CN120683092A - 一种聚羟基脂肪酸酯工程菌及其制备方法和应用 - Google Patents

一种聚羟基脂肪酸酯工程菌及其制备方法和应用

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种聚羟基脂肪酸酯工程菌及其制备方法和应用。该制备方法包括步骤1：选取PHA生产菌株接种到培养基上，进行摇床扩增培养；步骤2：培养完成后采用低温等离子体诱变仪进行诱变育种；步骤3：对产PHA的优良突变菌株进行筛选、分离，构建高产PHA突变菌库；步骤4：对诱变后的突变菌库进行复合筛选，选择高产PHA的菌株。本发明通过提供一种采用新型小型等离子体诱变仪构建产PHA的工程菌的方法及其应用，通过低温等离子体诱变构建筛选高产PHA的工程菌，以提高PHA产量，为可降解生物材料PHA的生产提供新路径。

Description

一种聚羟基脂肪酸酯工程菌及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种聚羟基脂肪酸酯工程菌及其制备方法和应用。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHA)是一类由多种微生物在碳源充足而其他必需营养元素缺乏的条件下合成的可降解高分子聚酯。类似于假单胞菌或伯克氏菌产生鼠李糖脂的生物合成方式，PHA材料具有优异的生物相容性和环境友好性，可分为短链和/或中长链类型，包含均聚物及共聚物，通常以直径约0.2至0.7μm的不溶性颗粒形式在细胞质中储存。
凭借其可生物降解性及机械性能，PHA不仅被视为传统石油基塑料的环保替代品，更在生物医学领域表现出广泛的应用前景。工业上，采用微生物发酵技术获得富含PHA的菌株，再经过精细提纯制备出高纯度产品。其医用性主要体现在以下几个方面：
组织工程与再生医学：PHA材料可用于构建生物相容性支架，支持细胞黏附与增殖，为组织修复和再生提供理想微环境。
药物控释与载体系统：得益于其可控降解特性，PHA可制成缓释型药物载体，实现药物在体内的精准、持续释放，确保疗效同时降低副作用。
可吸收医疗器械：聚羟基丁酸酯(PHB)作为PHA家族的重要成员，其优良的生物相容性与缓释性能使其在可吸收缝合线、植入物和其他医用器械中得到了广泛应用，其降解产物对人体及环境均无害。
总之，凭借出色的生物安全性，PHA材料在医药、组织工程、医疗器械、和药物控释等领域展现了广阔的应用前景，为现代医疗材料的绿色可持续发展提供了强有力的技术支撑。
目前PHA生产主要通过菌株发酵工程，代谢工程实现，具有多种方法工艺。PHA生产的关键在于菌种性能，它直接决定了生产效率、工艺稳定性以及最终产品的质量。筛选和培育高产PHA菌株一直是提高工艺效能的关键步骤。常用的方法包括基因改造、人工物理诱变、化学诱变等策略，通过优化代谢途径和调控基因表达来提升PHA的合成效率。目前常用的生产菌株(如罗尔斯通氏菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属和盐单胞菌属)。如CN113583922A公布了一种利用基因工程改造和诱变筛选构建高效PHA工程菌的综合方法，其主要是利用ARTP诱变得到一种低盐浓度生长的盐单胞菌后进行结合基因分子改造提高PHA生产。
CN118516416A公开了一种降低细胞色素d氧化酶复合物基因cydA的表达量或其编码蛋白的活性能够显著降低发酵后期盐单胞菌对溶氧的需求，实现在发酵后期低转速甚至无搅拌的缺氧或无氧条件下，菌株仍然能够高效地进行PHA合成，进而有效提升PHA的产量。但这些方法主要是在着重于基因工程的基础促进PHA的生产，使用新型方法也是注重于降低其生长适应要求而非利用等离子体等方法作为主要提高手段改造菌株。
室温下能产生大量高能活性粒子(RONS)的低温等离子体是一种有前景的物理诱变方法。等离子体也称为物质的第四态，是气体被高压电激发后部分电离或完全电离时的状态，主要由处于中性、电离和激发态的自由电子、原子和分子等成分组成，可有效作用于微生物的DNA分子，导致DNA链断裂或碱基损伤引发基因突变。进而引发菌株SOS修复机制，产生种类多样的错配位点，形成突变并最终经稳定遗传生成丰富突变库
发明内容
为了综合解决上述问题，发明提供一种采用新型小型等离子体诱变仪构建产PHA的工程菌的方法及其应用，通过低温等离子体诱变构建筛选高产PHA的工程菌，以提高PHA产量，为可降解生物材料PHA的生产提供新路径。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种聚羟基脂肪酸酯工程菌的制备方法，包括
步骤1：选取PHA生产菌株接种到培养基上，进行摇床扩增培养；
步骤2：培养完成后采用低温等离子体诱变仪进行诱变育种；
步骤3：对产PHA的优良突变菌株进行筛选、分离，构建高产PHA突变菌库；
步骤4：对诱变后的突变菌库进行复合筛选，选择高产PHA的菌株。
优选的，步骤1的PHA生产菌株为罗尔斯通氏菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属或盐单胞菌属中的任意一种。
优选的，其特征在于，步骤2的诱变条件为：在低温等离子体诱变仪功率6～8W，频率20-40Khz，电极距离菌液载片3-5cm的条件下，作用10-150s。
优选的，步骤3选择死亡率在96～99％的菌株。
优选的，其特征在于，步骤4复合筛选时采用尼罗红荧光染色结合96孔板高通量筛选。
本发明第二方面提供如上方法制备的聚羟基脂肪酸酯工程菌。
本发明第三方面提供聚羟基脂肪酸酯工程菌在生产聚羟基脂肪酸酯中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明在诱变环节采用了新型小型等离子体诱变设备，并明确了功率(6～8W)、频率(20～40KHz)、作用距离(3～5cm)和作用时间(10～150s)等关键参数。
这些特定诱变条件在大气环境下进行，可精确控制诱变强度和时间，从而在保证较高突变率的同时，维持较好的菌株活性。诱变效率和可重复性更高。
2.本发明通过对不同诱变强度分组后，统计菌株死亡率，选择死亡率在96～99％之间的组别进行高产PHA突变菌库的构建。这一策略能够兼顾“突变幅度足够大”与“仍保留活力个体”的平衡点，大幅提升后续高产菌株出现的概率。现有技术中往往仅凭经验或简单调整诱变时间，而缺少针对死亡率的精确筛选，导致高产突变株的获取效率不高。
3.在复合筛选阶段，本发明采用了尼罗红荧光染色法，并借助酶标仪的荧光检测功能，对96孔板中的菌株进行高通量定量筛选。与传统的“先培养后提取再检测PHA含量”方式相比，该方法可在较早期、较小体量的培养规模(96孔板)就对大量菌株进行快速、半定量评估，大幅节省筛选时间和成本这种“荧光+高通量”的复合筛选技术为快速、精准地锁定高产菌株提供了重要保障。
4.本发明不仅考量PHA合成量，也将前12小时和48小时的生长速度作为重要指标。通过对生长速度和PHA荧光值的综合评定，可以挑选出兼具快速生长与高PHA产量的突变株，从而在后续发酵规模放大时更具实际价值。与现有单一PHA产量指标筛选相比，这种复合筛选方式显著提高了菌株在工业化生产环境中的适应性。
5.在荧光检测锁定候选菌株后，本发明通过离心、冻干、酯化等步骤，采用GC检测进行PHA含量与组成的最终定量确认。这种“双重检测(荧光预筛+GC定量)”模式既保证了高通量筛选的效率，又能通过准确的化学分析确认PHA产量与成分，最大程度上降低了假阳性或漏筛的风险。
因此，本发明在低温等离子体诱变的设备与参数设计、死亡率控制构建突变菌库、高通量荧光筛选方法以及最终精确定量检测等多个方面，均进行了有针对性的改进与组合，解决了传统诱变和筛选效率低、周期长、过程不可控等问题。正是这些“差异性结构或步骤”共同形成了本发明的创新核心，对快速、高效地获得稳定高产PHA的工程菌具有决定性贡献。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
在附图中：
图1为涂板死亡率观测表；
图2为死亡曲线；
图3为45h生长曲线；
图4为尼罗红荧光检测结果图；
图5为GC检测结果图；
图6为本发明的方法流程图。
具体实施方式
以下结合图1-图6本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
一种聚羟基脂肪酸酯工程菌，采用实施例2的方法制备得到。
实施例2：
一种聚羟基脂肪酸酯工程菌的制备方法，包括
步骤1：选取PHA生产菌株接种到培养基上，进行摇床扩增培养。PHA生产菌株为罗尔斯通氏菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属或盐单胞菌属中的任意一种。
实施例中，盐单胞菌属(Halomonas sp.，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号:CICC 24456)，接种到培养基上，进行摇床扩增培养。
进一步的，培养基为LB肉汤培养基，培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0-7.4，余量为水，盐单胞菌情况下额外添加5％-7％氯化钠。
进一步的，培养基进行灭菌，条件为121度，20分钟，冷却至室温后使用。
进一步的，接种量为5％，30度，200r/min培养12h至对数期，OD大于3。
步骤2：培养完成后采用低温等离子体诱变仪进行诱变育种；
进一步的，微生物培养至OD600大于3即可停止摇床培养。将培养好的微生物用6％的氯化钠盐水稀释OD600＝1
诱变育种时，将不锈钢片为Ф10mm的圆片小铁片置于酒精灯下高温灭菌后冷却静置10mins备用。取10ul菌液均匀涂布于无菌小铁片上，微微晾干放入等离子体诱变仪中低温等离子体源正下方进行诱变。
按照低温等离子体诱变仪的操作流程，育种条件为在功率6～8W，频率20-40Khz的条件下，电极距离菌液载片3-5cm的条件下，作用10-150s。
在大气压辉光放电过程中，低温等离子体源产生大量的活性粒子(包括自由电子、氧自由基和氮自由基等)会引起真菌DNA结构发生多样性损伤，进而形成大量突变位点。
步骤3：对产PHA的优良突变菌株进行筛选、分离，构建高产PHA突变菌库。具体的：
将步骤2诱变后的悬浮液稀释一定梯度后涂布于LB60平板中，在该条件下，计算菌株Halomonas sp的致死率和突变率结果。(致死率＝(辉光放电处理前菌落数-辉光放电处理后菌落数/辉光放电处理前菌落数)*100％，突变率＝(突变菌落数/辉光放电处理后菌落数)*100％)。
在梯度诱变时间条件下，可通过对比菌落与出发菌株颜色的深浅、半径大小得到多种突变菌株。观测结果图1、死亡曲线图2，发现在第100s和120s死亡率和突变率相比其他组别更高，并可观察到许多相比于出发菌株菌落形态具有明显差异。所以选择该组别作为处理组构建突变库进行筛选突变菌。
步骤4：对诱变后的突变菌库进行复合筛选，选择高产PHA的菌株。
选择48株形态差异明显的突变菌株放置于含有1ml LB60的48孔深孔板中30度、200r/min培养12h；将培养后突变菌各稀释2*102倍加入96孔酶标板中，在酶标仪温育模式下，以30-36度，中或高摇速，45h-56h培养时间，检测突变菌株生长曲线。
对48株突变菌生长曲线数据进行分析计算，并针对计算获得表1中所示的各突变菌前12h平均生长速度，总时间生长速度等指标和图3生长曲线本身综合选取4-8株突变菌进行发酵培养基的发酵培养，此处选取的是前12h最优异的15号菌株和45h生长最优异的26、27、30、35号突变菌株进行发酵生产检测。
进一步的，发酵培养基培养基的一般配方为:0.1‰-2‰(NH4)2CL，0.1‰-1‰MgSO4，5‰-10‰Na2HPO4·12H2O，0.5‰-2‰KH2PO4，不超过0.1％的其他微量元素(Fe(III)-NH4-Citrate，CaCl2·2H2O，ZnSO4·7H2O，MnCl2·4H2O，H3BO3，CoCl2·6H2O，CuSO4·5H2O，NiCl2·6H2O，NaMoO4·2H2O微量)(pH调至约9.0)。
优选为：0.1％(NH4)2SO4或者0.2％尿素，0.02％MgSO4，
1.0％Na2HPO4·12H2O，0.15％KH2PO4，不超过0.1％的其他微量元素(Fe(III)-NH4-Citrate，CaCl2·2H2O，ZnSO4·7H2O，MnCl2·4H2O，H3BO3，CoCl2·6H2O，CuSO4·5H2O，NiCl2·6H2O，NaMoO4·2H2O)(pH调至约9.0)。
进一步的，培养条件：30度、200r/min培养48h。
表1生长曲线指标生长速度表格
步骤4中，发酵完成后，取突变菌发酵液1mL，离心除去培养基后加入清水后额外加入30-50ul尼罗红荧光染色液进行染色30min，染色完成后置于应该荧光酶标板(96孔板)中，在发射光530-530nm接收光600-605nm荧光条件下检测荧光强度间接表征PHA产值；
发现30和35号菌株荧光强度相比1号出发菌株明显提高。选择作为后续检测菌株进行下一步操作。
接着，选取荧光值最高前2菌株30和35号菌株发酵液10-20ml进行离心冻干，8000-10000rpm 10mins重复三次，用ddH2O冲洗。冻干后取菌体20-40mg研磨酯化反应用于GC检测确定最终产量，取最高产量突变菌株为最佳突变菌。
尼罗红荧光检测结果图4发现选取的五株突变菌株中26、30、35菌株的荧光变化最为明显，基于所有数据选取30、35号菌株进行后续GC产量检测。
GC检测结果图5发现最高产量突变菌株35号为最佳突变菌。产量相比1号出发菌株产量提高27％。说明该方法有效筛选出阳性有效高产突变PHA菌株。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (7)

1.一种聚羟基脂肪酸酯工程菌的制备方法，其特征在于，包括
步骤1：选取PHA生产菌株接种到培养基上，进行摇床扩增培养；
步骤2：培养完成后采用低温等离子体诱变仪进行诱变育种；
步骤3：对产PHA的优良突变菌株进行筛选、分离，构建高产PHA突变菌库；
步骤4：对诱变后的突变菌库进行复合筛选，选择高产PHA的菌株。
2.根据权利要求1所述的一种聚羟基脂肪酸酯工程菌的制备方法，其特征在于，步骤1的PHA生产菌株为罗尔斯通氏菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属或盐单胞菌属中的任意一种。
3.根据权利要求2所述的一种聚羟基脂肪酸酯工程菌的制备方法，其特征在于，步骤2的诱变条件为：在低温等离子体诱变仪功率6～8W，频率20-40Khz，电极距离菌液载片3-5cm的条件下，作用10-150s。
4.根据权利要求3所述的一种聚羟基脂肪酸酯工程菌的制备方法，其特征在于，步骤3选择死亡率在96～99％的菌株。
5.根据权利要求4所述的一种聚羟基脂肪酸酯工程菌的制备方法，其特征在于，步骤4复合筛选时采用尼罗红荧光染色结合96孔板高通量筛选。
6.一种如权利要求1-5任一项所述方法制备得到聚羟基脂肪酸酯工程菌。
7.权利要求6所述的聚羟基脂肪酸酯工程菌在生产聚羟基脂肪酸酯中的应用。
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