CN120683038A - 一种牛外胚层干细胞系及其建立方法和应用 - Google Patents

一种牛外胚层干细胞系及其建立方法和应用

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Abstract

本发明公开了一种牛外胚层干细胞系及其建立方法和应用。所述牛外胚层干细胞系具有牛中间态干细胞系的多能性，并且表达一种或多种多能性标记物，能够稳定传代，在超过112代后仍保持类似于中间态(Formative)外胚层细胞的多能性转录组特征与正常核型，并且具有分化为三胚层的潜力。该牛中间态干细胞系具有用于肌源性分化、原始生殖细胞样细胞分化和作为体细胞核移植(SCNT)供体细胞的潜力，这表明它们在促进细胞培养肉生产和动物育种方面具有广泛应用前景。

Description

一种牛外胚层干细胞系及其建立方法和应用
本申请要求于2024年03月21日提交中国专利局、申请号为2024103257603、申请名称为“一种牛中间态干细胞系及其体外制备方法和用途”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及干细胞生物学领域，尤其涉及一种牛外胚层干细胞系及其建立方法和应用。
背景技术
胚胎外胚层细胞可以分化为完整的胎儿，并作为多能干细胞系(pluripotentstem cells,PSCs)的重要来源。来源于不同发育阶段外胚层的PSCs表现出不同的多能状态，可具体分为原始态中间态(Formative)或始发态(Primed)。人类和小鼠PSCs已广泛应用于胚胎发育、定向分化和疾病建模等相关领域中。
稳定的家畜PSCs不仅有助于了解家畜的胚胎发育和多能性，而且也是动物育种和培养肉类生产的最佳细胞来源。然而，由于物种的特异性，在大型动物中建立稳定的多能干细胞系的进展缓慢。最近，猪原肠化前上胚层干细胞。的建立及其在各个领域的潜在应用而引起了广泛关注。然而，牛胚胎发生和PSCs分子基础的研究远远落后于猪、小鼠、人类和非人灵长类动物。由于牛胚胎发育和多能干细胞自我更新的分子基础尚不明晰，从牛中建立外胚衍生的多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)具有挑战性。因此进一步追踪不同发育阶段的牛胚胎干细胞系具有重要的实际应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种牛外胚层干细胞及其体外制备方法和用途。用优化的3i/LAF培养系统成功建立了稳定的牛外胚层干细胞系。这项研究为研究家畜干细胞的多能性提供了宝贵的高质量种子细胞和新途径，同时推进了干细胞相关育种和细胞培养肉生产的研究。
在第一方面，本发明提供了一种牛外胚层干细胞系，其特征在于，所述牛外胚层干细胞系具有牛外胚层干细胞的多能性，并且表达一种或多种多能性标记物，能够稳定传代
在某些实施例中，所述外胚层干细胞系能够稳定遗传至少10次、20次、30次、40次、50次、60次、70次、80次、90次、100次、200次或更多。
在某些实施例中，所述多能性标记物选自POU5F1、NANOG、SOX2、CDH1、SSEA1和SSEA4中的一种或多种；
在某些实施例中，所述牛外胚层干细胞系来源于牛胚胎E7-E14的外胚层；
在某些实施例中，所述牛外胚层干细胞系来源于牛胚胎E10-E12的外胚层；
在某些实施例中，所述所述牛外胚层干细胞系来源于牛胚胎E10的外胚层；
在某些实施例中，所述E7-E14属于EPI谱系。
在某些实施例中，所述EPI谱系高表达TDGF1、POU5F1和NANOG中的一种或多种。
在某些实施例中，所述牛外胚层干细胞系高特异性表达多能性相关基因ETV1、ETV5、ZIC2、LIN28B、NODAL、NANOG和TDGF1中的一种或多种。
在某些实施例中，与始发态(Primed)的bESCs相比，所述牛外胚层干细胞系高表达NANOG、LEFTY2和NODAL基因中的一种或多种；
在某些实施例中，与始发态(Primed)的bEDSCs相比，所述牛外胚层干细胞系低表达GATA3、PAX6、TGFB2、PAX2、FGFR4、LMO1、MEIS2、ID2、HES1基因中的一种或多种。
在某些实施例中，与始发态(Primed)的bESCs相比，所述牛外胚层干细胞系高表达FGF4基因、ZFP42基因、ETV3L基因、DPPA3基因、ACVRL1基因、TDGF1基因和TBX3基因中的一种或多种；
在某些实施例中，与bEDSCs相比，所述牛外胚层干细胞系的参与干细胞增殖以及细胞间粘附调节的基因表达上调；
在某些实施例中，与bEDSCs相比，所述牛外胚层干细胞系还低表达HAND1、GATA3、TGFB2、ZFP42、VMO1、MEIS2、BMP4、IGF1R、CCND2和SPRY4基因中的一种或多种。
在某些实施例中，所述干细胞增殖的基因包括ELL3和/或FGF4；
在某些实施例中，所述细胞间粘附调节的基因包括NODAL、FOXA2和EPCAM中的一种或多种；
在某些实施例中，与bEDSCs相比，所述牛外胚层干细胞系还高表达DPPA3、LMO1、ACVRL1和WNT3A基因中的一种或多种。
在某些实施例中，所述牛外胚层干细胞系与biPSCs或bEPSCs相比，所述牛外胚层干细胞系表现出更高的LIN28A/B和/或NODAL表达水平；
在某些实施例中，与biPSCs相比，所述牛外胚层干细胞系还高表达NODAL、LIFR、IL6R、PDGFRA、ACVR1B、ETS1、IL6ST、SALL4基因中的一种或多种；
在某些实施例中，与biPSCs相比，所述牛外胚层干细胞系还低表达GDF15、BCL3、CD44、ETV2、FGFR4、KLF15、GDF1、BMP4、COX17和MYC基因中的一种或多种。在某些实施例中，与bEPSCs相比，所述牛外胚层干细胞系还高表达LIFR、ESRRB、IL6R、ACVR1B、KLF5、SALL4、CDH1基因中的一种或多种。
在某些实施例中，与bEPSCs相比，所述牛外胚层干细胞系还低表达MSC、GCK、TGFB2、MAPK15、KLF15、GDF1、ID4、FOS、COX17基因一种或多种。在某些实施例中，所述牛外胚层干细胞系依赖FGF/ERK和/或TGFβ/SMADs信号通路的激活以及WNT/β-catenin信号通路的抑制；
在某些实施例中，所述FGF/ERK信号通路相关基因包括MAPK1、MAPK14、FGF2、PDGFA、FGFR1和FGFR2中的一种或多种；
在某些实施例中，所述TGFβ/SMADs信号通路相关基因包括INHBA、NODAL、ACVR2A/2B、BMP4和BMPR1A/1B中的一种或多种；
在某些实施例中，所述WNT/β-catenin信号通路相关基因包括TCF7、APC、WNT11、CTNNB1、FZD2和WNT3A中的一种或多种。
在另一方面，本发明公开了一种用于培养牛外胚层干细胞系的培养基，其特征在于，所述培养基包括基础培养基和添加组分；
在某些实施例中，所述基础培养基包括DMEM/F12培养基和/或Neurobasal培养基；
在某些实施例中，所述DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基的质量比或体积比为1:1；
在某些实施例中，所述基础培养基中还包括选自由以下各项组成的组的一种或多种小分子抑制剂或细胞因子：CHIR99021、IWR-1-endo(XAV939)、WH-4-023、重组人LIF、重组人Activin A和重组人FGF-basic(154aa)、ROCK抑制剂Y-27632，或其任意组合；
在某些实施例中，所述CHIR99021使用浓度为1μM；
在某些实施例中，所IWR-1-endo使用浓度为0.5μM；
在某些实施例中，所述WH-4-023使用浓度为1μM；
在某些实施例中，所述重组人LIF使用浓度为10ng/mL；
在某些实施例中，所述重组人Activin A使用浓度为25ng/mL；
在某些实施例中，所述重组人FGF-basic使用浓度为10ng/mL；
在某些实施例中，所述ROCK抑制剂Y-27632使用浓度为5μM。
所述基础培养基中还包括选自由以下各项组成的组的一种或多种小分子抑制剂或细胞因子：CHIR99021(1μM,Selleckchem,S1263)、XAV939(1μM，Selleckchem，S1180)、WH-4-023(1μM,Selleckchem,S7565)、重组人LIF(10ng/mL,PeproTech,300-05)、重组人Activin A(25ng/mL,PeproTech,120-14E)和重组人FGF-basic(154aa)(10ng/mL,PeproTech,100-18B)、ROCK抑制剂Y-27632(5μM，Selleckchem，S1049)，或其任意组合。
所述培养基中的添加组分包括1×N2 supplement(Thermo Fisher Scientific，17502-048)、1×B27 supplement(Thermo Fisher Scientific,12587-010)、0.5％GlutaMAX(Thermo Fisher Scientific,35050-061)、1％非必需氨基酸(Thermo FisherScientific,11140-050)、0.1mMβ-巯基乙醇(Thermo Fisher Scientific,21985-023)、1％青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific,15140-122)、5％knockout serumreplacement(KOSR,Thermo Fisher Scientific,A3181502,optional)和50μg/mL抗坏血酸(Sigma–Aldrich,A4544)。
在另一方面，本发明公开了一种牛外胚层干细胞系的体外制备方法，其特征在于，所述方法包括将从牛E10-E14的胚胎分离的单个胚胎细胞在上述的培养基中进行培养的步骤；
在某些实施例中，所述E7-E14属于EPI谱系。
在某些实施例中，所述牛外胚层干细胞系来源于牛胚胎E10-E12的外胚层；
在某些实施例中，所述所述牛外胚层干细胞系来源于牛胚胎E10的外胚层。
在另一方面，本发明公开了如上任一所述的牛外胚层干细胞系或上述方法制备的牛外胚层干细胞系在诱导生成肌肉细胞或者提供核移植供体细胞中的应用。
在另一方面，本发明公开了一种肌肉细胞的制备方法，所述方法包括将如上任一所述的牛外胚层干细胞系或上述方法制备的牛外胚层干细胞系在成肌培养基中培养，获得肌肉细胞的步骤。
在另一方面，本发明公开了一种牛原始生殖细胞样细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将如上任一所述的牛外胚层干细胞系或上述方法制备的牛外胚层干细胞系在PGC诱导培养体系中培养，获得牛原始生殖细胞样细胞的步骤；
在某些实施例中，与所述牛外胚层干细胞系相比，牛原始生殖细胞样细胞高表达TFAP2C基因和PRDM1基因。
在另一方面，本发明公开了一种牛核移植方法，所述方法包括将如上任一所述的牛外胚层干细胞系或上述方法制备的牛外胚层干细胞系作为核移植供体细胞核或核移植供体细胞进行培养，获得牛细胞、组织、器官、完整个体的步骤。
有益效果：
本研究使用单细胞转录组测序来证明牛和猪在早期胚胎发育和多能性变化方面的相似性，并使用优化的3i/LAF培养系统成功建立了稳定的牛中间态(Formative)外胚层干细胞系。通过本申请建立的牛中间态外胚层干细胞系在超过112代后仍保持类似于中间态(Formative)外胚层细胞的多能性转录组特征与正常核型，并且具有分化为三胚层的潜力。本申请还进一步评估了bEpiSCs用于肌源性分化、原始生殖细胞样细胞分化和作为体细胞核移植(SCNT)供体细胞的潜力。这项研究为研究家畜干细胞的多能性提供了宝贵的高质量种子细胞和新途径，同时推进了细胞培养肉生产和干细胞相关育种的研究。
附图说明
图1为bEpiSCs的产生与特性。
A：建立bEpiSCs的战略。
B：在3i/LAF培养基中不同阶段的牛胚胎和细胞系的生长效率。
C：生长体(上)和bEpiSCs(下)的形态，白色箭头表示选定和传代的bEpiSCs菌落的形态。比例尺，200μm。
D：bEpiSCs种群倍增时间。
E：bEpiSCs的单细胞克隆效率。
F：bEpiSCs碱性磷酸酶(AP)染色试验。比例尺，100μm。
G：bEpiSCs核型分析。对每个细胞系，检测了45个中期细胞。
H：bEpiSC中多能性标记物POU5F1、NANOG和SOX2的免疫染色。DAPI用于细胞核染色。比例尺，100μm。
I：bEpiSCs中多能性表面标记物CDH1、SSEA1和SSEA4的免疫染色。DAPI用于细胞核染色。比例尺，50μm。
J：体外EB分化实验。外胚层神经特异性标记蛋白β-III-Tubulin、中胚层肌肉特异性标记蛋白α-SMA和内胚层特异性标记蛋白SOX17的免疫染色。DAPI用于细胞核染色。比例尺，100μm。
K：体内畸胎瘤形成试验。bEpiSCs畸胎瘤的苏木精和伊红(H&E)染色。比例尺，50μm。
对于D和E，误差条表示±SD(n＝3个独立实验)，ns。P≥0.05。对于(C)和(F-K)，在三个独立的实验中得到了类似的结果。
图2为3i/LAF对bEpiSCs的长期传代培养至关重要。
A：以3i/LAF组为对照，用减因子处理bEpiSCs，观察克隆形态和AP染色。比例尺，200μm。B：逐个减因子处理后bEpiSCs培养体系的克隆大小分析。每个处理组计数超过30个克隆。C：3i/LAF组和I/F组bEpiSCs基因表达差异的实时定量PCR分析。
D，E：使用qRT-PCR比较CHIR、IWR和wh缺失组与3i/LAF组中代表多能性(D)和谱系(E)标记基因的mRNA表达水平。
F：使用qRT-PCR比较FGF2缺失组与3i/LAF组中代表多能性和谱系标记基因的mRNA表达水平。G：使用qRT-PCR方法比较Activin A缺失组与3i/LAF组中代表性多能性和BMP信号通路标记基因的mRNA表达水平。
H：使用qRT-PCR比较LIF缺失组与3i/LAF组中代表多能性和JAK/STAT3信号通路标记基因的mRNA表达水平。
对于(B-H)，误差条表示±SD(n＝3个独立实验)，ns。P≥0.05；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P＜0.001；****，P＜0.0001。对于(A-H)，在三个独立的实验中得到了类似的结果，见图5。
图3为bEpiSCs转录组学分析。
A：PCA图显示了从牛胚胎谱系细胞和bEpiSCs中获得的scRNA-seq数据的分布，基于不同的胚胎谱系和bEpiSC系，用颜色编码的簇。
B：牛胚胎谱系细胞和bEpiSCs进行Spearman相关性分析。从蓝色到红色的颜色梯度表示相关性从低到高逐渐增加。
C：小提琴图显示了牛胚胎谱系以及来自不同胚胎阶段的bEpiSCs中formative和primed多能性代表基因的表达水平。
D：生成PCA图以将bEpiSCs与公开建立的Primed bESCs 15、bEDSCs 16、bEPSCs和biPSCs 18进行比较，其中每个数据点代表不同的细胞系。
E：在bEpiSCs和已发表的bPSCs之间鉴定了差异表达基因(DEGs)。通过两两比较，与已发表的bPSCs相比，红条表示在bEpiSCs中上调的基因，而绿条表示在bEpiSCs中下调的基因。
F：散点图显示bEpiSCs和已发表的bPSCs之间的平均基因表达水平比较，橙色突出显示上调基因，蓝色突出显示下调基因。对关键基因进行了适当的注释，见图6。
图4为bEpiSCs的潜在应用。
A：bEpiSC在模型图中的应用前景。
B：bEpiSCs在肌源分化不同阶段群体形态。比例尺，200μm。
C：qRT-PCR定量测定肌源性分化相关基因mRNA表达。
D：肌源性分化bEpiSC中肌细胞相关蛋白的免疫染色。比例尺，200μm。
E：牛bEpiSCs形成的PGCLCs拟胚体形态。
F：牛bEpiSCs形成的PGCLCs基因表达情况。
G：GFP-bEpiSCs的克隆形态，比例尺，50μm。
H：GFP-bEpiSCs克隆胚胎形态，比例尺，100μm。
I：bEpiSCs供核转移克隆效率统计。
J：牛克隆胚胎新生GFP-bEpiSCs的克隆形态，比例尺，200μm。
对于C,F，误差条表示±SD(n＝3个独立实验)，****，P<0.0001。对于(B-H)，在三个独立的实验中获得了类似的结果。
图5为bEpiSCs的培养修改，与图2相关。
A：不同浓度的CHIR(C)和IWR(I)处理的bEpiSCs的克隆形态和AP染色，浓度单位，μM，比例尺，200μM。
B：通过qRT-PCR定量表达多能性和谱系标记基因，C(CHIR)和I(IWR)，浓度单位，μM。
C：用不同浓度的IWP2和XAV939处理的bEpiSCs克隆的形态，比例尺，200μm。D：定量测定不同浓度IWP2和XAV939培养的bEpiSCs多能基因和谱系特异性标记基因的mRNA表达水平。对于B和D，误差条表示±SD(n＝3个独立实验)，ns。P≥0.05；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P＜0.001；****，P＜0.0001。对于(A-D)，在三个独立的实验中获得了类似的结果。
图6为bEpiSC与已发表的bPSC和猪pgEpiSC的比较分析，与图3相关。
A：通过对bPSCs的两两比较确定的基因本体和KEGG途径。
B：生成散点图以比较bEpiSCs和猪pgEpiSCs之间的平均基因表达水平，橙色突出显示上调基因，蓝色突出显示下调基因。对关键基因进行了适当的注释。
C：bEpiSCs和猪pgEpiSCs中差异表达基因的基因本体论和KEGG途径富集项。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，它们不应该理解成对本发明的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明的描述中，需要理解的是，所用到的术语仅仅是用于描述的目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所涉及的所有小鼠实验和奶牛实验程序均事先经中国农业大学实验动物福利与动物实验伦理审查委员会批复，批复号AW10204202-3-1。
小鼠
(ICR)IGS和BALB/c裸鼠购自北京Vital River实验动物技术有限公司，用于小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)分离和bEpiSCs畸胎瘤形成试验。用丝裂霉素C(Selleckchem，S8146)处理MEFs以制备bEpiSCs的饲养层细胞。
牛
采用E5、E6、E7、E10、E12和E14期荷斯坦牛胚胎进行牛胚胎单细胞收集和单细胞转录组分析。交配后n天获得胚胎日n(E(n))个胚胎。对于bEpiSCs的衍生，使用E7、E10、E12和E14胚胎。
牛胚胎采集和胚胎单细胞分离
本研究中使用的胚胎细胞完全来源于荷斯坦奶牛胚胎。E5-E7胚胎是通过解冻和培养冷冻的牛胚胎获得的，直到达到所需的发育阶段。对透明带进行15-30秒的Pronase(Sigma，10165921001)处理，然后使用DPBS+0.1％BSA组成的溶液进行清洗和去除。随后，机械分离胚胎细胞并将其转移到裂解液中。通过体内移植和随后的冲洗获得E10、E12和E14胚胎，通过酶处理和机械操作相结合的方法分离和收集单个胚胎细胞。
牛外胚层干细胞培养基
牛外胚层干细胞培养体系的组成与先前报道的3i/LAF培养体系相同，并对各组成成分的含量进行了相应的优化。具体而言，基础培养基(BM)是DMEM/F12培养基(ThermoFisher Scientific，10565-018)和Neurobasal培养基(Thermo Fisher Scientific，21103-049)的1:1混合物，并添加1×N2 supplement(Thermo Fisher Scientific，17502-048)、1×B27 supplement(Thermo Fisher Scientific,12587-010)、0.5％GlutaMAX(Thermo Fisher Scientific,35050-061)、1％非必需氨基酸(Thermo FisherScientific,11140-050)、0.1mMβ-巯基乙醇(Thermo Fisher Scientific,21985-023)、1％青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific,15140-122)、5％knockout serumreplacement(KOSR,Thermo Fisher Scientific,A3181502,optional)和50μg/mL抗坏血酸(Sigma–Aldrich,A4544)。为了制备3i/LAF培养系统，还需要向BM中添加以下小分子抑制剂或细胞因子：CHIR99021(1μM,Selleckchem,S1263)、IWR-1-endo(0.5μM,Selleckchem,S7086)、WH-4-023(1μM,Selleckchem,S7565)、重组人LIF(10ng/mL,PeproTech,300-05)、重组人Activin A(25ng/mL,PeproTech,120-14E)和重组人FGF-basic(154aa)(10ng/mL,PeproTech,100-18B)。优化后，加入了ROCK抑制剂Y-27632(5μM，Selleckchem，S1049)。另外，XAV939(1μM，Selleckchem，S1180)可以代替IWR-1-endo。将bEpiSCs与用丝裂霉素C处理的小鼠成纤维细胞一起培养。
本申请中，E指的是Embryonic DAY，也就是受精卵的发育天数。一般的，受精当天为E0，以此类推。即E7、E10、E12和E14分别指受精卵发育7天、10天、12天和14天。
实验模型和研究参与者详细信息
材料可用性
本研究中生成的所有bEpiSCs均可从主要联系人处获得，并提供完整的材料转让协议。
数据和代码可用性
本研究期间生成的scRNA-seq、RNA-seq数据集可在Gene Expression Omnibus(GEO)上获得，其登录代码如下：GSE256201。
动物治疗和伦理声明
所有小鼠实验和奶牛实验程序均事先经中国农业大学实验动物福利与动物实验伦理审查委员会批复，批复号AW10204202-3-1。
小鼠
(ICR)IGS和BALB/c裸鼠购自北京Vital River实验动物技术有限公司，用于小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)分离和bEpiSCs畸胎瘤形成试验。用丝裂霉素C(Selleckchem，S8146)处理MEFs以制备bEpiSCs的饲养层细胞。
牛
采用E5、E6、E7、E10、E12和E14期荷斯坦牛胚胎进行牛胚胎单细胞收集和单细胞转录组分析。交配后n天获得胚胎日n(E(n))个胚胎。对于bEpiSCs的衍生，使用E7、E10、E12和E14胚胎。
牛胚胎采集和胚胎单细胞分离
本研究中使用的胚胎细胞完全来源于荷斯坦奶牛胚胎。E5-E7胚胎是通过解冻和培养冷冻的牛胚胎获得的，直到达到所需的发育阶段。对透明带进行15-30秒的Pronase(蛋白酶Pronase，Sigma，10165921001)处理，然后使用DPBS+0.1％BSA组成的溶液进行清洗和去除。随后，机械分离胚胎细胞并将其转移到裂解液中。通过体内移植和随后的冲洗获得E10、E12和E14胚胎，通过酶处理和机械操作相结合的方法分离和收集单个胚胎细胞。
牛外胚层干细胞培养基
牛外胚层干细胞培养体系的组成与先前报道的3i/LAF培养体系2相同，并对各组成成分的含量进行了相应的优化。具体而言，3i/LAF培养基：基础培养基(BM)是DMEM/F12培养基(Thermo Fisher Scientific，10565-018)和Neurobasal培养基(Thermo FisherScientific，21103-049)的1:1混合物，并添加1×N2 supplement(Thermo FisherScientific，17502-048)、1×B27 supplement(Thermo Fisher Scientific,12587-010)、0.5％GlutaMAX(Thermo Fisher Scientific,35050-061)、1％非必需氨基酸(ThermoFisher Scientific,11140-050)、0.1mMβ-巯基乙醇(Thermo Fisher Scientific,21985-023)、1％青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific,15140-122)、5％knockout serumreplacement(KOSR,Thermo Fisher Scientific,A3181502,optional)和50μg/mL抗坏血酸(Sigma–Aldrich,A4544)。为了制备3i/LAF培养系统，还需要向BM中添加以下小分子抑制剂或细胞因子：CHIR99021(1μM,Selleckchem,S1263)、IWR-1-endo(0.5μM,Selleckchem,S7086)、WH-4-023(1μM,Selleckchem,S7565)、重组人LIF(10ng/mL,PeproTech,300-05)、重组人Activin A(25ng/mL,PeproTech,120-14E)和重组人FGF-basic(154aa)(10ng/mL,PeproTech,100-18B)。优化后，加入了ROCK抑制剂Y-27632(5μM，Selleckchem，S1049)。另外，XAV939(1μM，Selleckchem，S1180)可以代替IWR-1-endo。将bEpiSCs与用丝裂霉素C处理的小鼠成纤维细胞一起培养。
牛ICMs、外胚层和外胚层bEpiSCs的衍生
通过机械分离方法分离牛ICMs、上胚层和外胚层，并用TrypLETMExpress(非动物源性重组酶,它主要用于解离各种贴壁哺乳动物细胞，Gibco，12605010)处理3分钟，然后接种到补充有3i/LAF培养基的饲养细胞上。培养物在37℃下在5％O2和5％CO2下孵育。使用Accutase细胞解离试剂(Gibco，A11105-01)消化收集球形生长物并，以1:4的比例每3天传代一次。
实验方法
单细胞RNA文库制备及测序
如先前在研究7,8中所述，使用改良的Smart-seq2方案制备单细胞RNA-seq文库。简言之，将单个胚胎细胞转移到含有8bp条形码的裂解缓冲液中。随后，第一链cDNA被反向合成并在逆转录(RT)混合物中扩增，该混合物由4U RNase抑制剂、100U SuperScript II逆转录酶(Invitrogen，18064071)、1mM dNTPs(TAKARA，4019)、60mM MgCl2和带有10μM TSO引物的3μM RT引物组成。PCR扩增后，使用0.8×Beckman’s AMPure XP珠(A63882)纯化产物。然后进行生物素PCR富集以进一步提高文库质量。最后，按照KAPA PCR文库扩增/Illumina系列(KAPA KK8054)提供的说明构建单细胞RNA-seq文库。使用Illumina HiSeq Xten平台(Novogene)对高质量文库进行测序，配对末端reads长度为150bp。实验中使用的引物列于关键资源表中。
细胞群体倍增时间
bEpiSCs以3×105的密度接种在12孔板中，绘制bEpiSCs的生长曲线。随后使用LunaTM自动细胞计数器以12小时、24小时、36小时、48小时和60小时的间隔消化和计数细胞。每个时间点进行三次重复。使用以下公式计算加倍时间：加倍时间(DT)＝12×[lg2/(lgNt-lgN0)]，其中12是细胞培养时间(小时)；Nt是在48小时培养的细胞数；N0是在36小时时记录的细胞数。
单细胞克隆效率分析
用TrypLETMExpress(非动物源性重组酶,它主要用于解离各种贴壁哺乳动物细胞Gibco，12605010)消化牛EpiSCs，并通过40μm细胞过滤器过滤。将细胞分别接种在具有100、500和1000个细胞的6孔板中。培养3天后，计数形成的克隆数量，计算单细胞克隆形成率并取平均值。
核型分析
在进行核型分析之前，将1％KaryoMAX Colcemid溶液(有丝分裂抑制剂，主要用于细胞培养实验中，能够使细胞停滞在有丝分裂中期，Gibco，15212012)加入bEpiSCs培养基中并孵育1小时。然后使用TrypLETMExpress(非动物源性重组酶,它主要用于解离各种贴壁哺乳动物细胞，Gibco，12605010)将bEpiSC解离成单细胞，并通过离心收集。随后，将bEpiSCs悬浮在0.075M KCl(Sigma，P5405)的低渗溶液中，并在37℃下孵育15分钟。在该步骤之后，用甲醇和乙酸以3:1的比例固定bEpiSCs；这个过程重复三次。将得到的bEpiSCs悬浮液滴到预冷的载玻片上，在室温下彻底干燥，并用10％Giemsa染色液(Sangon，E6073140001)染色30分钟。每个细胞系检测超过45个中期细胞。
碱性磷酸酶(AP)染色
有关AP染色(AP是一种多能干细胞(PSC)表型标志物，包括未分化的胚胎干细胞(ESC)、诱导多能性干细胞(iPSC)和胚胎生殖细胞(EGC)，它们具有自我更新和分化为所有三种胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的能力)程序和注意事项的详细信息，请参阅碱性磷酸酶检测试剂盒(Millipore，SCR004)。
免疫荧光分析
用DPBS洗涤细胞进行免疫荧光(IF)分析，然后在室温下在4％多聚甲醛(PFA)中固定30分钟。随后，用DPBS冲洗细胞，并用0.1％Triton X-100渗透20分钟。在另一轮DPBS洗涤后，在室温下用3％BSA封闭细胞1小时。一抗在4℃下孵育过夜，随后使用清洗液(含有0.1％Triton X-100和0.1％Tween 20的DPBS)洗涤三次。将二抗在室温下孵育1小时，然后使用相同的清洗液洗涤三次。最后，进行DAPI(细胞核染料DAPI)染色以可视化细胞核，从而实现直接观察和摄影。本申请涉及的抗体如表4所示。
表4
拟胚体分化
消化后，将bEpiSCs以每孔1×106个细胞的密度接种，并在35mm低附着板上MEF培养基中培养5-7天，MEF培养基：DMEM(Gibco，11960-044)，添加10％FBS(Gibco、16000-044)、1％青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific,15140-122)和1％GlutaMAX(ThermoFisher Scientific，35050-061)，在水平摇床上以70rpm的速度进行培养。随后，将拟胚体(EB)转移到12孔板中，并在相同的培养基中孵育一周，每天更换两次培养基。随后利用贴壁细胞进行免疫荧光染色。
畸胎瘤形成
消化后通过离心收集制备的1×107bEpiSCs，重悬于50μL BM中，随后皮下注射到BALB/c裸鼠的颈部。4-5周后，收集畸胎瘤并进行后续的H&E分析。
H&E分析
畸胎瘤在DPBS中清洗两次，并在4℃的温度下用4％PFA固定2天。随后，将畸胎瘤组织用酒精梯度(70％、80％、90％、95％，最后每小时100％)脱水，然后转移到二甲苯中并包埋在石蜡中。将样品切片至5μm厚，然后在二甲苯中脱蜡，并使用浓度降低的乙醇进行再水化。最后，用苏木精(使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色，Sigma–Aldrich，MHS16)和伊红(使细胞质和细胞外基质中的成分着红色，Sigma-Aldrich、HT110116)对样品进行染色，然后在显微镜(Leica，DM5500B)下观察。
RT–qPCR
使用RNA prep Pure Cell/Bacteria试剂盒(TIANGEN，DP430)从bEpiSCs中提取总RNA，然后使用5×All-In-One RT Master Mix(Abm，G490)反转录为cDNA。随后，用2×RealStar Green Power Mixture(GenStar，A311-05)在Archimed Real Time System(ROCGENE)上进行PCR扩增。使用对比CT(2-ΔΔCT)方法对数据进行分析。利用GAPDH作为内参，计算ΔCT值。所有实验均进行了三次独立的生物重复。用于实时PCR的引物序列可以在关键资源表中找到。
bEpiSCs的肌源性分化
该实验方案与猪pgEpiSCs 1相同。简而言之，成肌分化基础培养基(MDBM)由DMEM/F12、1％非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、1％青霉素-链霉素、15％KOSR和200μM抗坏血酸组成。在第一阶段中，bEpiSCs被分离成小块，并在添加1％B27补充剂、3μM CHIR99021和2μMSB431542(Selleckchem,S1067)的MDBM中培养3天。在第二阶段，从第4天到第6天，将培养基更换为含有3μM CHIR99021、2μM SB431542、500nm LDN193189(Stemgent,04-0074)和20ng/mL重组人FGF-basic(154a.a.)的组合。对于第三阶段，用10ng/mL HGF(Peprotech,100-39H)、10ng/mL IGF-1(Peprotech,100-11)、20ng/mL重组人FGF-basic(154a.a.)和0.5μMLDN193189替换培养液培养2天。在第四阶段中，bEpiSCs开始分化为肌前体细胞。bEpiSCs-MPCs用浓度为10ng/mL的IGF-1处理4天，在第五阶段，则使用10ng/mL HGF和10ng/mL IGF-1的组合物处理20至25天以促进骨骼肌成熟。对于骨骼肌成熟过程，用由DMEM/F12组成的N2培养基处理细胞，N2培养基由DMEM/F12添加15％KOSR、1％N2补充物、1％青霉素-链霉素和1％非必需氨基酸组成。
rRNA缺失的RNA-seq(rRNA在总RNA中占比很高，通常不包含有用的转录组信息，去除rRNA可以提高测序效率，降低测序成本，并提高数据质量)
使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，74106)分别从四个bEpiSCs样品中提取总RNA。为了构建链特异性RNA-seq文库，我们采用了rRNA去除方案(Globin-Zero Gold rRNARemoval Kit，Illumina，GZG1224)，结合UltraTMDirectional RNA Library PrepKit for(NEB，E7420S)进行操作。使用Qubit dsDNA高灵敏度测定试剂盒(Invitrogen，Life Technologies，Q32851)对所有文库进行定量，并在Illumina HiSeq4000平台上测序。
载体构建
GFP质粒保存于实验室。总之，我们通过修饰PB-CAG-MCS载体(由吴森教授提供)，生成了产生了PB-CMV-EF1A-GFP-NLS质粒。具体而言，我们用人延伸因子1α(EF1A)启动子取代了鸡β-肌动蛋白启动子，并在EF1A启动子下游整合了GFP-NLS。
bEpiSCs转染
使用LipofectamineTM3000试剂(Invitrogen，L3000008)转染牛EpiSCs。具体而言，在24孔板中正常细胞传代16小时后进行转染。首先，在离心管中加入25μL Opti-MEMTM培养基，然后加入0.75μL LipofectamineTM3000试剂并充分混合。然后，取另一个离心管，加入25μL Opti-MEMTM培养基，加入0.5μg DNA和1μL P3000TM试剂，充分混合。然后将DNA混合物与LipofectamineTM试剂以1:1的比例混合，孵育10-15分钟，然后加入细胞进行培养。
bEpiSCs克隆胚胎的产生
从北京周边的牛场获得卵巢，提取3-8mm卵泡中的卵母细胞。将具有三层卵丘细胞的卵母细胞转移到成熟培养基中，并在38.5℃和5％CO2下成熟18小时。成熟培养基以TCM199(Gibco，12340-030)为基础，添加10％FBS(Gibco、16000-044)、0.01IU/mL促卵泡激素(FSH、Sigma、F4021)、0.01IU/mL促黄体生成素(LH、Sigma，L6420)、1μg/mL雌二醇(Sigma，E2257)。卵母细胞成熟18小时后，使用0.1％透明质酸酶(Sigma，H4272)去除多余的卵丘，将带极体的卵母细胞置于含有7.5μg/mL细胞松弛素(Sigma、C6762)的HM培养基中10分钟，然后转移到含有10％FBS的HM培养液中进行去核。将去核的卵母细胞转移到成熟培养基中，直到注射细胞核。bEpiSCs在含有10ng/mL BMP4(PeproTech，315-27)、5μM SB431542和10ng/mL FGF2的基础培养基中分化1周以上，然后作为供体细胞进行核移植。选择透明的圆形供体细胞，并将其注射到卵周间隙，使细胞尽可能靠近细胞质，以提高融合效率。将重建的胚胎放置在融合细胞的两个电极之间，并与微针对准，使得体细胞朝向两个电极中的一个。融合条件为：双直流脉冲2.5kV/cm，10μs，间隔1s；融合液为0.3mmol/L甘露醇(Sigma，1375105)、0.15mmol/LCaCl2(Sigma，C7902)和0.15mmol/L MgCl2(Sigma，M2393)。在体式显微镜下检测融合率。然后将重组胚胎转移到含有5μM ionomycin(Sigma，407950)的IVC培养基中培养4分钟，然后转移到含有2mM 6-DMAP(Sigma，D2629)的IVC培养基中培养4小时。将活化的胚胎在IVC培养基中洗涤三次，并转移到IVC培养基中进行培养。
定量统计分析
单细胞RNA-seq低水平处理和过滤
对于STRT-seq数据集，Raw reads被位于Read 2上的8bp细胞条形码分割，允许2次错配。此外，位于Read 2上的8bp唯一分子标识符(UMIs)被切换到配对的Read 1的标识线上。然后对Read 1进行处理以去除模板切换寡核苷酸(TSO)引物、低质量碱基和polyA序列51。将修剪后的reads与各自的参考基因组(牛：Bos_taurus.ARS_UCD.12；猪：Sscrofa1.1)对齐。唯一分子标识符(UMI)使用kallisto(v-0.46.0)3计数。
不同谱系胚胎阶段差异表达基因的鉴定
根据牛胚胎发育过程中的分化过程，我们将牛胚胎细胞分为三个主要谱系：胚胎谱系，包括E5的前ICM(内细胞团)，E6和E7的ICM(内细胞团)，E10和E12的外胚层以及E14的外胚层；TE(滋养外胚层)谱系，包括E5 pre-TE(E5(桑椹胚晚期)的前滋养外胚层)、E6、E7、E10、E12和E14的TE；和下胚层谱系，包括E10、E12的下胚层和E14的最终形内胚层(图1中C)。
表达倾向的构建
为了追踪胚胎发育过程中DEGs的动态变化(滋养外胚层(TE)谱系的差异表达基因(DEGs)表现出明显的表达趋势，这些基因在不同发育阶段的表达模式反映了滋养外胚层的分化和功能变化)，我们构建了DEGs在外胚层谱系中的表达趋势。我们首先分别计算了每个谱系中每个基因在特定胚胎发育时间点的平均表达水平。对胚胎谱系的平均表达水平进行重新缩放，并通过参数k＝10和iter.max＝100的k-means聚类方法进行分析，将胚胎发育过程中具有相似趋势的DEG分组为单独的聚类。
跨物种比较分析
我们通过基因组浏览器105(http://dec2021.archive.ensembl.org/index.html)中的BioMart工具下载了四个物种的同源基因列表，保留了16841个基因，均为1:1的同源基因。然后，我们在牛和猪胚胎谱系数据集中保留了1:1的同源基因。对于猪和牛胚胎数据集之间的综合分析，我们使用Seurat CCA方法进行锚定和数据集比对。选择了数据集中重复可变的前2000个特征，并使用具有以下参数的“FindIntegrationAnchors”函数来识别锚点：“reduction＝'cca，k，anchor＝5，normalization。Method＝'SCT'”。然后，基于已识别的锚点，使用“IntegrateData”函数对数据集进行集成，该函数具有以下参数：“dims＝1:30，k.weight＝50，归一化。方法＝‘SCT’”。使用“AverageExpression”函数获得综合测定中的基因平均表达值，并使用“cor”函数计算两个物种不同细胞类型之间的Spearman相关系数。利用“FindMarkers”函数，分别用Wilcoxon秩和检验确定了两个物种的状态和formative状态、formative状态和primed状态之间基因表达水平的倍数变化。只有|'avg_logFC'|>0.25和'p_val'<0.05被认为是DEGs。
伪时间分析
使用R包Monocle3(v-1.3.1)4重建了胚胎细胞的发育轨迹。UMI矩阵作为输入，并利用Seurat获得的可变基因对细胞进行伪时间排序。进一步使用destiny(v-2.14.0)R包5将两个物种的单个细胞按照通过“FindAllMarkers”函数计算得到的猪所有胚胎日细胞之间差异表达基因(DEGs)来确定它们的发育顺序。
RNA-seq数据处理与分析
使用kallisto(v-0.46.0)将蛋白质编码基因(来自Ensembl-Bos_taurus.ARS_UCD.12的基因注释文件[GTF])的表达水平量化为百万转录本(TPM)。使用DEseq2工具(v-1.30.1)6鉴定不同细胞类型之间的DEGs。我们使用Benjamini-Hochberg调整的错误发现率(FDR)<0.05和绝对log2(倍数变化)>2作为统计显著性的截止值。
bEpiSCs与胚胎细胞的转录组相关性分析
对于bEpiSC和牛胚胎数据集之间的综合分析，我们使用Seurat RPCA方法进行锚定和数据集比对。选择了数据集中重复可变的前2000个特征，并使用具有以下参数的“FindIntegrationAnchors”函数识别锚点：“reduction＝'rpca'，k，anchor＝15”。然后，基于已识别的锚点，使用具有以下参数的“IntegrateData”函数对数据集进行集成：“dims＝1:30，k.weight＝50”。在组合数据集上应用缩放和PCA，并使用集成的PCA坐标作为聚类和t-SNE可视化工作流程的输入，参数如下：“dims＝1:5’.关键标记通过“FeaturePlot”功能进行可视化。
功能富集分析
使用Metascape(http://metascape.org)对所选基因进行功能富集分析。牛的基因被映射到它们的人类直系同源物上，人类(智人)是分析的目标物种。使用基因组中的所有基因作为背景集，以基因本体论(GO)-生物过程(GO-BP)和Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes(KEGG)途径作为本体论来源，进行富集分析。最小计数≥3的术语，调整后的P<0.01和富集因子≥1.5被认为是显著的，并且相似的项被分组成簇。使用-log10(P值)柱状图描绘关键通路。
统计分析
对于图2中C-H、图5中B、图5中D中的RT–qPCR数据进行双因素方差分析，并对图2中B、1中D和1中E中的数据进行分析。图2中B、2中D、2中E和图6中B采用Dunnett的多重比较检验。图2中C、2中F-2中H用Bonferroni的多重比较检验。图2中D和2中E使用Tukey多重比较检验来比较细胞群体倍增时间和单细胞克隆效率。
表3关键资源表
挑选克隆步骤：
在干细胞建系过程中，胚胎细胞的贴壁生长特性是关键环节之一。然而，除了上胚层细胞能够正常贴壁生长外，下胚层细胞和滋养外胚层细胞等其他胚层细胞也可能发生贴壁，这会对干细胞克隆的纯度和质量产生不利影响。因此，挑选具有典型穹顶状形态的克隆是确保干细胞系建成功的关键步骤。为此，我们制定了以下克隆筛选标准：
1.克隆必须呈现立体的穹顶状结构，这是典型胚胎干细胞克隆的标志性形态。
2.克隆应具有清晰且明确的边界，以便于区分和挑选。
3.在生长过程中，克隆中心位置不应出现凹陷，且整体不应呈现单层贴壁状，以确保克隆的三维结构得以保持。
4.对于扁平且非单层的克隆，可以进行整体消化后传代培养，以观察继代细胞中是否能够形成穹顶状克隆。通常情况下，经过1-2轮筛选后，克隆将呈现出均一的穹顶状形态，并且克隆的生长速率和大小也将趋于一致。此时，可以认为干细胞建系已经成功。通过严格遵循这些筛选标准，可以有效提高干细胞建系的成功率，并确保所建立的干细胞系具有良好的纯度和稳定性。
不同时期胚胎建系方法优化：
对于E6-8天的胚胎，以E7胚胎为例，采用全胚接种的方式，在接种时，需要使用玻璃针将胚胎分裂，并使内细胞团暴露于饲养层细胞上，便于上胚层干细胞的贴壁生长。
对于E9-E14胚胎，需要在接种前将胚胎的胚盘分离出来，再将胚盘通过酶解法消化为细胞团，将细胞团接种至饲养层细胞上。
实施例1、牛外胚层干细胞(Bovine epiblast stem cells，bEpiSCs)的建立和特点
1、如图1中A所示，通过机械分离方法从不同发育阶段的牛胚胎(包括E7、E10、E12和E14)中剥离外胚层(Epiblast isolation)，用TrypLETMExpress(Gibco，12605010)处理3分钟，然后接种到补充有3i/LAF培养基的饲养细胞(小鼠胎儿成纤维细胞)上。培养物在37℃下在含有5％的O2和5％的CO2环境下孵育。使用Accutase细胞解离试剂(Gibco，A11105-01)消化收集球形生长物并以1:4的比例每3天传代一次，传代后得到最初的球形生长物(也叫outgrowth，为胚胎细胞贴壁后形成的初级克隆)，分别将outgrowth传代培养成功后，获得E7bEpiSCs细胞系(本申请中又称作E7bEpiSCs系或E7bEpiSCs)、E10bEpiSCs细胞系(本申请中又称作E10bEpiSCs系或E10bEpiSCs)、E12bEpiSCs细胞系(本申请中又称作E12bEpiSCs系或E12bEpiSCs)和E14bEpiSCs细胞系(本申请中又称作E14bEpiSCs系或E14bEpiSCs)(细胞系指的是能够传代并具有一定数量及稳定性的细胞系，bEpiSCs指牛外胚层干细胞)。
2、对不同发育阶段的胚胎进行建系效率统计，统计结果如下表(图2中B)所示。
表1
牛胚胎发育阶段 胚胎数量 原代衍生物比例 细胞系
E7 20 6/20 2
E10 4 4/4 4
E12 3 3/3 3
E14 3 3/3 3
3、对牛外胚层干细胞(bEpiSCs)进行选择和传代培养：
分别将上述bEpiSCs(E7bEpiSCs、E10bEpiSCs、E12bEpiSCs、E14bEpiSCs)在丝裂霉素C(Selleckchem,S8146)处理的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞(5×104细胞/cm2)上培养。每12h更换一次新鲜的3i/LAF培养基。要使bEpiSCs保持未分化状态，以下三点很重要：(a)新制备的3i/LAF培养基应在4℃下保存不超过一周，不应冷冻；(b)传代密度必须合适：bEpiSCs的播种密度约为3-5×104cells/cm2；(c)必须保证新鲜的饲养细胞和适当的密度(3-4×104cells/cm2)。用Accutase细胞分离试剂(Gibco,A11105-01)每2-3天传代一次bEpiSCs，传代比例为1:3-1:5。具体的通行天数和比例应根据实际情况进行调整。
当传代培养至图1中C下半图的传代时间后，将细胞放置在显微镜下进行观察，观察结果如图1中C(outgrowth为胚胎细胞贴壁后形成的初级克隆，bEpiSCs-P19\P14\P11\P15中的19\14\11\15指的是传代次数(P＝passages))所示，可以看出所有bEpiSCs系均呈现圆顶形态。
4、对不同发育阶段胚胎来源的bEpiSCs的细胞增殖能力和单细胞集落形成效率进行分析：
doubleing time(细胞倍增时间)：
分别将上述bEpiSCs(E7bEpiSCs、E10bEpiSCs、E12bEpiSCs、E14bEpiSCs)以3×105的细胞密度在12孔板上播种，绘制出bEpiSCs的生长曲线。随后使用LunaTM自动细胞计数仪每隔12小时、24小时、36小时、48小时和60小时对细胞进行消化和计数。每个时间点进行3次重复。倍增时间计算公式如下：倍增时间(DT)＝12×[lg2/(lgNt-lgN0)]，其中12为细胞培养时间(小时)；Nt为48h培养的细胞数；N0为36h时记录的细胞数。结果如图1中D所示。
单细胞集落形成效率：
分别将上述bEpiSCs用TrypLETMExpress(Gibco,12,605,010)消化，并通过40μm细胞过滤器过滤。细胞分别接种于100、500和1000个细胞的6孔板中。培养3d后，计数形成的菌落数，计算单细胞菌落形成率并取平均值。结果如图1中E所示。
结果如图1中D和E(图中，bEpiSCs-PX中的X指的是传代次数(P＝passages))所示，可以看出，不同胚胎外胚层来源的bEpiSCs的细胞增殖能力没有显着差异，倍增时间为12小时，单细胞集落形成效率约为23％，表明不同胚胎外胚层来源的细胞系具有很好的一致性。
5、鉴于E10EPI是多能性形成的关键阶段，选择E10bEpiSCs进行多能性测定，具体地，使用碱性磷酸酶检测试剂盒(Millipore，SCR004)对E10bEpiSCs进行染色，染色结果如图1中F所示，在集落中观察到碱性磷酸酶染色呈阳性，阳性结果证明其具有多能性。
对E10bEpiSCs进行核型分析：
将1％KaryoMAX Colcemid溶液(Gibco，15212012)加入bEpiSCs培养基中并孵育1小时。然后使用TrypLETMExpress(Gibco，12605010)将bEpiSCs解离成单细胞，并通过离心收集。随后，将bEpiSCs悬浮在0.075M KCl(Sigma，P5405)的低渗溶液中，并在37℃下孵育15分钟。在该步骤之后，用甲醇和乙酸以3:1的比例固定bEpiSCs；这个过程重复三次。将得到的bEpiSCs悬浮液滴到预冷的载玻片上，在室温下彻底干燥，并用10％Giemsa染色液(Sangon，E6073140001)染色30分钟。每个细胞系检测超过45个中期细胞。结果如图1中G所示，核型分析显示bEpiSCs的染色体计数正常为60，说明其具有牛这个物种正常染色体核型。
6、用DPBS洗涤细胞进行免疫荧光(IF)分析，然后在室温下在4％多聚甲醛(PFA)中固定30分钟。随后，用DPBS冲洗细胞，并用0.1％Triton X-100渗透20分钟。在另一轮DPBS洗涤后，在室温下用3％BSA封闭细胞1小时。一抗在4℃下孵育过夜，随后使用清洗液(含有0.1％Triton X-100和0.1％Tween 20的DPBS)洗涤三次。将二抗在室温下孵育1小时，然后使用相同的清洗液洗涤三次。最后，进行DAPI染色以可视化细胞核，实现直接观察和摄影(如图H-I)。结果如图1中H-I所示，可以看出，多能性分析证明POU5F1、NANOG和SOX2的高水平表达。此外，CDH1、SSEA1和SSEA4等多能性相关表面标记物也高度表达。
将E10bEpiSCs消化后，以每孔1×106个细胞的密度接种，并在35mm低附着板上MEF培养基中培养5-7天：DMEM(Gibco，11960-044)，添加10％FBS(Gibco、16000-044)、1％青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific,15140-122)和1％GlutaMAX(Thermo FisherScientific，35050-061)，在水平摇床上以70rpm的速度进行培养。随后，将拟胚体(EB)转移到12孔板中，并在相同的培养基中孵育一周，每天更换两次培养基，随后利用贴壁细胞进行免疫荧光染色，结果如图1中J所示，体外分化测定证实了E10bEpiSCs具有形成拟胚体并分化为三个胚层的能力。
消化后通过离心收集制备的1×107E10bEpiSCs，重悬于50μL BM中，随后皮下注射到BALB/c裸鼠的颈部。4-5周后，收集畸胎瘤并进行后续的H&E分析。结果如图1中K所示，体内畸胎瘤实验证实了这些细胞能够产生具有代表所有三个胚层的有组织结构的畸胎瘤。总之，E10bEpiSCs具有基本的PSCs特征。
实施例2、3i/LAF因子对于bEpiSCs的长期维持至关重要
CHIR99021(1μM,Selleckchem,S1263)、WH-4-023(1μM,Selleckchem,S7565)、重组人LIF(10ng/mL,PeproTech,300-05)、重组人Activin A(25ng/mL,PeproTech,120-14E)和重组人FGF-basic(154aa)(10ng/mL,PeproTech,100-18B)、IWR-1-endo(0.5μM,Selleckchem,S7086)。
为了探讨纳入3i/LAF培养系统的不同细胞因子和小分子抑制剂对bEpiSCs的多能性和自我更新能力的影响，我们进行了单因子缩减来评估这些分子的功能。使用3i/LAF培养的E10bEpiSCs作为对照组，我们将实施例1的E10bEpiSCs传代实验12小时后替换掉减因子培养基。在无因子的培养基中培养48小时并观察细胞形态和AP染色情况，结果如图2中A-B(-CHIR99021、-WH-4-023、-IWR-1-endo、-LIF(10ng/mL,PeproTech,300-05)、-Activin A和-FGF-basic分别为缺少对应因子)所示，可以看出，在来自IWR-1-endo(IWR)无因子组的E10bEpiSCs中观察到克隆明显变平、边界不清晰和分化。相比之下，来自FGF2无因子组的bEpiSCs克隆表现出明显较慢的增殖速率、较小的克隆体积和更严重的细胞凋亡。IWR和FGF2在E10bEpiSCs自我更新中的关键作用是显而易见的，证实了之前关于牛始发态(Primed)PSCs的报告。
通过比较3i/LAF和IWR/FGF2(I/F)(仅用添加IWR和FGF2)条件下培养的E10bEpiSCs的基因表达谱，我们发现仅使用I/F会导致多能性相关基因的下调和发育相关基因的上调(图2中C)。因此，IWR和FGF2的组合可以有效维持始发态(Primed)bESCs的多能性，但这种组合不足以维持E10bEpiSCs的多能性。
为了研究与WNT/β-catenin信号通路相关的三种小分子抑制剂在bEpiSCs多能性和自我更新中的功能，我们收集了用分别减去CHIR99021(CHIR)/IWR/WH4023(WH)(分别代表去掉CHIR99021、IWR-1-endo和WH-4-023因子)的第三代E10bEpiSCs，进行差异分析表达基因(differentially expressed gene，DEG)分析。分析表明，去除任何WNT相关小分子会导致bEpiSCs中核心多能性基因POU5F1、SOX2和NANOG表达异常，以及ZFP42、UTF1和TDGF1表达显着下降(图2中D)。此外，参与中胚层分化和胚胎原肠胚形成的基因上调，例如BMP4基因、CDH2基因、GATA6基因、WNT5A基因、LEF1基因和CTNNB1基因(图2中E)，表明在去除WNT相关小分子，直接或间接触发E10bEpiSCs的分化过程。
CHIR和IWR的组合被证明可以维持小鼠EpiSCs和人类ESCs的自我更新。我们按图5中A的浓度研究了CHIR与IWR浓度的不同比例对E10bEpiSCs多能性的影响。分别将3i/LAF培养基中的IWR和CHIR因子的浓度按图5中A所示的浓度(其中，C为CHIR，I为IWR；xC/yI中，x为CHIR的浓度，单位是μM，y为IWR的浓度，单位是μM)进行配置和分组，我们将实施例1的E10bEpiSCs传代实验12小时后替换掉减因子培养基。在无因子的培养基中培养48小时并对其进行克隆形态、AP染色和基因表达分析，结果表明，如图5中A和B所示，低浓度IWR(>0.5μM)的存在可以抵消高CHIR浓度(<5μM)对EpiSCs分化的促进作用。
使用上述方法，我们进一步通过图5中C和7中D中的浓度探讨是否存在一个IWP2或XAV939的浓度范围能够代替3i/LAF培养基中的IWR，研究了IWP2和XAV939(IWR的替代因子)对E10bEpiSCs形态和多能性维持的影响，发现1-2.5μMXAV939的浓度范围可用于有效替代IWR(图5中C和7中D，图5中D，3i/LAF为3i/LAF培养基，xIWP2和yXAV939中的x和y分别代表浓度，单位为μM)。
分别将3i/LAF培养基中的FGF2、Activin A和LIF因子的浓度按图2中F、G和H所示的浓度进行配置和分组，我们将实施例1的E10bEpiSCs传代实验12小时后替换掉减因子培养基，在无因子的培养基中培养48小时并查了FGF2、激活素A和LIF对bEpiSCs多能性的影响，发现FGF2的耗竭导致核心多能性调节网络的失调和bEpiSCs的多谱系分化(图2中F，-FGF2、-Action A和-LIF分别代表减去相应小分子，其余浓度不变)。去除激活素A导致POU5F1和NANOG表达显着降低，而中内胚层相关基因(例如BMP2基因、BMP4基因和IDs基因)的表达显着增加(图2中G)，-FGF2、-Action A和-LIF分别代表减去相应小分子，其余浓度不变。JAK/STAT3信号通路的激活对于维持干细胞多能性至关重要38。然而，核心JAK/STAT3信号基因STAT3的表达下调，中内胚层相关基因GATA6表达上调(图2中H，-FGF2、-Action A和-LIF分别代表减去相应小分子，其余浓度不变)，表明LIF补充是有益的。总之，我们的研究表明，3i/LAF培养系统有效维持bEpiSCs多能性，同时强调所有因素对自我更新能力的积极影响。
实施例3、bEpiSCs的转录组分析
牛胚胎的单细胞转录组特征可作为评估牛胚胎干细胞多能性状态的明确基准。为了进一步评估bEpiSCs的基因表达特征和多能性状态：
我们首先将不同阶段的牛胚胎获得的bEpiSCs的单细胞转录组数据与牛胚胎谱系的单细胞转录组数据进行了比较(表2)。PCA显示bEpiSCs的发育和多能性特征与E10-E12外胚层的发育和多能性特征密切相关(图3中A)。斯皮尔曼相关分析显示，E7和E10bEpiSCs与E10外胚层表现出更强的相关性，而E12和E14bEpiSCs与E12外胚层表现出更高的相关性(图3中B)。我们进一步将不同胚胎阶段分离的bEpiSCs与牛胚胎谱系的单细胞进行比较。在多能性方面，我们观察到bEpiSCs中幼稚多能性相关基因的下调。相反，发现形成多能性相关基因在bEpiSCs中上调。此外，bEpiSCs中引发的多能性相关基因的表达水平较低(图3中C)，表明bEpiSCs表现出中间态(Formative)多能性的特征。
接下来，我们对本研究中建立的E10bEpiSCs和之前报道的牛PSCs之间的大量RNA转录组进行了比较分析，包括始发态(Primed)的bESCs15、bEDSCs16、bEPSCs和biPSCs18。PCA分析揭示了Dim2水平的多能性差异，表明bEpiSCs与bEDSCs表现出更大程度的相似性(图3中D)。
为了区分bEpiSCS和其他牛PSC，我们进行了比较分析以确定bEpiSCs的独特特征。
与始发态(Primed)的bESCs相比，E10bEpiSCs的NANOG、LEFTY2、NODAL基因与其他与多能性调节相关的干细胞标记物表达水平更高(FGF4基因、ZFP42基因、ETV3L基因、DPPA3基因、ACVRL1基因、TDGF1基因和TBX3基因)。进一步，其GATA3基因、PAX6基因、TGFB2基因、PAX2基因、FGFR4基因、LMO1基因、MEIS2基因、ID2基因、HES1基因基因表达水平更低。
此外，与bEDSCs相比，E10bEpiSCs参与干细胞增殖(ELL3基因和FGF4基因)以及细胞间粘附调节(NODAL基因、FOXA2基因和EPCAM基因)的基因表达上调；而且，DPPA3基因、LMO1基因、ACVRL1基因和WNT3A基因表达水平更高。进一步，其HAND1基因、GATA3基因、TGFB2基因、ZFP42基因、VMO1基因、MEIS2基因、BMP4基因、IGF1R基因、CCND2基因和SPRY4基因基因表达水平更低。
此外，与biPSCs相比，E10bEpiSCs表现出更高的LIN28A/B基因、NODAL基因、LIFR基因、IL6R基因、PDGFRA基因、ACVR1B基因、ETS1基因、IL6ST基因、SALL4基因表达水平。进一步，其GDF15基因、BCL3基因、CD44基因、ETV2基因、FGFR4基因、KLF15基因、GDF1基因、BMP4基因、COX17基因、MYC基因表达水平更低。
此外，与bEPSCs相比，E10bEpiSCs表现出更高的LIN28A/B基因、NODAL基因、LIFR基因、ESRRB基因、IL6R基因、ACVR1B基因、KLF5基因、SALL4基因、CDH1基因表达水平。进一步，其MSC基因、GCK基因、TGFB2基因、MAPK15基因、KLF15基因、GDF1基因、ID4基因、FOS基因、COX17基因表达水平更低。
此外，与biPSCs或bEPSCs相比，E10bEpiSCs表现出更高的LIN28A/B基因和NODAL基因表达水平，这两者都因其对细胞分化的抑制作用以及IL6R参与PI3K-Akt信号通路而闻名(图3中E和3中F；图6中A)。
为了研究bEpiSCs和猪pgEpiSCs之间的异同，我们在体RNA水平上对这两种细胞类型的基因表达进行了比较分析。对差异表达基因(DEGs)的分析显示，牛和猪的EpiSCs在多能性维持(例如POU5F1基因、NANOG基因、LIN28B基因)或胚层分化(例如BMP4基因、EOMES基因、NODAL基因)方面没有显着差异(图6中B)。然而，仅在离子转运(ATOX1基因、ATP4A基因和GCK基因)和细胞激活(GLI3基因、IRF1基因和EZH2基因)方面观察到变化(图6中C)。这些发现表明，牛和猪的EpiSCs在维持3i/LAF系统中的多能特性方面具有相似的调控网络。
总之，我们成功建立了牛中间态(Formative)EpiSCs，其表现出与其他已发表的牛PSCs不同的基因表达特征。
表2
实施例4、bEpiSCs的潜在应用
本实施例还评估了bEpiSCs用于肌源性分化和作为体细胞核移植(SCNT)供体细胞的潜力(图4中A)。
具体地，成肌分化基础培养基(MDBM)由DMEM/F12、1％非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、1％青霉素-链霉素、15％KOSR和200μM抗坏血酸组成。
在第一阶段中，E10bEpiSCs被分离成小块，并在添加1％B27补充剂、3μMCHIR99021和2μM SB431542(Selleckchem,S1067)的MDBM中培养3天。
在第二阶段，从第4天到第6天，将培养基更换为含有3μM CHIR99021、2μMSB431542、500nm LDN193189(Stemgent,04-0074)和20ng/mL重组人FGF-basic(154a.a.)的组合的培养基。
对于第三阶段，用10ng/mL HGF(Peprotech,100-39H)、10ng/mL IGF-1(Peprotech,100-11)、20ng/mL重组人FGF-basic(154a.a.)和0.5μM LDN193189替换培养液培养2天。
在第四阶段中，bEpiSCs开始分化为肌前体细胞。bEpiSCs-MPCs用浓度为10ng/mL的IGF-1处理4天，
在第五阶段，则使用10ng/mL HGF和10ng/mL IGF-1的组合物处理20至25天以促进骨骼肌成熟。对于骨骼肌成熟过程，用由DMEM/F12组成的N2培养基处理细胞，N2培养基由DMEM/F12添加15％KOSR、1％N2补充物、1％青霉素-链霉素和1％非必需氨基酸组成，最终获得bEpiSCs衍生的分化肌肉细胞。
1、各个阶段的细胞观察结果如图4中B(stage1-5分别代表上述一至五阶段)所示，可以看出细胞逐渐由干细胞克隆形态向中胚层然后向肌肉细胞样细胞分化的过程。
2、使用RNA prep Pure Cell/Bacteria试剂盒(TIANGEN，DP430)分别从bEpiSCs和bEpiSCs衍生的分化肌肉细胞(五阶段的bEpiSCs)中提取总RNA，然后使用5×All-In-OneRT Master Mix(Abm，G490)反转录为cDNA。随后，用2×RealStar Green Power Mixture(GenStar，A311-05)在Archimed Real Time System(ROCGENE)上进行PCR扩增。使用对比CT(2-ΔΔCT)方法对数据进行分析。利用GAPDH作为内参，计算ΔCT值。所有实验均进行了三次独立的生物重复。qPCR分析显示bEpiSCs衍生的肌肉细胞(第5阶段)表达MYOG、MYMK、MYH3和MYH11(图4中C)。
3、进一步对bEpiSCs衍生的分化肌肉细胞进行免疫染色的实验：
用DPBS洗涤细胞进行免疫荧光(IF)分析，然后在室温下在4％多聚甲醛(PFA)中固定30分钟。随后，用DPBS冲洗细胞，并用0.1％Triton X-100渗透20分钟。在另一轮DPBS洗涤后，在室温下用3％BSA封闭细胞1小时。一抗在4℃下孵育过夜，随后使用清洗液(含有0.1％Triton X-100和0.1％Tween 20的DPBS)洗涤三次。将二抗在室温下孵育1小时，然后使用相同的清洗液洗涤三次。最后，进行DAPI染色以可视化细胞核，实现直接观察和摄影。
使用特异性MYOSIN抗体和FACTIN抗体免疫染色证明了bEpiSCs衍生的分化肌肉细胞中MYOSIN和FACTIN的表达，表明初始肌肉分化成功(图4中D)。
4、作为基因组编辑动物克隆的供体细胞
载体构建
GFP质粒保存于实验室。总之，我们通过修饰PB-CAG-MCS载体(由吴森教授提供)，生成了产生了PB-CMV-EF1A-GFP-NLS质粒(公开于：“Elucidation of the pluripotentpotential of bovine embryonic lineages facilitates the establishment offormative stem cell lines”文献中，文献中的名称为PB-CMV-EF1A-GFP-NLS)。具体而言，我们用人延伸因子1α(EF1A)启动子取代了鸡β-肌动蛋白启动子，并在EF1A启动子下游整合了GFP-NLS。
bEpiSCs转染
使用LipofectamineTM3000试剂(Invitrogen，L3000008)将PB-CMV-EF1A-GFP-NLS质粒转染E10bEpiSCs：
在24孔板中E10bEpiSCs传代16小时后进行转染，首先，在离心管中加入25μLOpti-MEMTM培养基，然后加入0.75μL LipofectamineTM3000试剂并充分混合。然后，取另一个离心管，加入25μL Opti-MEMTM培养基，加入0.5μg PB-CMV-EF1A-GFP-NLS质粒和1μLP3000TM试剂，充分混合。然后将PB-CMV-EF1A-GFP-NLS质粒混合物与LipofectamineTM试剂以1:1的比例混合，孵育10-15分钟，然后加入细胞进行培养。获得PB-CMV-EF1A-GFP-NLS质粒的E10bEpiSCs。
bEpiSCs克隆胚胎的产生：
从北京周边的牛场获得卵巢，提取3-8mm卵泡中的卵母细胞。将具有三层卵丘细胞的卵母细胞转移到成熟培养基中，并在38.5℃和5％CO2下成熟18小时。成熟培养基以TCM199(Gibco，12340-030)为基础，添加10％FBS(Gibco、16000-044)、0.01IU/mL促卵泡激素(FSH、Sigma、F4021)、0.01IU/mL促黄体生成素(LH、Sigma，L6420)、1μg/mL雌二醇(Sigma，E2257)。卵母细胞成熟18小时后，使用0.1％透明质酸酶(Sigma，H4272)去除多余的卵丘，将带极体的卵母细胞置于含有7.5μg/mL细胞松弛素(Sigma、C6762)的HM培养基中10分钟，然后转移到含有10％FBS的HM培养液中进行去核。将去核的卵母细胞转移到成熟培养基中，直到注射细胞核。bEpiSCs在含有10ng/mL BMP4(PeproTech，315-27)、5μM SB431542和10ng/mL FGF2的基础培养基中分化1周以上，然后作为供体细胞进行核移植。选择透明的圆形供体细胞，并将其注射到卵周间隙，使细胞尽可能靠近细胞质，以提高融合效率。将重建的胚胎放置在融合细胞的两个电极之间，并与微针对准，使得体细胞朝向两个电极中的一个。融合条件为：双直流脉冲2.5kV/cm，10μs，间隔1s；融合液为0.3mmol/L甘露醇(Sigma，1375105)、0.15mmol/LCaCl2(Sigma，C7902)和0.15mmol/L MgCl2(Sigma，M2393)。在体式显微镜下检测融合率。然后将重组胚胎转移到含有5μM ionomycin(Sigma，407950)的IVC培养基中培养4分钟，然后转移到含有2mM 6-DMAP(Sigma，D2629)的IVC培养基中培养4小时。将活化的胚胎在IVC培养基中洗涤三次，并转移到IVC培养基中进行培养。
胚胎移植及冲胚具体操作步骤：
1受体牛移植操作步骤
1.1受体牛实行第1-2尾椎间硬膜外麻醉，擦拭外阴部。
1.2重新将胚胎装入0.25mL塑料细管，细管装入移植枪。把装有细管的移植枪套上硬外套，用塑料环卡紧，再套上软外套。
1.3将胚胎移植到受体有黄体一侧子宫角的上1/3～1/2处。
2非手术冲胚
2.1非手术冲胚所需主要器材
实体显微镜：1-2台、冲胚管(二路式)：经产牛用20#冲胚管，育成牛用18#冲胚管、冲胚管内芯：长度为64cm、子宫颈扩张棒、50mL注射器：9-10个、20mL注射器：2个、10mL注射器：2个、5mL注射器：2个、集卵漏斗：1个、Φ90mm培养皿：2个/头，每个培养皿外底部划1cm2方格、剪毛剪。
2.2非手术冲胚所需药品
杜氏磷酸缓冲液(PBS)、酒精、碘酊、新洁尔灭、生理盐水、2％利多卡因、0.9％生理盐水、土霉素。
2.3非手术冲胚技术步骤
将供体牛保定在六柱栏中，用2％利多卡因在荐椎和第一尾椎结合处或第二尾椎结合处实行尾椎膜外麻醉，直至尾部无知觉。利多卡因用量约5-10mL/头。
用扩宫棒扩张子宫颈，然后把带内芯的冲胚管慢慢插入子宫角，当冲胚管到达子宫角弯曲处，拔出内芯5cm，左右，再把冲胚管往子宫角前端送。当内芯再次到达子宫角弯曲处时，再向外拔出内芯5～10cm，直到冲胚管到达子宫角前端为止。
给冲胚管气囊充气约8～12mL，抽出冲胚管内芯，连接冲胚管与50mL注射器之间的接口。
将8个50mL注射器编号1～8，每个注射器吸取50mL冲胚液，每次将一管冲胚液从冲胚管注入子宫角，然后将所有回收液吸回原注射器，每个子宫角反复4次，用200mL冲胚液。
用一个50mL注射器吸取50mL冲胚液，把8个冲胚用的50mL注射器中的回收液在室温下(18℃～22℃)注入集卵漏斗中过滤，当集卵漏斗内剩下约20mL回收液时，摇动集卵漏斗将其倒入Φ90mm培养皿内。用PBS液冲洗集卵漏斗壁和底直至没有粘液为止。上述培养皿待镜检。
我们将PB-CMV-EF1A-GFP-NLS质粒转入bEpiSCs细胞中获得GFP-bEpiSCs细胞。
受体牛移植操作步骤：
受体牛实行第1-2尾椎间硬膜外麻醉，擦拭外阴部。
GFP-bEpiSCs细胞装入0.25mL塑料细管，细管装入移植枪。把装有细管的移植枪套上硬外套，用塑料环卡紧，再套上软外套。
将胚胎移植到受体有黄体一侧子宫角的上1/3-1/2处。
结果表明，牛bEpiSCs形成的PGCLCs拟胚体形态如图4中E所示，牛bEpiSCs形成的PGCLCs基因表达情况4中F所示，与bEpiSCs相比，PGCLCs的TFAP2C基因和PRDM1基因表达量明显升高。我们通过转染生成了GFP-bEpiSCs(图4中G)，将其用作胚胎克隆的供体细胞，并获得了GFP-bEpiSCs克隆的囊胚(图4中H)。bEpiSCss的囊胚形成效率与成纤维细胞克隆相当，均达到约30％(图4中I)。使用GFP-bEpiSCs克隆胚胎可以有效地从头建立bEpiSCs(图4中J)。这些发现表明bEpiSCs在细胞培养肉类生产、基因编辑和动物育种方面具有潜在应用。
在这项研究中，我们利用单细胞转录组测序，对牛早期胚胎关键发育阶段的基因表达模式进行了全面分析。我们的研究结果揭示了牛胚胎早期外胚层发育过程中发生了从原始态(naive)到中间态(Formative)再到始发态(Primed)的转变。具体来说，我们观察到LIF/STAT3信号相关基因在初始EPI阶段下调，而WNT/β-catenin信号相关基因在从中间态(Formative)到始发态(Primed)EPI的过渡过程中上调。这些结果进一步强调了偶蹄类(牛和猪之间)胚胎发育的进化保守性和多能性的调节。利用优化的3i/LAF培养系统，我们基于在猪和牛中观察到的保守的早期胚胎发育，成功建立了牛外胚层干细胞(bEpiSCss)。这些细胞表现出长期稳定性，保持正常的核型，表现出形成性外胚层的特征，表达多能标记基因，具有体外和体内三个胚层发育的能力，并表现出典型的干细胞多能性。
本研究中在3i/LAF条件下培养的bEpiSCs表现出形成多能性的特征。从培养系统的角度来看，FGF2和WNT抑制剂都广泛应用于除bEPSCs之外的bPSCs的培养中(其中FGF2对于bEPSCs的自我更新不是必需的)。本研究中使用的3i/LAF培养系统显示出对牛形成PSCs的多能性和自我更新的有效用途。我们的研究结果表明，任何小分子或细胞因子的去除都不利于bEpiSCs多能性的维持，这凸显了3i/LAF对于保留bEpiSCs多能性的适用性。有趣的是，bEpiSCs可以源自更广泛的胚胎阶段(E7-E14)，通过细胞集落选择来解决不同发育阶段胚胎盘固有的异质性。此外，bEpiSCs中NODAL表达的转录水平相对高于之前报道的bPSCs中观察到的转录水平，可以作为原肠胚形成前外胚层的标记，并在中胚层和内胚层形成中发挥关键作用，表明bEpiSCs和中间态(Formative)外胚层细胞之间的相似性。
值得注意的是，牛bEpiSCs和猪pgEpiSCs显示出非常相似的克隆形态、多能性特征和转录组特征。这项全面的研究增强了我们对牲畜物种胚胎多能性动态的共性和区别的理解。此外，bEpiSCs表现出强大的生肌分化潜力，从而为推进细胞培养肉生产提供了一条新途径。此外，bEpiSCs可以作为基因组编辑克隆胚胎的供体细胞，为干细胞育种和基因组编辑技术的后续发展带来创新前景。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
参考文献：
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Claims (12)

1.一种牛外胚层干细胞系，其特征在于，所述牛外胚层干细胞系具有牛外胚层干细胞的多能性，并且表达一种或多种多能性标记物，其中所述多能性标记物选自POU5F1、NANOG、SOX2、CDH1、SSEA1和SSEA4中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的牛外胚干细胞系，其特征在于，所述牛外胚层干细胞具有中间态多能性且系能够稳定遗传至少10次、20次、30次、40次、50次、60次、70次、80次、90次、100次、200次或更多次；
优选的，所述牛外胚层干细胞系来源于牛胚胎E7-E14的外胚层；
优选的，所述牛外胚层干细胞系来源于牛胚胎E10-E12的外胚层；
优选的，所述所述牛外胚层干细胞系来源于牛胚胎E10的外胚层；
优选的，所述牛胚胎E7-E14属于EPI谱系。
3.根据权利要求1所述的牛外胚层干细胞系，其特征在于，与始发态(Primed)的bESCs相比，所述牛外胚层干细胞系高表达NANOG、LEFTY2和NODAL基因中的一种或多种；
优选的，与始发态(Primed)的bEDSCs相比，所述牛外胚层干细胞系低表达GATA3、PAX6、TGFB2、PAX2、FGFR4、LMO1、MEIS2、ID2、HES1基因中的一种或多种；
优选的，与始发态(Primed)的bESCs相比，所述牛外胚层干细胞系高表达FGF4基因、ZFP42基因、ETV3L基因、DPPA3基因、ACVRL1基因、TDGF1基因和TBX3基因中的一种或多种；
优选的，与始发态(Primed)的bEDSCs相比，所述牛外胚层干细胞系低表达GATA3、PAX6、TGFB2、PAX2、FGFR4、LMO1、MEIS2、ID2、HES1基因中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的牛外胚层干细胞系，其特征在于，与bEDSCs相比，所述牛外胚层干细胞系的参与干细胞增殖以及细胞间粘附调节的基因表达上调；
优选地，所述干细胞增殖的基因包括ELL3和/或FGF4；
优选地，所述细胞间粘附调节的基因包括NODAL、FOXA2和EPCAM中的一种或多种；
优选的，与bEDSCs相比，所述牛外胚层干细胞系还高表达DPPA3、LMO1、ACVRL1和WNT3A基因中的一种或多种；
优选的，与bEDSCs相比，所述牛外胚层干细胞系还低表达HAND1、GATA3、TGFB2、ZFP42、VMO1、MEIS2、BMP4、IGF1R、CCND2和SPRY4基因中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的牛外胚层干细胞系，其特征在于，所述牛外胚层干细胞系与biPSCs或bEPSCs相比，所述牛外胚层干细胞系表现出更高的LIN28A/B和/或NODAL表达水平；
优选的，与biPSCs相比，所述牛外胚层干细胞系还高表达NODAL、LIFR、IL6R、PDGFRA、ACVR1B、ETS1、IL6ST、SALL4基因中的一种或多种；
优选的，与biPSCs相比，所述牛外胚层干细胞系还低表达GDF15、BCL3、CD44、ETV2、FGFR4、KLF15、GDF1、BMP4、COX17和MYC基因中的一种或多种；
优选的，与bEPSCs相比，所述牛外胚层干细胞系还高表达LIFR、ESRRB、IL6R、ACVR1B、KLF5、SALL4、CDH1基因中的一种或多种；
优选的，与bEPSCs相比，所述牛外胚层干细胞系还低表达MSC、GCK、TGFB2、MAPK15、KLF15、GDF1、ID4、FOS、COX17基因一种或多种。
6.根据权利要求1所述的牛外胚层干细胞系，其特征在于，所述牛外胚层干细胞系依赖FGF/ERK和/或TGFβ/SMADs信号通路的激活以及WNT/β-catenin信号通路的抑制；
优选的，所述FGF/ERK信号通路相关基因包括MAPK1、MAPK14、FGF2、PDGFA、FGFR1和FGFR2中的一种或多种；
优选的，所述TGFβ/SMADs信号通路相关基因包括INHBA、NODAL、ACVR2A/2B、BMP4和BMPR1A/1B中的一种或多种；
优选的，所述WNT/β-catenin信号通路相关基因包括TCF7、APC、WNT11、CTNNB1、FZD2和WNT3A中的一种或多种。
7.一种用于培养牛外胚层干细胞系的培养基，其特征在于，所述培养基包括基础培养基和添加组分；
优选的，所述基础培养基包括DMEM/F12培养基和/或Neurobasal培养基；
更优选的，所述DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基的质量比或体积比为1:1；
优选的，所述基础培养基中还包括选自由以下各项组成的组的一种或多种小分子抑制剂或细胞因子：CHIR99021、IWR-1-endo、WH-4-023、重组人LIF、重组人Activin A和重组人FGF-basic(154aa)、ROCK抑制剂Y-27632，或其任意组合。
8.一种牛外胚层干细胞系的体外制备方法，其特征在于，所述方法包括将从牛胚胎E10-E14中分离的一个或多个外胚层细胞在权利要求7所述的培养基中进行培养的步骤；
优选的，优选的，所述从牛胚胎E10-E14属于EPI谱系；
优选的，所述牛外胚层干细胞系来源于牛胚胎E10-E12的外胚层；
优选的，所述所述牛外胚层干细胞系来源于牛胚胎E10的外胚层。
9.权利要求1-6任一所述的牛外胚层干细胞系或权利要求8所述方法制备的牛外胚层干细胞系在诱导生成肌肉细胞或者提供核移植供体细胞或细胞核中的应用。
10.一种肌肉细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1-6任一所述的牛外胚层干细胞系或权利要求8所述方法制备的牛外胚层干细胞系在成肌培养基中培养，获得肌肉细胞的步骤。
11.一种牛原始生殖细胞样细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1-6任一所述的牛外胚层干细胞系或权利要求8所述方法制备的牛外胚层干细胞系在PGC诱导培养体系中培养，获得牛原始生殖细胞样细胞的步骤；
优选的，与所述牛外胚层干细胞系相比，牛原始生殖细胞样细胞高表达TFAP2C基因和PRDM1基因。
12.一种牛核移植方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1-6任一所述的牛外胚层干细胞系或权利要求8所述方法制备的牛外胚层干细胞系作为核移植供体细胞核或核移植供体细胞进行培养，获得牛细胞、组织、器官、完整个体的步骤。
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