序列(SEQ ID NO.12)：

ATGGCTGTTACTAATGTCGCTGAACTTAACGCACTCGTAGAGCGCGTAAAAAAAGCCCAGCGTGAATATGCCAGTTTCACTCAAGAACAAGTAGACAAAATCTTCCGCGCCGCCGCTCTGGCCGCTGCAGATGCTCGAATCCCTCTCGCTAAGATGGCCGTTGCCGAATCCGGCATGGGCATCGTCGAAGATAAAGTGATCAAAAACCACTTTGCTTCCGAATACATCTATAACGCCTATAAAGATGAAAAGACCTGCGGCGTCCTGTCTGAAGATGACACCTTTGGTACTATTACAATCGCTGAACCGATTGGTATCATCTGCGGTATCGTCCCGACCACTAACCCGACTTCAACCGCTATCTTTAAATCTCTGATTAGCCTGAAGACTCGTAACGCCATCATCTTCTCCCCGCATCCGCGTGCTAAAGATGCAACCAATAAAGCAGCTGATATCGTACTGCAGGCGGCTATCGCTGCCGGCGCGCCGAAAGATCTGATTGGTTGGATTGACCAGCCTTCCGTAGAACTGTCCAATGCGCTGATGCATCACCCGGATATCAACCTGATCCTCGCCACCGGCGGTCCGGGCATGGTTAAAGCAGCGTACAGCTCTGGTAAACCGGCAATCGGCGTAGGCGCGGGTAACACTCCCGTTGTTATCGACGAAACGGCTGATATCAAACGCGCCGTCGCATCCGTACTGATGTCTAAAACCTTCGATAACGGCGTTATTTGTGCTTCCGAGCAGTCCGTAGTCGTTGTAGATTCCGTATACGACGCCGTTCGCGAACGTTTCTCCAGCCACGGCGGCTACCTGCTGCAGGGCCAGGAGCTGAAAGCGGTTCAGAATATCATTCTGAAAAATGGCGCGCTGAACGCCGCTATCGTTGGTCAACCTGCGTATAAAATCGCTGAGCTGGCAGGCTTCACCGTTCCTGTGTCCACCAAGATTCTGATTGGTGAAGTCACCGACGTTGATGAAAGTGAGCCGTTTGCCCACGAAAAACTGTCCCCGACGCTGGCGATGTATCGTGCGAAGAACTTCGAAGACGCGGTTGATAAAGCGGAAAAACTGGTTGCTATGGGCGGTATCGGCCACACTTCCTGCCTGTATACCGACCAGGATAACCAGCCAGAACGCGTTGCTTACTTCGGTCAGTTGATGAAAACCGCACGTATCCTGATCAACACCCCGGCTTCTCAGGGTGGTATCGGTGACCTGTATAACTTCAAACTCGCACCTTCCCTGACTCTGGGTTGTGGTTCATGGGGTGGTAACTCCATCTCGGAAAACGTTGGTCCTAAGCACCTGATCAACAAGAAAACCGTTGCTAAGCGAGCTGAAAACATGTTGTGGCACAAACTTCCGAAATCTATCTACTTCCGTCGTGGCTCACTGCCAATCGCGCTGGATGAAGTGATTACTGATGGTCACAAACGCGCGCTGATCGTCACCGACCGTTTCCTGTTTAACAACGGCTACGCAGACCAGATCACTTCCGTACTGAAAGCGGCCGGCGTTGAAACAGAAGTTTTCTTTGAAGTGGAAGCTGACCCGACTCTGACCATCGTCCGTAAAGGCGCTGAGCTGGCGAACTCTTTCAAACCGGACGTGATTATCGCCCTGGGCGGCGGTTCCCCGATGGACGCGGCGAAAATCATGTGGGTCATGTACGAACATCCGGAAACCCACTTCGAAGAGCTGGCGCTGCGCTTTATGGATATCCGTAAGCGTATCTACAAGTTCCCGAAAATGGGCGTTAAAGCCAAAATGGTGGCGATCACCACCACGTCTGGTACCGGCTCTGAAGTCACGCCGTTCGCCGTTGTTACCGATGATGCAACCGGGCAGAAATACCCGCTGGCTGACTATGCCCTGACCCCGGATATGGCGATTGTTGATGCCAACCTGGTCATGGAAATGCCGAAATCCCTGTGTGCTTTCGGTGGTCTGGATGCGGTGACCCATGCGCTGGAAGCTTACGTTTCCGTACTGGCCTCCGAGTTCTCCGACGGTCAGGCTCTGCAGGCGCTGAAGCTGCTGAAAGAAAACCTGCCGGCGTCTTACCATGAAGGTTCTAAGAACCCGGTAGCGCGTGAGCGCGTACACAGTGCTGCAACGATCGCCGGTATTGCGTTTGCTAACGCCTTCCTGGGTGTATGTCACTCCATGGCGCACAAGCTTGGTTCTCAGTTCCACATTCCTCACGGTCTGGCGAACGCCCTGTTGATCAGTAACGTTATCCGCTATAACGCCAACGACAACCCGACCAAACAGACGGCATTCAGCCAGTACGACCGTCCGCAGGCCCGTCGTCGCTATGCGGAAATCGCTGACCACCTGGGTCTGACTGCACCGGGTGACCGCACCGCAGCGAAAATCGAAAAACTGCTTGGCTGGCTGGAAGAAATTAAAGCTGAACTGGGTATTCCTAAGTCTATCCGCGAAGCTGGCGTGCAGGAAGCTGACTTCCTGGCCCACGTTGATAAGCTGTCTGAAGACGCATTCGATGACCAGTGCACCGGCGCCAACCCGCGCTATCCGCTGATTGCCGAGCTGAAACAGATTCTGCTGGATACCTACTACGGTCGCCATTACGTCGAAGGCGGCGTGGAAGAGAAGAAAGAAGCCGCGCCGGGTAAAGCTGAGAAAAAAGCGAAGAAATCCGCTTAA

基因aroC核苷酸序列(SEQ ID NO.13)：

ATGGCTGGAAACACAATTGGACAACTCTTTCGCGTAACCACCTTCGGCGAATCGCACGGGCTGGCGCTCGGCTGCATCGTCGATGGTGTTCCGCCAGGCATTCCGCTGACGGAAGCGGACCTGCAACATGACCTCGACCGTCGTCGCCCTGGGACATCGCGCTATACCACCCAGCGCCGCGAGCCGGATCAGGTCAAAATTCTCTCCGGTGTTTTTGAAGGCGTTACTACCGGCACCAGCATTGGCTTGTTGATCGAAAACACTGACCAGCGCTCTCAGGATTACAGTGCGATTAAGGACGTTTTCCGTCCAGGCCATGCCGATTACACCTACGAACAAAAATACGGTCTGCGCGATTATCGCGGCGGTGGACGTTCTTCCGCCCGCGAAACCGCCATGCGCGTGGCGGCAGGAGCTATTGCCAAAAAATATCTCGCCGAGAAATTTGGTATTGAAATCCGTGGCTGCCTGACCCAGATGGGCGACATTCCGCTGGATATCAAAGACTGGTCGCAGGTCGAGCAAAATCCGTTTTTTTGCCCGGACCCCGACAAAATCGACGCGTTAGACGAGTTGATGCGTGCGCTGAAAAAAGAGGGCGACTCCATCGGCGCTAAAGTCACCGTTGTTGCCAGTGGCGTTCCTGCCGGACTTGGCGAGCCGGTCTTTGACCGCCTGGATGCTGACATCGCCCATGCGCTGATGAGCATCAACGCGGTGAAAGGCGTGGAAATTGGCGACGGCTTTGACGTGGTGGCGCTGCGCGGCAGCCAGAACCGCGATGAAATCACCAAAGACGGTTTCCAGAGCAACCATGCGGGCGGCATTCTCGGCGGTATCAGCAGCGGGCAGCAAATCATTGCCCATATGGCGCTGAAACCGACCTCCAGCATTACCGTGCCGGGTCGTACCATTAACCGCTTTGGCGAAGAAGTTGAGATGATCACCAAAGGCCGTCACGATCCCTGTGTCGGGATCCGCGCAGTGCCGATCGCAGAAGCGATGCTGGCGATCGTTTTAATGGATCACCTGTTACGGCAACGGGCGCAAAATGCCGATGTGAAGACTGATATTCCACGCTGGTAA

基因frdA核苷酸序列(SEQ ID NO.14)：

GTGCAAACTTTTCAAGCCGATCTTGCCGTTATTGGCGCAGGCGGAGCAGGTCTTCGTGCTGCAATTGCCGCCGCGCAAGCTAATCCAAATGCTAAAATCGCTCTAATTTCAAAAGTCTATCCTATGCGCAGCCATACCGTTGCTGCTGAAGGGGGTTCCGCTGCCGTCGCGCAGGATCATGATAGCTTTGAGTACCATTTCCACGATACTGTTGCAGGCGGCGACTGGCTATGCGAACAGGATGTCGTCGACTACTTCGTTCATCACTGCCCGACGGAAATGACCCAGCTTGAGCAGTGGGGTTGTCCGTGGAGCCGCCGCCCTGACGGCAGCGTCAACGTCCGGCGCTTCGGCGGTATGAAGATCGAGCGAACCTGGTTCGCAGCCGATAAAACCGGCTTTCATATGCTGCACACCCTGTTCCAGACCTCGCTTCAGTTCCCCCAAATCCAACGCTTCGACGAACACTTTGTCCTCGATATCCTGGTCGACGAAGGTCAGGCGCGCGGTCTGGTCGCGATGAATATGATGGAGGGTACGCTGGTACAGATCCGCGCCAACGCGGTAGTTCTGGCGACCGGCGGCGCAGGACGCGTATATCGCTACAATACCAACGGCGGGATCGTCACCGGCGATGGTATGGGTATGGCGCTCAGCCACGGCGTACCGCTGCGCGATATGGAGTTCGTGCAATATCACCCAACCGGCCTGCCGGGTTCCGGTATTCTGATGACGGAAGGCTGCCGCGGTGAAGGCGGTATTCTGGTCAACAAGAATGGCTACCGCTATCTGCAGGATTACGGCATGGGCCCGGAAACTCCGCTGGGCGAGCCAAAAAACAAATATATGGAGCTGGGTCCGCGCGACAAAGTCTCCCAGGCTTTCTGGCACGAATGGCGTAAAGGCAACACGATCCCAACGCCGCGAGGCGACGTGGTCTACCTCGATCTGCGTCATTTGGGCGAGAAAAAGCTGCTTGAACGTCTGCCGTTTATCTGTGAACTCTCAAAAGCCTACGTGGGCGTCGATCCGGTGAAAGATCCCATTCCGGTACGTCCAACCGCGCACTACACCATGGGCGGTATCGAAACCGACCAGCAGTGTGAAACCCGTATTAAAGGGCTGTTTGCCGTTGGCGAATGCTCTTCTGTCGGTTTGCACGGCGCTAACCGTCTCGGCTCCAACTCGCTGGCGGAGCTGGTGGTGTTTGGTCGTTTGGCCGGTGAACAGGCCATGCAGCGCGCCACCGAAGCGGGCGAAGCCAATAGCACCGCGCTGGACGCGCAGGTCGTCGATATCGAGAAGCGCCTGAAGGACCTGGTGAATCAGGAAGGTAACGAAAACTGGGCGAAGATCCGTGATGAAATGGGTCTGTCGATGGAAGAAGGCTGCGGCATCTACCGTACGCCGGAGCTCATGCAGAAAACGGTTGATAAGCTGGCCGAGCTGCAGGAGCGCTTCAAGCGCGTGCGTATCACCGACACCTCCAGCGTGTTCAATACCGACCTGCTGTATACCATCGAACTGGGTCATGGTCTGAACGTCGCCGAATGTATGGCGCATTCCGCCATCGCGCGTAAAGAGTCCCGCGGCGCGCATCAGCGTCTGGATGAAGGCTGCACCGAGCGTGACGACGTCAACTTCCTCAAGCATACCCTCGCCTTCCGCGACGCCAACGGTAATACCACTCTGGAGTACAGTGATGTGAAAATCACCACTCTGCCGCCGGCAAAACGCGTGTACGGGGCGGAAGCGGAAGCAGCCGAGAAGAAGGAGACGACGAATGGCTGA

突变蛋白基因trpE^fbr(S40F)D核苷酸序列(SEQ ID NO.15)：

ATGCAAACACAAAAACCGACTCTCGAACTGCTAACCTGCGAAGGCGCTTATCGCGACAATCCCACCGCGCTTTTTCACCAGTTGTGTGGGGATCGTCCGGCAACGCTGCTGCTGGAATTCGCAGATATCGACAGCAAAGATGATTTAAAAAGCCTGCTGCTGGTAGACAGTGCGCTGCGCATTACAGCTTTAGGTGACACTGTCACAATCCAGGCACTTTCCGGCAACGGCGAAGCCCTCCTGGCACTACTGGATAACGCCCTGCCTGCGGGTGTGGAAAGTGAACAATCACCAAACTGCCGTGTGCTGCGCTTCCCCCCTGTCAGTCCACTGCTGGATGAAGACGCCCGCTTATGCTCCCTTTCGGTTTTTGACGCTTTCCGTTTATTGCAGAATCTGTTGAATGTACCGAAGGAAGAACGAGAAGCCATGTTCTTCGGCGGCCTGTTCTCTTATGACCTTGTGGCGGGATTTGAAGATTTACCGCAACTGTCAGCGGAAAATAACTGCCCTGATTTCTGTTTTTATCTCGCTGAAACGCTGATGGTGATTGACCATCAGAAAAAAAGCACCCGTATTCAGGCCAGCCTGTTTGCTCCGAATGAAGAAGAAAAACAACGTCTCACTGCTCGCCTGAACGAACTACGTCAGCAACTGACCGAAGCCGCGCCGCCGCTGCCAGTGGTTTCCGTGCCGCATATGCGTTGTGAATGTAATCAGAGCGATGAAGAGTTCGGTGGCGTAGTGCGTTTGTTGCAAAAAGCGATTCGCGCTGGAGAAATTTTCCAGGTGGTGCCATCTCGCCGTTTCTCTCTGCCCTGCCCGTCACCGCTGGCGGCCTATTACGTGCTGAAAAAGAGTAATCCCAGCCCGTACATGTTTTTTATGCAGGATAATGATTTCACCCTATTTGGCGCGTCGCCGGAAAGCTCGCTCAAGTATGATGCCACCAGCCGCCAGATTGAGATCTACCCGATTGCCGGAACACGCCCACGCGGTCGTCGCGCCGATGGTTCACTGGACAGAGATCTCGACAGCCGTATTGAACTGGAAATGCGTACCGATCATAAAGAGCTGTCTGAACATCTGATGCTGGTTGATCTCGCCCGTAATGATCTGGCACGCATTTGCACCCCCGGCAGCCGCTACGTCGCCGATCTCACCAAAGTTGACCGTTATTCCTATGTGATGCACCTCGTCTCTCGCGTAGTCGGCGAACTGCGTCACGATCTTGACGCCCTGCACGCTTATCGCGCCTGTATGAATATGGGGACGTTAAGCGGTGCGCCGAAAGTACGCGCTATGCAGTTAATTGCCGAGGCGGAAGGTCGTCGCCGCGGCAGCTACGGCGGCGCGGTAGGTTATTTCACCGCGCATGGCGATCTCGACACCTGCATTGTGATCCGCTCGGCGCTGGTGGAAAACGGTATCGCCACCGTGCAAGCGGGTGCTGGTGTAGTCCTTGATTCTGTTCCGCAGTCGGAAGCCGACGAAACCCGTAACAAAGCCCGCGCTGTACTGCGCGCTATTGCCACCGCGCATCATGCACAGGAGACTTTCTGATGGCTGACATTCTGCTGCTCGATAATATCGACTCTTTTACGTACAACCTGGCAGATCAGTTGCGCAGCAATGGGCATAACGTGGTGATTTACCGCAACCATATTCCGGCGCAAACCTTAATTGAACGCCTGGCGACCATGAGCAATCCGGTGCTGATGCTTTCTCCTGGCCCCGGTGTGCCGAGCGAAGCCGGTTGTATGCCGGAACTCCTCACCCGCTTGCGTGGCAAGCTGCCCATTATTGGCATTTGCCTCGGACATCAGGCGATTGTCGAAGCTTACGGGGGCTATGTCGGTCAGGCGGGCGAAATTCTCCACGGTAAAGCCTCCAGCATTGAACATGACGGTCAGGCGATGTTTGCCGGATTAACAAACCCGCTGCCGGTGGCGCGTTATCACTCGCTGGTTGGCAGTAACATTCCGGCCGGTTTAACCATCAACGCCCATTTTAATGGCATGGTGATGGCAGTACGTCACGATGCGGATCGCGTTTGTGGATTCCAGTTCCATCCGGAATCCATTCTCACCACCCAGGGCGCTCGCCTGCTGGAACAAACGCTGGCCTGGGCGCAGCAGAAACTAGAGCCAGCCAACACGCTGCAACCGATTCTGGAAAAACTGTATCAGGCGCAGACGCTTAGCCAACAAGAAAGCCACCAGCTGTTTTCAGCGGTGGTGCGTGGCGAGCTGAAGCCGGAACAACTGGCGGCGGCGCTGGTGAGCATGAAAATTCGCGGTGAGCACCCGAACGAGATCGCCGGGGCAGCAACCGCGCTACTGGAAAACGCAGCGCCGTTCCCGCGCCCGGATTATCTGTTTGCTGATATCGTCGGTACTGGCGGTGACGGCAGCAACAGTATCAATATTTCTACCGCCAGTGCGTTTGTCGCCGCGGCCTGTGGGCTGAAAGTGGCGAAACACGGCAACCGTAGCGTCTCCAGTAAATCTGGTTCGTCCGATCTGCTGGCGGCGTTCGGTATTAATCTTGATATGAACGCCGATAAATCGCGCCAGGCGCTGGATGAGTTAGGTGTATGTTTCCTCTTTGCGCCGAAGTATCACACCGGATTCCGCCACGCGATGCCGGTTCGCCAGCAACTGAAAACCCGCACCCTGTTCAATGTGCTGGGGCCATTGATTAACCCGGCGCATCCGCCGCTGGCGTTAATTGGTGTTTATAGTCCGGAACTGGTGCTGCCGATTGCCGAAACCTTGCGCGTGCTGGGGTATCAACGCGCGGCGGTGGTGCACAGCGGCGGGATGGATGAAGTTTCATTACACGCGCCGACAATCGTTGCCGAACTGCATGACGGCGAAATTAAAAGCTATCAGCTCACCGCAGAAGACTTTGGCCTGACACCCTACCACCAGGAGCAACTGGCAGGCGGAACACCGGAAGAAAACCGTGACATTTTAACACGTTTGTTACAAGGTAAAGGCGACGCCGCCCATGAAGCAGCCGTCGCTGCGAACGTCGCCATGTTAATGCGCCTGCATGGCCATGAAGATCTGCAAGCCAATGCGCAAACCGTTCTTGAGGTACTGCGCAGTGGTTCCGCTTACGACAGAGTCACCGCACTGGCGGCACGAGGGTAA

基因pflB核苷酸序列(SEQ ID NO.16)：

ATGTCCGAGCTTAATGAAAAGTTAGCCACAGCCTGGGAAGGTTTTGCGAAAGGTGACTGGCAGAACGAAGTCAACGTCCGCGACTTCATCCAGAAAAACTATACCCCGTACGAAGGTGACGAGTCCTTCCTGGCTGGCGCAACTGAAGCGACCACCAAGCTGTGGGACACCGTAATGGAAGGCGTTAAACAGGAAAACCGCACTCATGCGCCTGTTGATTTTGATACTTCCCTTGCGTCCACCATCACCTCTCATGACGCTGGCTACATCGAGAAAGGTCTCGAGAAAATCGTTGGTCTGCAGACTGAAGCGCCGCTGAAACGTGCGATTATCCCGTTCGGTGGTATCAAAATGGTAGAAGGCTCCTGCAAAGCGTACAATCGCGAGCTGGACCCAATGCTGAAGAAAATCTTCACTGAATACCGTAAAACCCACAACCAGGGCGTGTTTGACGTTTACACCAAAGACATCCTGAACTGCCGTAAATCTGGCGTTCTGACCGGTCTGCCGGATGCCTATGGTCGTGGTCGTATCATCGGTGACTACCGTCGCGTTGCGCTGTACGGTATCGACTTCCTGATGAAAGACAAATACGCTCAGTTCGTCTCTCTGCAAGACAAACTGGAAAGCGGTGAAGATCTGGAAGCAACCATCCGTCTGCGTGAAGAAATCTCTGAGCAGCACCGTGCGCTGGGTCAGATCAAAGAAATGGCGGCTAAATATGGCTGCGATATCTCTGGTCCTGCTACCACCGCTCAGGAAGCTATCCAGTGGACCTACTTTGGTTACCTGGCTGCCGTTAAATCTCAGAACGGCGCGGCAATGTCCTTCGGTCGTACCTCCAGCTTCCTGGACATCTTCATCGAACGTGACCTGAAAGCCGGTAAAATCACCGAGCAAGACGCTCAGGAAATGATTGACCACCTGGTCATGAAACTGCGTATGGTTCGTTTCCTGCGTACTCCAGAATATGATGAACTGTTCTCCGGTGACCCGATTTGGGCAACTGAATCCATCGGCGGTATGGGCGTTGACGGCCGTACTCTGGTAACCAAAAACAGCTTCCGTTTCCTGAACACCCTGTACACCATGGGGCCGTCTCCGGAGCCGAACATCACCATTCTGTGGTCTGAAAAACTGCCGCTGAGCTTCAAAAAATTCGCTGCAAAAGTGTCCATCGATACCTCTTCTCTGCAGTATGAGAACGATGACCTGATGCGCCCAGACTTCAACAACGATGACTACGCTATCGCTTGCTGCGTAAGCCCGATGGTTGTTGGTAAGCAAATGCAGTTCTTCGGTGCTCGCGCTAACCTCGCGAAAACCATGCTGTACGCAATCAACGGCGGCGTTGATGAAAAACTGAAAATGCAGGTTGGTCCTAAATCTGAACCGATCAAAGGCGACGTTCTGAACTTCGATGAAGTGATGGACCGCATGGATCACTTCATGGACTGGCTGGCTAAACAGTACGTCACTGCGCTGAACATCATCCACTACATGCACGACAAGTACAGCTACGAAGCCTCCCTGATGGCGCTGCACGACCGTGATGTTATCCGCACTATGGCATGTGGTATCGCAGGTCTGTCCGTTGCTGCTGACTCCCTGTCTGCAATCAAATATGCGAAAGTTAAACCGATTCGTGATGAAAACGGTCTGGCTGTCGACTTCGAAATCGAAGGCGAATACCCGCAGTTTGGTAACAACGACTCTCGCGTCGATGATATGGCCGTTGACCTGGTTGAACGTTTCATGAAGAAAATTCAGAAACTGCACACCTACCGTAACGCTATCCCGACTCAGTCCGTTCTGACCATCACCTCTAACGTTGTGTATGGTAAGAAAACTGGTAACACCCCAGACGGTCGTCGCGCTGGCGCTCCGTTCGGACCAGGTGCTAACCCGATGCACGGCCGTGACCAGAAAGGTGCAGTTGCCTCTCTGACCTCCGTTGCTAAACTGCCGTTTGCTTACGCGAAAGATGGTATCTCTTATACCTTCTCTATCGTTCCGAACGCACTGGGTAAAGACGACGAAGTTCGTAAAACTAACCTCGCAGGCCTGATGGATGGTTACTTCCACCACGAAGCGTCCATCGAAGGCGGTCAGCACCTGAACGTCAACGTCATGAACCGCGAAATGCTGCTCGACGCGATGGAAAACCCGGAAAAATATCCGCAGCTGACCATCCGCGTATCCGGTTATGCAGTACGTTTTAACTCCCTGACTAAAGAACAGCAGCAGGACGTTATTACTCGTACCTTCACTCAGACCATGTAA

基因trpDC核苷酸序列(SEQ ID NO.17)：

ATGGCTGACATTCTGCTGCTCGATAATATCGACTCTTTTACGTACAACCTGGCAGATCAGTTGCGCAGCAATGGGCATAACGTGGTGATTTACCGCAACCATATTCCGGCGCAAACCTTAATTGAACGCCTGGCGACCATGAGCAATCCGGTGCTGATGCTTTCTCCTGGCCCCGGTGTGCCGAGCGAAGCCGGTTGTATGCCGGAACTCCTCACCCGCTTGCGTGGCAAGCTGCCCATTATTGGCATTTGCCTCGGACATCAGGCGATTGTCGAAGCTTACGGGGGCTATGTCGGTCAGGCGGGCGAAATTCTCCACGGTAAAGCCTCCAGCATTGAACATGACGGTCAGGCGATGTTTGCCGGATTAACAAACCCGCTGCCGGTGGCGCGTTATCACTCGCTGGTTGGCAGTAACATTCCGGCCGGTTTAACCATCAACGCCCATTTTAATGGCATGGTGATGGCAGTACGTCACGATGCGGATCGCGTTTGTGGATTCCAGTTCCATCCGGAATCCATTCTCACCACCCAGGGCGCTCGCCTGCTGGAACAAACGCTGGCCTGGGCGCAGCAGAAACTAGAGCCAGCCAACACGCTGCAACCGATTCTGGAAAAACTGTATCAGGCGCAGACGCTTAGCCAACAAGAAAGCCACCAGCTGTTTTCAGCGGTGGTGCGTGGCGAGCTGAAGCCGGAACAACTGGCGGCGGCGCTGGTGAGCATGAAAATTCGCGGTGAGCACCCGAACGAGATCGCCGGGGCAGCAACCGCGCTACTGGAAAACGCAGCGCCGTTCCCGCGCCCGGATTATCTGTTTGCTGATATCGTCGGTACTGGCGGTGACGGCAGCAACAGTATCAATATTTCTACCGCCAGTGCGTTTGTCGCCGCGGCCTGTGGGCTGAAAGTGGCGAAACACGGCAACCGTAGCGTCTCCAGTAAATCTGGTTCGTCCGATCTGCTGGCGGCGTTCGGTATTAATCTTGATATGAACGCCGATAAATCGCGCCAGGCGCTGGATGAGTTAGGTGTATGTTTCCTCTTTGCGCCGAAGTATCACACCGGATTCCGCCACGCGATGCCGGTTCGCCAGCAACTGAAAACCCGCACCCTGTTCAATGTGCTGGGGCCATTGATTAACCCGGCGCATCCGCCGCTGGCGTTAATTGGTGTTTATAGTCCGGAACTGGTGCTGCCGATTGCCGAAACCTTGCGCGTGCTGGGGTATCAACGCGCGGCGGTGGTGCACAGCGGCGGGATGGATGAAGTTTCATTACACGCGCCGACAATCGTTGCCGAACTGCATGACGGCGAAATTAAAAGCTATCAGCTCACCGCAGAAGACTTTGGCCTGACACCCTACCACCAGGAGCAACTGGCAGGCGGAACACCGGAAGAAAACCGTGACATTTTAACACGTTTGTTACAAGGTAAAGGCGACGCCGCCCATGAAGCAGCCGTCGCTGCGAACGTCGCCATGTTAATGCGCCTGCATGGCCATGAAGATCTGCAAGCCAATGCGCAAACCGTTCTTGAGGTACTGCGCAGTGGTTCCGCTTACGACAGAGTCACCGCACTGGCGGCACGAGGGTAAATGATGCAAACCGTTTTAGCGAAAATCGTCGCAGACAAGGCGATTTGGGTAGAAGCCCGCAAACAGCAGCAACCGCTGGCCAGTTTTCAGAATGAGGTTCAGCCGAGCACGCGACATTTTTATGATGCGCTACAGGGTGCGCGCACGGCGTTTATTCTGGAGTGCAAGAAAGCGTCGCCGTCAAAAGGCGTGATCCGTGATGATTTCGATCCAGCACGCATTGCCGCCATTTATAAACATTACGCTTCGGCAATTTCGGTGCTGACTGATGAGAAATATTTTCAGGGGAGCTTTAATTTCCTCCCCATCGTCAGCCAAATCGCCCCGCAGCCGATTTTATGTAAAGACTTCATTATCGACCCTTACCAGATCTATCTGGCGCGCTATTACCAGGCCGATGCCTGCTTATTAATGCTTTCAGTACTGGATGACGACCAATATCGCCAGCTTGCCGCCGTCGCTCACAGTCTGGAGATGGGGGTGCTGACCGAAGTCAGTAATGAAGAGGAACAGGAGCGCGCCATTGCATTGGGAGCAAAGGTCGTTGGCATCAACAACCGCGATCTGCGTGATTTGTCGATTGATCTCAACCGTACCCGCGAGCTTGCGCCGAAACTGGGGCACAACGTGACGGTAATCAGCGAATCCGGCATCAATACTTACGCTCAGGTGCGCGAGTTAAGCCACTTCGCTAACGGTTTTCTGATTGGTTCGGCGTTGATGGCCCATGACGATTTGCACGCCGCCGTGCGCCGGGTGTTGCTGGGTGAGAATAAAGTATGTGGCCTGACGCGTGGGCAAGATGCTAAAGCAGCTTATGACGCGGGCGCGATTTACGGTGGGTTGATTTTTGTTGCGACATCACCGCGTTGCGTCAACGTTGAACAGGCGCAGGAAGTGATGGCTGCGGCACCGTTGCAGTATGTTGGCGTGTTCCGCAATCACGATATTGCCGATGTGGTGGACAAAGCTAAGGTGTTATCGCTGGCGGCAGTGCAACTGCATGGTAATGAAGAACAGCTGTATATCGATACGCTGCGTGAAGCTCTGCCAGCACATGTTGCCATCTGGAAAGCATTAAGCGTCGGTGAAACCCTGCCCGCCCGCGAGTTTCAGCACGTTGATAAATATGTTTTAGACAACGGCCAGGGTGGAAGCGGGCAACGTTTTGACTGGTCACTATTAAATGGTCAATCGCTTGGCAACGTTCTGCTGGCGGGGGGCTTAGGCGCAGATAACTGCGTGGAAGCGGCACAAACCGGCTGCGCCGGACTTGATTTTAATTCTGCTGTAGAGTCGCAACCGGGCATCAAAGACGCACGTCTTTTGGCCTCGGTTTTCCAGACGCTGCGCGCATATTAA

基因pox核苷酸序列(SEQ ID NO.18)：

ATGAAACAGACCGTGGCGGCATACATTGCCAAAACTCTAGAACAGGCTGGCGTTAAACGTATTTGGGGCGTGACCGGGGATTCTCTTAATGGCTTAAGCGACAGCCTGAACCGCATGGGGACCATCGACTGGATGCCCACGCGCCATGAAGAAGTTGCCGCCTTCGCCGCCGGAGCGGAAGCGCAGCTTACCGGCGAACTGGCGGTGTGCGCCGGTTCCTGCGGGCCGGGCAACCTGCATCTGATTAACGGTCTTTTCGACTGCCACCGCAACCATGTTCCGGTGCTGGCCATCGCCGCCCATATTCCTTCCAGCGAAATCGGCAGCGGTTACTTTCAGGAAACGCATCCGCAGGAGCTGTTTCGCGAATGCAGCCACTACTGCGAACTGGTCTCCTCGCCGGAGCAGATCCCGCAGGTGCTGGCCATCGCTATGCGCAAAGCGGTGATTAACCGCGGCGTCTCGGTAGTGGTGCTCCCCGGCGACGTTGCGCTAAAACCCGCGCCGGAAAGCGCCAGCAGCCACTGGTACCACGCCCCGCTGCCGCAGGTGACGCCGGCAGAAGAAGAACTGAAAAAACTGGCCCAGCTGCTGCGCTATTCGAGCAATATCGCGCTGATGTGCGGCAGCGGCTGCGCCGGAGCGCATAAAGAGCTGGTTGAGTTCGCCGCGAAGCTGAAAGCGCCTATCGTTCACGCGCTGCGCGGCAAAGAGCACGTTGAATACGATAACCCTTATGATGTTGGGATGACCGGGCTGATAGGCTTCTCCTCCGGTTTCCATACCATGATGAACGCTGACACCCTGGTGCTGCTCGGCACCCAGTTCCCCTATCGCGCCTTCTACCCGACGGACGCAAAAATTATTCAGATCGATATCAACCCCGGCAGTATCGGCGCGCACAGTAAAGTGGACATGGCGCTGATCGGCGATATCAAATCCACCCTCAGCGCGCTGCTGCCGCATCTGGAAGAGAAAACCGACCGCAAGTTCCTCGACAAAGCCCTGGAACACTATCGCGACGCGCGCAAGGGGCTCGATGACCTGGCGAAGCCAAGCGATAAAACCCTTCATCCGCAGTATCTGGCGCAGCGGATCAGCCACTTTGCCGACGACGACGCCATTTTTACCTGTGACGTCGGAACGCCAACCGTGTGGGCTGCGCGCTATTTACAGATGAACGGCAAGCGCCGCCTGATCGGATCGTTCAACCACGGTTCGATGGCTAACGCCATGCCGCAGGCCATCGGCGCGAAGGCCACCGCCCCCGACCGGCAGGTCGTGGCAATGTGCGGCGACGGCGGCTTTAGCATGCTGATGGGGGATTTTCTCTCGCTGGCGCAAATGAAGCTGCCGGTGAAGATCGTTATCTTCAATAACAGCGTCCTGGGCTTTGTCGCGATGGAGATGAAGGCCGGCGGCTATCTGACAGACGGCACCGAGCTGCATGCGACCAACTTTGCCCGCATCGCCGAGGCCTGCGGCATTAAGGGCATCCGTGTCGAAAAAGCGGCTGACGTAGACCAGGCGTTGCAAACCGCCTTCAGTACCGACGGCCCGGTCCTGGTGGATGTGGTGGTCGCCAGTGAAGAACTGGCGATGCCGCCGCAGATCAAACTGGAGCAGGCCAAAGGTTTCAGCCTTTACATGCTGCGCGCGATTATTAGCGGCCGCGGCGATGAGGTTATCGAACTGGCGAAAACTAACTGGCTAAGGTAA

基因trpBA核苷酸序列(SEQ ID NO.19)：

ATGACAACATTACTTAACCCCTATTTTGGTGAGTTTGGCGGCATGTACGTGCCACAAATCCTGATGCCTGCTCTGCGCCAGCTGGAAGAAGCTTTTGTCAGTGCGCAAAAAGATCCTGAATTTCAGGCTCAGTTCAACGACCTGCTGAAAAACTATGCCGGGCGTCCAACCGCGCTGACCAAATGCCAGAACATTACAGCCGGGACGAACACCACGCTGTATCTCAAGCGTGAAGATTTGCTGCACGGCGGCGCGCATAAAACTAACCAGGTGCTGGGGCAGGCGTTGCTGGCGAAGCGGATGGGTAAAACCGAAATCATCGCCGAAACCGGTGCCGGTCAGCATGGCGTGGCGTCGGCCCTTGCCAGCGCCCTGCTCGGCCTGAAATGCCGTATTTATATGGGTGCCAAAGACGTTGAACGCCAGTCGCCTAACGTTTTTCGTATGCGCTTAATGGGTGCGGAAGTGATCCCGGTGCATAGCGGTTCCGCGACGCTGAAAGATGCCTGTAACGAGGCGCTGCGCGACTGGTCCGGTAGTTACGAAACCGCGCACTATATGCTGGGCACCGCAGCTGGCCCGCATCCTTATCCGACCATTGTGCGTGAGTTTCAGCGGATGATTGGCGAAGAAACCAAAGCGCAGATTCTGGAAAGAGAAGGTCGCCTGCCGGATGCCGTTATCGCCTGTGTTGGCGGCGGTTCGAATGCCATCGGCATGTTTGCTGATTTCATCAATGAAACCAACGTCGGCCTGATTGGTGTGGAGCCAGGTGGTCACGGTATCGAAACTGGCGAGCACGGCGCACCGCTAAAACATGGTCGCGTGGGTATCTATTTCGGTATGAAAGCGCCGATGATGCAAACCGAAGACGGGCAGATTGAAGAATCTTACTCCATCTCCGCCGGACTGGATTTCCCGTCTGTCGGCCCACAACACGCGTATCTTAACAGCACTGGACGCGCTGATTACGTGTCTATTACCGATGATGAAGCCCTTGAAGCCTTCAAAACGCTGTGCCTGCACGAAGGGATCATCCCGGCGCTGGAATCCTCCCACGCCCTGGCCCATGCGTTGAAAATGATGCGCGAAAACCCGGATAAAGAGCAGCTACTGGTGGTTAACCTTTCCGGTCGCGGCGATAAAGACATCTTCACCGTTCACGATATTTTGAAAGCACGAGGGGAAATCTGATGGAACGCTACGAATCTCTGTTTGCCCAGTTGAAGGAGCGCAAAGAAGGCGCATTCGTTCCTTTCGTCACGCTCGGTGATCCGGGCATTGAGCAGTCATTGAAAATTATCGATACGCTAATTGAAGCCGGTGCTGACGCGCTGGAGTTAGGTATCCCCTTCTCCGACCCACTGGCGGATGGCCCGACGATTCAAAACGCCACTCTGCGCGCCTTTGCGGCAGGTGTGACTCCGGCACAATGTTTTGAAATGCTGGCACTGATTCGCCAGAAACACCCGACCATTCCCATTGGCCTGTTGATGTATGCCAATCTGGTGTTTAACAAAGGCATTGATGAGTTTTATGCCCAGTGCGAAAAAGTCGGCGTCGATTCGGTGCTGGTTGCCGATGTGCCAGTTGAAGAGTCCGCGCCCTTCCGCCAGGCCGCGTTGCGTCATAATGTCGCACCTATCTTCATCTGCCCGCCAAATGCCGATGACGACCTGCTGCGCCAGATAGCCTCTTACGGTCGTGGTTACACCTATTTGCTGTCACGAGCAGGCGTGACCGGCGCAGAAAACCGCGCCGCGTTACCCCTCAATCATCTGGTTGCGAAGCTGAAAGAGTACAACGCTGCACCTCCATTGCAGGGATTTGGTATTTCCGCCCCGGATCAGGTAAAAGCAGCGATTGATGCAGGAGCTGCGGGCGCGATTTCTGGTTCGGCCATTGTTAAAATCATCGAGCAACATATTAATGAGCCAGAGAAAATGCTGGCGGCACTGAAAGTTTTTGTACAACCGATGAAAGCGGCGACGCGCAGTTAA

基因pta核苷酸序列(SEQ ID NO.20)：

GTGGTGCAGTTTTGTATCCCGCCCGATACTGGCGGTAACGAAAGAGGATATATCGTGTCCCGTACAATTATGCTGATCCCTACCGGAACCAGCGTAGGCCTGACCAGCGTCAGCCTCGGTGTTGTCCGTGCTATGGAACGTAAAGGCGTGCGCCTGAGCGTCTTTAAACCAATCGCTCAACCACGCGCCGGTGGCGATGCGCCAGACCAGACGACGACCATCATTCGCGCGAACTCCGACCTTCCGGCCGCAGAACCGTTGAAGATGAGCCACGTTGAGTCGCTGCTCTCCAGCAACCAGAAAGACGTGCTGATGGAAGAGATCATCGCCAACTACCACGCCAACGCTCAGGATGCTGAAGTGGTGCTGGTTGAAGGTCTGGTCCCGACCCGCAAACATCAGTTTGCCCAGTCGCTGAACTACGAAATCGCCAAAACGCTGAACGCTGAAATCGTCTTCGTCATGTCCCAGGGTACCGATACTCCGGAACAGCTGAAAGAACGCGTTGAGCTGACTCGCAGCAGCTTCGGCGGCGCGAAAAACACCAGCATTACCGGCGTAATCGTCAACAAGCTGAATGCGCCAGTTGACGAACAGGGCCGTACTCGCCCTGACCTGTCAGAAATCTTCGACGACTCTTCCAAAGCGAAAGTCGTGAAGATCGATCCGGCTCAGCTGCAGAACGGTAGCCCATTACCGGTTCTGGGCGCGGTGCCGTGGAGCTTCGATCTGATCGCCACCCGCGCGATCGATATGGCGCGTCACCTGAACGCCACCATCATCAACGAAGGCGACATTAATACCCGCCGCGTGAAGTCCGTGACCTTCTGCGCACGCAGCATTCCACACATGCTGGAGCACTTCCGCGCAGGATCGCTGCTGGTCACTTCCGCAGACCGTCCCGACGTTCTGGTCGCCGCCTGCCTGGCCGCGATGAACGGCGTGGAAATCGGCGCCATCCTGCTGACCGGCGGCTACGAAATGGACGAGCGCATCAGCAAGCTGTGCGAACGCGCATTCGCGACCGGCCTGCCGGTATTTATGGTCAACACCAATACCTGGCAGACCTCCCTGAGCCTGCAGAGCTTCAACCTGGAAGTTCCGGTTGACGATCACGAGCGCATCGAGAAAGTTCAGGAATACGTGGCTAACTACATTAACGCTGACTGGATCGAGTCGCTCACCGCGACTTCCGAGCGTAGCCGTCGCCTCTCTCCGCCAGCCTTCCGCTATCAGCTCACCGAGCTGGCGCGTAAAGCAGGCAAGCGCGTTGTTCTGCCAGAAGGTAACGAACCGCGTACCGTTAAAGCCGCCGCTATCTGCGCCGAGCGCGGTATCGCCACCTGCGTCCTGCTGGGCAACCCCGAAGAAATCACCCGCGTTGCCGCGTCTCAGGGCGTAGAGCTGGGCGCCGGGATTGAAATCGTCGATCCGGAAGTGGTTCGCGAAAGCTACGTAGCTCGCCTGGTCGAGCTGCGTAAGAGCAAGGGTATGACCGAAGCGGTTGCTCGCGAGCAGCTGGAAGACAACGTGGTTCTTGGCACCCTGATGCTGGAGCAAGACGAAGTTGACGGTCTGGTCTCCGGCGCGGTTCACACCACCGCCAACACCATCCGTCCGCCACTGCAGCTGATCAAAACGGCCCCTGGCAGCTCTCTGGTCTCCTCCGTATTCTTCATGCTGCTGCCGGAACAGGTTTACGTTTACGGCGACTGCGCGATCAACCCGGATCCGACCGCTGAGCAGCTGGCTGAAATCGCCATTCAGTCTGCTGAATCCGCAATTGCCTTTGGCATCGAGCCGCGCGTGGCCATGCTCTCCTACTCCACCGGCACTTCAGGCGCAGGCAGCGATGTAGAGAAAGTTCGCGAAGCAACTCGTCTGGCGCAGGAAAAACGTCCTGACCTGATGATCGACGGCCCGCTGCAGTATGATGCTGCGGTAATGGCTGACGTTGCGAAATCCAAAGCGCCGAACTCCCCGGTTGCCGGACGCGCTACCGTGTTCATCTTCCCGGATCTGAACACCGGTAACACCACTTACAAAGCCGTACAGCGTTCCGCCGACCTGATCTCCATCGGGCCGATGCTCCAAGGCATGCGTAAGCCGGTGAACGACCTGTCCCGCGGCGCGCTGGTTGACGATATCGTCTATACCATCGCCCTGACCGCGATTCAGTCGTCCCAGCAGCAAGCATAA

基因tktA核苷酸序列(SEQ ID NO.21)：

ATGTCCTCACGTAAAGAGCTTGCCAATGCTATTCGTGCGCTGAGCATGGACGCAGTACAGAAAGCCAAATCCGGTCACCCGGGTGCCCCTATGGGTATGGCTGACATTGCCGAAGTCCTGTGGCGTGATTTCCTGAAACACAACCCGCAGAATCCGTCCTGGGCTGACCGTGACCGCTTCGTGCTGTCCAACGGCCACGGCTCCATGCTGATCTACAGCCTGCTGCACCTCACCGGTTACGATCTGCCGATGGAAGAACTGAAAAACTTCCGTCAGCTGCACTCTAAAACTCCGGGTCACCCGGAAGTGGGTTACACCGCTGGTGTGGAAACCACCACCGGTCCGCTGGGTCAGGGTATTGCCAACGCAGTCGGTATGGCGATTGCAGAAAAAACGCTGGCGGCGCAGTTTAACCGTCCGGGCCACGACATTGTCGACCACTACACCTACGCCTTCATGGGCGACGGCTGCATGATGGAAGGCATCTCCCACGAAGTTTGCTCTCTGGCGGGTACGCTGAAGCTGGGTAAACTGATTGCATTCTACGATGACAACGGTATTTCTATCGATGGTCACGTTGAAGGCTGGTTCACCGACGACACCGCAATGCGTTTCGAAGCTTACGGCTGGCACGTTATTCGCGACATCGACGGTCATGACGCGGCATCTATCAAACGCGCAGTAGAAGAAGCGCGCGCAGTGACTGACAAACCTTCCCTGCTGATGTGCAAAACCATCATCGGTTTCGGTTCCCCGAACAAAGCCGGTACCCACGACTCCCACGGTGCGCCGCTGGGCGACGCTGAAATTGCCCTGACCCGCGAACAACTGGGCTGGAAATATGCGCCGTTCGAAATCCCGTCTGAAATCTATGCTCAGTGGGATGCGAAAGAAGCAGGCCAGGCGAAAGAATCCGCATGGAACGAGAAATTCGCTGCTTACGCGAAAGCTTATCCGCAGGAAGCCGCTGAATTTACCCGCCGTATGAAAGGCGAAATGCCGTCTGACTTCGACGCTAAAGCGAAAGAGTTCATCGCTAAACTGCAGGCTAATCCGGCGAAAATCGCCAGCCGTAAAGCGTCTCAGAATGCTATCGAAGCGTTCGGTCCGCTGTTGCCGGAATTCCTCGGCGGTTCTGCTGACCTGGCGCCGTCTAACCTGACCCTGTGGTCTGGTTCTAAAGCAATCAACGAAGATGCTGCGGGTAACTACATCCACTACGGTGTTCGCGAGTTCGGTATGACCGCGATTGCTAACGGTATCTCCCTGCACGGTGGCTTCCTGCCGTACACCTCCACCTTCCTGATGTTCGTGGAATACGCACGTAACGCCGTACGTATGGCTGCGCTGATGAAACAGCGTCAGGTGATGGTTTACACCCACGACTCCATCGGTCTGGGCGAAGACGGCCCGACTCACCAGCCGGTTGAGCAGGTCGCTTCTCTGCGCGTAACCCCGAACATGTCTACATGGCGTCCGTGTGACCAGGTTGAATCCGCGGTCGCGTGGAAATACGGTGTTGAGCGTCAGGACGGCCCGACCGCACTGATCCTCTCCCGTCAGAACCTGGCGCAGCAGGAACGAACTGAAGAGCAACTGGCAAACATCGCGCGCGGTGGTTATGTGCTGAAAGACTGCGCCGGTCAGCCGGAACTGATTTTCATCGCTACCGGTTCAGAAGTTGAACTGGCTGTTGCTGCCTACGAAAAACTGACTGCCGAAGGCGTGAAAGCGCGCGTGGTGTCCATGCCGTCTACCGACGCATTTGACAAGCAGGATGCTGCTTACCGTGAATCCGTACTGCCGAAAGCGGTTACTGCACGCGTTGCTGTAGAAGCGGGTATTGCTGACTACTGGTACAAGTATGTTGGCCTGAACGGTGCTATCGTCGGTATGACCACCTTCGGTGAATCTGCTCCGGCAGAGCTGCTGTTTGAAGAGTTCGGCTTCACTGTTGATAACGTTGTTGCGAAAGCAAAAGAACTGCTGTAA

基因pykF核苷酸序列(SEQ ID NO.22)：

ATGAAAAAGACCAAAATTGTTTGCACCATCGGTCCGAAAACCGAATCCGAAGAGATGTTGACCAAAATGCTGGACGCCGGTATGAACGTTATGCGTCTGAACTTCTCTCACGGTGACTATGCGGAACACGGCCAGCGCATCCAGAACCTGCGCAATGTGATGAGCAAAACGGGCAAGAAAGCGGCAATCCTTCTGGATACCAAAGGTCCGGAAATCCGTACTATTAAGCTGGAAGGCGGTAACGACGTCTCCCTGAAAGCGGGCCAGACTTTCACCTTCACCACCGACAAATCGGTGGTAGGTAATAACGAAATCGTTGCGGTGACCTATGAAGGCTTCACCAGCGACCTGAGCGTCGGCAACACCGTACTGGTCGACGATGGTCTGATCGGTATGGAAGTCACCGCGATCGAAGGTAACAAAGTTGTTTGTAAAGTGCTGAACAACGGCGACCTCGGCGAGAACAAAGGCGTTAACCTGCCGGGCGTATCTATCGCTCTGCCGGCGCTGGCTGAGAAAGACAAACAGGACCTGATCTTCGGTTGCGAGCAGGGCGTGGACTTTGTTGCGGCCTCCTTTATCCGTAAGCGTTCCGACGTCGTGGAAATCCGCGAGCACCTGAAAGCTCACGGCGGCGAGAAGATCCAGATCATCTCTAAAATTGAAAACCAGGAAGGCCTGAACAACTTCGATGAAATCCTCGAAGCTTCTGACGGCATCATGGTTGCGCGTGGCGACCTGGGCGTTGAAATCCCGGTTGAAGAAGTTATCTTCGCGCAGAAAATGATGATCGAAAAATGTATCCGCGCGCGTAAAGTCGTTATTACCGCGACCCAAATGCTGGATTCCATGATCAAAAACCCGCGTCCGACCCGTGCGGAAGCGGGCGACGTGGCTAACGCCATCCTCGACGGCACCGATGCTGTCATGCTCTCAGGCGAATCCGCAAAAGGTAAATATCCGCTGGAAGCGGTCACCATCATGGCGACCATCTGCGAACGTACCGACCGCGTGATGACCAGCCGTCTTGAGTACAACAACGATAACCGTAAGCTGCGCATCACCGAAGCGGTCTGCCGCGGTGCGGTTGAAACGGCAGAAAAACTGGAAGCGCCGCTGATCGTCGTCGCGACCCAGGGCGGTAAATCCGCGCGCGCCGTACGTAAATACTTCCCGGATGCAACCATCCTGGCGCTGACCACCAACGAAACCACTGCGCGTCAGCTGGTGCTGAGCAAAGGCGTGGTAGCGCAGCTGGTTGAAGAGATCGCCTCTACCGACGCTTTCTATCACCTCGGTAAAGAGCTGGCGCTGCAGAGCGGCCTGGCGCGCAAAGGCGACGTGGTTGTTATGGTTTCCGGCGCATTAGTCCCGAGCGGAACCACCAATACCGCTTCCGTGCACGTGCTGTAA

突变蛋白基因serA^{fbr(H344A,N346A,N364A)}核苷酸序列(SEQ ID NO.23):

ATGGCAAAGGTATCGCTGGAGAAAGACAAGATTAAGTTTCTGCTGGTAGAAGGCGTGCACCAAAAGGCGCTGGAAAGCCTTCGTGCAGCTGGTTACACCAACATCGAATTTCACAAAGGCGCGCTGGATGATGAACAATTAAAAGAATCCATCCGCGATGCCCACTTCATCGGCCTGCGATCCCGTACCCATCTGACTGAAGACGTGATCAACGCCGCAGAAAAACTGGTCGCTATTGGCTGTTTCTGTATCGGAACAAACCAGGTTGATCTGGATGCGGCGGCAAAGCGCGGGATCCCGGTATTTAACGCACCGTTCTCAAATACGCGCTCTGTTGCGGAGCTGGTGATTGGCGAACTGCTGCTGCTATTGCGCGGCGTGCCGGAAGCCAATGCTAAAGCGCACCGTGGCGTGTGGAACAAACTGGCGGCGGGTTCTTTTGAAGCGCGCGGCAAAAAGCTGGGTATCATCGGCTACGGTCATATTGGTACGCAATTGGGCATTCTGGCTGAATCGCTGGGAATGTATGTTTACTTTTATGATATTGAAAATAAACTGCCGCTGGGCAACGCCACTCAGGTACAGCATCTTTCTGACCTGCTGAATATGAGCGATGTGGTGAGTCTGCATGTACCAGAGAATCCGTCCACCAAAAATATGATGGGCGCGAAAGAAATTTCACTAATGAAGCCCGGCTCGCTGCTGATTAATGCTTCGCGCGGTACTGTGGTGGATATTCCGGCGCTGTGTGATGCGCTGGCGAGCAAACATCTGGCGGGGGCGGCAATCGACGTATTCCCGACGGAACCGGCGACCAATAGCGATCCATTTACCTCTCCGCTGTGTGAATTCGACAACGTCCTTCTGACGCCACACATTGGCGGTTCGACTCAGGAAGCGCAGGAGAATATCGGCCTGGAAGTTGCGGGTAAATTGATCAAGTATTCTGACAATGGCTCAACGCTCTCTGCGGTGAACTTCCCGGAAGTCTCGCTGCCACTGCACGGTGGGCGTCGTCTGATGCACATCGCCGAAGCCCGTCCGGGCGTGCTAACTGCGCTGAACAAAATCTTCGCCGAGCAGGGCGTCGCCATCGCCGCGCAATATCTGCAAACTTCCGCCCAGATGGGTTATGTGGTTATTGATATTGAAGCCGACGAAGACGTTGCCGAAAAAGCGCTGCAGGCAATGAAAGCTATTCCGGGTACCATTCGCGCCCGTCTGCTGTACTAA

基因budC核苷酸序列(SEQ ID NO.24):

ATGAAAAAAGTCGCACTCGTGACCGGCGCAGGCCAGGGTATCGGTAAAGCTATCGCCCTTCGCCTGGTTCAAGATGGCTTTGCCGTGGCCATCGCCGATTATAACGATGCCACCGCACAGGCGGTTGCTGACGAAATTAACCAGCACGGCGGCCAGGCGCTGGCGGTGAAGGTCGATGTCTCGAAACGCGATCAGGTTTTTGCCGCCGTTGAGCAGGCGCGTAAGGGCCTTGGCGGTTTTGACGTGATCGTTAACAACGCCGGGGTCGCGCCCTCTACGCCTATCGAAGAGATTCGCGAGGACGTCATCGATAAAGTCTACAATATCAACGTTAAGGGCGTTATCTGGGGCATTCAGGCCGCGGTAGATGCGTTTAAAAAAGAGGGCCACGGCGGCAAGATCATCAACGCCTGCTCCCAGGCGGGCCACGTGGGTAACCCGGAACTGGCGGTCTACAGTTCAAGCAAGTTTGCCGTGCGCGGCCTGACGCAAACCGCCGCCCGCGATCTGGCGCATCTGGGAATTACCGTTAACGGCTACTGCCCGGGGATCGTCAAAACCCCCATGTGGGCGGAAATTGACCGTCAGGTTTCCGAAGCGGCGGGCAAACCGCTGGGCTACGGAACCCAGGAATTTGCGAAACGCATTACCCTCGGTCGTCTTTCCGAACCGGAAGACGTCGCGGCCTGCGTCTCTTATCTGGCCGGTCCGGACTCCAACTACATGACCGGTCAGTCGCTGCTGATCGATGGCGGTATGGTATTCAGTTAA

基因glnA核苷酸序列(SEQ ID NO.25):

GTGGCGTTTGAAACCCCGGAAGAAATTGTCAAGTTCATCAAGGATGAAAACGTCGAGTTCGTTGACGTTCGATTCACCGACCTTCCCGGCACCGAGCAGCACTTCAGCATCCCAGCTGCCAGCTTCGATGCAGATACAATCGAAGAAGGTCTCGCATTCGACGGATCCTCGATCCGTGGCTTCACCACGATCGACGAATCTGACATGAATCTCCTGCCAGACCTCGGAACGGCCACCCTTGATCCATTCCGCAAGGCAAAGACCCTGAACGTTAAGTTCTTCGTTCACGATCCTTTCACCCGCGAGGCATTCTCCCGCGACCCACGCAACGTGGCACGCAAGGCAGAGCAGTACCTGGCATCCACCGGCATTGCAGACACCTGCAACTTCGGCGCCGAGGCTGAGTTCTACCTCTTCGACTCCGTTCGCTACTCCACCGAGATGAACTCCGGCTTCTACGAAGTAGATACCGAAGAAGGCTGGTGGAACCGTGGCAAGGAAACCAACCTCGACGGCACCCCAAACCTGGGCGCAAAGAACCGCGTCAAGGGTGGCTACTTCCCAGTAGCACCATACGACCAAACCGTTGACGTGCGCGATGACATGGTTCGCAACCTCGCAGCTTCCGGCTTCGCTCTTGAGCGTTTCCACCACGAAGTCGGTGGCGGACAGCAGGAAATCAACTACCGCTTCAACACCATGCTCCACGCGGCAGATGATATCCAGACCTTCAAGTACATCATCAAGAACACCGCTCGCCTCCACGGCAAGGCTGCAACCTTCATGCCTAAGCCACTGGCTGGCGACAACGGTTCCGGCATGCACGCTCACCAGTCCCTCTGGAAGGACGGCAAGCCACTCTTCCACGATGAGTCCGGCTACGCAGGCCTGTCCGACATCGCCCGCTACTACATCGGCGGCATCCTGCACCACGCAGGCGCTGTTCTGGCGTTCACCAACGCAACCCTGAACTCCTACCACCGTCTGGTTCCAGGCTTCGAGGCTCCAATCAACCTGGTGTACTCACAGCGCAACCGTTCCGCTGCTGTCCGTATCCCAATCACCGGATCCAACCCGAAGGCAAAGCGCATCGAATTCCGCGCTCCAGACCCATCAGGCAACCCATACCTGGGCTTTGCAGCGATGATGATGGCCGGCCTCGACGGCATCAAGAACCGCATCGAGCCACACGCTCCAGTGGACAAGGACCTCTACGAACTACCACCAGAGGAAGCTGCATCCATTCCACAGGCACCAACCTCCCTGGAAGCATCCCTGAAGGCACTGCAGGAAGACACCGACTTCCTCACCGAGTCTGACGTCTTCACCGAGGATCTCATCGAGGCGTACATCCAGTACAAGTACGACAACGAGATCTCCCCAGTTCGCCTGCGCCCAACCCCGCAGGAATTCGAATTGTACTTCGACTGCTAA

基因dhaT核苷酸序列(SEQ ID NO.26):

ATGAGCTATCGTATATTTGATTATCTGGTGCCAAACGTGAACTTTTTTGGTCCCAATGCTGTTTCTGTCGTCGGCGAACGCTGTAAGCTGCTGGGCGGTAAAAAAGCGCTGCTGGTCACCGATAAAGGTCTGCGGGCCATCAAAGACGGCGCGGTGGATAAAACTCTCGGCTATCTGCAGGAAGCCGGTATTGAGGTGGTGGTTTTTGATGGCGTCGAGCCAAATCCAAAAGACACCAACGTGCGCGATGGCCTGGCGGTCTTTCGTCAAGAACAGTGCGATATTATCGTCACCGTCGGCGGCGGTAGCCCTCATGACTGCGGTAAAGGGATTGGTATCGCGGCTACCCACGAAGGGGATCTTTACCGCTATGCCGGCATAGAAACCCTGGCTAACCCACTGCCGCCGATCGTCGCGGTGAATACCACCGCCGGTACCGCCAGCGAAGTGACCCGCCACTGCGTACTGACCAACACCCAAACAAAAGTGAAGTTCGTTATCGTCAGCTGGCGTAACCTGCCCTCGGTCTCCATCAATGACCCGCTGCTCATGCTTGGCAAACCGGCCCCGCTGACCGCCGCAACCGGCATGGATGCGTTAACCCACGCCGTGGAGGCCTATATTTCCAAAGATGCCAACCCGGTCACCGATGCCGCCGCGATCCAGGCCATCCGCCTGATCGCCCGGAACTTGCGCCAGGCCGTCGCGCTGGGCAGCAACCTGCAAGCCCGCGAAAACATGGCCTACGCTTCCCTGCTGGCGGGAATGGCTTTCAATAACGCCAACCTCGGTTACGTTCACGCCATGGCCCATCAGCTTGGCGGCCTGTACGATATGCCGCACGGCGTGGCGAACGCGGTTCTGTTGCCGCACGTTGCGCGCTACAACCTGATCGCCAATCCGGAAAAGTTTGCCGACATCGCCGAATTTATGGGAGAAAACATCCACGGACTTTCAACCATGGACGCCGCCGAGTCGGCCATTTGCGCCATCGCCCGCCTCTCTTCCGATATCGGCATTCCGCAGCATCTGAGCGAGCTGGGAGTTAAAGAGGCTGACTTCCCCTATATGGCGGAGATGGCCTTGAAAGACGGCAACGCCTTCTCAAATCCGCGCAAGGGTAACGAGAAAGAGATTGTCGCTATCTTCCGCCAGGCTTTCTGA

基因ywkB核苷酸序列(SEQ ID NO.27):

TTGAGCATCTTAGATATCTTAATCCTCCTGGCGCCGATCTTCTTTGTTATCGTGCTGGGTTGGTTTGCAGGACATTTTGGAAGTTATGATGCCAAGTCGGCAAAAGGGGTAAGTACGTTAGTAACGAAATACGCACTTCCAGCTCACTTTATCGCTGGTATTTTGACAACTTCCAGAAGTGAATTTTTATCACAAGTACCTTTAATGATTTCTTTAATTATTGGGATTGTTGGTTTCTATATCATCATTCTTTTGGTTTGCAGATTTATATTCAAGTATGATTTAACGAACTCATCTGTATTTTCTTTGAACTCTGCACAGCCGACATTCGCATTTATGGGTATCCCGGTATTGGGAAGCTTATTCGGAGCGAATGAAGTTGCGATTCCGATCGCGGTCACAGGTATCGTGGTTAACGCGATTCTTGATCCGCTCGCGATCATTATCGCTACTGTTGGTGAGTCTTCTAAGAAAAACGAAGAGAGTGGCGACAGCTTCTGGAAGATGACAGGAAAATCAATCCTGCATGGTCTTTGTGAGCCGCTTGCAGCTGCTCCGTTAATCAGTATGATCTTGGTGCTGGTTTTCAATTTCACTCTTCCTGAGCTGGGTGTTAAAATGCTTGATCAGCTTGGAAGCACAACATCTGGTGTTGCTCTCTTCGCTGTTGGTGTTACCGTTGGTATTCGTAAAATTAAACTCAGTATGCCGGCTATCGGTATTGCGTTACTAAAAGTTGCGGTTCAGCCTGCGTTAATGTTCCTGATTGCTCTTGCTATCGGACTTCCAGCTGACCAAACAACAAAAGCAATCCTTCTTGTTGCATTCCCTGGTTCTGCCGTTGCAGCCATGATTGCGACTCGTTTCGAGAAACAAGAAGAAGAAACTGCAACTGCGTTTGTGGTCAGTGCGATTCTGTCATTGATTTCACTTCCAATCATTATCGCGCTTACTGCGTAA

基因gldA核苷酸序列(SEQ ID NO.28):

ATGGATCGCATTATTCAATCACCCGGTAAGTACATTCAGGGCGCGGACGCAATTTCTCGCCTTGGCGGATACCTCAAACCGCTGGCTGAGCGCTGGCTCATCGTTGGCGATAAATTTGTACTCGGTTTTGCCGAAGAAAAACTGCGTAAAAGCCTGGCAGATGCCGATCTGGTTGGCGAAATCGCGCCGTTTGGCGGCGAATGCTCACACAATGAAATCAACCGCTTGCGTGATATTGCCGGTTCCGCCCGCTGCACAGCCGTGCTGGGTATCGGCGGCGGCAAGACGCTGGATACCGCAAAAGCATTAGCACACTTTATGAATCTGCCGGTGGTGATTGCCCCGACGATTGCCTCCACCGATGCCCCCTGCAGCGCGCTCTCTGTCATCTATACCGATGACGGCGAGTTTGATAGCTACCTGATGCTGCCGCGCAACCCGAATATGGTCATTGTCGATACGCAAATCGTTGCCGGAGCCCCGGCGCGCCTGCTGGCGGCCGGTATCGGCGACGCGCTGGCGACCTGGTTTGAAGCGCGTGCCTGCTCCCGCAGCGGCGCCACCACCATGGCGGGCGGCAAATGTACTCAGGCAGCGCTGGCGCTGGCTGAACTGTGCTACAACACGCTGATTGAAGAAGGTGAAAAAGCGATGCTTGCGGCAGAGCAGCACGTTGTGACGCCAGCGCTGGAGCGGGTGATTGAAGCCAACACCTACCTGAGCGGCGTCGGCTTTGAAAGCGGCGGCCTGGCGGCTGCGCACGCTATCCACAACGGCCTGACCGCGATCCCGGATGCTCACCACTACTATCATGGTGAAAAAGTAGCTTTCGGTACGCTCACGCAGCTGGTACTGGAAAACGCGCCGGTAGAAGAGATCGAAACCGTAGCGGCGCTGTGCCATAGCGTCGGACTGCCTATCACCCTGGCGCAGCTGGATATTAAAGCCGATATCCCAGGCAAAATGCGTACCGTAGCGGAAGCCGCCTGCGCAGAAGGCGAAACCATCCATAATATGCCCGGCGGCGCAACGCCGGATCAGGTTTATGCCGCGCTTCTGGTTGCCGACCAGTACGGTCAACGCTTCCTGCAAGAGTGGGAATAA

基因pck核苷酸序列(SEQ ID NO.29):

ATGAACTCAGTTGATTTGACCGCTGATTTACAAGCCTTATTAACATGTCCAAATGTGCGTCATAATTTATCAGCAGCACAGCTAACAGAAAAAGTCCTCTCCCGAAACGAAGGCATTTTAACATCCACAGGTGCTGTTCGCGCGACAACAGGCGCTTACACAGGACGCTCACCTAAAGATAAATTCATCGTGGAGGAAGAAAGCACGAAAAATAAGATCGATTGGGGCCCGGTGAATCAGCCGATTTCAGAAGAAGCGTTTGAGCGGCTGTACACGAAAGTTGTCAGCTATTTAAAGGAGCGAGATGAACTGTTTGTTTTCGAAGGATTTGCCGGAGCAGACGAGAAATACAGGCTGCCGATCACTGTCGTAAATGAGTTCGCATGGCACAATTTATTTGCGCGGCAGCTGTTTATCCGTCCGGAAGGAAATGATAAGAAAACAGTTGAGCAGCCGTTCACCATTCTTTCTGCTCCGCATTTCAAAGCGGATCCAAAAACAGACGGCACTCATTCCGAAACGTTTATTATTGTCTCTTTCGAAAAGCGGACAATTTTAATCGGCGGAACTGAGTATGCCGGTGAAATGAAGAAGTCCATTTTCTCCATTATGAATTTCCTGCTGCCTGAAAGAGATATTTTATCTATGCACTGCTCCGCCAATGTCGGTGAAAAAGGCGATGTCGCCCTTTTCTTCGGACTGTCAGGAACAGGAAAGACCACCCTGTCGGCAGATGCTGACCGCAAGCTGATCGGTGACGATGAACATGGCTGGTCTGATACAGGCGTCTTTAATATTGAAGGCGGATGCTACGCTAAGTGTATTCATTTAAGCGAGGAAAAGGAGCCGCAAATCTTTAACGCGATCCGCTTCGGGTCTGTTCTCGAAAATGTCGTTGTGGATGAAGATACACGCGAAGCCAATTATGATGATTCCTTCTATACTGAAAACACGCGGGCAGCTTACCCGATTCATATGATTAATAACATCGTGACTCCAAGCATGGCCGGCCATCCGTCAGCCATTGTATTTTTGACGGCTGATGCCTTCGGAGTCCTGCCGCCGATCAGCAAACTAACGAAGGAGCAGGCGATGTACCATTTTTTGAGCGGTTACACGAGTAAGCTTGCCGGAACCGAACGTGGTGTCACGTCTCCTGAAACGACGTTTTCTACATGCTTCGGCTCACCGTTCCTGCCGCTTCCTGCTCACGTCTATGCTGAAATGCTCGGCAAAAAGATCGATGAACACGGCGCAGACGTTTTCTTAGTCAATACCGGATGGACCGGGGGCGGCTACGGCACAGGCGAACGAATGAAGCTTTCTTACACTAGAGCAATGGTCAAAGCAGCGATTGAAGGCAAATTAGAGGATGCTGAAATGATAACTGACGATATTTTCGGCCTGCACATTCCGGCCCATGTTCCTGGCGTTCCTGATCATATCCTTCAGCCTGAAAACACGTGGACCAACAAGGAAGAATACAAAGAAAAAGCAGTCTACCTTGCAAATGAATTCAAAGAGAACTTTAAAAAGTTCGCACATACCGATGCCATCGCCCAGGCAGGCGGCCCTCTCGTATAA

基因ackA核苷酸序列(SEQ ID NO.30):

ATGTCGAGTAAGTTAGTACTGGTTCTGAACTGCGGTAGCTCCTCTCTGAAATTCGCTATCCTTGATGCCGTCAACGGTGACGAATACCTGTCCGGTTTAGCAGAATGTTTCCATCTTCCAGAAGCCCGTATCAAATGGAAAATGGATGGCAGCAAACAAGAAGCCGAGCTAGGCGCTGGCGCTGCTCACAGTGAAGCGCTGAACTTTATCGTTAACACTATTCTGGCACAAAAACCAGAACTGTCTGCTCAGCTGACCGCAATCGGCCATCGTATCGTTCACGGCGGTGAGAAATACACCAGCTCCGTTGTTATCGATGACTCCGTCATTCAGGGCATTAAAGATTCCGCATCTTTCGCTCCGCTGCACAACCCTGCGCACCTGATCGGTATCGCTGAAGCGCTGAAATCCTTCCCGCATCTGAAAGATAAGAACGTTGCCGTGTTCGACACCGCGTTCCACCAGACCATGCCGGAAGAATCTTACCTCTATGCCCTGCCGTACAGCCTGTACAAAGAACACGGCGTACGTCGCTACGGCGCGCACGGTACCAGCCACTTCTATGTGACTCAGGAAGCTGCGAAAGTTCTGAACAAACCGGTTGAAGAGCTGAACATCATCACCTGCCATCTGGGCAACGGTGGTTCCGTTTCCGCTATCCGTAACGGTAAATGCGTTGACACCTCTATGGGTCTGACTCCGCTGGAAGGCCTGGTTATGGGTACGCGTTCTGGCGATATCGACCCGGCAATCATTTTCCATCTGCACGATGCCCTGGGCATGAGCGTAGACGCCATCAACAAAATGCTGACCAAAGAGTCCGGTCTGCTCGGCCTGACCGAAGTGACCAGCGACTGCCGCTATGTTGAAGACAACTACCAGGACAAAGCGGATGCTAAACGCGCTATGGACGTTTACTGCCACCGCCTGGCAAAATACATCGGTTCCTACACCGCGCTGATGGATGGCCGTCTGGACGCGGTTATTTTCACCGGCGGTATCGGTGAGAACGCGGCGATGGTTCGCGAACTGTCTCTGGGCAAACTGGGCGTACTGGGCTTTGAAGTTGATCACGAGCGCAACCTGGCTGCCCGTTTCGGCAAGTCTGGCTTCATCAACAAAGAAGGCACTCGCCCGGCTATCGTCATTCCGACCAACGAAGAGCTGGTCATCGCGCAAGACGCCAACCGTCTGACCGCCTGA

实施例1从克雷伯氏菌属产酸克雷伯氏菌K.oxytoca CICC21518出发构建L-色氨酸生产菌株

出发菌株产酸克雷伯氏菌K.oxytoca CICC21518购买于中国工业微生物菌株保藏管理中心，保藏号为：CICC21518。K.oxytoca CICC21518为革兰氏阴性菌，需氧或兼性厌氧生长，最适培养温度为37℃。K.oxytoca CICC21518的VP(Voges-Proskauer)反应呈阳性，具有代谢柠檬酸盐进行生长的能力。产酸克雷伯氏菌具有广泛的底物谱，迟缓发酵乳糖，发酵甘露醇、肌醇、山梨醇、蜜二糖、侧金盏花醇和棉子糖。

1.1以来自Escherichia coli W3110中磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因ppsA替换α-乙酰乳酸脱羧酶基因budA

磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因ppsA序列长度为2379个碱基，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。α-乙酰乳酸脱羧酶基因budA序列长度为780个碱基，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

(1)基因替换载体构建：采用常规的方法制备K.oxytoca CICC21518的基因组DNA，该过程参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备的方法，提取产酸克雷伯氏菌K.oxytoca CICC21518的基因组DNA。以K.oxytoca CICC21518的基因组DNA为模板，利用PCR扩增budA基因的上下游同源臂，用于后续基因替换。以E.coli W3110基因组为模板扩增出中间段替换基因ppsA。所获得的上游同源臂和基因ppsA为模板进行重组PCR，再将获得重组片段和上下游同源臂进行重组PCR，然后获得ΔbudA::ppsA的基因替换片段，两端包含EcoRI和BamHI的酶切位点。

将自杀质粒pR6KmobsacB用限制性内切酶EcoRI和BamHI进行双酶切，酶切产物经核酸胶回收后，使用T5核酸外切酶与基因替换片段连接，获得基因替换质粒pR6KmobsacB-ΔbudA::ppsA。

(2)基因敲除步骤：接种携带步骤(1)获得的质粒的大肠杆菌S17-1λpir以及产酸克雷伯氏菌K.oxytoca CICC21518在37℃下过夜培养，转接上述菌株在37℃下培养至OD_600nm约为0.6-0.8。分别收集5mL大肠杆菌菌液和1mL产酸克雷伯氏菌菌液，在6500rpm离心3分钟收集菌体，用0.85％生理盐水洗菌体两次，用100μL生理盐水将两种菌体混合后滴在LB平板上，正置于37℃培养箱过夜培养。用0.85％生理盐水冲洗菌膜收集细胞后，在6500rpm离心3分钟收集菌体用0.85％生理盐水洗菌体两次，稀释4-10倍涂布于添加卡那霉素的含20％柠檬酸盐的M9固体平板上，37℃培养36～48小时，挑取生长的单菌落于含有卡那霉素的LB培养基中37℃培养利用上下游引物进行菌液PCR验证，得到可同时PCR出长片段和短片段的正确单交换目的菌。

将正确的单交换目的菌株转接至无抗性的LB培养基中，37℃过夜培养，之后转接至含15％蔗糖的LB培养基中37℃培养10～12小时，转接两代，梯度稀释涂布在含15％蔗糖的LB固体培养基上于37℃过夜培养，挑取生长的单菌落于LB培养基中，利用上下游引物进行菌液PCR验证，提取PCR验证条带大小正确的单菌落基因组，用上述引物进行基因组温度梯度PCR验证，条带大小正确的为双交换目的菌。

1.2以来自Escherichia coli W3110的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶突变蛋白编码基因aroG^fbr(D146N)替换α-乙酰乳酸合酶基因budB

3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶突变蛋白基因aroG^fbr(D146N)序列长度为1053个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。α-乙酰乳酸合酶基因budB序列长度为1680个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

以来自Escherichia coli W3110的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶突变蛋白编码基因aroG^fbr(D146N)替换α-乙酰乳酸合酶编码基因budB，载体的构建及操作步骤参照本实施例步骤1.1中的ppsA基因替换budA基因的操作步骤。该步骤使用的产酸克雷伯氏菌是在1.1的基础上进行的。

1.3色氨酸酶编码基因tnaA敲除

色氨酸酶编码基因tnaA序列长度为1416个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

敲除载体构建：通过PCR扩增tnaA基因的上下游同源臂。以所获得的上、下游同源臂为模板进行重组，通过PCR扩增重组片段，获得tnaA的截短片段，两端包含EcoRI和BamHI的酶切位点。

将tnaA的截短重组片段和自杀质粒pR6KmobsacB分别用限制性内切酶EcoRI和BamHI进行双酶切，酶切产物经核酸胶回收后，使用T5核酸外切酶与基因替换片段连接，获得基因替换质粒pR6KmobsacB-ΔtnaA。基因操作步骤参照本实施例步骤1.1中的ppsA基因替换budA基因的操作步骤。该步骤使用的产酸克雷伯氏菌是在1.2的基础上进行的。

1.4以内源的2,3-丁二醇合成途径基因簇的启动子P_budABC替换色氨酸操纵子的衰减子trpL

内源的2,3-丁二醇合成途径基因簇的启动子P_budABC序列长度为106个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。色氨酸操纵子的衰减子trpL序列长度为45个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

以内源的2,3-丁二醇合成途径基因簇的启动子P_budABC替换色氨酸操纵子的衰减子trpL载体的构建及操作步骤参照本实施例步骤1.1中的ppsA基因替换budA基因的操作步骤。该步骤使用的产酸克雷伯氏菌是在1.3的基础上进行的。

1.5色氨酸操纵子的转录抑制因子trpR敲除

色氨酸操纵子的转录抑制因子trpR序列长度为327个碱基，其核苷酸序列如SEQID NO.8所示。

色氨酸操纵子的转录抑制因子trpR敲除载体的构建及操作步骤参照本实施例步骤1.3中的tnaA基因敲除的操作步骤。该步骤使用的产酸克雷伯氏菌是在1.4的基础上进行的。

1.6以来自E.coli W3110的3-脱氢奎尼酸合酶基因aroB替换乳酸脱氢酶基因ldhD

来自E.coli W3110的3-脱氢奎尼酸合酶基因aroB序列长度为1089个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。乳酸脱氢酶基因ldhD序列长度为990个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

以来自E.coli W3110的3-脱氢奎尼酸合酶基因aroB替换乳酸脱氢酶基因ldhD载体的构建及操作步骤参照本实施例步骤1.1中的ppsA基因替换budA基因的操作步骤。该步骤使用的产酸克雷伯氏菌是在1.6的基础上进行的。

1.7以来自E.coli W3110的莽草酸脱氢酶编码基因aroE替换乙醇脱氢酶基因adhE

来自E.coli W3110的莽草酸脱氢酶编码基因aroE序列长度为819个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。乙醇脱氢酶基因adhE序列长度为780个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

以来自E.coli W3110的莽草酸脱氢酶编码基因aroE替换乙醇脱氢酶基因adhE载体的构建及操作步骤参照本实施例步骤1.1中的ppsA基因替换budA基因的操作步骤。该步骤使用的产酸克雷伯氏菌是在1.7的基础上进行的。

1.8以来自E.coli W3110的分支酸合酶编码基因aroC替换富马酸还原酶亚基A基因frdA

来自E.coli W3110的分支酸合酶编码基因aroC序列长度为1086个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。富马酸还原酶亚基A基因序列长度为1791个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

以来自E.coli W3110的分支酸合酶编码基因aroC替换富马酸还原酶亚基A基因frdA载体的构建及操作步骤参照本实施例步骤1.1中的ppsA基因替换budA基因的操作步骤。该步骤使用的产酸克雷伯氏菌是在1.8的基础上进行的。

1.9以来自E.coli W3110的色氨酸操纵子部分基因簇trpE^fbr(S40F)D替换丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB

来自E.coli W3110的色氨酸操纵子部分基因簇trpE^fbr(S40F)D序列长度为3158个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB基因序列长度为2283个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。

以来自E.coli W3110的色氨酸操纵子部分基因簇trpE^fbr(S40F)D替换丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB载体的构建及操作步骤参照本实施例步骤1.1中的ppsA基因替换budA基因的操作步骤。该步骤使用的产酸克雷伯氏菌是在1.8的基础上进行的。

1.10以来自E.coli W3110的色氨酸操纵子部分基因簇trpDC替换丙酮酸氧化酶基因pox

来自E.coli W3110的色氨酸操纵子部分基因簇trpDC序列长度为2958个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。丙酮酸氧化酶基因pox基因序列长度为1719个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

以来自E.coli W3110的色氨酸操纵子部分基因簇trpDC替换丙酮酸氧化酶基因pox载体的构建及操作步骤参照本实施例步骤1.1中的ppsA基因替换budA基因的操作步骤。该步骤使用的产酸克雷伯氏菌是在1.9的基础上进行的。

1.11以来自E.coli W3110的色氨酸操纵子部分基因簇trpBA替换磷酸转乙酰基酶基因pta

来自E.coli W3110的色氨酸操纵子部分基因簇trpBA序列长度为2000个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。磷酸转乙酰基酶基因pta基因序列长度为2199个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。

以来自E.coli W3110的色氨酸操纵子部分基因簇trpBA替换磷酸转乙酰基酶基因pta载体的构建及操作步骤参照本实施例步骤1.1中的ppsA基因替换budA基因的操作步骤。该步骤使用的产酸克雷伯氏菌是在1.10的基础上进行的。

1.12以来自E.coli W3110的转酮酶编码基因tktA替换丙酮酸激酶基因pykF

来自E.coli W3110的转酮酶编码基因tktA序列长度为1992个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。丙酮酸激酶基因pykF序列长度为1413个碱基，其核苷酸序列如SEQID NO.22所示。

以来自E.coli W3110的转酮酶编码基因tktA替换丙酮酸激酶基因pykF载体的构建及操作步骤参照本实施例步骤1.1中的ppsA基因替换budA基因的操作步骤。该步骤使用的产酸克雷伯氏菌是在1.11的基础上进行的。

1.13以来自E.coli W3110的3-磷酸甘油酸脱氢酶突变蛋白编码基因serA^{fbr(H344A ,N346A,N364A)}替换2,3-丁二醇脱氢酶基因budC

来自E.coli W3110的3-磷酸甘油酸脱氢酶突变蛋白编码基因serA^{fbr(H344A ,N346A,N364A)}序列长度为1233个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示。2,3-丁二醇脱氢酶基因budC序列长度为771个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。

以来自E.coli W3110的3-磷酸甘油酸脱氢酶突变蛋白编码基因serA^{fbr(H344A ,N346A,N364A)}替换2,3-丁二醇脱氢酶基因budC载体的构建及操作步骤参照本实施例步骤1.1中的ppsA基因替换budA基因的操作步骤。该步骤使用的产酸克雷伯氏菌是在1.12的基础上进行的。

1.14以来自谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC13032的谷氨酰胺合酶编码基因glnA替换1,3-丙二醇脱氢酶基因dhaT

来自谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC13032的谷氨酰胺合酶编码基因glnA序列长度为1434个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。1,3-丙二醇脱氢酶基因dhaT序列长度为1164个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。

以来自谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC13032的谷氨酰胺合酶编码基因glnA替换1,3-丙二醇脱氢酶基因dhaT载体的构建及操作步骤参照本实施例步骤1.1中的ppsA基因替换budA基因的操作步骤。该步骤使用的产酸克雷伯氏菌是在1.13的基础上进行的。

1.15以来自于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的芳香族氨基酸外排蛋白基因ywkB替换甘油脱氢酶基因gldA

来自于B.subtilis 168的芳香族氨基酸外排蛋白基因ywkB序列长度为960个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。甘油脱氢酶基因gldA序列长度为1104个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。

以来自于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的芳香族氨基酸外排蛋白基因ywkB替换甘油脱氢酶基因gldA载体的构建及操作步骤参照本实施例步骤1.1中的ppsA基因替换budA基因的操作步骤。该步骤使用的产酸克雷伯氏菌是在1.14的基础上进行的。

1.16以来自于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pck替换乙酸激酶基因ackA

来自于B.subtilis 168的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pck序列长度为1584个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示。乙酸激酶基因ackA序列长度为1203个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示。

以来自于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pck替换乙酸激酶基因ackA载体的构建及操作步骤参照本实施例步骤1.1中的ppsA基因替换budA基因的操作步骤。该步骤使用的产酸克雷伯氏菌是在1.15的基础上进行的。

最终获得重组产酸克雷伯氏菌命名为Klebsiella oxytoca TRP-27，其基因型为K.oxytoca CICC21518ΔbudA::ppsAΔbudB::aroG^fbr(D146N)ΔtnaAΔtrpL::P_budABCΔtrpRΔldhD::aroBΔadhE::aroEΔfrdA::aroCΔpflB::trpE^fbr(S40F)DΔpox::trpDCΔpta::trpBAΔpykF::tktAΔbudC::serA^{fbr(H344A,N346A,N364A)}ΔdhaT::glnAΔgldA::ywkBΔackA::pck。图1所示为本实施例重组细菌的L-色氨酸合成代谢途径。

实施例2重组产酸克雷伯氏菌K.oxytoca TRP-27以葡萄糖为底物摇瓶发酵生产L-色氨酸

(1)平板培养：将重组菌株K.oxytoca TRP-27划线到含有质量体积比为1.8％琼脂的LB培养基上，37℃培养10小时；

(2)种子培养：在无菌的条件下，用无菌枪尖挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到5mL的LB液体培养基中，37℃摇床振荡培养10小时；接着按1％(v/v)的接种量接种到100mL的LB液体培养基37℃摇床振荡培养10小时；

(3)摇瓶发酵培养：在无菌条件下，取步骤(2)所得的菌液，按照5％(v/v)接种量接种到含80g/L葡萄糖的发酵培养基中。其中，所述发酵条件是：培养温度为37℃，培养方式为摇床培养，转速为每分钟180转，以氨水调整pH维持在6.8，同时对发酵样品进行高效液相色谱分析测定发酵液中l-色氨酸的浓度。当葡萄糖不再被消耗时，停止发酵，由发酵液得到L-色氨酸；

结果显示，重组菌株K.oxytoca TRP-27培养60h，消耗葡萄糖80g/L，L-色氨酸浓度达到14.6g/L，L-色氨酸得率达到0.183g/g。

其中：上述步骤(1)～(2)中所述的LB培养基配方是：蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；NaCl 10g/L，pH 7.0；121℃灭菌20分钟。

上述步骤(3)中所述的发酵培养基配方为：葡萄糖80g/L，酵母粉5g/L，K₂HPO₄ 10g/L，NaH₂PO₄ 2g/L，NH₄SO₄ 10g/L，MgSO₄·7H₂O 0.7g/L，1000×微量元素溶液1mL；其中，所述1000×微量元素溶液的配方为：CaCl₂·2H₂O 3g/L，ZnCl₂ 3g/L，FeCl₃·2H₂O 20g/L，MnCl₂·2H₂O 11g/L，CuCl₂·2H₂O 1g/L，CoCl₂·2H₂O 2g/L，H₃BO₃ 0.35g/L，NaMoO₄·2H₂O0.024g/L。在其他实施例中，葡萄糖的含量可以在80～90g/L范围内调整。

发酵产物L-色氨酸的检测方法如下：

将发酵液样品12,000rpm离心1min，取样品上清100μL，加入400μL 0.5mol/L碳酸氢钠(pH＝9.0)和100μL 1％2,4-二硝基氟苯(2,4-Dinitrofluorobenzene，DNFB)，振荡混匀后60℃避光1h。冷却至室温后，加入0.01mol/L KH₂PO₄(pH7.0)1mL，摇匀后离心，取上清经0.22μm滤膜过滤后，通过高效液相检测L-色氨酸。具体的液相检测条件如下：

所用液相色谱仪的型号为Agilent 1260，色谱柱型号为月旭Welchrom C₁₈(4.6mm*250mm，5μm)；检测器为VWD检测器；检测波长为254nm；流动相A为0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液，流动相B为乙腈，使用不同配比流动相A和B进行梯度洗脱，具体如下：0-10min，5％B；10-13min，80％B；13.1-18min，5％B；流速1mL/min；柱温30℃；进样量5μL；分析时间为18min。

实施例3重组产酸克雷伯氏菌K.oxytoca TRP-27以葡萄糖为底物补料分批发酵生产L-色氨酸

(1)平板培养：将重组菌株K.oxytoca TRP-27划线到含有质量体积比为1.8％琼脂的LB培养基上，37℃培养10小时；

(2)种子培养：在无菌的条件下，用无菌枪尖挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到5mL的LB液体培养基中，37℃摇床振荡培养10小时；接着按1％(v/v)的接种量接种到100mL的LB液体培养基37℃摇床振荡培养10小时；

(3)7.5L发酵罐培养：在无菌条件下，取步骤(2)所得的菌液，按照10％(v/v)接种量接种到含60g/L葡萄糖的发酵培养基中。其中，所述发酵条件是：装液量5L，培养温度为37℃，培养方式为搅拌培养，搅拌转速为每分钟500转，溶氧水平级联转速和通气量维持在15％～20％，氨水调整pH维持在6.8±0.1，其间根据葡萄糖浓度补加500g/L葡萄糖母液，使葡萄糖浓度维持在0g/L。发酵40h停止发酵，由发酵液得到L-色氨酸。

结果显示，重组菌株K.oxytoca TRP-27培养60h，消耗葡萄糖272.7g/L，L-色氨酸浓度达到60.0g/L，L-色氨酸得率达到0.23g/g，是迄今为止最高的产量和转化率，也是首次以产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)为底盘菌株获得L-色氨酸高产菌株。

其中，上述步骤中所述的产物L-色氨酸的检测方法以及LB培养基配方和发酵培养基配方和实施例2中一致，区别在于：本实施例的发酵培养基配方中葡萄糖的浓度为60g/L。

下面通过实验对本发明的技术方案作进一步的说明。

实验例1阻断2,3-丁二醇合成途径并增强L-色氨酸合成途径

本实验例选择克雷伯氏菌属的产酸克雷伯氏菌K.oxytoca CICC21518作为生产宿主，通过阻断2,3-丁二醇合成以强化前体丙酮酸的积累，同时强化磷酸烯醇式丙酮酸合酶和反馈抑制不敏感的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶的表达以实现将2,3-丁二醇合成代谢流通过丙酮酸重定向至L-色氨酸合成。

其中本发明采用的基因敲除和基因整合均采用两步同源重组技术，具体操作过程参考上述实施例。同时本实验例选择来自大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸合酶ppsA(核苷酸序列为SEQ ID NO.1)和反馈抑制不敏感的3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶基因aroG^fbr(D146N)(核苷酸序列为SEQ ID NO.3)，参照上述基因整合技术，将ppsA基因整合到K.oxytoca基因组中2,3-丁二醇合成途径关键基因α-乙酰乳酸脱羧酶基因budA(核苷酸序列为SEQ IDNO.2)的位点上，获得重组菌株K.oxytoca TRP-2；将ppsA和aroG^fbr(D146N)基因分别整合至K.oxytoca基因组中2,3-丁二醇合成途径关键基因α-乙酰乳酸脱羧酶基因budA(核苷酸序列为SEQ ID NO.2)和α-乙酰乳酸合酶基因budB(核苷酸序列为SEQ ID NO.4)的位点上，获得重组菌株K.oxytoca TRP-4。

将出发菌株K.oxytoca TRP-0、K.oxytoca TRP-2和重组菌株K.oxytoca TRP-4按照实施例2的培养方式分别摇瓶培养60h，发酵液经高效液相色谱(HPLC)进行代谢物分析。

表1.阻断2,3-丁二醇合成途径并增强L-色氨酸合成途径的影响

发酵结果如表1所示，结果显示，出发菌株K.oxytoca CICC21518主要发酵产物为2,3-丁二醇，敲除budA、budB，添加ppsA、aroG^fbr(D146N)后，重组菌株K.oxytoca TRP-4发酵培养后几乎不再积累2,3-丁二醇，L-色氨酸积累了0.8g/L。

实验例2阻断L-色氨酸降解途径

本实验例敲除K.oxytoca CICC21518的L-色氨酸酶编码基因tnaA(核苷酸序列为SEQ ID NO.5)以提高L-色氨酸积累。

其中本发明采用的基因敲除采用两步同源重组技术，具体操作过程参考上述实施例1。重组菌株K.oxytoca TRP-4经敲除色氨酸酶tnaA，获得重组菌株K.oxytoca TRP-5。

将重组菌株K.oxytoca TRP-4和K.oxytoca TRP-5按照实施例2的培养方式摇瓶培养60h，发酵液经高效液相色谱(HPLC)进行代谢物分析。

表2.阻断l-色氨酸降解途径对L-色氨酸生产的影响

发酵结果如表2所示，结果显示，经敲除色氨酸酶tnaA后，重组菌株K.oxytocaTRP-5的L-色氨酸积累量提高至1.3g/L。

实验例3引入内源强启动子强化色氨酸操纵子基因的表达

本实验例尝试引入内源强启动子P_budABC(核苷酸序列为SEQ ID NO.6)替换thrL(核苷酸序列为SEQ ID NO.7)以增强L-色氨酸合成基因簇的转录。

其中本发明采用的基因整合采用两步同源重组技术，具体操作过程参考上述实施例1。在重组菌株K.oxytoca TRP-5的基础上，引入强启动子P_budABC至衰减子thrL位点，获得重组菌株K.oxytoca TRP-6。

将重组菌株K.oxytoca TRP-5和K.oxytoca TRP-6按照实施例2的培养方式摇瓶培养60h，发酵液经高效液相色谱(HPLC)进行代谢物分析。

表3.引入内源强启动子强化色氨酸操纵子基因的表达

发酵结果如表3所示，结果显示，强启动子P_budABC替换thrL后，重组菌株K.oxytocaTRP-6的L-色氨酸积累量明显提高，提高至5.2g/L。

实验例4筛选不同的限速基因提高L-色氨酸生产

为了进一步提高L-色氨酸生产，本实验例筛选了L-色氨酸合成途径的限速基因以保证强大的L-色氨酸合成相关基因的表达水平。具体地，首先在重组菌株K.oxytoca TRP-6的基础上，失活L-色氨酸操纵子的转录阻遏因子trpR(SEQ ID NO.8)，获得重组菌株K.oxytoca TRP-7。随后在重组菌株K.oxytoca TRP-7的基础上，增强莽草酸合成关键基因和L-色氨酸合成关键基因的表达以提高L-色氨酸积累水平。具体地，强化来自E.coliW3110的3-脱氢奎尼酸合酶编码基因aroB(SEQ ID NO.9)、莽草酸脱氢酶编码基因aroE(SEQID NO.11)、分支酸合酶编码基因aroC(SEQ ID NO.13)、色氨酸操纵子部分基因簇trpE^fbrD(SEQ ID NO.15)、色氨酸操纵子部分基因簇trpDC(SEQ ID NO.17)、色氨酸操纵子部分基因簇trpBA(SEQ ID NO.19)和转酮酶编码基因tktA(SEQ ID NO.21)的表达。

其中本实验例采用的基因整合和基因敲除采用两步同源重组技术，具体操作过程参考上述实施例1。在重组菌株K.oxytoca TRP-7的D-乳酸脱氢酶基因ldhD(SEQ ID NO.10)位点上分别引入上述基因，另外，本实验例进一步将筛选到的限速基因全部整合至K.oxytoca TRP-7的不同基因位点上，基因位点分别为adhE(SEQ ID NO.12)、frdA(SEQ IDNO.14)、pflB(SEQ ID NO.16)、pox(SEQ ID NO.18)、pta(SEQ ID NO.20)、pykF(SEQ IDNO.22)。

将获得的一系列重组K.oxytoca按照实施例2的培养方式摇瓶培养60h，发酵液经高效液相色谱(HPLC)进行代谢物分析。

表4不同限速基因的表达对提高L-色氨酸生产的影响

结果如表4所示，增强不同限速基因所获得重组菌株中，L-色氨酸的产量均有不同水平的提高，其中增强trpE^fbr(S40F)D限速基因的重组菌(TRP-11)具有最好的提升效果。进一步将筛选到的限速基因全部整合至K.oxytoca TRP-7的不同基因位点上，获得菌株K.oxytoca TRP-22能够积累10.1g/L的L-色氨酸。

实验例5强化L-丝氨酸合成以提高L-色氨酸生产

在L-色氨酸合成途径中，L-丝氨酸参与色氨酸合酶催化的反应，该反应为L-色氨酸合成的最后一步。因此L-丝氨酸的供应有利于L-色氨酸生产。然而L-丝氨酸合成主要受限于3-磷酸甘油酸脱氢酶受到L-丝氨酸的严格反馈抑制。

因此，本发明采用两步同源重组技术在重组菌株K.oxytoca TRP-22的基础上，将来自E.coli W3110的3-磷酸甘油酸脱氢酶突变蛋白编码基因serA^{fbr(H344A,N346A,N364A)}(SEQID NO.23)插入至2,3-丁二醇脱氢酶基因budC(SEQ ID NO.24)的位点上，获得重组菌株K.oxytoca TRP-23。

将获得的重组K.oxytoca按照实施例2的培养方式摇瓶培养60h，发酵液经高效液相色谱(HPLC)进行代谢物分析。

表5.过表达反馈不敏感的3-磷酸甘油酸脱氢酶对提高L-色氨酸生产的影响

结果如表5所示，过表达反馈不敏感的3-磷酸甘油酸脱氢酶，可以提高L-色氨酸积累水平，获得的菌株K.oxytocaTRP-23能够积累12.2g/L的L-色氨酸。

实验例6强化谷氨酰胺供应以提高L-色氨酸生产

在L-色氨酸合成途径中，分支酸是其关键的中间代谢产物，同时也是L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的前体物质。然而分支酸主要通过氨基苯甲酸合酶进入L-色氨酸合成，该反应需要谷氨酰胺参与。因此谷氨酰胺的供应有利于L-色氨酸生产。本发明采用两步同源重组技术,在重组菌株K.oxytoca TRP-23的基础上，将来自谷氨酸棒杆菌C.glutamicumATCC13032的谷氨酰胺合酶编码基因glnA(SEQ ID NO.25)插入至1,3-丙二醇脱氢酶基因dhaT(SEQ ID NO.26)的位点上，获得重组菌株K.oxytoca TRP-24。

将获得的重组K.oxytoca按照实施例2的培养方式摇瓶培养60h，发酵液经高效液相色谱(HPLC)进行代谢物分析。

表6.强化谷氨酰胺供应对提高L-色氨酸生产的影响

结果如表6所示，引入异源谷氨酰胺合酶编码基因glnA可以提高L-色氨酸积累水平，获得的菌株K.oxytocaTRP-24能够积累13.0g/L的L-色氨酸。

实验例7强化L-色氨酸外排途径以提高L-色氨酸生产

L-色氨酸合成途径中关键酶的活性和表达会受到L-色氨酸的严格反馈抑制。为了缓解这种负反馈效应，除了已知的在关键酶中引入负反馈不敏感的突变位点，降低胞内L-色氨酸浓度也是一种重要手段。另外，过高浓度的胞内L-色氨酸也会抑制菌株生长，提高L-色氨酸外排则能有效降低胞内L-色氨酸浓度。因此，本发明采用两步同源重组技术，在重组菌株K.oxytoca TRP-24的基础上，将来自于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的芳香族氨基酸外排蛋白基因ywkB(SEQ ID NO.27)和来自于大肠杆菌W3110的L-色氨酸外排蛋白基因yddG分别插入至甘油脱氢酶基因gldA(SEQ ID NO.28)的位点上，获得重组菌株K.oxytoca TRP-25和TRP-26。

将获得的一系列重组K.oxytoca按照实施例2的培养方式摇瓶培养60h，发酵液经高效液相色谱(HPLC)进行代谢物分析。

表7.强化l-色氨酸外排对提高L-色氨酸生产的影响

结果如表7所示，引入异源的L-色氨酸外排蛋白均可以提高重组菌株的L-色氨酸积累水平。特别的，引入芳香族氨基酸外排蛋白基因ywkB获得的菌株K.oxytocaTRP-25能够积累更多的L-色氨酸，其摇瓶发酵产量达到14.0g/L。

实验例8增强磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的表达以提高L-色氨酸生产

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶可以催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸，后者为L-色氨酸合成的前体。因此，增强磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的表达可能有利于L-色氨酸生产。本发明采用两步同源重组技术，在重组菌株K.oxytoca TRP-26的基础上，将来自于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pck(SEQ ID NO.29)插入至乙酸激酶基因ackA(SEQ ID NO.30)的位点上，获得重组菌株K.oxytoca TRP-27。

将获得的重组K.oxytoca按照实施例2的培养方式摇瓶培养60h，发酵液经高效液相色谱(HPLC)进行代谢物分析。

表8.增强磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的表达对提高L-色氨酸生产的影响

结果如表8所示，增强磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶表达获得的菌株K.oxytocaTRP-27摇瓶发酵能够积累14.6g/L的L-色氨酸。

通过以上实验例可以看出，结合产酸克雷伯氏菌自身的代谢途径，通过引入不同来源的L-色氨酸合成关键基因可以实现代谢通量从2,3-丁二醇向L-色氨酸的转变。进一步结合L-色氨酸合成途径的优化、L-色氨酸降解途径的阻断、前体物质供应的增强和转运蛋白的筛选，极大程度的促进了L-色氨酸代谢流的稳定和产物的积累。由此，得到了一株高效生产L-色氨酸的基因工程菌株。

通过上述实施例和实验例可以看到，本发明提供了一种高产L-色氨酸的重组微生物及其构建方法和应用。本发明通过筛选敲除或添加的基因，优选了一种高产L-色氨酸的重组产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)TRP-27，其基因型为K.oxytoca CICC21518ΔbudA::ppsAΔbudB::aroG^fbr(D146N)ΔtnaAΔtrpL::P_budABCΔtrpRΔldhD::aroBΔadhE::aroEΔfrdA::aroCΔpflB::trpE^fbr(S40F)DΔpox::trpDCΔpta::trpBAΔpykF::tktAΔbudC::serA^{fbr(H344A,N346A,N364A)}ΔdhaT::glnAΔgldA::ywkBΔackA::pck。本发明的重组产酸克雷伯氏菌可以用于发酵生产L-色氨酸，实验证实本发明的工程菌株能够代谢葡萄糖高效生产L-色氨酸，产量达60.0g/L，得率达0.23g/g。本发明提供了一种通过将2,3-丁二醇合成代谢通量通过丙酮酸重定向至L-色氨酸合成以实现微生物高效生产L-色氨酸的方法；本发明提供的L-色氨酸生产过程简便，成本低，具有重要的经济效益和社会意义。

Claims (10)

1.一种生产L-色氨酸的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物的出发菌株选自克雷伯氏菌属菌株；所述重组微生物过表达包括磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因ppsA、色氨酸操纵子部分基因簇trpE^fbrD基因。

2.按照权利要求1所述的生产L-色氨酸的重组微生物，其特征在于：所述色氨酸操纵子部分基因簇trpE^fbrD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

3.按照权利要求1所述的生产L-色氨酸的重组微生物，其特征在于：所述出发菌株选自产酸克雷伯氏菌、土生克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌或肺炎克雷伯氏菌中的至少一种。

4.按照权利要求1-3任一项所述的生产L-色氨酸的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物是在出发菌株的基础上，失活副产物和/或2,3-丁二醇合成途径中的酶基因，增强L-色氨酸合成通量相关的基因构建的；所述副产物选自乙酸、甲酸、琥珀酸、乳酸中的至少一种；所述L-色氨酸合成通量相关的基因选自L-色氨酸合成相关酶基因、代谢通路相关基因、外排蛋白基因、内源强启动子基因中的至少一种。

5.按照权利要求4所述的生产L-色氨酸的重组微生物，其特征在于：所述副产物和/或2,3-丁二醇合成途径中的酶基因选自丙酮酸激酶编码基因pykF、色氨酸酶编码基因tnaA、色氨酸操纵子的转录抑制因子trpR、色氨酸操纵子的衰减子trpL、丙酮酸氧化酶基因pox、磷酸转乙酰基酶基因pta、乙酸激酶ackA、富马酸还原酶亚基A基因frdA、乳酸脱氢酶基因ldhD、丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB、乙醇脱氢酶基因adhE、α-乙酰乳酸合酶基因budB、α-乙酰乳酸脱羧酶基因budA、2,3-丁二醇脱氢酶基因budC、甘油脱氢酶基因gldA、1,3-丙二醇脱氢酶基因dhaT中的至少一种到十六种。

6.按照权利要求4所述的生产L-色氨酸的重组微生物，其特征在于：所述L-色氨酸合成通量相关的基因选自2,3-丁二醇合成基因簇的启动子P_budABC、3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶突变蛋白编码基因aroG^fbr，3-磷酸甘油酸脱氢酶突变蛋白编码基因serA^fbr、3-脱氢奎尼酸合酶编码基因aroB、莽草酸脱氢酶编码基因aroE、分支酸合酶编码基因aroC、色氨酸操纵子部分基因簇trpDC、色氨酸操纵子部分基因簇trpBA、转酮酶编码基因tktA，芳香族氨基酸外排蛋白编码基因ywkB、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pck、谷氨酰胺合酶编码基因glnA、L-色氨酸外排蛋白基因yddG中的至少一种到十三种。

7.权利要求1-6任一项所述生产L-色氨酸的重组微生物的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括在出发菌株的基础上，失活副产物和/或2,3-丁二醇合成途径中的酶基因，增强L-色氨酸合成通量相关的基因构建的；所述副产物选自乙酸、甲酸、琥珀酸、乳酸中的至少一种；所述L-色氨酸合成通量相关的基因选自L-色氨酸合成相关酶基因、代谢通路相关基因、外排蛋白基因、内源强启动子基因中的至少一种。

8.权利要求1-6任一项所述生产L-色氨酸的重组微生物在用于生产L-色氨酸中的应用。

9.按照权利要求8所述的应用，其特征在于：取过表达包括磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因ppsA、色氨酸操纵子部分基因簇trpE^fbrD基因的重组微生物，使用含葡萄糖的发酵培养基培养，即得。

10.按照权利要求9所述的应用，其特征在于：所述发酵培养基中葡萄糖的浓度为80-100g/L；

和/或，所述重组微生物进行培养时的接种量为体积比5-10％；

和/或，所述培养时的搅拌转速为500-1000转/分钟；和/或，所述培养时的pH为6.8±0.1；和/或，所述培养时的温度为37±0.5℃；和/或，所述培养期间维持葡萄糖浓度在0-5g/L；和/或，所述培养的时间为40-60小时。