CN120683075B - 一种植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白y-l4-t及其应用 - Google Patents

一种植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白y-l4-t及其应用

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Abstract

本发明公开了一种植酸酶‑普鲁兰水解酶融合蛋白Y‑L4‑T及其应用，属于酶工程技术领域。本发明的植酸酶‑普鲁兰水解酶融合蛋白Y‑L4‑T的氨基酸序列如SEQ ID NO.46所示。本发明构建了一种植酸酶‑普鲁兰水解酶融合蛋白Y‑L4‑T，该融合蛋白的植酸酶活性与植酸酶YiAPPA基本一致，淀粉酶活性显著高于普鲁兰水解酶TK‑PUL。该融合蛋白处理后的小麦面包的比容明显增大，硬度明显降低，弹性明显提高；并且可有效缓解储藏期间小麦面包硬度的增加和弹性的减少。本发明的融合蛋白Y‑L4‑T可有效改善面包品质及延长面包货架期，在烘焙领域具有良好的应用前景。

Description

一种植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白Y-L4-T及其应用
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，特别是涉及一种植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白Y-L4-T及其应用。
背景技术
植酸酶又称肌醇六磷酸酶，可以降解植酸生成无机磷和磷酸肌醇。在植物性食品原料中添加植酸酶，有利于解除植酸的抗营养作用，提高食品中磷的吸收利用率。因此植酸酶可以作为一种新型食品添加剂应用于食品加工领域。例如，在面包制作过程中添加植酸酶，可使植酸含量降低以及矿物质和蛋白质含量提高。此外，植酸酶处理还改善了面包的香气、口感和咀嚼性。α-淀粉酶和普鲁兰酶等淀粉水解酶作为天然添加剂在面包制作过程中发挥着重要作用。α-淀粉酶和普鲁兰酶分别能够水解淀粉中的α-1,4-糖苷键和α-1,6糖苷键，两种酶的协同作用能更好地将淀粉转化为更多的分子量较小的还原糖。在面包制作过程中，还原糖生成量的增加可以为酵母提供更多的底物，影响酵母的发酵速度和发酵产物，从而改善面包的体积、硬度、物理和感官特性。此外，面包制作中添加淀粉水解酶还有利于延长其保质期。已有研究表明，面包制作过程中同时添加植酸酶和淀粉水解酶，植酸酶和淀粉水解酶的协同作用有利于优化面包的发酵过程，改善面包的质地和口感等。
蛋白质融合技术是指将两个或两个以上的蛋白质通过连接肽进行融合，从而得到所需的多功能融合蛋白质。通过蛋白质融合技术生产融合蛋白可大大降低酶制剂的生产成本，并有利于改进融合蛋白的酶学特性。因此，在面包制作过程中，尝试采用植酸酶和淀粉水解酶的融合蛋白替代植酸酶及淀粉水解酶，有望降低酶制剂的生产成本及改善植酸酶或淀粉水解酶的酶学特性，提高酶制剂的作用效率。
来源于Yersinia intermedia的植酸酶YiAPPA是目前已知的植酸酶活性最高的植酸酶，其酶活是目前应用最广泛的植酸酶Aspergillus niger PhyA酶活的40倍。来源于Thermococcus kodakarensis的嗜热酸性III型普鲁兰水解酶TK-PUL具有α-淀粉酶和普鲁兰酶的功能，可同时水解淀粉中α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键，将淀粉高效水解为低分子量还原糖。植酸酶YiAPPA和普鲁兰水解酶TK-PUL的酶学特性，使这两种酶在面包制作中展现出良好的应用潜力。采用蛋白质融合技术构建植酸酶YiAPPA和普鲁兰水解酶TK-PUL的融合蛋白，有望改善酶制剂的酶学特性，充分发挥酶制剂间的协同作用，提高酶制剂的作用效率，实现融合蛋白在面包制作中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白Y-L4-T及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明构建了一种植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白Y-L4-T，该融合蛋白的植酸酶活性与植酸酶YiAPPA基本一致，淀粉酶活性显著高于普鲁兰水解酶TK-PUL。该融合蛋白处理后的小麦面包的比容明显增大，硬度明显降低，弹性明显提高；并且可有效缓解储藏期间小麦面包硬度的增加和弹性的减少。本发明的融合蛋白Y-L4-T可有效改善面包品质及延长面包货架期，在烘焙领域具有良好的应用前景。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白Y-L4-T，其氨基酸序列如SEQ IDNO.46所示。
本发明还提供编码上述植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白Y-L4-T的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示。
本发明还提供一种重组载体，所述重组载体上含有上述基因。
本发明还提供一种重组微生物，所述重组微生物中包含上述重组载体。
本发明还提供上述植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白Y-L4-T在降解植酸和淀粉中的应用。
本发明还提供上述植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白Y-L4-T在生产面食中的应用。
可选的，所述面食包括面包。
本发明还提供一种改善面包比容和/或质构特性的方法，包括在面包制作过程中添加上述植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白Y-L4-T的步骤。
本发明还提供上述基因、上述重组载体或上述重组微生物在生产植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白Y-L4-T中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明采用蛋白质融合技术构建植酸酶YiAPPA和普鲁兰水解酶TK-PUL的融合蛋白。植酸酶YiAPPA和普鲁兰水解酶TK-PUL按照不同的融合顺序，通过不同的连接肽连接，构建得到8种融合蛋白，进一步通过比较各融合蛋白的植酸酶活性和淀粉酶活性，筛选得到酶活性提高的融合蛋白Y-L4-T。该融合蛋白Y-L4-T的植酸酶活性为1802.59U/mg，与植酸酶YiAPPA基本一致；淀粉酶活性为60.94U/mg，与普鲁兰水解酶TK-PUL相比，提高了1.42倍。与植酸酶YiAPPA和普鲁兰水解酶TK-PUL的混合酶相比，融合蛋白Y-L4-T处理后的小麦面包的比容明显增大，硬度明显降低，弹性明显提高；并且融合蛋白Y-L4-T可有效缓解储藏期间小麦面包硬度的增加和弹性的减少。本发明构建得到的融合蛋白Y-L4-T可有效改善面包品质及延长面包货架期，在烘焙领域具有良好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白的构建与筛选过程示意图；
图2为植酸酶YiAPPA、普鲁兰水解酶TK-PUL和植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白Y-L4-T的SDS-PAGE检测结果图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中涉及的材料与试剂如下：
大肠杆菌Escherichia coli HST08、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RIK1285、枯草芽孢杆菌表达载体pBE-S均购自宝日医生物技术(北京)有限公司。
KOD-Plus-neo DNA聚合酶购自Toyobo公司，DNA限制性内切酶购自Fermentase公司，PCR产物纯化试剂盒、质粒抽提试剂盒E.Z.N.A.购自Omega Bio-tek公司，ClonExpressUltra One Step Cloning Kit试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司，ChelatingSepharoseTM Fast Flow购自美国GE Healthcare公司，Bradford法蛋白浓度测定试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司，高活性酵母购自安琪酵母股份有限公司，基因合成由上海博益生物科技有限公司完成，聚合酶链式反应引物合成和测序由上海生工生物工程股份有限公司完成，其它化学试剂均为国产或进口分析纯。
LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10，pH 7.0。筛选培养基采用含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基及含10μg/mL卡那霉素的LB培养基。
本发明中所用到的分子克隆技术和蛋白质检测技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照如下实验手册中的相关部分来进行：Green MR,SambrookJ.Molecular cloning:alaboratory manual[M].NewYork:Cold SpringHarbor Laboratory Press,2012。
实施例1植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白的构建
1、基因的合成
来源于Yersinia intermedia的植酸酶YiAPPA的基因序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；来源于Thermococcus kodakarensis的普鲁兰水解酶TK-PUL的基因序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；连接肽L1的基因序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；连接肽L2的基因序列如SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；连接肽L3的基因序列如SEQ ID NO.9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；连接肽L4的基因序列如SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示。将上述基因交由上海博益生物科技有限公司进行全基因合成。
SEQ ID NO.1：
AATAGTTATGCGATTAGTGCCGCGCCGGTTGCCATACAACCCACGGGCTATACATTGGAGCGAGTGGTTATTTTGAGCCGCCATGGTGTTCGCTCGCCAACCAAACAAACACAGTTAATGAATGATGTTACCCCTGACACGTGGCCGCAATGGCCGGTCGCCGCAGGATACTTAACCCCCCGAGGTGCACAATTAGTGACATTGATGGGCGGATTCTATGGTGATTACTTCCGTAGCCAAGGGTTACTCGCAGCAGGGTGCCCAACTGACGCGGTTATTTATGCTCAGGCCGATGTTGATCAACGAACGCGTTTAACGGGGCAGGCATTCCTTGATGGAATAGCACCGGGGTGTGGACTGAAAGTACATTATCAGGCTGATTTGAAAAAAGTGGATCCGCTGTTTCATCCCGTCGACGCGGGGGTGTGTAAGTTAGATTCGACACAAACCCATAAGGCTGTTGAGGAGCGACTAGGTGGGCCATTAAGTGAACTGAGCAAACGCTATGCTAAGCCCTTTGCCCAGATGGGTGAGATTCTGAATTTTGCGGCATCTCCTTACTGTAAATCACTGCAACAGCAAGGGAAAACCTGTGATTTTGCCAACTTTGCAGCGAATAAGATCACGGTGAACAAGCCGGGGACAAAAGTCTCGCTCAGCGGACCACTGGCACTGTCATCAACCTTAGGTGAGATCTTTTTGCTACAAAATTCACAAGCGATGCCTGATGTTGCCTGGCATCGGTTAACGGGAGAAGATAATTGGATCTCGTTATTATCGTTGCACAATGCGCAATTTGATTTAATGGCAAAAACACCTTATATCGCTCGTCATAAGGGCACACCGTTGCTGCAACAGATCGAGACTGCCCTCGTCCTTCAGCGTGATGCTCAGGGGCAAACATTGCCATTATCACCTCAAACCAAAATTCTGTTCCTCGGGGGACATGATACAAACATCGCCAATATTGCTGGAATGTTGGGGGCTAACTGGCAATTACCACAGCAGCCCGATAATACCCCACCTGGGGGGGGATTGGTCTTCGAGCTATGGCAAAACCCAGATAATCATCAACGTTATGTCGCGGTGAAAATGTTCTATCAAACAATGGGCCAATTGCGAAATGCTGAGAAACTAGACCTGAAAAACAATCCGGCTGGTAGGGTCCCTGTTGCAATAGACGGTTGTGAAAATAGTGGTGATGACAAACTTTGTCAGCTTGATACCTTCCAAAAGAAAGTAGCTCAGGCGATTGAACCTGCTTGCCATATT。
SEQ ID NO.2：
NSYAISAAPVAIQPTGYTLERVVILSRHGVRSPTKQTQLMNDVTPDTWPQWPVAAGYLTPRGAQLVTLMGGFYGDYFRSQGLLAAGCPTDAVIYAQADVDQRTRLTGQAFLDGIAPGCGLKVHYQADLKKVDPLFHPVDAGVCKLDSTQTHKAVEERLGGPLSELSKRYAKPFAQMGEILNFAASPYCKSLQQQGKTCDFANFAANKITVNKPGTKVSLSGPLALSSTLGEIFLLQNSQAMPDVAWHRLTGEDNWISLLSLHNAQFDLMAKTPYIARHKGTPLLQQIETALVLQRDAQGQTLPLSPQTKILFLGGHDTNIANIAGMLGANWQLPQQPDNTPPGGGLVFELWQNPDNHQRYVAVKMFYQTMGQLRNAEKLDLKNNPAGRVPVAIDGCENSGDDKLCQLDTFQKKVAQAIEPACHI。
SEQ ID NO.3：
AGCGGATGTATCTCGGAGAGCAACGAAAATCAAACTGCAACGGCTTCGACCGTTCCACCGACTTCAGTGACACCCTCACAGTCTTCCACTCCCACAACCTCGACCTCGACGTACGGCCCTTCCGAAAGAACGGAGCTTAAACTTCCTTCGGTTAACTACACTCCCATCTACGTCGGCATAGAGAAAGGCTGTCCCTCCGGAAGAGTCCCGGTGAAGTTCACGTACAACCCCGGAAACAAGACCGTAAAGTCTGTCAGCCTCCGCGGGAGCTTCAACAACTGGGGAGAGTGGCCGATGGAGCTGAAGAACGGCACGTGGGAGACGACCGTCTGTCTCCGCCCTGGAAGGTATGAGTATAAGTACTTCATCAACGGCCAGTGGGTCAAGGACATGTCCGACGACGGGACGGGAAGGCCCTACGACCCCGATGCAGACGCCTATGCCCCCGATGGCTACGGGGGAAAGAACGCCGTGAGGGTAGTTGAGGGCCGCGAAGCGTTCTACGTGGAGTTCGATCCAAGAGACCCAGCCTACCTCAGCATCGCGGACAAAAGAACCGTGGTCAGGTTCGAGGCTAAGAGAGACACCGTCGAGTCTGCGGTTCTCGTTACGGATCACGGGAACTACACGATGAAGCTTCAGGTCTGGTGGGACTTCGGCGAAACCTGGCGCGCCGAGATGCCAGTTGAACCCGCTGATTATTACATTCTCGTAACCTCCTCCGACGGCGGGAAGTTTGCCGTCCTAAACACAAGCGAAAGCCCGTTCTTCCACTTTGATGGCGTTGAGGGGTTCCCCCAGCTGGAGTGGGTGAGCAACGGGATAACCTACCAGATATTCCCCGACAGGTTCAACAACGGCAATAAAAGCAACGATGCCCTAGCTTTGGATCACGACGAGCTAATTTTGAACCAGGTTAATCCAGGGCAGCCAATCCTCTCCAACTGGAGCGACCCGATAACGCCCCTCCACTGCTGCCACCAGTACTTCGGCGGCGACATAAAGGGAATAACGGAGAAGCTCGACTACCTTCAGAGCCTAGGTGTTACTATAATCTACATCAACCCGATTTTCCTCTCGGGAAGCGCCCACGGCTACGACACCTACGACTACTACCGGCTCGACCCCAAGTTCGGGACCGAGGATGAGCTGAGAGAGTTCCTCGATGAGGCCCACAGGAGGGGAATGAGGGTAATCTTCGATTTCGTGCCCAACCACTGCGGCATAGGGAATCCAGCCTTCCTCGACGTCTGGGAGAAGGGCAACGAAAGCCCATACTGGGACTGGTTCTTCGTCAAGAAGTGGCCCTTCAAGCTCGGCGATGGGAGCGCCTACGTCGGCTGGTGGGGCTTTGGGAGCCTTCCGAAGCTCAACACTGCCAACCAGGAGGTCAGGGAGTACCTGATAGGAGCGGCCCTCCACTGGATAGAGTTCGGCTTTGACGGCATTAGGGTGGATGTGCCGAACGAAGTCCTCGACCCGGGGACGTTCTTCCCGGAGCTGAGAAAGGCAGTTAAGGAGAAAAAGCCCGACGCGTACCTCGTCGGCGAGATATGGACGCTCTCCCCGGAGTGGGTGAAGGGAGACCGCTTCGACTCCCTCATGAACTACGCCCTCGGGAGGGACATCCTCCTGAACTACGCTAAGGGCCTGCTCAGCGGAGAAAGTGCAATGAAAATGATGGGACGTTACTACGCTTCCTACGGCGAGAACGTAGTTGCGATGGGCTTCAACCTCGTTGATTCGCACGACACTTCGAGGGTTCTCACTGACCTCGGTGGTGGCAAACTGGGAGACACACCGTCAAACGAGTCAATTCAGAGGCTCAAGCTCCTCTCAACGCTCCTCTATGCCCTGCCCGGAACTCCCGTCACCTTCCAGGGGGACGAGAGGGGACTGCTCGGAGACAAGGGACACTACGATGAGCAACGCTATCCGATACAGTGGGATACTGTGAACGAGGACGTCCTGAACCACTACAGGGCACTGGCGGAGCTCAGAAAAAGAGTTCCCGCATTGAGGAGCAGCGCAATGAGGTTCTACACTGCCAAAGGCGGCGTTATGGCCTTCTTCAGGGGACATCATGACGAGGTTCTCGTCGTTGCCAACAGCTGGAAGAAGCCAGCCCTACTGGAGCTTCCCGAGGGAGAGTGGAAAGTAATCTGGCCTGAGGATTTCAGCCCGGAACTGCTTCGCGGCACAGTTGAAGTGCCAGCCATAGGGATAATCATCCTTGAGCGGGGT。
SEQ ID NO.4：
SGCISESNENQTATASTVPPTSVTPSQSSTPTTSTSTYGPSERTELKLPSVNYTPIYVGIEKGCPSGRVPVKFTYNPGNKTVKSVSLRGSFNNWGEWPMELKNGTWETTVCLRPGRYEYKYFINGQWVKDMSDDGTGRPYDPDADAYAPDGYGGKNAVRVVEGREAFYVEFDPRDPAYLSIADKRTVVRFEAKRDTVESAVLVTDHGNYTMKLQVWWDFGETWRAEMPVEPADYYILVTSSDGGKFAVLNTSESPFFHFDGVEGFPQLEWVSNGITYQIFPDRFNNGNKSNDALALDHDELILNQVNPGQPILSNWSDPITPLHCCHQYFGGDIKGITEKLDYLQSLGVTIIYINPIFLSGSAHGYDTYDYYRLDPKFGTEDELREFLDEAHRRGMRVIFDFVPNHCGIGNPAFLDVWEKGNESPYWDWFFVKKWPFKLGDGSAYVGWWGFGSLPKLNTANQEVREYLIGAALHWIEFGFDGIRVDVPNEVLDPGTFFPELRKAVKEKKPDAYLVGEIWTLSPEWVKGDRFDSLMNYALGRDILLNYAKGLLSGESAMKMMGRYYASYGENVVAMGFNLVDSHDTSRVLTDLGGGKLGDTPSNESIQRLKLLSTLLYALPGTPVTFQGDERGLLGDKGHYDEQRYPIQWDTVNEDVLNHYRALAELRKRVPALRSSAMRFYTAKGGVMAFFRGHHDEVLVVANSWKKPALLELPEGEWKVIWPEDFSPELLRGTVEVPAIGIIILERG。
SEQ ID NO.5：GAGGGTAAGTCTTCGGGCTCAGGCTCAGAGTCAAAATCCACC。
SEQ ID NO.6：EGKSSGSGSESKST。
SEQ ID NO.7：GGTTCCGCTGGATCAGCTGCTGGATCAGGAGAATTC。
SEQ ID NO.8：GSAGSAAGSGEF。
SEQ ID NO.9：
GCTGAAGCTGCTGCTAAGGAAGCTGCTGCTAAGGAAGCTGCTGCTAAGGCT。
SEQ ID NO.10：AEAAAKEAAAKEAAAKA。
SEQ ID NO.11：
GAAGCTGCTGCTAAGGAAGCTGCTGCTAAGGGTGGTGGTGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCC。
SEQ ID NO.12：EAAAKEAAAKGGGGSGGGGSGGGGS。
2、植酸酶YiAPPA重组表达质粒和普鲁兰水解酶TK-PUL重组表达质粒的构建
根据植酸酶YiAPPA的基因序列设计PCR引物Y-F、Y-R(表1)，以YiAPPA的合成基因为模板，以Y-F、Y-R为引物，进行PCR扩增。PCR扩增体系为：10×buffer I 5μL、dNTP 5μL、MgSO45μL、上下游引物各2μL、模板1μL、KOD-Plus-neo DNA聚合酶2μL、ddH2O 28μL。PCR扩增条件为：98℃5min；98℃20s，60℃40s，74℃2min，30个循环；74℃，10min。扩增产物经Nde I和Xba I双酶切，连接至经相同双酶切处理的载体pBE-S，构建重组质粒pBE-S-yiappa。
根据普鲁兰水解酶TK-PUL的基因序列设计PCR引物T-F、T-R(表1)，以TK-PUL的合成基因为模板，以T-F、T-R为引物，进行PCR扩增。PCR扩增体系同上。PCR扩增条件为：98℃5min；98℃20s，60℃40s，74℃2min10 s，30个循环；74℃，10min。扩增产物经Nde I和Xba I双酶切，连接至经相同双酶切处理的载体pBE-S，构建重组质粒pBE-S-tkpul。
表1构建重组质粒所用引物
引物名称 引物序列
Y-F 5’-GCACATATGAATAGTTATGCGATTAGTG-3’(SEQ ID NO.13)
Y-R 5’-ATGTCTAGAAATATGGCAAGCAGGTTC-3’(SEQ ID NO.14)
T-F 5’-GCACATATGAGCGGATGTATCTCGGAGAG-3’(SEQ ID NO.15)
T-R 5’-ATGTCTAGAACCCCGCTCAAGGATG-3’(SEQ ID NO.16)
注：下划线标注的部分为限制性酶切割位点。
3、植酸酶-普鲁兰酶融合蛋白的构建
采用蛋白质融合技术构建植酸酶-普鲁兰酶融合蛋白，构建示意图如图1所示。根据ClonExpressUltra One Step Cloning Kit试剂盒说明书以及各基因序列设计所需引物(表2)。
融合蛋白T-L1-Y的构建步骤如下：
(1)根据载体pBE-S的基因序列设计PCR引物TL1Y-F、TL1Y-R(表2)，以载体pBE-S为模板，以TL1Y-F、TL1Y-R为引物，进行PCR扩增制备线性化载体。根据融合单元的基因序列设计PCR引物，以普鲁兰水解酶TK-PUL的合成基因为模板，以TL1Y-F1、TL1Y-R1为引物，进行PCR扩增制备插入片段1；以连接肽L1的合成基因为模板，以TL1Y-F2、TL1Y-R2为引物，进行PCR扩增制备插入片段2；以植酸酶YiAPPA的合成基因为模板，以TL1Y-F3、TL1Y-R3为引物，进行PCR扩增制备插入片段3。采用PCR产物纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。PCR扩增体系同上。PCR扩增条件为：98℃5min；98℃20s，60℃40s，74℃4min，30个循环；74℃，10min。
(2)将纯化后的PCR扩增产物混合，根据ClonExpressUltra One Step CloningKit试剂盒说明书配置重组反应体系。重组反应体系包括：线性化载体1μL；插入片段12μL；插入片段20.5μL；插入片段31.5μL；2×CE Mix 5μL。重组反应条件为：50℃，30min。待反应完成后，将重组反应体系立即置于冰上冷却，获得由线性化载体及3种插入片段构成的重组产物。
(3)将重组产物转化大肠杆菌HST08感受态细胞，氨苄青霉素抗性平板筛选转化子，提取重组质粒。将重组质粒送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序，并与对应基因序列进行比对，确认重组质粒pBE-S-tl1y构建成功。
融合蛋白T-L2-Y、T-L3-Y、T-L4-Y、Y-L1-T、Y-L2-T、Y-L3-T、Y-L4-T的构建方法均参照融合蛋白T-L1-Y的构建方法进行。
表2构建植酸酶-融合蛋白所用引物
实施例2植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白的筛选
1、植酸酶YiAPPA、普鲁兰水解酶TK-PUL及植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白的表达
将植酸酶YiAPPA、普鲁兰水解酶TK-PUL、植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白的重组表达质粒分别转化至枯草芽孢杆菌RIK1285感受态细胞，同时转化pBE-S作为阴性对照Contr.，获得重组枯草芽孢杆菌。
重组枯草芽孢杆菌的种子培养条件为：采用含10μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，用100mL三角瓶进行培养，其中培养基的装液量为10mL，培养温度为37℃，转速为180rpm，培养时间为24h。重组枯草芽孢杆菌的发酵培养条件为：采用含10μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，用500mL三角瓶进行培养，其中培养基的装液量为50mL，接种量为1％，培养温度为37℃，转速为180rpm，培养时间为36h。
2、植酸酶YiAPPA、普鲁兰水解酶TK-PUL及植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白的纯化
采用Ni2+亲和层析柱对发酵上清液中目的蛋白质进行纯化，用200mmol/L咪唑洗脱缓冲液洗脱，即得到纯化后的融合蛋白。利用SDS-PAGE检测融合蛋白的纯度，并采用Bradford法测定融合蛋白的浓度。
3、植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白的筛选
植酸酶的酶活力测定：取250μL酶液于离心管中，加入750μL 0.25mol/L醋酸钠缓冲液(pH 4.5)，混匀。向实验组管中加入2mL 1.5mmol/L植酸钠溶液(0.25mol/L醋酸钠缓冲液，pH 4.5)，对照组中加入2mL颜色/终点混合液(钼酸铵/钒酸铵/硝酸)，摇匀。于30℃反应30min后，立即向实验组中加入2mL颜色/终点混合液，对照组中加入2mL 1.5mmol/L植酸钠溶液，并混匀，于415nm处测定光吸收值。反应液中无机磷含量与反应液于415nm处吸光值的换算公式如下：无机磷(mmol/L)＝26.5510×OD415nm+0.3113。植酸酶活力单位(U)定义为：在37℃、pH 4.5的条件下，每分钟从1.5mmol/L植酸钠溶液中释放出1μmol/L无机磷所需要的植酸酶量为一个酶活力单位(U)。植酸酶YiAPPA及植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白的植酸酶活性检测结果如表3所示。
淀粉酶的酶活力测定：将10μL酶液与490μL含1％(m/v)小麦淀粉的50mmol/L MES，pH 4.5缓冲液混合，于30℃反应30min后，迅速放入冰水浴中终止反应，然后采用3,5-二硝基水杨酸法测定反应体系中还原糖量。生成的还原糖通过麦芽糖标准工作曲线折算为麦芽糖质量表示。酶活力单位(U)定义：在一定反应条件下，每分钟催化产生1μmol麦芽糖的酶量为一个酶活力单位(U)。普鲁兰水解酶TK-PUL及植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白的淀粉酶活性测定结果如表3所示。
植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白的植酸酶活性和淀粉酶活性测定结果显示：融合蛋白Y-L4-T的植酸酶比活力为1802.59U/mg，与植酸酶YiAPPA的植酸酶比活力基本一致；融合蛋白Y-L4-T的淀粉酶比活力为60.94U/mg，与普鲁兰水解酶相比，提高了1.42倍。植酸酶YiAPPA、普鲁兰水解酶TK-PUL及融合蛋白Y-L4-T的SDS-PAGE检测图如图2所示。
表3植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白的酶活力测定结果(37℃，pH 4.5)
重组蛋白 植酸酶比活力(U/mg) 重组蛋白 淀粉酶比活力(U/mg)
YiAPPA 1785.32±109.05 TK-PUL 25.22±2.31
T-L1-Y 1053.33±100.26 T-L1-Y 20.34±2.09
T-L2-Y 1089.53±109.03 T-L2-Y 19.82±1.83
T-L3-Y 1389.51±110.68 T-L3-Y 24.36±1.47
T-L4-Y 1492.16±134.15 T-L4-Y 24.69±1.43
Y-L1-T 1391.23±119.02 Y-L1-T 25.02±1.33
Y-L2-T 1433.15±128.25 Y-L2-T 25.71±1.73
Y-L3-T 1675.26±154.04 Y-L3-T 39.96±2.95
Y-L4-T 1802.59±128.27 Y-L4-T 60.94±2.59
融合蛋白Y-L4-T的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示：
AATAGTTATGCGATTAGTGCCGCGCCGGTTGCCATACAACCCACGGGCTATACATTGGAGCGAGTGGTTATTTTGAGCCGCCATGGTGTTCGCTCGCCAACCAAACAAACACAGTTAATGAATGATGTTACCCCTGACACGTGGCCGCAATGGCCGGTCGCCGCAGGATACTTAACCCCCCGAGGTGCACAATTAGTGACATTGATGGGCGGATTCTATGGTGATTACTTCCGTAGCCAAGGGTTACTCGCAGCAGGGTGCCCAACTGACGCGGTTATTTATGCTCAGGCCGATGTTGATCAACGAACGCGTTTAACGGGGCAGGCATTCCTTGATGGAATAGCACCGGGGTGTGGACTGAAAGTACATTATCAGGCTGATTTGAAAAAAGTGGATCCGCTGTTTCATCCCGTCGACGCGGGGGTGTGTAAGTTAGATTCGACACAAACCCATAAGGCTGTTGAGGAGCGACTAGGTGGGCCATTAAGTGAACTGAGCAAACGCTATGCTAAGCCCTTTGCCCAGATGGGTGAGATTCTGAATTTTGCGGCATCTCCTTACTGTAAATCACTGCAACAGCAAGGGAAAACCTGTGATTTTGCCAACTTTGCAGCGAATAAGATCACGGTGAACAAGCCGGGGACAAAAGTCTCGCTCAGCGGACCACTGGCACTGTCATCAACCTTAGGTGAGATCTTTTTGCTACAAAATTCACAAGCGATGCCTGATGTTGCCTGGCATCGGTTAACGGGAGAAGATAATTGGATCTCGTTATTATCGTTGCACAATGCGCAATTTGATTTAATGGCAAAAACACCTTATATCGCTCGTCATAAGGGCACACCGTTGCTGCAACAGATCGAGACTGCCCTCGTCCTTCAGCGTGATGCTCAGGGGCAAACATTGCCATTATCACCTCAAACCAAAATTCTGTTCCTCGGGGGACATGATACAAACATCGCCAATATTGCTGGAATGTTGGGGGCTAACTGGCAATTACCACAGCAGCCCGATAATACCCCACCTGGGGGGGGATTGGTCTTCGAGCTATGGCAAAACCCAGATAATCATCAACGTTATGTCGCGGTGAAAATGTTCTATCAAACAATGGGCCAATTGCGAAATGCTGAGAAACTAGACCTGAAAAACAATCCGGCTGGTAGGGTCCCTGTTGCAATAGACGGTTGTGAAAATAGTGGTGATGACAAACTTTGTCAGCTTGATACCTTCCAAAAGAAAGTAGCTCAGGCGATTGAACCTGCTTGCCATATTGAAGCTGCTGCTAAGGAAGCTGCTGCTAAGGGTGGTGGTGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCAGCGGATGTATCTCGGAGAGCAACGAAAATCAAACTGCAACGGCTTCGACCGTTCCACCGACTTCAGTGACACCCTCACAGTCTTCCACTCCCACAACCTCGACCTCGACGTACGGCCCTTCCGAAAGAACGGAGCTTAAACTTCCTTCGGTTAACTACACTCCCATCTACGTCGGCATAGAGAAAGGCTGTCCCTCCGGAAGAGTCCCGGTGAAGTTCACGTACAACCCCGGAAACAAGACCGTAAAGTCTGTCAGCCTCCGCGGGAGCTTCAACAACTGGGGAGAGTGGCCGATGGAGCTGAAGAACGGCACGTGGGAGACGACCGTCTGTCTCCGCCCTGGAAGGTATGAGTATAAGTACTTCATCAACGGCCAGTGGGTCAAGGACATGTCCGACGACGGGACGGGAAGGCCCTACGACCCCGATGCAGACGCCTATGCCCCCGATGGCTACGGGGGAAAGAACGCCGTGAGGGTAGTTGAGGGCCGCGAAGCGTTCTACGTGGAGTTCGATCCAAGAGACCCAGCCTACCTCAGCATCGCGGACAAAAGAACCGTGGTCAGGTTCGAGGCTAAGAGAGACACCGTCGAGTCTGCGGTTCTCGTTACGGATCACGGGAACTACACGATGAAGCTTCAGGTCTGGTGGGACTTCGGCGAAACCTGGCGCGCCGAGATGCCAGTTGAACCCGCTGATTATTACATTCTCGTAACCTCCTCCGACGGCGGGAAGTTTGCCGTCCTAAACACAAGCGAAAGCCCGTTCTTCCACTTTGATGGCGTTGAGGGGTTCCCCCAGCTGGAGTGGGTGAGCAACGGGATAACCTACCAGATATTCCCCGACAGGTTCAACAACGGCAATAAAAGCAACGATGCCCTAGCTTTGGATCACGACGAGCTAATTTTGAACCAGGTTAATCCAGGGCAGCCAATCCTCTCCAACTGGAGCGACCCGATAACGCCCCTCCACTGCTGCCACCAGTACTTCGGCGGCGACATAAAGGGAATAACGGAGAAGCTCGACTACCTTCAGAGCCTAGGTGTTACTATAATCTACATCAACCCGATTTTCCTCTCGGGAAGCGCCCACGGCTACGACACCTACGACTACTACCGGCTCGACCCCAAGTTCGGGACCGAGGATGAGCTGAGAGAGTTCCTCGATGAGGCCCACAGGAGGGGAATGAGGGTAATCTTCGATTTCGTGCCCAACCACTGCGGCATAGGGAATCCAGCCTTCCTCGACGTCTGGGAGAAGGGCAACGAAAGCCCATACTGGGACTGGTTCTTCGTCAAGAAGTGGCCCTTCAAGCTCGGCGATGGGAGCGCCTACGTCGGCTGGTGGGGCTTTGGGAGCCTTCCGAAGCTCAACACTGCCAACCAGGAGGTCAGGGAGTACCTGATAGGAGCGGCCCTCCACTGGATAGAGTTCGGCTTTGACGGCATTAGGGTGGATGTGCCGAACGAAGTCCTCGACCCGGGGACGTTCTTCCCGGAGCTGAGAAAGGCAGTTAAGGAGAAAAAGCCCGACGCGTACCTCGTCGGCGAGATATGGACGCTCTCCCCGGAGTGGGTGAAGGGAGACCGCTTCGACTCCCTCATGAACTACGCCCTCGGGAGGGACATCCTCCTGAACTACGCTAAGGGCCTGCTCAGCGGAGAAAGTGCAATGAAAATGATGGGACGTTACTACGCTTCCTACGGCGAGAACGTAGTTGCGATGGGCTTCAACCTCGTTGATTCGCACGACACTTCGAGGGTTCTCACTGACCTCGGTGGTGGCAAACTGGGAGACACACCGTCAAACGAGTCAATTCAGAGGCTCAAGCTCCTCTCAACGCTCCTCTATGCCCTGCCCGGAACTCCCGTCACCTTCCAGGGGGACGAGAGGGGACTGCTCGGAGACAAGGGACACTACGATGAGCAACGCTATCCGATACAGTGGGATACTGTGAACGAGGACGTCCTGAACCACTACAGGGCACTGGCGGAGCTCAGAAAAAGAGTTCCCGCATTGAGGAGCAGCGCAATGAGGTTCTACACTGCCAAAGGCGGCGTTATGGCCTTCTTCAGGGGACATCATGACGAGGTTCTCGTCGTTGCCAACAGCTGGAAGAAGCCAGCCCTACTGGAGCTTCCCGAGGGAGAGTGGAAAGTAATCTGGCCTGAGGATTTCAGCCCGGAACTGCTTCGCGGCACAGTTGAAGTGCCAGCCATAGGGATAATCATCCTTGAGCGGGGT。
融合蛋白Y-L4-T的氨基酸序列如SEQ ID NO.46所示：
NSYAISAAPVAIQPTGYTLERVVILSRHGVRSPTKQTQLMNDVTPDTWPQWPVAAGYLTPRGAQLVTLMGGFYGDYFRSQGLLAAGCPTDAVIYAQADVDQRTRLTGQAFLDGIAPGCGLKVHYQADLKKVDPLFHPVDAGVCKLDSTQTHKAVEERLGGPLSELSKRYAKPFAQMGEILNFAASPYCKSLQQQGKTCDFANFAANKITVNKPGTKVSLSGPLALSSTLGEIFLLQNSQAMPDVAWHRLTGEDNWISLLSLHNAQFDLMAKTPYIARHKGTPLLQQIETALVLQRDAQGQTLPLSPQTKILFLGGHDTNIANIAGMLGANWQLPQQPDNTPPGGGLVFELWQNPDNHQRYVAVKMFYQTMGQLRNAEKLDLKNNPAGRVPVAIDGCENSGDDKLCQLDTFQKKVAQAIEPACHIEAAAKEAAAKGGGGSGGGGSGGGGSSGCISESNENQTATASTVPPTSVTPSQSSTPTTSTSTYGPSERTELKLPSVNYTPIYVGIEKGCPSGRVPVKFTYNPGNKTVKSVSLRGSFNNWGEWPMELKNGTWETTVCLRPGRYEYKYFINGQWVKDMSDDGTGRPYDPDADAYAPDGYGGKNAVRVVEGREAFYVEFDPRDPAYLSIADKRTVVRFEAKRDTVESAVLVTDHGNYTMKLQVWWDFGETWRAEMPVEPADYYILVTSSDGGKFAVLNTSESPFFHFDGVEGFPQLEWVSNGITYQIFPDRFNNGNKSNDALALDHDELILNQVNPGQPILSNWSDPITPLHCCHQYFGGDIKGITEKLDYLQSLGVTIIYINPIFLSGSAHGYDTYDYYRLDPKFGTEDELREFLDEAHRRGMRVIFDFVPNHCGIGNPAFLDVWEKGNESPYWDWFFVKKWPFKLGDGSAYVGWWGFGSLPKLNTANQEVREYLIGAALHWIEFGFDGIRVDVPNEVLDPGTFFPELRKAVKEKKPDAYLVGEIWTLSPEWVKGDRFDSLMNYALGRDILLNYAKGLLSGESAMKMMGRYYASYGENVVAMGFNLVDSHDTSRVLTDLGGGKLGDTPSNESIQRLKLLSTLLYALPGTPVTFQGDERGLLGDKGHYDEQRYPIQWDTVNEDVLNHYRALAELRKRVPALRSSAMRFYTAKGGVMAFFRGHHDEVLVVANSWKKPALLELPEGEWKVIWPEDFSPELLRGTVEVPAIGIIILERG。
实施例3植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白Y-L4-T的面包烘焙应用
小麦面包制作方法：
(1)小麦面包的配方：以300g金龙鱼高筋小麦粉、4.5g高活性酵母、18g糖、3g盐、180g水为原料，分别向上述原料中添加融合蛋白Y-L4-T(每Kg小麦粉添加3.25、6.5或13mg融合蛋白)或植酸酶YiAPPA和普鲁兰水解酶TK-PUL的混合酶(每kg小麦粉添加1.15mgYiAPPA+2.1mg TK-PUL、2.3mgYiAPPA+4.2mg TK-PUL或4.6mgYiAPPA+8.4mg TK-PUL)，并以不添加酶的小麦面包作为对照。
(2)小麦面包的加工流程：按照上述配方体系称取各组分，将其倒入搅拌缸内搅拌至配料均匀，然后倒入适量水，低速搅拌3min再高速搅拌5min。将混合好的面团取出并静置5min，然后将面团大概分切为90g/块。将这些面团于37℃、90％相对湿度的培养箱中孵育90min，进行醒发。将醒发结束的面团以上火170℃、下火210℃烘烤20min。烘烤结束后，将小麦面包在室温下冷却2h后放置于4℃、46％相对湿度的条件下储藏。
每kg小麦粉添加3.25mg融合蛋白制成的小麦面包命名为小麦面包①号；每kg小麦粉添加6.5mg融合蛋白制成的小麦面包命名为小麦面包②号；每kg小麦粉添加13mg融合蛋白制成的小麦面包命名为小麦面包③号；每kg小麦粉添加1.15mg YiAPPA+2.1mg TK-PUL混合酶制成的小麦面包命名为小麦面包④号；每kg小麦粉添加2.3mg YiAPPA+4.2mg TK-PUL混合酶制成的小麦面包命名为小麦面包⑤号；每kg小麦粉添加4.6mgYiAPPA+8.4mg TK-PUL混合酶制成的小麦面包命名为小麦面包⑥号。
小麦面包的比容测定：采用油菜籽置换法测定储藏第0天小麦面包的比容。取待测小麦面包样品，称重后放入一定容积的容器中，将油菜籽加入容器中，完全覆盖面包样品并摇实填满，用直尺将填充剂刮平，取出面包，将油菜籽倒入量筒中测量体积，容积体积减去油菜籽体积得到面包体积。面包比容(SV)＝面包体积(V)/面包质量(m)。小麦面包的比容测定结果如表4所示，经酶处理的小麦面包(小麦面包①～⑥号)的比容均大于对照组的比容；在添加等量酶的情况下，经融合蛋白处理的小麦面包(小麦面包①～③号)的比容均大于经混合酶处理的小麦面包(小麦面包④～⑥号)的比容；小麦面包③号的比容最大，即每Kg小麦粉添加13mg融合蛋白制成的小麦面包比容最大。
表4小麦面包的比容
小麦面包的质构特性测定：分别将储藏第0天、1天、3天、5天、7天的面包切成3cm的薄片，使用质地分析仪测定不同储藏天数小麦面包的硬度和弹性参数。小麦面包的质构特性测定结果如表5所示，融合蛋白和混合酶的添加显著降低了小麦面包的硬度，并提高了小麦面包的弹性；在小麦面包于4℃储藏后，融合蛋白和混合酶的添加也显著改善了小麦面包的硬度和弹性。融合蛋白和混合酶对于改善小麦面包的质构特性非常有效，并且改善效果与酶剂量呈正比；在添加等量酶的条件下，融合蛋白改善小麦面包质构特性的效果明显优于混合酶。小麦面包的质构特性测定结果表明，小麦面包③号的质构特性改善程度最明显，即每Kg小麦粉添加13mg融合蛋白制成的小麦面包的质构特性改善最明显。
表5小麦面包的质构特性
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白Y-L4-T，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.46所示。
2.编码权利要求1所述的植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白Y-L4-T的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示。
3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体上含有权利要求2所述的基因。
4.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物中包含权利要求3所述的重组载体。
5.权利要求1所述的植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白Y-L4-T在降解植酸和淀粉中的应用。
6.权利要求1所述的植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白Y-L4-T在生产面食中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述面食包括面包。
8.一种改善面包比容和/或质构特性的方法，其特征在于，包括在面包制作过程中添加权利要求1所述的植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白Y-L4-T的步骤。
9.权利要求2所述的基因、权利要求3所述的重组载体或权利要求4所述的重组微生物在生产植酸酶-普鲁兰水解酶融合蛋白Y-L4-T中的应用。
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