CN120683060A - 一株大肠杆菌噬菌体pd2061、噬菌体组合物及其应用 - Google Patents

一株大肠杆菌噬菌体pd2061、噬菌体组合物及其应用

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Abstract

本发明属于噬菌体技术领域，公开了一株大肠杆菌噬菌体PD2061、噬菌体组合物及其应用，所述大肠杆菌噬菌体PD2061，其保藏编号为CGMCC NO.46163，于2024年8月16日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述大肠杆菌噬菌体PD2061不仅对大肠杆菌具有高裂解率，并且对沙门氏菌也具有一定的裂解性能，在防治大肠杆菌和沙门氏菌混合感染的疾病时具有更大的优势。可将该噬菌体用于制备治疗或预防动物源大肠杆菌病和/沙门氏菌病的药物制剂，提高患大肠杆菌病/沙门氏菌病或混合感染病的禽类存活率，提高饲料利用率，降低养殖中禽类只死淘率。

Description

一株大肠杆菌噬菌体PD2061、噬菌体组合物及其应用
技术领域
本发明涉及噬菌体技术领域，尤其涉及一株大肠杆菌噬菌体PD2061、噬菌体组合物及其应用。
背景技术
大肠杆菌属肠杆菌科，广泛分布于动物肠道、空气悬浮粒子、衣服表面、养殖场环境以及河流湖泊等，具有分布广等特点。近年来，随着鸡饲养规模的逐步扩大与饲养密集度的增加， 再加之部分鸡场存在管理水平低、环境卫生水平差以及诱发应激因素较多等问题，导致鸡大肠杆菌病的发生概率明显提升。
大肠杆菌既可以垂直传播，也可以水平传播，主要引起禽类的脐炎、卵黄吸收不全、心包炎、气囊炎、肝周炎、腹泻、败血症等，部分可引起关节炎、湿眼圈、皮下脓肿等。同时引起动物减食、不化料，饲料报酬降低，生产性能下降。
畜禽生产中通常使用抗生素对大肠杆菌病进行治疗，但是抗生素的不科学使用带来一系列问题，包括：多重耐药菌株的产生、肠道菌群平衡的破坏、动物免疫机能的降低以及抗生素剂量超标引起的动物中毒、环境污染、动物产品中抗生素残留等问题，因此，亟需寻找高效、安全、无残留的杀菌制剂以替代抗生素。
噬菌体是一种感染细菌、真菌等微生物的特异性高的病毒，作为一种天然的抗菌剂，噬菌体具有抗生素无法比拟的优势，且噬菌体用于临床治疗已有悠久的历史，取得了较好的效果，是一种有广阔前景的抗生素替代物。
而现有的大肠杆菌噬菌体基于其宿主的裂解特异性，其裂解谱具有一定的局限性，通常需要多株噬菌体组合使用以扩展裂解谱，因此，现有的大肠杆菌噬菌体资源有待进一步开发。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种大肠杆菌噬菌体PD2061、噬菌体组合物及其应用，所述大肠杆菌噬菌体PD2061的裂解谱宽，对大肠杆菌和沙门氏菌都具有一定的裂解性能，可用于制备治疗或预防鸡大肠杆菌病和/沙门氏菌病的药物制剂，提高鸡患大肠杆菌病/沙门氏菌病或混合感染病的存活率，该噬菌体还可与抗生素组合作为联合制剂用于上述病害的防治中。
为解决上述问题，本申请提供以下技术方案：
第一方面，本申请提供一株大肠杆菌（Escherichia coli bacteriophage）噬菌体PD2061，其保藏编号为CGMCC NO.46163，该噬菌体于2024年8月16日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.46163。
经电镜观察到，所述噬菌体PD2061具有呈多面体的头部结构和收缩性的尾部，头部宽60~65nm，长78~83nm，尾部长约90~93nm，根据病毒分类国际委员会(ICTV)的分类方法，本申请的该噬菌体PD2061的形态符合肌尾噬菌体科的特征，属于肌尾噬菌体。
所述大肠杆菌噬菌体PD2061的效价高，能够达到3×1011pfu/ml。
该噬菌体具有良好的耐高温属性，能够在棚舍等高温高湿环境下应用。
所述大肠杆菌噬菌体PD2061耐酸性能较好，经过胃酸时其效价损失较低，能过进入肠道充分发挥效果。实验证明，该噬菌体在pH4 .0～10 .0稳定，在pH 1.0与pH 13.0条件下作用3h，仍能检测到其效价。
所述大肠杆菌噬菌体PD2061对大肠杆菌具有广谱裂解性，对大肠杆菌的裂解率达到90.00%，此外，该噬菌体对沙门氏菌也具有一定的裂解性，其裂解率达到20%。因此，大肠杆菌噬菌体PD2061在防治大肠杆菌和沙门氏菌混合感染的疾病时是具有更大的优势的。
本申请中，噬菌体PD2061包括进行点突变或缺失突变或添加突变的同源性高于98%或99%且保持基本相同的杀菌活性的突变株。由于噬菌体在复制过程中非常容易发生突变，因此，噬菌体的上述突变体也在本申请请求保护的范围内。噬菌体PD2061的基因组序列可根据本发明保藏的生物材料通过公知的方法测序得到。对于本领域技术人员来说，根据本发明提供的噬菌体筛选出与其性状极度相似的突变体并不需要付出创造性的劳动。
第二方面，本申请还提供一种噬菌体组合物，其包括前述的大肠杆菌噬菌体PD2061。
在实际应用中，为了进一步拓宽噬菌体的裂解谱，充分发挥不同噬菌体的裂解谱的差异，进行优势互补，可将上述大肠杆菌噬菌体PD2061和其他噬菌体进行组合使用，如与同为大肠杆菌噬菌体的PD328（在公开号为CN115717126A的专利中公开，）、PD06和PD114（这两株噬菌体都在公告号为CN111349618B的专利中公开）中的一种或两种以上进行组合使用，用以扩大大肠杆菌的杀菌谱，尽可能杀灭环境中的所有大肠杆菌病原体，用于大肠杆菌病的防治。此外，也可将上述大肠杆菌噬菌体PD2061与其他不同种类的噬菌体（抑制引发同类疾病的不同病原菌，如现有的沙门氏菌噬菌体）配合，用于沙门氏菌病的防治，也可用于大肠杆菌和沙门氏菌联合感染病的防治。
第三方面，本申请还提供所述大肠杆菌噬菌体PD2061或前述的噬菌体组合物在制备防治大肠杆菌和/或沙门氏菌感染导致的疾病的药物中的应用。所述防治包括预防和治疗。本文中术语“预防”是指包括通过给予所述组合物来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文中术语“治疗”是指包括通过给予所述组合物而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。
可选地，所述大肠杆菌感染导致的疾病包括：由鸡源大肠杆菌引起的急性败血症、脐炎、气囊炎、卵黄性腹膜炎、输卵管炎等。
可选地，所述沙门氏菌感染导致的疾病包括：由鸡源大肠杆菌引起的鸡白痢、鸡伤寒、鸡副伤寒等。
大肠杆菌噬菌体PD2061或前述的噬菌体组合物在防治鸡源大肠杆菌和/或沙门氏菌感染导致的疾病的效果明显。
第四方面，本申请还提供一种噬菌体药物制剂，其有效成分包括前述的大肠杆菌噬菌体PD2061或前述的噬菌体组合物。
优选的，所述噬菌体药物制剂还包括其他抑菌或杀菌活性成分；所述药物制剂形式为口服给药剂型、外用剂型或肠外给药剂型。所述噬菌体药物制剂的应用方法为：将噬菌体或其组合物作为治疗药物添加到饮用水或饲料中，或对鸡灌服、皮下注射、肌肉注射，通过上述方式可预防及治疗大肠杆菌病，提高存活率等。
可选地，所述噬菌体药物制剂中还包含药学上可接受的载体。本文所使用的术语“药学上可接受的载体”指不对生物体造成显著刺激且不消除所给予的活性组分的生物活性和特性的载体或稀释剂。为了将所述药物组合物配制成液体制剂，药学上可接受的载体必须适于无菌和生物相容性。实例包括盐水、无菌水、Ringer’s溶液、缓冲生理盐水、白蛋白输注液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、各类的培养基等。它们可以单独使用或以其任意组合使用。根据需要，可以加入其它常规添加剂，例如，抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂等。当其与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂组合时，还可以将本发明的组合物制备成注射剂和口服剂型(例如，水性溶液、悬浮液和乳液、丸剂、胶囊、粒剂)和其他中间剂型，如冻干剂。
可选地，所述噬菌体药物制剂为粉剂，其还包含：作为保护剂的脱脂奶粉和乳糖。
可选地，噬菌体粉剂包括以下质量份数的各成分：脱脂奶粉、乳糖和噬菌体悬液。
所述噬菌体粉剂的制备方法为：将相应用用量的脱脂奶粉、乳糖和噬菌体悬液混合，进行喷雾干燥，从而得到噬菌体粉剂。
优选地，所述喷雾干燥条件为：入口温度为120℃，气流速度为120L/min，喷雾速率100％，喷头盖大小为4 .0μm，喷雾干燥1h左右。
第五方面，本申请还提供一种饲料添加剂，其包括前述的大肠杆菌噬菌体PD2061或前述的噬菌体组合物。优选地，噬菌体的浓度为1010PFU/mL以上。
通过将上述饮用水添加剂或者饲料添加剂加入水或与饲料混拌，对鸡群进行饲喂，从而对鸡场饮用水和饲料进行消毒杀菌，该噬菌体的耐酸性可在胃酸的环境中存活，有效进行大肠杆菌病的防治。
本申请还提供一种禽类饮用水添加剂，其包括前述的大肠杆菌噬菌体PD2061或前述的噬菌体组合物。优选地，噬菌体的浓度为1010PFU/mL以上。
所述饮用水添加剂、饲料添加剂的形式为液体剂型、粉末剂型或固体剂型，但不仅限于以上三种剂型。
第六方面，本申请还提供一种环境消毒剂，其有效成分包括前述的大肠杆菌噬菌体PD2061或前述的噬菌体组合物。
优选地，噬菌体的浓度为108PFU/mL以上。优选地，所述环境消毒剂还包含其他用于环境中细菌抑制或消灭的活性成分。
本申请还提供上述环境消毒剂在鸡场环境消毒中的应用，所述环境消毒剂的应用方法为：通过喷雾、浸泡对养殖环境、饲养器具进行大肠杆菌和/或沙门氏菌的消毒，所述养殖环境包括鸡舍、鸡笼、饮水器、食槽等饲喂工具、粪便和垫料。
所述应用方法包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对鸡场的配水系统、养殖业设施、饲养器具或其他环境表面进行消毒去污，并对饲料进行消毒防腐，所述环境消毒剂可用于代替抗生素或传统消毒产品发挥消毒效果，而且使用安全，其对人体及家禽不会造成损害。
第七方面，本申请还提供一种鸡肉消毒剂，其包括前述的大肠杆菌噬菌体PD2061或前述的噬菌体组合物。
所述鸡肉消毒剂可通过对屠宰场内处理完成后鸡肉生肉表面进行喷洒或浸泡，从而达到大肠杆菌和/沙门氏菌的杀菌。
此外，已经有研究表明，在抗生素与噬菌体联合应用时，这两者间具有协同作用（Phage–Antibiotic Synergy，PAS）：噬菌体与抗生素联合应用时可以通过某些机制，如某些抗生素可以引起细菌细胞伸长或丝状化，增强细菌对噬菌体裂解作用的敏感性，还可以增加噬菌斑大小，加速噬菌体扩增来增强噬菌体裂解能力；同时，噬菌体还可以增加细菌对某些抗生素的敏感程度，从而降低抗生素最小抑菌浓度（MIC），降低抗生素使用量。因此，开发抗生素与噬菌体联合制剂是具有市场应用价值的。
因此，第八方面，本申请还提供一种噬菌体抗生素联合制剂，其活性成分为前述的大肠杆菌噬菌体PD2061或前述的噬菌体组合物和抗生素的混合物；所述抗生素为复方磺胺嘧啶、硫酸庆大霉素、盐酸大观霉素、盐酸林可霉素中的任意一种或两种以上的组合。
实验证明，加入噬菌体PD2061后，复方磺胺嘧啶悬浊液的MIC值降低64倍，硫酸庆大霉素粉剂的MIC值降低32倍，盐酸大观霉素盐酸林可霉素混合粉剂的MIC值降低8倍。此外，在使用同一种抗生素治疗情况下，在加入噬菌体组与不加入噬菌体组对比，患大肠杆菌病的鸡群的死淘数有明显降低，证明噬菌体PD2061与抗生素联用比单一使用抗生素效果更好。
上述结果说明，噬菌体抗生素联合制剂的使用，不仅可大幅度地降低抗生素的用量、并且对禽类大肠杆菌病的防治效果更好。所述抗生素可选择不同剂型的抗生素直接与噬菌体进行混配或稀释后与噬菌体进行混配。
可选地，噬菌体抗生素联合制剂中，其活性成分为前述的大肠杆菌噬菌体PD2061或前述的噬菌体组合物和抗生素的混合物。稀释使用时，每1L水中，噬菌体PD2061的含量为1.0×107~108PFU，所述抗生物为复方磺胺嘧啶或硫酸钠庆大霉素或盐酸大观霉素和盐酸林可霉素混合物。
其中，每1L水中，复方磺胺嘧啶的含量为0.08~0.18g（或0.2~0.45ml复方磺胺嘧啶悬浊液(浓度为0.4g/ml)），硫酸钠庆大霉素的含量为0.1~0.15g（或2~3g硫酸钠庆大霉素可溶性粉（0.05g/g盐酸大观霉素盐酸林可霉素可溶性粉）），盐酸大观霉素和盐酸林可霉素的含量为：0.2~0.4g大观霉素，0.1~0.2g林可霉素（或0.5~1g盐酸大观霉素盐酸林可霉素可溶性粉（大观霉素0.4g/g，林可霉素0.2g/g））。
优选地，应用时，噬菌体PD2061的用量为1.0×108PFU/L，复方磺胺嘧啶的含量为0.08g/L（或0.2ml/L的复方磺胺嘧啶悬浊液(浓度为0.4g/ml)），硫酸钠庆大霉素的含量为0.1g/L（或2g/L硫酸钠庆大霉素可溶性粉（0.05g/g盐酸大观霉素盐酸林可霉素可溶性粉）），盐酸大观霉素和盐酸林可霉素的含量为：0.2g/L大观霉素，0.1g/L林可霉素（或0.5g盐酸大观霉素盐酸林可霉素可溶性粉（大观霉素0.4g/g，林可霉素0.2g/g））。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供一种宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体PD2061，其不仅对大肠杆菌具有高裂解率，并且还可裂解沙门氏菌，在防治大肠杆菌和沙门氏菌混合感染的疾病时具有更大的优势。可将该噬菌体用于制备治疗或预防鸡大肠杆菌病和/沙门氏菌病的药物制剂，提高鸡患大肠杆菌病/沙门氏菌病或混合感染病的存活率， 提高饲料利用率，降低养殖中鸡只死淘率。
该噬菌体可用作环境消毒剂、饲料添加剂、鸡肉生肉消毒剂的活性成分，在解决病原菌感染的同时，避免了由于使用抗生素带来的抗生素残留和病原菌耐药性的问题。
2、本发明涉及的上述噬菌体从自然界中获得，易于进行工业化生产，由上述噬菌体制备而来的药物或消毒剂不仅可降低成本，还具有绿色环保的优点，不会对环境中的有益菌造成危害。
3、本发明还提供一种噬菌体抗生素联合制剂，在有效降低抗生素在实际应用中的用量的同时，降低产量的生产成本，还提高对相应疾病的防治效果。
附图说明
图1为大肠杆菌噬菌体的噬菌斑图片；
图2为大肠杆菌噬菌体的电镜图片；
图3为大肠杆菌噬菌体的pH值稳定性的测试结果；
图4为大肠杆菌噬菌体的一步生长曲线；
图5为大肠杆菌噬菌体的温度稳定性的测试结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1 大肠杆菌噬菌体PD2061的分离纯化
1、实验方法
（1）宿主菌的复苏与培养
选取20株本实验室保存的大肠杆菌(JD1~JD20)，用灭菌的接种坏蘸取冻存液在MAC培养基上划线复苏，37℃恒温箱培养18~24h，得到单菌落；挑取单菌落接种于5mL的NB肉汤中，37℃、170rpm/min震荡培养16h，得到新鲜的大肠杆菌菌液。
（2）噬菌体的分离
取适量来自山东地区的鸡毛、粪水等样品于泡样瓶中，加入适量肉汤培养基中，加入增殖得到的20株大肠杆菌菌液，将混合液放入37℃、170 rpm/min震荡培养12h，11000rpm离心5min，然后用0.22 μm的无菌微孔滤膜滤过，得到噬菌体增殖液；将噬菌体原液通过10倍比稀释，取合适梯度噬菌体稀释液分别和20株大肠杆菌（JD1~JD20）逐一1:1混合均匀，37℃孵育5 min后，吸取200 μL混合液置于上层琼脂（琼脂浓度为0.7%）中，混匀后迅速倾倒下层琼脂（琼脂浓度为1.5%）平皿上，摇匀平置至培养基凝固，置于37℃培养箱倒置培养4~6h后，获得形成噬菌斑的双层平板。
（3）噬菌体的纯化
在形成噬菌斑的双层琼脂培养基挑取单个噬菌斑，并置于1mL的NB肉汤中于恒温摇床37℃，170 rpm培养约30min得到噬菌体浸出液。取噬菌体浸出液与对应成斑的大肠杆菌（后面称为宿主菌）增殖液1：1混合均匀（37℃孵育5min），吸取200 μL置于上层琼脂混匀后迅速倾倒下层琼脂平皿上，摇匀平置至培养基凝固，置于37℃培养箱倒置培养4~6 h后，再次获得形成噬菌斑的双层平板。在形成菌斑的双层培养基上用灭菌镊子挑取单个噬菌斑置于1mL的NB肉汤中，于恒温摇床37℃，170rpm培养约30min得到噬菌体浸出液。重复以上步骤3次，得到纯化后的噬菌体浸出液。
（4）噬菌体增殖与效价测定
取等量纯化后的噬菌体浸出液与宿主菌增殖液于5mL液体NB培养基中，37℃，170rpm振荡培养，直至液体变清亮，将清亮液体11000rpm离心10min，取上清，使用0 .22 μm的无菌微孔滤膜滤过，得到噬菌体增殖液，并采用双层平板法测定新分离的噬菌体效价。如图1所示，大肠杆菌噬菌体在双层琼脂培养基平板上形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰可见。
2、实验结果及分析
按照上述实验方法，使用20株大肠杆菌分离株筛选到12株大肠杆菌噬菌体，编号分别为PD2061-PD2070。这12株大肠杆菌噬菌体均在双层琼脂培养基平板上形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰可见，直径约0 .2mm～1 .0mm；效价在2.8×109PFU/mL-3.0×1011PFU/mL，结果如下表1所示。
表1新分离的12株大肠杆菌噬菌体效价(pfu/mL)
实施例2 大肠杆菌噬菌体PD2061的形态学观察和鉴定
1、实验方法：铜网制作与电镜观察：取20 µL噬菌体样本滴在带有碳涂布膜的铜网上，待其自然沉淀15 min，用滤纸稍吸干后，再用2 % (W/V)磷钨酸（PTA）染色1~2 min，滤纸稍吸干，待干燥后，采用透射电子显微镜下进行观察拍照。
2、鉴定结果
如图2所示，经电镜观察到，该噬菌体PD2061具有呈多面体的头部结构和收缩性的尾部，头部宽60~65nm，长78~83nm，尾部长约90~93nm，根据病毒分类国际委员会(ICTV)的分类方法，本申请的该噬菌体PD2061的形态符合肌尾噬菌体科的特征，属于肌尾噬菌体。
实施例3大肠杆菌噬菌体PD2061裂解谱的测定
1、实验材料
宿主菌：选择实施例1中的20株大肠杆菌临床分离株(JD1~JD20)以及实验室保存的60株不同动物来源的大肠杆菌，其中包括：鸡源大肠杆菌、鸭源大肠杆菌、鸽源大肠杆菌、鹅源大肠杆菌、猪源大肠杆菌、驴源大肠杆菌等宿主菌（具体见表2）。
2、实验方法：
选取实验室保存的从不同地区分离的不同来源的大肠杆菌80株致病菌株，通过双层平板法测定大肠杆菌噬菌体PD2061对上述80株大肠杆菌的裂解率。
3、实验结果及分析
从表2的裂解谱实验结果可知：
（1）大肠杆菌噬菌体PD2061能够裂解80株不同动物种源的大肠杆菌中的72株，裂解率高达90.00%，属于宽裂解谱噬菌体。
（2）大肠杆菌噬菌体PD2061对于不同动物种源的大肠杆菌均有较高的裂解率。其中，对鸡源的大肠杆菌的裂解率为90%（27/30），其他动物园大肠杆菌的裂解率也基本在90%。
表2大肠杆菌噬菌体PD2061对80株大肠杆菌裂解谱结果
实施例4噬菌体PD2061对沙门氏菌的裂解试验
1、实验方法
本实施例中，选取10株鸡源沙门氏菌沙门氏菌，按照实施例3中裂解谱的测定方法进行大肠杆菌噬菌体PD2061的裂解谱进行测定。
2、实验结果及分析
如表3结果所示，大肠杆菌噬菌体PD2061对这10株沙门氏菌裂解率为20%，该结果说明，噬菌体PD2061可以裂解部分沙门氏菌，对沙门氏菌防治能够起到一定作用，在大肠杆菌和沙门氏菌的混合感染中的防治中具有应用优势。
表3大肠杆菌噬菌体PD2061对10株沙门氏菌裂解谱结果
实施例5 大肠杆菌噬菌体PD2061对pH的耐受性
1、实验方法
取无菌试管中加入不同pH值(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的NB肉汤4.5mL，各三支为一份，共取两份，然后将试管置于37℃的水浴锅中，待温度稳定之后，加入500 μL的3×1011pfu/mL噬菌体PD2061增殖液，混匀37℃水浴作用1h、2h、3h。作用结束之后，立即向混合液中加入适量的1mol/L的HCl或者NaOH使混合液的pH值约为7，进行10倍比稀释，取合适稀释梯度测定效价，每个pH值试管设定3个重复。以pH值为横坐标，噬菌体效价的对数值为纵坐标绘制噬菌体pH值稳定性曲线。
2、实验结果及分析
从图3可知，在pH4 .0～10 .0范围内，噬菌体PD2061的效价无明显变化，说明该噬菌体能够耐受一定范围的酸碱环境；在pH 1.0与pH 13.0时作用3h，仍能检测到该噬菌体的效价，证明该噬菌体具有较强的耐酸碱属性，在一定时间内能够适应一定范围的强酸酸碱环境。此外，该噬菌体的耐酸性能好，经过胃酸时其效价损失较低，能过进入肠道充分发挥作用。
实施例6噬菌体的温度稳定性
1、实验方法：
将加有相同体积效价为3×1011pfu/mL 的噬菌体增殖液的各个容器分别置于60℃、70℃、80℃、90℃条件下，每一温度两个平行样，各保温10 min、20 min 和60 min后，待作用结束后取样，并立即将各个样品置于冰浴中冷却，再进行10倍比稀释，取合适稀释梯度测定其效价。以温度为横坐标，以噬菌体效价的对数值为纵坐标，绘制噬菌体的热稳定性曲线。
2、实验结果及分析：
如图5示，噬菌体在60℃作用60 min后基本上保持原活性；70℃作用60 min后，效价仍保持在1010pfu/mL以上；80℃作用60 min后，效价保持在105pfu/mL以上；90℃作用60min后仍能检测到效价保持一定的活性。由此可见噬菌体的热稳定性较高。
实施例6 大肠杆菌噬菌体PD2061的一步生长曲线
1、实验方法
将感染复数为0.001的噬菌体增殖液和宿主菌新鲜增殖液各1mL，充分混匀(此时开始计时) ，37℃孵育5min，13000rpm离心30s，用微量移液器尽量吸去上清，再用5 mL NB肉汤洗涤1次(13000rpm离心30s) ，弃上清。用预热的NB肉汤混悬沉淀(总体积为5mL)并充分混匀，迅速置于37℃摇床中170rpm振荡培养，在0时刻和每隔10min取出150 μL，10000rpm离心1min，
用NB肉汤做10倍倍比稀释后采用双层平板法测噬菌体效价，做3个平行，结果取平均值，以感染时间为横坐标，感染体系中噬菌体的滴度为纵坐标，绘制一步生长曲线，得到噬菌体的潜伏期、爆发期，计算出爆发量。
爆发量＝噬菌体爆发末期的总个数/爆发初期细菌的总个数
2、实验结果及分析
从图4的结果可知，噬菌体PD2061感染宿主菌后，噬菌体裂解周期时长约为80min，潜伏期约为10min，噬菌体的爆发期约为70min，80min后，噬菌体数量基本不变，进入稳定期，此时效价可达3×1011pfu/mL，噬菌体PD2061的爆发量为150。
实施例7大肠杆菌噬菌体PD2061对大肠杆菌最佳感染复数(MOI)的测定
1、实验方法
挑取单个大肠杆菌菌落接种于5ml NB肉汤培养基中，37℃，170rpm培养12～16h获得菌液。倾注法测定菌浓度，根据测定结果将菌液浓度调整1×109cfu/mL、1×108cfu/mL...1×105cfu/mL。将实施例1分离所得噬菌体浓度调整至1×105～1×107PFU/mL。按照表4的噬菌体数量与细菌数量比值将噬菌体和菌液加入NB培养基中，37℃，170rpm摇床中增殖，直至液体变清亮，记录增殖时间。取适量清亮液体11000rpm离心10min，取上清，使用0.22μm的无菌微孔滤膜滤过，双层平板法测定过滤液中噬菌体效价，噬菌体效价最高的MOI（噬菌体数量/细菌数量）即为该噬菌体的最佳感染复数。
2、实验结果
结果如表4所示，MOI在0.001:1时，PD2061效价达到最高，为3.0×1011PFU/mL，该结果说明，在生产时，噬菌体PD2061的初始投入量较少的情况下，就能达到最高的繁殖产量，有利于其规模化工业生产。
表4不同感染复数下大肠杆菌噬菌体PC817的效价
实施例8大肠杆菌噬菌体在环境消毒中的应用
1、实验方法
山东省滨州市某种肉鸡孵化场，孵化场检测出大量大肠杆菌，且使用化学消毒剂等杀菌效果不明显。本实验设计使用大肠杆菌噬菌体PD2061制备消毒剂对孵化车间进行喷雾消毒，用以测定其消毒效果。
所述噬菌体环境消毒剂的制备方法为：取噬菌体PD2061增殖液与水按1：1000倍稀释后使用，效价为1.0×107PFU/mL。同时，以苯扎溴铵消毒剂与水1:25稀释作为对照。
（1）空气消毒方法：
分别找两个同等大小的孵化车间采用自然沉降法对孵化车间前后的空气进行采样，以中央点及墙角4点共5点作为测试点，采样点距地面0 .3m，墙角四点离墙1m，每点放置9cm直径大小的XLD琼脂平板。消毒前每个采样点使用2个XLD琼脂平板，打开培养皿盖子，采样10min，使用鸡场自带的雾线进行消毒，设置实验组和对照组，实验组使用噬菌体环境消毒剂(10mL/m3)进行处理，对照组采用苯扎溴铵 (苯扎溴铵1:25稀释)这种消毒剂进行消毒。
消毒30min后，五个采样点再各放置2个XLD琼脂平板，打开培养皿盖子，采样10min。将消毒前后的采样培养皿放置37℃恒温培养箱，培养12～24h，对培养细菌进行计数。
按奥氏公式记数菌落总数C＝50000N/AT，式中C:每立方米菌落总数(CFU/m3) ；N:每皿菌落数；A:培养皿面积(cm2)；T:采样时间(min)。
2、实验结果及分析
结果如表5所示，对照组中，经苯扎溴铵消毒剂消毒后，孵化车间空气大肠杆菌的消亡率为47.47％；实验组中，经噬菌体混合制剂消毒后，孵化车间空气大肠杆菌消亡率为89.52％。由此可见，噬菌体混合制剂的环境消毒效果明显优于现有的苯扎溴铵这种化学消毒剂，且使用更安全。
表5噬菌体消毒剂和苯扎溴铵消毒剂消毒前后的大肠杆菌菌落计数
因此，上述结果本说明噬菌体混合制剂对孵化车间大肠杆菌具有优异的消杀效果，可作为一种新型生物环境消毒剂进行推广应用。
实施例9 大肠杆菌噬菌体对鸡场大肠杆菌病的治疗作用
1、实验方法
选择北方某蛋鸡场，场内近一周内死淘率达到2.91%，出现畸形蛋软壳蛋，产蛋率下降15%左右，经现场解剖死淘鸡只，发现肝脏等器官表面覆盖一层黄色干酪样物质，无菌采集肝脏样品带回实验室进行检测，发现此鸡场主要是由大肠杆菌感染引起的死淘率上升以及产蛋质量下降，随即选择两栋1200羽鸡舍分别作为试验组和对照组。
(1)试验组的处理：将制备的噬菌体制剂添加至水线中，使水线中的噬菌体总浓度为1×108pfu/mL，连续使用五天。对照组处理的水线中不添加噬菌体。其他免疫和用药程序按照养殖场程序进行。
(2)同时统计试验组与对照组的鸡舍的每日死淘数量及产蛋率等情况，对试验组和对照组的死淘鸡只进行剖检，分离鉴定死淘鸡只肝脏内的菌株。
2、实验结果及分析
（1）结果如表6所示，使用大肠杆菌噬菌体PD2061的试验组能有效降低鸡只的死淘数量，降低大肠杆菌致死率，逐步提高产蛋率，对大肠杆菌感染有很好的治疗效果。
表6噬菌体制剂治疗效果结果统计
实施例10噬菌体制剂对鸡大肠杆菌病的预防作用
1、实验方法
选取南方某肉鸡场，1日龄雏鸡，试验组采用100只雏鸡，对照组100只雏鸡，按照下述方法进行实验：
（1）噬菌体喷干粉制备：本实施例采用的噬菌体制剂采用冻干粉剂型，制备方法为：选用脱脂奶粉和乳糖作为保护剂，加入噬菌体制剂，其中脱脂奶粉、乳糖、噬菌体具体比例为1:1:8，采用瑞士BUCHIB-90型纳米喷雾干燥机干燥，喷雾干燥约1h后，收集喷干颗粒，最终得到噬菌体粉剂，其噬菌体的总浓度为1×1010PFU/g。
其中，喷雾干燥的工艺参数为：入口温度为120℃，气流速度为120L/min，喷雾速率100％，喷头盖大小为4 .0μm。
（2）实验组处理：将制备的噬菌体粉剂按照500g/吨添加至饲料中进行使用。对照组处理：饲料中不添加噬菌体粉剂。其他免疫和用药程序按照养殖场程序进行。
（3）检测第1周、第2周后的总死淘率，对死淘鸡只肝脏内菌株进行检测，并统计总体重增长率。
2、实验结果及分析
结果如表7所示，噬菌体组的整体死淘率低于未添加噬菌体的对照组，噬菌体组死淘鸡只中大肠杆菌检出率远低于对照组，且噬菌体组的体重增长率（1.25%）高于对照组（100%），大肠杆菌的分离率（12.5%）远低于对照组（69.23%）；该结果说明，本发明的噬菌体制剂在大肠杆菌预防方面有着极好的效果，且能够提高饲料利用率，提高雏鸡体重增长。
表7噬菌体混合制剂预防效果结果统计
实施实例11噬菌体制剂与抗生素的体外协同作用
1.实验方法
（1）选择一株对噬菌体PD2061敏感的从鸡场分离的大肠杆菌DC1，增殖后将菌浓度调整至1×107cfu/ml。
（2）将抗生素复方磺胺嘧啶悬浊液、硫酸庆大霉素粉剂、盐酸大观霉素盐酸林可霉素可溶性粉，使用无菌水1:9进行溶解，再放入170rpm、37℃摇床充分混匀30min，得到各种抗生素溶液。
（3）对上述抗生素使用96孔板法测定其最小抑菌浓度MIC值（MIC值表现为粉剂/悬浊液的溶解倍数），再将上述抗生素MIC的稀释倍数在进行2倍比稀释，稀释10次，取全部稀释液各50ul加入96孔板中，再取噬菌体PD2061向各孔加入50ul（添加噬菌体效价为1.0×107PFU/ml），再取100ulNB肉汤作为培养液加入孔中，放入微生物生长曲线分析仪，设置参数37℃800rpm12h，次日观察统计结果做出对比。
2.实验结果
（1）结果如表8所示，从该结果可知，在未加入噬菌体时，抗生素复方磺胺嘧啶悬浊液对大肠杆菌DC1的MIC值为0.025mg/ml，在加入噬菌体PD2061后，复方磺胺嘧啶悬浊液稀释0.00039mg/ml时仍然具有抑菌作用，MIC值降低64倍。
抗生素硫酸钠庆大霉素粉剂对大肠杆菌DC1的MIC值为0.0015mg/ml，在加入噬菌体PD2061后，硫酸庆大霉素粉剂稀释至0.000048mg/ml时仍然具有抑菌作用，MIC值降低32倍。
抗生素盐酸大观霉素对大肠杆菌DC1 MIC值为0.2mg/ml，在加入噬菌体PD2061后，盐酸大观霉素盐酸林可霉素（此为成品混合抗生素）稀释至0.025时仍然具有抑菌作用，MIC值降低8倍。
（2）向各种抗生素中加入噬菌体PD2061后，抗生素的最小抑菌浓度大幅度地降低，通过将噬菌体和抗生素的联合使用，可有效降低抗生素的使用量，降低抗生素使用成本，减少环境中的抗生素残留。
表8 噬菌体PD2061与抗生素协同作用结果
实施实例12噬菌体抗生素联合制剂对鸡大肠杆菌病的治疗
选择对噬菌体PD2061敏感的攻毒菌株DC1，选取1日龄雏鸡160只，将这160只雏鸡均分为以下八个组别，每组20只雏鸡，操作分别如下：
试验1组：先进行攻毒处理，再立刻使用复方磺胺嘧啶悬浊液进行治疗，用量为每1L水中加入0.2ml的复方磺胺嘧啶悬浊液，饮水连用5天；
试验2组：先进行攻毒处理，再立刻使用硫酸钠庆大霉素可溶性粉进行治疗（用法用量为每L水中加入2g硫酸钠庆大霉素可溶性粉），连用5天；
试验3组：先进行攻毒处理，再使用盐酸大观霉素盐酸林可霉素可溶性粉进行治疗（用法用量为每1L水中加入0.5g盐酸大观霉素盐酸林可霉素可溶性粉），连用5天；
试验4组：先进行攻毒处理，再立刻使用复方磺胺嘧啶悬浊液（广东温氏大华农生物科技有限公司，磺胺嘧啶0.4g/ml，用法用量为每1L水中加入0.2ml复方磺胺嘧啶悬浊液），并同时联用噬菌体PD2061（用法用量为每1L水中加入10ml噬菌体增殖液，噬菌体效价为1.0×107PFU/ml）进行治疗，连用5天；
试验5组：先进行攻毒处理，再立刻使用硫酸钠庆大霉素可溶性粉（泰安豪信康达生物有限公司，庆大霉素0.05g/g，用法用量为1L水中加入2g硫酸钠庆大霉素可溶性粉）联用噬菌体PD2061（用法用量为每1L水中加入10ml噬菌体增殖液，噬菌体效价为1.0×107PFU/ml）进行治疗，连用5天；
试验6组：先进行攻毒处理，再立刻使用盐酸大观霉素盐酸林可霉素可溶性粉（广东温氏大华农生物科技有限公司，大观霉素0.4g/g， 林可霉素0.2g/g，用法用量为每1L水0.5g盐酸大观霉素盐酸林可霉素可溶性粉）联用噬菌体PD2061（用法用量为每1L水10ml噬菌体增殖液，噬菌体效价为1.0×107PFU/ml）进行治疗，连用5天；
试验7组：进行攻毒处理后，不做任何治疗；
对照组：不进行攻毒，正常饲养作为对照组。
所述攻毒处理的方法为：使用0.2ml的浓度1×107cfu/ml的大肠杆菌DC1对雏鸡进行腹腔注射攻毒。
连续统计5天内每天各组的雏鸡的总死淘情况。
2.实验结果
如表9所示，在使用同一种抗生素治疗情况下，与不加入噬菌体组仅用抗生素的试验组1~3相比，加入噬菌体的试验组4~6的鸡死淘数有明显降低，如试验4组的总死淘数低于试验1组，试验5组的总死淘数低于试验2组，试验6组的总死淘数低于试验3组。该结果说明，噬菌体PD2061与抗生素联用组对鸡大肠杆菌病的治疗效果比单一抗生素组的更好。
表9噬菌体抗生素联用治疗死淘情况
实施实例13 噬菌体抗生素联合制剂对鸡大肠杆菌、沙门氏菌混合感染的治疗
选择对噬菌体PD2061敏感的攻毒菌株DC1、SM1，选取1日龄雏鸡160只，将这160只雏鸡均分为以下八个组别，每组20只雏鸡，操作分别如下：
试验1组：先进行攻毒处理，再立刻使用复方磺胺嘧啶悬浊液广东温氏大华农生物科技有限公司，磺胺嘧啶0.4g/ml)进行治疗，用量为每1L水中加入0.2ml的复方磺胺嘧啶悬浊液，饮水连用5天；
试验2组：先进行攻毒处理，再立刻使用硫酸钠庆大霉素可溶性粉进行治疗（泰安豪信康达生物有限公司，庆大霉素0.05g/g),用量为每L水中加入2g硫酸钠庆大霉素可溶性粉，连用5天；
试验3组：先进行攻毒处理，再使用盐酸大观霉素盐酸林可霉素可溶性粉（广东温氏大华农生物科技有限公司，大观霉素0.4g/g)进行治疗,用量为每1L水中加入0.5g盐酸大观霉素盐酸林可霉素可溶性粉，连用5天；
试验4组：先进行攻毒处理，再立刻使用复方磺胺嘧啶悬浊液（广东温氏大华农生物科技有限公司，磺胺嘧啶0.4g/ml，用法用量为每1L水中加入0.2ml复方磺胺嘧啶悬浊液），并同时联用噬菌体PD2061（用法用量为每1L水中加入10ml噬菌体增殖液，噬菌体效价为5.0×107PFU/ml）进行治疗，连用5天；
试验5组：先进行攻毒处理，再立刻使用硫酸钠庆大霉素可溶性粉（泰安豪信康达生物有限公司，庆大霉素0.05g/g，用法用量为1L水2g）联用噬菌体PD2061（用法用量为每1L水中加入10ml噬菌体增殖液，噬菌体效价为5.0×107PFU/ml）进行治疗，连用5天；
试验6组：先进行攻毒处理，再立刻使用盐酸大观霉素盐酸林可霉素可溶性粉（广东温氏大华农生物科技有限公司，大观霉素0.4g/g， 林可霉素0.2g/g，用法用量为每1L水0.5g）联用噬菌体PD2061（用法用量为每1L水10ml噬菌体增殖液，噬菌体效价为5.0×107PFU/ml）进行治疗，连用5天；
试验7组：进行攻毒处理后，不做任何治疗；
对照组：不进行攻毒，正常饲养作为对照组。
所述攻毒处理的方法为：使用0.2ml的浓度1×107cfu/ml的大肠杆菌DC1及0.2ml的浓度1×107cfu/ml的沙门氏菌SM1对雏鸡进行腹腔注射攻毒。
连续统计5天内每天各组的雏鸡的总死淘情况。
2.实验结果
如表10所示，在使用同一种抗生素治疗情况下，与不加入噬菌体组仅用抗生素的试验组1~3相比，加入噬菌体的试验组4~6的鸡死淘数有明显降低，如试验4组的总死淘数低于试验1组，死淘率降低50%；试验5组的总死淘数低于试验2组，死淘率降低55%；试验6组的总死淘数低于试验3组，死淘率降低45%。该结果说明，面对大肠杆菌和沙门氏菌混合感染，噬菌体PD2061与上述三种抗生素联用能有效控制死淘，死淘率显著降低，治疗效果明显优于单一使用抗生素。
表10噬菌体抗生素联用治疗死淘情况
实施例14噬菌体的安全性试验
1、实验方法
选取1日龄雏鸡60只，分为噬菌体组30只和对照组30只，噬菌体组口服 1×1010PFU噬菌体0 .2mL，饲养观察7天。对照组口服同等剂量无菌生理盐水。进行剖检观察心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑部、肠道病变，饲养过程中观察精神、采食等状态。2、实验结果及分析
在整个给药期间，噬菌体组和对照组的鸡中没有观察到疾病或毒性症状，精神状态和采食正常。经过详细的临床剖检观察，无论是噬菌体组还是对照组，雏鸡的主要器官以及肠道均正常。这说明噬菌体PD2061的安全性较高，对动物机体无不良影响。
实施例14大肠杆菌噬菌体PD2061的全基因组分析
提取噬菌体PD2061的基因组，进行全基因组测序和序列分析，结果如下：
基因组全长166913 bp，G+C含量为35.49%，碱基C、G、A、T含量依次为16.71%、18.78%、32.72%、31.77%。全基因组RAJD在线注释结果显示该基因组含有271个开放阅读框（ORFs）。同时在271个ORFs中，含有高度保守的末端酶大亚基（Phage terminase, largesubunit）见序列表中的序列1，经在线工具CGE server分析该基因组不含耐药基因及毒力基因。经PHAJDER分析该基因组不含溶原性相关基因。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一株大肠杆菌噬菌体PD2061，其特征在于，其保藏编号为CGMCC NO.46163。
2.一种噬菌体组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体PD2061。
3.如权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体PD2061或如权利要求2所述的噬菌体组合物在制备防治大肠杆菌和/或沙门氏菌感染导致的疾病的药物中的应用。
4.一种噬菌体药物制剂，其特征在于，其有效成分包括如权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体PD2061或如权利要求2所述的噬菌体组合物。
5.根据权利要求1所述的噬菌体药物制剂，其特征在于，所述药物制剂形式为口服给药剂型、外用剂型或肠外给药剂型。
6.根据权利要求1所述的噬菌体药物制剂，其特征在于，所述噬菌体药物制剂为粉剂，还包含：作为保护剂的脱脂奶粉和乳糖。
7.一种饲料添加剂或禽类饮用水添加剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体PD2061或如权利要求2所述的噬菌体组合物。
8.一种环境消毒剂，其特征在于，有效成分包括如权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体PD2061或如权利要求2所述的噬菌体组合物。
9.如权利要求7所述的环境消毒剂在鸡场环境消毒中的应用，其特征在于，所述环境消毒剂的应用方法为：通过喷雾、浸泡对养殖环境、饲养器具进行大肠杆菌和/或沙门氏菌的消毒，所述养殖环境包括鸡舍、鸡笼、饮水器、食槽等饲喂工具、粪便和垫料。
10.一种鸡肉消毒剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体PD2061或如权利要求2所述的噬菌体组合物。
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