CN120731270A - 通过在水稻actin1启动子调控下过表达ospcs1、osabcc1和oshma3基因来产生低砷低镉水稻 - Google Patents

通过在水稻actin1启动子调控下过表达ospcs1、osabcc1和oshma3基因来产生低砷低镉水稻

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Abstract

本发明涉及一种经基因修饰的水稻植株或植株细胞，其包含可操作地连接到OsActin1启动子的异源重金属ATP酶基因、可操作地连接到OsActin1启动子的异源ATP结合盒(ABC)转运蛋白基因、以及可操作地连接到OsActin1启动子的异源植物螯合肽合酶基因，其中与在所述经修饰的水稻植株的其他营养组织中的活性相比，OsActin1启动子在所述经修饰的水稻植株的种子胚乳中具有低活性；其中与未进行所述基因修饰的对照水稻植株相比，所述经基因修饰的水稻植株的水稻谷粒中的砷(As)和镉(Cd)减少。本发明还涉及构建此类经基因修饰的水稻植株或植株细胞的方法，以及用于进行此方法的试剂盒。

Description

通过在水稻ACTIN1启动子调控下过表达OSPCS1、OSABCC1和 OSHMA3基因来产生低砷低镉水稻
技术领域
本发明涉及生产转基因水稻植株，该转基因水稻植株经基因修饰而在谷粒中含有比对照非转基因水稻谷粒的砷和镉水平降低的砷和镉水平，本发明涉及用于制备此类植株的方法，并且涉及用于将水稻植株转化成此类植株的细菌。更具体而言，本发明的经基因修饰的植株过表达可操作地连接到OsActin1启动子的异源P1B型重金属ATP酶基因、可操作地连接到OsActin1启动子的异源ATP结合盒(ABC)转运蛋白基因、以及可操作地连接到OsActin1启动子的异源植物螯合肽合酶基因，其中与在所述经修饰的水稻植株的其他营养组织中的活性相比，OsActin1启动子在所述经修饰的水稻植株的种子胚乳中具有低活性。
背景技术
砷(As)是被归类为无阈值一类致癌物的剧毒类金属，可引发对人类的急性和慢性的健康危害(参见文献Hughes，2002)。镉(Cd)是一种有毒重金属，其优先在人类肝脏和肾脏中积累，导致肾小管功能障碍、骨质疏松症、心血管疾病和癌症(参见文献Fowler，2009)。人类主要是通过受As和Cd这两种有毒元素污染的水和食品而暴露于As和Cd。水稻(Oryzasativa)供养了全球人口的半数以上，是Cd和As的主要膳食来源。与其他谷类作物相比，水稻从土壤中摄取As和Cd的效率可能更高，这归因于Cd和As的高效摄取和运输系统，以及在淹水稻田中为主要形态的亚砷酸盐[As(III)]的更高生物可及性(参见文献Ma等人，2008；Sui等人，2018；Xu等人，2008)。在孟加拉国和印度，用于灌溉农作物的地下水受到As污染，导致水稻成为As的主要暴露源，占总As摄取量的约50％(参见文献Panda等人，2010)。在日本和中国，水稻是广大民众膳食Cd摄取的最重要的来源(参见文献Song等人，2017；Tsukahara等人，2003)。因此，开发和生产低As低Cd水稻一直是保障广大民众健康所需要的。
上调参与As或Cd封存的基因是产生低As或低Cd水稻谷粒的重要且有效的方法。OsHMA3是属于P1B型重金属ATP酶家族的液泡膜转运蛋白(参见文献Miyadate等人，2011；Ueno等人，2010)。OsHMA3参与将Cd从胞质溶胶运输到根部细胞液泡中进行封存，从而限制Cd从根部向芽部的运输，减轻了Cd对水稻植株的地上部分的毒性并且减少了Cd在水稻谷粒中的积累(参见文献Miyadate等人，2011；Ueno等人，2010)。OsHMA2是另一种P1B型重金属ATP酶，其是主要在根部和茎节的维管束中表达的位于质膜上的内流转运蛋白(参见文献Takahashi等人，2012；Yamaji等人，2013)。OsHMA2参与锌(Zn)和Cd通过韧皮部运输到发育组织(参见文献Takahashi等人，2012；Yamaji等人，2013)。在玉米泛素基因启动子或水稻OsHMA2启动子调控下的OsHMA3的过表达选择性增加了Cd在根部液泡中的封存，并减少了Cd向水稻芽部和谷粒的转移(参见文献Shao等人，2018；Ueno等人，2010)。在水稻中，OsABCC1是在As解毒中发挥重要作用的液泡膜转运蛋白。OsABCC1敲除突变体对As处理表现出超敏性，并且水稻谷粒中的As浓度增加(参见文献Hayashi等人，2017；Song等人，2014)。在胞质溶胶中，植物螯合肽(PC)与As(III)螯合形成PC-As(III)复合物，然后其通过OsABCC1被运输到液泡中进行封存(参见文献Hayashi等人，2017；Song等人，2014)。PC是非编码的重金属(类)结合肽，其一般结构为(γ-Glu-Cys)n(2-11)-Gly(参见文献Grill等人，1985)。通过植物螯合肽合酶(PCS)由谷胱甘肽(GSH)合成PC(参见文献Ha等人，1999)。在水稻中已鉴定出两种PCS，即OsPCS1和OsPCS2(参见文献Das等人，2017；Hayashi等人，2017；Li等人，2007)。发现OsPCS1的过表达增强了PC依赖性的As封存，并显著减少了水稻谷粒中的As积累(参见文献Hayashi等人，2017)。在一项更为复杂的研究中，通过共表达两种不同的、在RCc3(水稻根特异性cDNA克隆3)启动子调控下的维管As封存基因ScYCF1(酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)酵母镉因子)和OsABCC1，以及由玉米泛素基因启动子驱动的c-ECS(一种细菌c-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因)，获得了较低谷粒As的水稻(参见文献Deng等人，2018)。然而，在另一则报道中，小麦植物螯合肽合酶基因(TaPCS1)在水稻中的异源表达使得Cd敏感性增强(参见文献Wang等人，2012)。因此，有必要解决利用PCS调控水稻谷粒中As和Cd积累的矛盾。更重要的是，注意到迄今为止，尚无研究报道关注通过基因工程方法同时减少水稻谷粒中的As和Cd。
发现水稻肌动蛋白1基因(OsActin1)启动子在营养组织和生殖组织这两者中均具有高活性(参见文献Park等人，2010)。然而，值得注意的是，在种子发育过程中，主要在糊粉层和胚中而不是在淀粉胚乳中检测到OsActin1启动子的活性(参见文献Park等人，2010)，这可能具有主要在营养组织中驱动基因过表达的潜力。在本发明中，我们报道了在OsActin1启动子的调控下过表达或共过表达OsPCS1、OsABCC1和OsHMA3基因的转基因水稻株系的产生和表征。我们的目的在于通过增强营养组织和器官的细胞液泡中As和Cd的封存来产生低As低Cd的水稻谷粒，且不会使转基因植物产生任何多效性表型或产量损失。
发明内容
在本公开中，提供了一种用于调节水稻中As和Cd分配的策略，其结果是同时大幅减少了谷粒中As和Cd的积累，且不损害农业性状。螯合重金属(类)的植物螯合肽(PC)在植物Cd和As的解毒中起到重要作用。液泡PC-As转运蛋白基因OsABCC1和PC合酶基因OsPCS1的共过表达在减少水稻谷粒中的As浓度和提高As耐受性方面表现出协同效应，从而使得As封存最大化。OsPCS1的过表达使水稻植株具有As耐受性，但导致Cd超敏性。当暴露于Cd时，从OsPCS1转基因植株中分离出的液泡中的Cd浓度远低于T5105对照植株的液泡中的Cd浓度。对T5105和OsHMA3转基因植株的叶肉原生质体和液泡中Cd和PC2-Cd的运输活性的分析表明，PC2-Cd通过OsHMA3阻止了Cd封存在液泡中。OsHMA3和OsPCS1同时过表达完全挽救了由OsPCS1过表达引起的Cd超敏性所导致的生长缺陷，这表明OsHMA3与PC竞争以结合Cd。最后，与T5105植株相比，水稻植株中在OsActin1启动子调控下OsABCC1、OsPCS1和OsHMA3的三重过表达使得糙米中的As浓度减少了92％，并且Cd浓度减少了98％，且不影响植株生长和必需元素稳态。该策略可应用于减少通过食用水稻的As和Cd的膳食摄入量。
根据第一方面，本发明提供了一种经基因修饰的水稻植株或植株细胞，其包含可操作地连接到OsActin1启动子的异源P1B型重金属ATP酶基因；可操作地连接到OsActin1启动子的异源ATP结合盒(ABC)转运蛋白基因、以及可操作地连接到OsActin1启动子的异源植物螯合肽合酶基因，其中与在经修饰的水稻植株的其他营养组织中的活性相比，OsActin1启动子在经修饰的水稻植株的种子胚乳中具有低活性；其中与未进行所述基因修饰的对照水稻植株相比，所述经基因修饰的水稻植株的水稻谷粒中的砷(As)和镉(Cd)减少。
在一些实施方案中，OsActin1启动子包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：31所示的核酸序列或其功能序列变体。
在一些实施方案中，异源P1B型重金属ATP酶基因编码SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列；异源ABC转运蛋白基因编码SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列，并且植物螯合肽合酶基因编码SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，异源P1B型重金属ATP酶基因包含由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO：22所示的多核苷酸序列具有至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或100％序列同一性的核酸序列，异源ABC转运蛋白基因包含由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO：36所示的多核苷酸序列具有至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或100％序列同一性的核酸序列，并且异源植物螯合肽合酶基因包含由于遗传密码的简并性而与SEQ IDNO：32所示的多核苷酸序列具有至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或100％序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，外源P1B型重金属ATP酶基因、外源ABC转运蛋白基因和/或外源植物螯合肽合酶基因来自谷类作物。
在一些实施方案中，异源P1B型重金属ATP酶基因为OsHMA3并且包含SEQ ID NO：22所示的核酸序列，异源ABC转运蛋白基因为OsABCC1并且包含SEQ ID NO：36所示的核酸序列，并且异源植物螯合肽合酶基因为OsPCS1并且包含SEQ ID NO：32所示的核酸序列。
在一些实施方案中，经基因修饰的水稻植株或植株细胞包含可操作地连接到OsActin1启动子的异源OsHMA3基因、可操作地连接到OsActin1启动子的异源OsABCC1基因、以及可操作地连接到OsActin1启动子的异源OsPCS1基因。
在一些实施方案中，经基因修饰的水稻植株或植株细胞属于亚洲栽培稻(Oryzasativa L)种。
根据第二方面，本发明提供了一种构建经基因修饰的水稻植株的方法，与对照水稻植株的水稻谷粒相比，经基因修饰的水稻植株的水稻谷粒中的砷(As)和镉(Cd)减少，该方法包括以下步骤：
a)产生包含可操作地连接到OsActin1启动子的异源P1B型重金属ATP酶基因的经基因修饰的水稻植株；
b)产生包含可操作地连接到OsActin1启动子的异源ATP结合盒(ABC)转运蛋白基因的经基因修饰的水稻植株；
c)产生包含可操作地连接到OsActin1启动子的异源植物螯合肽合酶基因的经基因修饰的水稻植株；
d)选择分别过表达所述外源P1B型重金属ATP酶基因、所述外源ATP结合盒(ABC)转运蛋白基因和所述外源植物螯合肽合酶基因的经基因修饰的水稻植株；
e)将三种经基因修饰的水稻植株中的两种杂交，以产生就外源基因而言的双纯合子植株；以及
f)将步骤(e)中的双纯合子植株与第三种经基因修饰的水稻植株杂交，以产生过表达所述外源基因的三重纯合子植株。
在一些实施方案中，OsActin1启动子如第一方面所限定。
在根据第二方面的方法的一些实施方案中，异源基因如第一方面所限定。
根据第二方面，本发明提供了一种用于构建经基因修饰的水稻植株的试剂盒，与对照水稻植株的水稻谷粒相比，所述经基因修饰的水稻植株的水稻谷粒中的砷(As)和镉(Cd)减少，其中试剂盒包括：包含含有可操作地连接到OsActin1启动子的异源重金属ATP酶基因的载体的细菌，和/或包含含有可操作地连接到OsActin1启动子的异源ATP结合盒(ABC)转运蛋白基因的载体的细菌，和/或包含含有可操作地连接到OsActin1启动子的异源植物螯合肽合酶基因的载体的细菌。在优选的实施方案中，所述细菌为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。
在一些实施方案中，OsActin1启动子包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：31所示的核酸序列或其功能序列变体。
在一些实施方案中，异源P1B型重金属ATP酶基因编码SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列；异源ABC转运蛋白基因编码SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列，并且植物螯合肽合酶基因编码SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，异源P1B型重金属ATP酶基因包含由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO：22所示的多核苷酸序列具有至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或100％序列同一性的核酸序列，异源ABC转运蛋白基因包含由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO：36所示的多核苷酸序列具有至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或100％序列同一性的核酸序列，并且异源植物螯合肽合酶基因包含由于遗传密码的简并性而与SEQ IDNO：32所示的多核苷酸序列具有至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或100％序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，外源P1B型重金属ATP酶基因、外源ABC转运蛋白基因和/或外源植物螯合肽合酶基因来自谷类作物。
在一些实施方案中，异源P1B型重金属ATP酶基因为OsHMA3并且包含SEQ ID NO：22所示的核酸序列，异源ABC转运蛋白基因为OsABCC1并且包含SEQ ID NO：36所示的核酸序列，并且异源植物螯合肽合酶基因为OsPCS1并且包含SEQ ID NO：32所示的核酸序列。
附图说明
图1示出了本研究中使用的二元构建体和基因的图。(A)二元构建体的示意图。图的下部子图示出了位于二元构建体的T-DNA区的基因，该二元构建体具有衍生自pCAMBIA1305.1的骨架。图的上部子图示出了用于替换pCAMBIA1305.1中的GUSPlus的目的基因。OsHMA3和OsPCS1基因的cDNA克隆分别用于构造构建体pCActin1-cHMA3和pCActin1-cPCS1，而OsABCC1基因的基因组克隆用于构造构建体pCActin1-gABCC1。在所有构建体中，用OsActin1启动子替换pCAMBIA1305.1中的CaMV35S启动子。图未按比例绘制。(B)pCActin1-gABCC1的重叠群图谱。由Sequencher 5.1(基因编码公司，MI 48108，美国)生成重叠群图谱。其从T-DNA的左侧边界开始到右侧边界，之后是pC1305.1骨架区。pCActin1-gABCC1携带潮霉素磷酸转移酶基因(P35S：Hpt：T35S)，以及在如(A)所示的T-DNA区中的OsActin1基因启动子调控下的OsABCC1基因的基因组克隆(PActin1：gABCC1：TNos)。P35S：Hpt：T35S基因的转录方向朝向LB，而PActin1：gABCC1：TNos基因的转录方向朝向RB。(C)pCActin1-cPCS1的重叠群图谱。由Sequencher 5.1(基因编码公司，M148108，美国)生成重叠群图谱。其从T-DNA的左侧边界开始到右侧边界，之后是pC1305.1骨架区。pCActin1-cPCS1携带潮霉素磷酸转移酶基因(P35S：Hpt：T35S)，以及在如(A)所示的T-DNA区中的OsActin1基因启动子调控下的OsPCS1基因的cDNA克隆(PActin1：cPCS1：TNos)。P35S：Hpt：T35S基因的转录方向朝向LB，而PActin1：cPCS1：TNos基因的转录方向朝向RB。(D)pCActin1-cHMA3的重叠群图谱。由Sequencher5.1(基因编码公司，MI 48108，美国)生成重叠群图谱。其从T-DNA的左侧边界开始到右侧边界，之后是pC1305.1骨架区。pCActin1-cHMA3携带潮霉素磷酸转移酶基因(P35S：Hpt：T35S)，以及在如(A)所示的T-DNA区中的OsActin1基因启动子调控下的OsHMA3基因的cDNA克隆(PActin1：cHMA3：TNos)。P35S：Hpt：T35S基因的转录方向朝向LB，而PActin1：cHMA3：TNos基因的转录方向朝向RB。(A)至(D)中的缩略语：LB，左侧边界；T35S，CaMV35S终止子；Hpt CDS，潮霉素磷酸转移酶基因编码区P35S，CaMV35S启动子；PActin1，OsActin1启动子；GOI，目的基因；TNos，胭脂碱合酶基因终止子；RB，右侧边界ORF，开放阅读框
图2示出了产生OsHMA3过表达株系的结果。(A)通过Southern印迹杂交分析检测转基因PActin1：cHAM3：TNos植株(T0)中T-DNA的拷贝数。M，分子标记。(B)通过qRT-PCR检测T5105和转基因PActin1：cHAM3：TNos植株(T0)中OsHMA3基因的表达水平。仅选取并检测了携带单拷贝的PActin1：cHAM3：TNos基因的T0植株。(C)T5105和OsHMA3过表达株系HMA3-L3(T2)的形态学表型。在播种后第120天对植株进行成像。(D)和(E)T5105和OsHMA3过表达株系(T2)的株高(D)和结实率(E)。数值为平均值±SD，基于三次生物学重复。T5105和OsHMA3过表达株系之间没有观察到显著差异(学生t-检验的P＞0.05)。L1，HMA3-L1；L3，HMA3-L3；L12，HMA3-L12。
图3示出了产生OsABCC1过表达株系的结果。(A)通过Southern印迹杂交分析检测转基因PActin1：gABCC1：TNos植株(T0)中T-DNA的拷贝数。M，分子标记。(B)通过qRT-PCR检测T5105(NT)和转基因PActin1：gABCC1：TNos植株(T0)中OsABCC1基因的表达水平。仅选取并检测了携带单拷贝的PActin1：gABCC1：TNos基因的T0植株。(C)T5105和OsABCC1过表达株系ABCC1-L27(T2)的形态学表型。在播种后第120天对植株进行成像。(D)和(E)T5105和OsABCC1过表达株系(T2)的株高(D)和结实率(E)。数值为平均值±SD，基于三次生物学重复。T5105和OsABCC1过表达株系之间没有观察到显著差异(学生t-检验的P＞0.05)。L3，ABCC1-L3；L27，ABCC 1-L27；L31，ABCC1-L31。
图4示出了产生OsPCS1过表达株系的结果。(A)通过Southern印迹杂交分析检测转基因PActin1：cPCS1：TNos植株(T0)中T-DNA的拷贝数。M，分子标记。(B)通过qRT-PCR检测T5105(NT)和转基因PActin1：cPCS1：TNos植株(T0)中OsPCS1基因的表达水平。仅选取并检测了携带单拷贝的PActin1：cPCS1：TNos基因的T0植株。(C)T5105和OsPCS1过表达株系PCS1-L1(T2)的形态学表型。在播种后第120天对植株进行拍照。(D)和(E)T5105和OsPCS1过表达株系(T2)的株高(D)和结实率(E)。数值为平均值±SD，基于三次生物学重复。T5105和OsPCS1过表达株系之间没有观察到显著差异(学生t-检验的P＞0.05)。L1，PCS1-L1；L3，PCS1-L3；L4，PCS1-L4。
图5示出了OsHMA3过表达株系的表征结果。(A)T5105和三株独立的OsHMA3过表达株系的圆锥花序的形态。(B)T5105和OsHMA3过表达株系中OsHMA3的表达水平。(C)在经或不经Cd处理的土壤中生长的T5105和OsHMA3过表达株系的谷粒中的Cd浓度。(D)在经Cd处理的土壤中生长的T5105和OsHMA3过表达株系HMA3-L3的不同秸秆组织中的Cd浓度。(E)在Cd处理后第14天，T5105(NT)和OsHMA3过表达株系的幼苗。(F)和(G)在Cd处理后第14天，T5105和OsHMA3过表达株系的芽长(F)和干重(DW)(G)。数据为平均值±SD，基于三次生物学重复。使用学生t-检验计算T5105和OsHMA3过表达株系之间的显著差异(*P＜0.05；**P＜0.01)。对照，未经Cd处理的土壤；对照+Cd，含3mg/kg以CdSO4形式存在的Cd的土壤。
图6示出了OsABCC1过表达株系的表征结果。(A)T5105和OsABCC1过表达株系的圆锥花序的形态。(B)T5105和OsABCC1过表达株系中OsABCC1的表达水平。(C)在经或不经As处理的土壤中生长的T5105和OsABCC1过表达株系的谷粒中的As浓度。(D)在经As处理的土壤中生长的T5105和OsABCC1过表达株系ABCC1-L27的不同秸秆组织中的As浓度。(E)在As处理后第14天，T5105(NT)和OsABCC1过表达株系的幼苗。(F)和(G)在As处理后第14天，T5105和OsABCC1过表达株系的芽长(F)和干重(DW)(G)。全部数据为平均值±SD，至少基于三次生物学重复。使用学生t-检验计算T5105和OsABCC1过表达株系之间的显著差异(*P＜0.05；**P＜0.01)。对照，未经As处理的土壤；对照+As，含10mg/kg以NaAsO2形式存在的As的土壤。
图7示出了T5105和OsABCC1过表达株系对Cd处理的耐受性测试结果。(A)在含Cd的培养基中处理后第14天，T5105(NT)和OsABCC1过表达株系的幼苗。NT，T5105；L3，ABCC1-L3；L27，ABCC1-L27；L31，ABCC11-L31。(B)和(C)在含Cd的培养基中处理后第14天，T5105和OsABCC1过表达株系的芽长(B)和干重(DW)(C)。(D)土壤中生长的T5105和ABCC1-L27的谷粒中的Cd浓度。对照，未经Cd处理的土壤；对照+Cd，含3mg/kg以CdSO4形式存在的Cd的土壤。数值为平均值±SD，基于三次生物学重复。T5105和OsABCC1过表达株系之间没有观察到显著差异(学生t-检验的P＞0.05)。
图8示出了OsPCS1过表达株系的表征结果。(A)T5105和OsPCS1过表达株系的圆锥花序的形态。(B)T5105和OsAPCS1过表达株系中OsPCS1的表达水平。(C)在经或不经As处理的土壤中生长的T5105和OsPCS1过表达株系的谷粒中的As浓度。(D)在经或不经Cd处理的土壤中生长的T5105和OsPCS1过表达株系的谷粒中的Cd浓度。(E)和(F)在经As或Cd处理的土壤中生长的T5105和OsPCS1过表达株系PCS1-L1的不同秸秆组织中的As(E)或Cd(F)浓度。全部数据为平均值±SD，至少基于三次生物学重复。使用学生t-检验计算T5105和OsPCS1过表达株系之间的显著差异(*P＜0.05；**P＜0.01)。对照，未经As或Cd处理的土壤；对照+As，含10mg/kg以NaAsO2形式存在的As的土壤。对照+Cd，含3mg/kg以CdSO4形式存在的Cd的土壤。
图9示出了OsPCS1过表达株系的As和Cd耐受性的测试结果。(A)在As处理后第14天，T5105(NT)和OsPCS1过表达株系的幼苗。(B)和(C)在As处理后第14天，T5105和OsPCS1过表达株系的芽长(B)和干重(DW)(C)。(D)在Cd处理后第14天，T5105(NT)和OsPCS1过表达株系的幼苗。(E)和(F)在Cd处理后第14天，T5105和OsPCS1过表达株系的芽长(E)和干重(DW)(F)。全部数据为平均值±SD，基于三次生物学重复。使用学生t-检验计算T5105和OsPCS1过表达株系之间的显著差异(*P＜0.05；**P＜0.01)。NT，T5105；L1，PCS1-L1；L3，PCS1-L3；L4，PCS1-L4。
图10示出了OsABCC1和OsPCS1共过表达株系的As耐受性测试结果。(A)在As处理后第14天，T5105(NT)、ABCC1-L27(A27)、PCS1-L1(P1)以及OsABCC1和OsPCS1共过表达株系(AP)的幼苗。(B)和(C)如(A)所示的水稻植株的芽长(B)和干重(DW)(C)。(D)和(E)在如(A)所示的水稻植株的根部(D)和芽部(E)的As浓度。(F)在经或未经As处理的土壤中生长的T5105、ABCC1-L27、PCS1-L1和AP植株的谷粒中的As浓度。数据为平均值±SD，基于三次生物学重复。不同的字母表示通过单因素方差分析(ANOVA)随后进行LSD检验计算得出的显著差异，P＜0.05。对照，未经As处理的土壤；对照+As，含10mg/kg以NaAsO2形式存在的As的土壤。
图11示出了OsPCS1和OsHMA3共过表达株系的Cd耐受性测试结果。(A)在Cd处理后第14天，T5105(NT)、PCS1-L1(P1)、HMA3-L3(H3)、以及OsHMA3和OsPCS1共过表达株系(HP)的幼苗。(B)和(C)如(A)所示的水稻植株的芽长(B)和干重(DW)(C)。(D)和(E)在如(A)所示的水稻植株的根部(D)和芽部(E)的As浓度。(F)在经或未经Cd处理的土壤中生长的T5105、HMA3-L3、PCS1-L1和HP植株的谷粒中的Cd浓度。数据为平均值±SD，基于三次生物学重复。不同的字母表示通过单因素ANOVA随后进行LSD检验计算得出的显著差异，P＜0.05。对照，未经Cd处理的土壤；对照+Cd，含3mg/kg以CdSO4形式存在的Cd的土壤。
图12示出了OsPCS1过表达和植物螯合肽2-Cd复合物(PC2-Cd)对OsHMA3介导的液泡中Cd封存的影响的测试结果。(A)从在含Cd的培养基中生长的T5105和PCS1-L1幼苗中分离的液泡和原生质体中的Cd浓度。使用学生t-检验计算T5105和OsPCS1-L1之间的显著差异(**P＜0.01)。数据为平均值±SD，基于三次生物学重复。(B)在将原生质体与Cd或PC2-Cd复合物孵育后，T5105和HMA3-L3的液泡和原生质体中的Cd浓度。使用学生t-检验计算Cd处理和PC2-Cd处理之间的显著差异(**P＜0.01)。数据为平均值±SD，基于三次生物学重复。
图13示出了OsABCC1、OsPCS1和OsHMA3共过表达株系的谷粒中的As和Cd浓度。(A)T5105以及OsABCC1、OsPCS1和OsHMA3共表达株系(PAH)的形态学表型。播种后第120d对植株拍照。(B)T5105和PAH植株的株高。(C)T5105和PAH植株的圆锥花序和未抛光水稻谷粒。(D)T5105和PAH植株的结实率。(E)T5105和PAH植株的100粒谷粒的重量。数据为平均值±SD，(B)、(D)和(E)基于至少三次生物学重复。使用学生-t检验检测出T5105和PAH植株之间无显著差异(P＞0.05)。(F)和(G)在经或不经As和Cd双重处理的土壤中生长的T5105、PCS1-L1、ABCC1-L27、HMA3-L3和PAH植株的水稻谷粒中的As(F)和Cd(G)浓度。数据为平均值±SD，基于三次生物学重复。(F)和(G)中的不同字母表示通过单因素ANOVA随后进行LSD检验计算得出的显著差异，P＜0.05。对照，未经As或Cd处理的土壤；对照+As+Cd，含10mg/kg以NaAsO2形式存在的As和3mg/kg以CdSO4形式存在的Cd的土壤。
图14示出了T5105和转基因植株的谷粒中其他元素的浓度。T5105、PCS1-L1、ABCC1-L27、HMA3-L3和PAH植株在经或不经As和Cd双重处理的土壤中生长。通过ICP-MS测定谷粒中Co、Cu、Fe、Mn、Se和Zn的浓度。数据为平均值±SD，基于三次生物学重复。通过LSD检验，P＞0.05，T5105和转基因植株之间没有检测到显著差异。对照，未经As或Cd处理的土壤；对照+As+Cd，含10mg/kg以NaAsO2形式存在的As和3mg/kg以CdSO4形式存在的Cd的土壤。
图15示出了T5105、PCS1-L1、ABCC1-L27、HMA3-L3和PAH植株对As和Cd的耐受性的测试结果。(A)在As和Cd处理后第14天，T5105、PCS1-L1(P1)、ABCC1-L27(A27)、HMA3-L3(H3)和PAH植株的幼苗。(B)和(C)如(A)所示的水稻植株的芽长(B)和干重(DW)(C)。(D)和(E)在如(A)所示的水稻植株的根部(D)和芽部(E)的As浓度。(F)和(G)在如(A)所示的水稻植株的根部(F)和芽部(G)的Cd浓度。数据为平均值±SD，基于三次生物学重复。不同的字母表示通过单因素ANOVA随后进行LSD检验计算得出的显著差异，P＜0.05。As+Cd处理1(As+CD T1)，包含50μM NaAsO2+10μM CdSO4的半强度MS培养基；As+Cd处理2(As+Cd T2)，包含75μMNaAsO2和20μM CdSO4的半强度MS培养基。
具体实施方式
为方便起见，本说明书中提及的参考文献以参考文献列表的形式列出，并附于实施例的末尾。这些参考文献的全部内容均通过引用并入本文。
定义
为方便起见，在此收集了说明书、实施例和附加权利要求中使用的一些术语。
在本文中，将术语“包括”定义为在实践本发明时其中的各种组分、成分或步骤可以联合使用。因此，术语“包括”涵盖了更有限制性的术语“基本上由……组成”和“由……组成”。
术语“农杆菌属(Agrobacterium)”是指土壤传播的、革兰氏阴性的、杆状致植物病细菌，其导致冠状根瘤。术语“农杆菌属”包括但不限于根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株(通常导致受感染植株出现冠状根瘤)和发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogens)菌株(导致受感染宿主植株出现毛根病)。植株细胞感染农杆菌通常会导致受感染细胞产生冠瘿碱(例如，胭脂氨酸、农杆碱、章鱼碱等)。
在提及诸如基因等核酸序列时所用的术语“表达”是指将基因中编码的遗传信息通过基因的“转录”(即通过RNA聚合酶的酶促作用)转化为RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)的过程，以及在适用的情况下(当基因编码蛋白质时)，通过mRNA的“翻译”转化为蛋白质的过程。基因表达可在该过程的多个阶段受到调节。“上调”或“激活”是指增加基因表达产物(即RNA或蛋白质)的产生的调节，而“下调”或“抑制”是指减少产生的调节。参与上调或下调的分子(例如，转录因子)通常分别称为“激活剂”和“抑制剂”。“过表达”是指特定基因的表达水平高于正常情况所观察到的水平。
术语“核酸序列”、“目的核苷酸序列”或“目的核酸序列”是指任何核苷酸序列(例如，RNA或DNA)，本领域技术人员可出于任何原因(例如，治疗疾病、赋予改良的品质等)认为需要对其进行操作。此类核苷酸序列包括但不限于结构基因(例如报告基因、选择标记基因、致癌基因、药物抗性基因、生长因子等)的编码序列，以及不编码mRNA或蛋白质产物的非编码调节序列(例如启动子序列、聚腺苷酸化序列、终止序列、增强子序列等)。
本文所用的术语“氨基酸”或“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列，或这些中的任一者的片段，以及天然存在或合成的分子。当本文所述的“氨基酸序列”是指天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时，“氨基酸序列”和类似术语并不意味着将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关的完整的天然氨基酸序列。
如本文所用，术语“功能序列变体”是指相对于参考序列或野生型序列具有一个或多个核酸改变的多核苷酸序列，但该改变不消除或实质上改变非变体参考的多核苷酸活性。例如，由SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：31定义的OsActin1启动子可以被截短或者在内部去除一个或多个核酸并保留活性。
术语“基因”涵盖结构基因的编码区，并包括与编码区的5′端和3′端相邻且与这两者中的各一端距离为约1kb的序列，由此使得该基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区5′端且存在于mRNA上的序列称为5′非翻译序列。位于编码区3′端或下游且存在于mRNA上的序列称为3′非翻译序列。术语“基因”涵盖基因的cDNA和基因组形式这两者。基因的基因组形式或克隆包含被称为“外显子”或“表达区域”或“表达序列”的编码区，该编码区被称为“内含子”或“干预区域”或“干预序列”的非编码序列中断。
本文所用的术语“种子”包括由受精植株卵子发育而来的全部组织；因此，其包括含有胚胎和储存的营养物质的成熟胚珠，以及分化为保护性种皮或外种皮的一层或多层珠被。种子组织中的营养物质可储存在胚乳中或胚体中，特别是子叶中，或存在于这两者中。
如本文所用，术语“种子”还可以指种子植株的成熟且受精的胚珠，即成熟的胚珠，其包含植株胚胎(即微型植株)并且还包含胚乳(即植株胚胎的养分供应源)，并且可以被种皮包裹。
如本文在提及“水稻植株”时所用的术语“水稻”是指稻属物种(Oryza spp.)，即栽培品种、非栽培水稻植株和原祖水稻植株。优选地，本发明的水稻植株为亚洲栽培稻(Oryzasativa)品种。
当提及基因或核酸时所用的术语“异源”是指经过某种方式操作的基因。例如，异源基因包括将一个物种的基因引入到另一物种。异源基因还包括以一些方式改变(例如，突变、添加多个拷贝、连接到非天然启动子或增强子序列等)的生物体天然基因。异源基因可以包括植物基因序列，该植物基因序列包括植物基因的cDNA形式；cDNA序列可以以正义表达(以产生mRNA)或者可以以反义表达(以产生与mRNA转录本互补的反义RNA转录本)。异源基因与内源植物基因的区别在于，异源基因序列通常与包含诸如启动子等调节元件的核苷酸序列连接，而该核苷酸序列在自然界中并未发现与该异源基因编码的蛋白质的基因或染色体中的植物基因序列相关，或者与自然界中不存在的染色体的一部分相关(例如，表达在该基因通常不表达的基因座中的基因)。
术语“转基因”是指通过转染过程将外来基因置于生物体中。术语“外来基因”是指通过实验操作引入到生物体基因组的任何核酸(例如，基因序列)，并且可包括在该生物体中发现的基因序列，只要引入的基因与天然存在的基因不位于同一位置即可。转基因也可以指“外源基因”，外源基因包括但不限于报告基因、标记基因、选择基因和功能基因。术语“内源基因”是指自然编码和表达的基因。
术语“转化子”和“转化细胞”包括原代转化细胞和源自该细胞的培养物，不考虑传代的次数。由于有意或偶然的突变，产生的后代的DNA含量可能不完全相同。转化子的定义包括与最初的转化细胞所筛选出的功能相同的突变子代。
术语“以可操作的组合”、“以可操作的顺序”和“可操作地连接”是指核酸序列以这样的方式连接，从而产生能够指导给定基因的转录和/或指导所需蛋白质分子的合成的核酸分子。该术语还指以这样的方式连接氨基酸序列，从而产生功能蛋白质。
在提及mRNA水平时特意使用的术语“过表达(overexpressed、overexpression和overexpressing)”及其语法等同词是指，比在对照或非转基因动物的给定组织中通常观察到的表达水平高约3倍的表达水平。使用本领域技术人员已知的多种技术中的任一种测定mRNA水平，包括但不限于qRT-PCR。
术语“启动子元件”、“启动子”或“启动子序列”是指位于DNA聚合物的编码区的5′端(即在其之前)的DNA序列。自然界中已知的大多数启动子的位置位于转录区域之前。启动子起到开关的作用，从而激活基因的表达。如果基因被激活，则称基因被转录，或参与转录。转录涉及由基因合成mRNA。因此，启动子作为转录调节元件并且还提供基因转录成mRNA的起始位点。
术语“载体”是指转移DNA片段的核酸分子。转移可以发生在细胞内、细胞间等。术语“载体”(vehicle)有时与“载体”(vector)互换使用。”
提供以下实施例以证明并进一步说明本发明的一些优选实施方案和方面，但不应理解为限制其范围。
实施例1
材料和方法
植物材料和生长条件
本研究使用的水稻品种为T5105，其是在泰国香型KTML 105(参见文献Luo和Yin，2013)的遗传背景下改良的香稻。经过处理或未经处理的T5105和转基因植株在24℃至33℃下在温室的盆栽土壤中生长，光周期为12小时日光和12小时黑暗，并且相对湿度为80％至85％。
基因、构建体和水稻转化
如图1所示意性示出的，基于二元载体pCAMBIA1305.1(登录号AF304545)构建了用于基因在水稻中过表达的构建体。简而言之，用源自水稻OsActin1基因(Os03g0718100)的1，414-bp启动子(pCActin1-cPCS1和pCActin1-gABCC1为SEQ ID NO：31；pCActin1-cHMA3为SEQ ID NO：21)替换位于pCAMBIA1305.1的T-DNA区中GUSPlusTM基因上游的CaMV35S启动子(参见文献Reece等人，1 990)。OsHMA3(Os07g0232900)(SEQ ID NO：22)和OsPCS1(Os05g0415200)(SEQ ID NO：32)的cDNA序列由GenScript(www.genscript.com.cn)合成。通过PCR从T5105扩增OsABCC1(Os04g0620000)(SEQ ID NO：35)的全长基因组DNA片段(从起始密码子到终止密码子)。GUSPlusTM基因的编码区被源自OsHMA3(Os07g0232900)(SEQ IDNO：22)、OsPCS1(Os05g0415200)(SEQ ID NO：32)的cDNA克隆或源自OsABCC1(Os04g0620000)(SEQ ID NO：35)的基因组克隆的编码区替换，以产生分别携带启动子融合基因PActin1：cHMA3：TNos、PActin1：cPCS1：TNos和PActin1：gABCC1：TNos以及NOS终止子(SEQ ID NO：23)、LB(SEQ ID NO：27)和RB(SEQ ID NO：28)的二元构建体pCActin1-cHMA3、pCActin1-cPCS1和pCActin1-gABCC1。将所有构建体引入根癌农杆菌菌株AGL1并用于水稻转化。农杆菌介导的T5105转化按照先前描述的步骤进行，并略作修改(参见文献Hiei等人，1994)。将水稻再生培养基N6S3-CH中的1mg/L KT和0.2mg/L NAA替换为1mg/L BA和1mg/L NAA。基因构建体如图1A至图1D以及SEQ ID NO：19-20、29-30、33-34所示。
Southern印迹杂交分析
使用HP植株DNA迷你试剂盒(Omega BIO-TEK)提取转基因水稻的基因组DNA。用限制性内切酶Hind III和BamH I(NEB)消化约2μg DNA。通过凝胶电泳在0.8％(w/v)琼脂糖凝胶上分离DNA片段。然后使片段从琼脂糖凝胶转印到Hybond-N+膜(GEHealthcare)上。使用DIG DNA标记混合物(Roche)和表1所列的引物对，通过PCR扩增地高辛标记的hpt基因特异性核酸探针。按照制造商的说明，使用DIG-High Prime DNA标记和Detection Starter试剂盒II(Roche)进行Southern印迹杂交和DIG标记的探针检测。使用ChemiDocTM Touch成像系统(Bio-Rad)检测化学发光信号。
表1.本研究使用的寡核苷酸引物
基因表达分析
使用FavorprepTM植物总RNA纯化迷你试剂盒(FAVORGEN)提取总RNA，然后使用DNaseI(Roche)进行DNA消化。使用cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)由1μg的总RNA合成第一链cDNA。使用FAST qPCR主混合液(KAPA Biosystems)在CFX96TM实时系统(Bio-Rad)中进行定量实时PCR(qRT-PCR)。水稻延伸因子(EF)基因OsEF-1α(Os03g0178000)基因的表达水平用作内部对照。不同基因的qRT-PCR引物列于表1。
测试水稻幼苗对As和Cd的耐受性
水稻种子经过表面消毒，并在组织培养室中，在25℃下在PhytatrayTMII容器的半强度MS培养基(Sigma-Aldrich)中发芽，光周期为16小时光照和8小时黑暗。将两周龄的水稻幼苗转移到含有不同浓度NaAsO2(0μM至100μM)和/或CdSO4(0μM至40μM)的半强度MS培养基中，并且继续培养14天。分别用5mM CaCl2和去离子水清洗经处理的幼苗的根部三次。在测量芽长之前，对它们进行拍照。将幼苗样品在70℃的烘箱中干燥7天，然后测定幼苗的干重。实验进行了三次生物学重复。
在用As和/或Cd处理的土壤中种植水稻
本研究中使用的对照土壤所含的背景水平的As为2.09mg/kg并且Cd为0.44mg/kg。对照土壤补充有10mg/kg以NaAsO2形式存在的As和/或3mg/kg以CdSO4形式存在的Cd。水稻幼苗在苗圃的对照土壤中生长28天。然后将其移植到经或未经As和/或Cd处理的土壤中，并在温室中生长至成熟。收获水稻种子和秸秆并干燥以供进一步分析。实验进行了三次生物学重复。
从水稻叶肉细胞中分离完整的原生质体和液泡并用CdSO4或PC2-Cd复合物处理原生质体
按照先前的描述从水稻叶肉细胞中分离原生质体(参见文献Trinidad等人，2021)。简而言之，将在半强度MS培养基中发芽并生长的10日龄水稻幼苗的芽切成0.5cm的条。通过添加原生质体分离缓冲液[0.6甘露醇、10mM甲基乙烷磺酸盐(MES)、10mM CaCl2、0.1％BSA(w/v)、1.5％(w/v)纤维素酶RS(C0615，Sigma，美国)和0.75％(w/v)果胶酶RS(P2401，Sigma，美国)]，将原生质体从条中释放出来，然后在28℃下在黑暗中轻柔震荡孵育4小时。使用吊桶式转头以慢加速和慢减速的设置在20℃下150g离心5min，从而收集原生质体。用20mlW5缓冲液(154mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KC1和2mM MES)洗涤沉淀物两次，并以100g旋转3min从而重新收集。为了分离完整的液泡，将预热至37℃的3ml裂解缓冲液[0.2M甘露醇、10％Ficoll-400、15mM EDTA(pH 8.0)、5mM磷酸钠(pH 8.0)]添加到原生质体中。通过上下移液5次至8次来轻轻重悬原生质体，并在37℃的温水浴中孵育5min至10min以进行裂解。通过在三步梯度上进行离心来纯化从原生质体释放的液泡。用两体积的溶液(5％w/v)覆盖一体积的裂解的原生质体悬浮液，该溶液由一体积的裂解缓冲液和一体积的液泡缓冲液(30mM KCl、20mM HEPES-KOH、pH7.5、0.4M甜菜碱、15mg mL-1BSA和1mM DDT)混合制备而成。然后将一体积的液泡缓冲液小心但快速地层叠在梯度的顶部。在以1，500g离心20min后，在5％溶液和液泡缓冲液之间的界面处收集液泡。将CdSO4、PC2和DDT以摩尔比1：1：1混合，并在25℃孵育1小时，从而形成PC2-Cd复合物。将原生质体重悬于MMG缓冲液(0.4M甘露醇、15mM MgCl2和4mM MES，用KOH调节pH至7.5)中。将10μM CdSO4或如上制备的PC2-Cd复合物添加到MMG缓冲液中的原生质体中，然后以室温在黑暗中孵育1小时。孵育后，在20℃下以150g离心5min从而收集原生质体。用W5缓冲液洗涤原生质体三次，以去除缓冲液中残留的Cd。将原生质体及从原生质体中分离的液泡用于通过ICP-MS的Cd测定。
通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)进行元素分析
通过ICP-MS测定糙米(去壳但未抛光的水稻种子)和秸秆中的元素浓度。在室温下，用3ml浓缩的HNO3/H2O2混合物(5：1，v：v)将约0.1g干燥的水稻种子或秸秆组织预消化过夜，然后在微波炉(Ethos One，Milestone技术)中消化。稀释后，通过ICP-MS(7700S，Agilent技术，美国)确定消化液中的元素浓度。将米粉1568b用作有证标准物质(CRM)，以评估分析程序的精确性和准确性。
统计分析
使用双尾学生t-检验(*P＜0.05或**P＜0.01)或单因素ANOVA随后进行LSD检验(显著性水平P＜0.05)分析数据。使用IBM SPSS统计学19软件进行全部分析。
实施例2
OsHMA3、OsABCC1和OsPCS1过表达株系的产生
构建了三种含有在OsActin1启动子调控下的OsHMA3、OsPCS1和OsABCC1基因的cDNA编码区或基因组克隆编码区的二元构建体，并且用这三种二元构建体在T5105遗传背景下通过农杆菌介导的水稻转化产生转基因水稻植株(图1A至图ID)。对转基因T0植株进行表征，以筛选出携带单拷贝T-DNA且显示出转基因过表达的转基因株系，以供进一步研究(图2A和图2B、图3A和图3B、图4A和图4B、图5A和图5B、图6A和图6B、图8A和图8B、表2)。使用qPCR和Southern印迹杂交法筛选典型株系。所用的引物和探针列于表1。每种基因选择了三个独立的转基因株系，并详细表征了生长发育、产量和基因表达。全部这些转基因株系在株高和圆锥花序以及结实率方面表现出与非转基因对照T5105相似的形态学表型(图2C至图2E、图3C至图3E、图4C至图4E)。
表2.本研究产生的转基因植株的总结
实施例3
OsHMA3过表达株系的谷粒中的Cd浓度显著降低
T5105和OsHMA3过表达株系(HMA3-L1、HMA3-L3和HMA3-L12)在对照土壤和含3mg/kg以CdSO4形式存在的Cd的土壤中生长。收获后，对种子和秸秆进行ICP-MS分析。对照土壤和经Cd处理土壤中的OsHMA3过表达株系的谷粒Cd浓度(0.003±0.001mg/kg和0.041±0.012mg/kg)分别仅为对照实验中T5105的谷粒Cd浓度(0.135±0.064mg/kg和2.010±0.813mg/kg)的2.0％和2.0％(图5C)。在经Cd处理的土壤中生长的T5105的秸秆中，茎节(茎节I和茎节II)的Cd浓度的水平相对而言高于根、节间、叶(叶鞘和叶片)和圆锥花序(花梗、花轴和苞叶)(图SD)。在经Cd处理的土壤中生长的HMA3-L3的秸秆中，与其他秸秆组织相比，根部具有最高水平的Cd浓度(图5D)。HMA3-L3根部的Cd浓度(78.001±7.056mg/kg)是T5105根部的Cd浓度(11.697±2.408mg/kg)的6.7倍，而HMA3-L3的茎节I(11.704±1.447mg/kg)和茎节II(9.002±0.590mg/kg)的Cd浓度分别为T5105的茎节I(125.837±24.001mg/kg)和茎节II(36.006±7.557mg/kg)的9.3％和25.0％(图5D)。这些结果表明，转基因植株中的PActin1：cHAM3：TNos基因的表达显著增强了Cd在根部的积累，并大幅减少了Cd向包括种子的植株地上部分的分配。
在半强度MS培养基中测试了T5105和OsHMA3过表达株系的幼苗的Cd耐受性。T5105植株对CdSO4浓度为10μM至40μM的Cd处理表现出增加的生长迟缓(图5E)。与未处理的T5105植株相比，在处理后第14天，经处理的T5105植株的芽长和干重都减少(图5F和图5G)。与未处理的T5105和未处理的转基因植株相比，在Cd处理后第14天，在含Cd的培养基中生长的OsHMA3过表达株系没有表现出明显的生长迟缓(图5E和图5F)。OsHMA3过表达株系的干重比未处理的水稻幼苗略有减少(图5G)。但该减少比经Cd处理后的T5105的减少低得多(图5G)。这些结果表明OsHMA3的过表达赋予了对Cd的极大耐受性。
实施例4
OsABCC1过表达株系的水稻谷粒中的As浓度部分减少
通过ICP-MS测定了在对照土壤和含10mg/kg以NaAsO2形式存在的As的土壤中生长的T5105和独立的OsABCC1过表达株系的种子和秸秆中的As浓度(图6C和图6D)。在对照土壤和As处理土壤中生长的OsABCC1过表达株系的平均谷粒As浓度(0.013±0.005mg/kg和0.197±0.024mg/kg)分别为对照实验中T5105的平均谷粒As浓度(0.018±0.008mg/kg和0.367±0.068mg/kg)的72.2％和53.7％(图6C)。对于在As处理的土壤中生长的植株，ABCC1-L27的根、茎(茎节I、茎节II、节间II)和下部叶子中的As浓度高于T5105的As浓度，而ABCC1-L27的旗叶叶片和圆锥花序(花梗、花轴和苞叶)中的As浓度与T5105的As浓度相似或更低(图6D)。在半强度MS培养基中，测试了T5105和OsABCC1过表达株系的幼苗的As耐受性。当用25μM以NaAsO2形式存在的As(III)处理T5105和OsABCC1过表达株系时，观察到T5105和OsABCC1过表达株系的单株芽长和单株干重没有显著差异(图6E至图6G)。然而，OsABCC1过表达株系对50μM As(III)至100μM As(III)表现出增强的耐受性，具有比T5105更长的芽长和更高的干重(图6E至图6G)。还测试了OsABCC1过表达株系在幼苗期的Cd耐受性。与T5105相比，OsABCC1过表达株系没有显示出对Cd处理的任何增强的耐受性(图7A至图7C)。进一步的科学研究还证明，由在对照或Cd处理的土壤中生长的ABCC1-L27收获的谷粒具有与由T5105收获的谷粒相似水平的Cd浓度(图7D)。这些结果表明，PActin1：gABCC1：TNos基因在转基因植株中的表达增加了As在根、茎(茎节I、茎节II、节间II)和下部叶子中的积累，并降低了谷粒中的As浓度。
实施例5
OsPCS1过表达株系的谷粒中的As和Cd浓度部分减少
T5105中OsPCS1基因的过表达导致水稻谷粒中As和Cd浓度的显著减少(图8C和图8D)。对于在对照土壤中生长的水稻植株，OsPCS1过表达株系的平均谷粒As浓度(0.003±0.001mg/kg)为T5105的平均谷粒As浓度(0.008±0.003mg/kg)的37.5％(图8C)。对于在As处理的土壤中生长的水稻植株，OsPCS1过表达株系的平均谷粒As浓度(0.064±0.008mg/kg)为T5105的平均谷粒As浓度(0.268±0.023mg/kg)的23.9％(图8C)。在Cd处理的种植实验中，在对照土壤和Cd处理的土壤中生长的OsPCS1过表达株系的平均谷粒Cd浓度(0.053±0.011mg/kg和1.042±0.122mg/kg)分别为对照实验中T5105的平均谷粒Cd浓度(0.115±0.018mg/kg和1.736±0.070mg/kg)的46.1％和60.0％(图8D)。观察到在OsPCS1过表达株系中，谷粒As浓度的减少比谷粒Cd浓度的减少更为显著(图8C)。还测定了水稻秸秆不同部位的As和Cd浓度。当在As处理的土壤中生长时，与T5105相比，OsPCS1过表达株系PCS1-L1的根、茎节(茎节I和茎节II)、节间II和叶子II具有更高水平的As浓度，但花梗、旗叶叶片、花轴和苞叶具有更低水平的As浓度(图8E)。当在Cd处理的土壤中生长时，与T5105相比，PCS1-L1的茎节(茎节I和茎节II)、节间II和花轴具有更高水平的Cd浓度，但根、旗叶和秸秆的花梗具有相似甚至更低水平的Cd浓度(图8F)。与在T5105和PCS1-L1的根部检测到最高As浓度不同，这两个株系的根部的Cd浓度远低于茎节的Cd浓度(图8E和图8F)。在As或Cd耐受性的幼苗测试中，OsPCS1过表达株系对以NaAsO2形式存在的75μM As(III)至100μM的As(III)表现出略微增强的耐受性，具有比T5105更长的芽长和更高的干重(图9A至图9C)。然而，OsPCS1过表达株系对10μM Cd2+至40μM Cd2+表现出显著超敏性，具有比T5105更短的芽长和更低的干重(图9D至图9F)。这些结果表明，在OsPCS1过表达株系中，PActin1：cPCS1：TNos基因的表达提高了根、茎和下部叶子中的As积累，并且减少了旗叶叶片、圆锥花序和种子中的As分配。同时，OsPCS1过表达株系中PActin1：cPCS1：TNos基因的表达增强了Cd主要在转基因植株茎中的积累。
实施例6
PActin1：gABCC1：TNos基因和PActin1：cPCS1：TNos基因的共表达对减少水稻谷粒中的As浓度显示出协同效应
在水稻植株中，通过ABCC1将As(lll)以植物螯合肽-砷(PC-As)复合物的形式封存在液泡中(参见文献Hayashi等人，2017；Song等人，2014)。为了进一步研究OsABCC1和OsPCS1的共过表达是否对降低水稻谷粒中的As浓度具有协同效应，通过将ABCC1-L27与PCS1-L1杂交，然后自花授粉并选择双纯合子，从而产生AP株系，以将PActin1：gABCC1：TNos基因和PActin1：cPCS1：TNos基因叠加至单一株系。与ABCC1-L27或PCS1-L1相比，AP在幼苗期的确表现出对25μM As(III)至100μM As(III)具有协同增强的耐受性(图10A至图10C)。此外，与ABCC1-L27或PCS1-L1相比，AP的根部具有更高的As浓度，且芽部具有更低的As浓度，特别是在幼苗期用75μM As(III)处理时更是如此(图10D和图10E)。在As处理的土壤中生长的AP谷粒中的As浓度(0.025±0.009mg/kg)远低于ABCC1-L27(0.149±0.000mg/kg)或PCS1-L1(0.067±0.002mg/kg)的谷粒中的As浓度，并且仅为T5105的谷粒中的As浓度(0.250±0.008mg/kg)的10.0％(图10F)。这些结果表明，PActin1：gABCCI：TNos基因和PActin1：cPCS1：TNos基因在转基因水稻植株中的共表达在减少水稻谷粒中的As浓度和在幼苗期提供对As处理的增强的耐受性方面显示出了协同效应。
实施例7
通过OsHMA3基因的共过表达减轻了OsPCS1过表达株系对Cd处理的超敏性
为了研究OsHMA3基因的共过表达是否可以减轻OsPCS1过表达株系对Cd处理的超敏性，通过将PCS1-L1和HMA3-L3杂交，然后自花授粉并选择双纯合子，产生了携带PActin1：cPCS1：TNos基因和PActin1：cHMA3：TNos基因的转基因株系(HP)。在含有Cd2+的半强度MS培养基上测试了HP、PCS1-L1、HMA3-L3和T5105的幼苗。与HMA3-L3相比，HP株系提供了对Cd处理相似水平的增强的耐受性，并且与PCS1-L1或T5105相比具有更长的芽长和更高的干重(图11A至图11C)。对经处理的幼苗的组织进行ICP-MS分析表明，与PCS1-L1或T5105植株相比，HP植株的根部积累了更多Cd，并且芽部分配了更少的Cd，这与HMA3-L3植株的模式相似(图11D和图11E)。在对照土壤和Cd处理的土壤中生长的HP植株的谷粒中的平均Cd浓度(0.004±0.001mg/kg和0.032±0.011mg/kg)与HMA3-L3植株的谷粒中的平均Cd浓度(0.004±0.001mg/kg和0.036±0.006mg/kg)相似，但明显低于对照实验中的PCS1-L1(0.085±0.008mg/kg和0.889±0.093mg/kg)和T5105(0.115±0.019mg/kg和1.913±0.630mg/kg)的谷粒中的平均Cd浓度(图11F)。
为了进一步研究OsPCS1过表达对水稻细胞液泡中的Cd封存的影响，从在含Cd培养基中生长的10日龄T5105和PCS1-L1幼苗的芽中分离原生质体和液泡，并通过ICP-MS分析进行Cd浓度测定。T5105(50.468±1.410ng/106个细胞)和PCS1-L1(49.839±3.694ng/106个细胞)的原生质体中的Cd浓度没有显著差异(图12A)。然而，PCS1-L1的液泡中的Cd浓度(24.429±1.498ng/106个细胞)仅为T5105的液泡中的Cd浓度(46.809±1.933ng/106个细胞)的52.2％(图12A)。这些结果表明，PCS1-L1中的PActin1：cPCS1：TNos基因的表达抑制了Cd在液泡中的封存。水稻中的OsPCS1基因的过表达将增加PC的合成，并且胞质溶胶中将形成更多的PC-Cd复合物。研究的下一步是调查PC2-Cd复合物是否会影响Cd通过HMA3在液泡中的封存。从T5105和HMA3-L3分离的原生质体分别与Cd2+和PC2-Cd复合物一起孵育。然后确定所孵育的原生质体及其液泡中的Cd浓度。在所有原生质体样品中检测到了水平相似的Cd浓度，这表明Cd和PC2-Cd这两者都可以以相似的效率被运输到T5105或HMA3-L3的原生质体中(图12B)。对于与Cd2+一起孵育的原生质体，HMA3-L3的液泡中的Cd浓度(1.318±0.073ng/106个细胞)为T5105的液泡中的Cd浓度(0.366±0.081ng/106个细胞)的3.6倍，这证明OsHMA3的过表达增强了Cd2+在液泡中的封存(图12B)。对于与PC2-Cd一起孵育的原生质体，T5105(0.141±0.029ng/106个细胞)和HMA3-L3(0.423±0.058ng/106个细胞)的液泡中的Cd浓度分别为原生质体与Cd2+一起孵育的T5105和HMA3-L3的液泡中的Cd浓度的38.5％和32.1％(图12B)。同时，与PC2-Cd一起孵育的HMA3-L3的液泡中的Cd浓度(0.423±0.058ng/106个细胞)为对照实验中T5105的液泡中的Cd浓度(0.141±0.029ng/106个细胞)的3倍(图12B)。这些结果表明，PC2-Cd复合物抑制了HMA3介导的Cd2+在液泡中的封存，而OsHMA3基因的过表达可以减轻由于在水稻细胞中过表达OsPCS1基因而导致的PC2或其他PC的过度产生所引起的此类抑制。
实施例8
通过在单一水稻株系中叠加PActin1：cHMA3：TNos、PActin1：cPCS1：TNos和PActin1：gABCC1：TNos产生低As低Cd的水稻谷粒
为了产生As和Cd元素这两者都为低浓度的水稻谷粒，通过将来自PCS1-L1的PActin1：cPCS1：TNos基因、来自ABCC1-L27的PActin1：gABCC1：TNos基因和来自HMA3-L3的PActin1：cHMA3：TNos基因杂交和标记辅助选择，开发了共过表达OsPCS1、OsABCC1和OsHMA3基因的水稻株系(PAH)。与其亲本转基因株系一样，PAH株系生长发育正常，并且株型、生长期、圆锥花序和种子、结实率和百粒重量与T5105相似(图13A至图13E)。使PAH、PCS1-L1、ABCC1-L27、HMA3-L3和T5105植株分别在对照土壤和用As和Cd两者处理的土壤中生长，并通过ICP-MS分析对谷粒进行As和Cd浓度测定。对于在对照土壤中生长的植株，PAH的谷粒As浓度(0.002±0.000mg/kg)为T5105的谷粒As浓度(0.011±0.001mg/kg)的18.2％，而PAH的谷粒Cd浓度(0.004±0.001mg/kg)为T5105的谷粒Cd浓度(0.115±0.019mg/kg)的3.5％(图13F和图13G)。对于在As和Cd处理的土壤中生长的植株，PAH的谷粒As浓度(0.027±0.002mg/kg)为T5105的谷粒As浓度(0.343±0.017mg/kg)的7.9％，而PAH的谷粒Cd浓度(0.036±0.006mg/kg)为T5105的谷粒Cd浓度(1.809±0.136mg/kg)的2.0％(图13F和图13G)。在两种土壤的实验中，PAH的谷粒中的As或Cd浓度低于携带单一转基因的亲本株系的谷粒中的As或Cd浓度，或者与之相当(图13F和图13G)。值得注意的是，与T5105相比，HMA3-L3中OsHMA3基因的过表达没有使谷粒As浓度产生任何显著变化，而且ABCC1-L27中OsABCC1基因的过表达没有影响谷粒Cd浓度(图13F和图13G)。这些结果表明，PC依赖的且OsABCC1介导的As在液泡中的封存以及OsHMA3介导的Cd在液泡中的封存是彼此独立的。ICP-MS分析还表明，在对照土壤或As和Cd处理的土壤中生长的4种株系的谷粒中，包括钴(Co)、铜(Cu)、铁(Fe)、锰(Mn)、硒(Se)和锌(Zn)在内的微量营养元素的浓度没有表现出任何显著差异(图14)。在包含50μM As(III)和10μM Cd2+(处理1)或包含75μM As(III)+20μM Cd2+(处理2)的半强度MS培养基中测试了转基因株系和T5105的幼苗。在两种处理中，在所测试的全部株系中，PAH幼苗对As和Cd双重处理表现出最高的耐受性增强，并且具有最长的芽长和最大的干重(图15A至图15C)。与T5105相比，PAH幼苗在根中积累的As或Cd浓度高得多，而在芽中积累的As或Cd浓度较低(图15D至图15G)。这些结果共同表明，在PAH株系中共表达的PActin1：cPCS1：TNos基因、PActin1：gABCC1：TNos基因和PActin1：cHMA3：TNos基因通过增加根部对As和Cd这两种有毒元素的积累和封存，并且减少As和Cd向组织和器官地上部分、特别是种子的运输，显著减少了水稻谷粒中的As和Cd浓度，并在幼苗期提供了增强的对As和Cd重处理的耐受性，而且对植株的生长发育、产量和微量营养素没有任何减损。
综上所述，在T5105遗传背景下使用基因工程方法产生了在OsActin1启动子下过表达OsABCC1、OsPCS1和OsHMA3的转基因植株。单独表达PActin1：cPCS1：TNos基因或PActin1：gABCC1：TNos基因部分减少了转基因水稻植株的谷粒中的As浓度。PActin1：cPCS1：TNos基因和PActin1：gABCC1：TNos基因的共表达显著减少了双基因过表达转基因植株的谷粒中的As浓度。PActin1；cHMA3：TNos基因的表达显著减少了转基因水稻株系的谷粒中的Cd浓度。PActin1：cPCS1：TNos基因、PActin1：gABCC1：TNos基因和PActin1：cHMA3：TNos基因的共表达显著减少了三基因过表达转基因植株的谷粒中的As和Cd浓度。全部转基因植株都显示出了与非转基因T5105相似的正常生长发育，没有任何多效性表型或产量损失。低As低Cd水稻将减少人类通过食用水稻对两种有毒元素的摄取，并且有利于我们的健康。
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Claims (17)

1.一种经基因修饰的水稻植株或植株细胞，其包含可操作地连接到OsActin1启动子的异源P1B型重金属ATP酶基因、可操作地连接到OsActin1启动子的异源ATP结合盒(ABC)转运蛋白基因、以及可操作地连接到OsActin1启动子的异源植物螯合肽合酶基因，其中与在所述经修饰的水稻植株的其他营养组织中的活性相比，所述OsActin1启动子在所述经修饰的水稻植株的种子胚乳中具有低活性；
其中与未进行所述基因修饰的对照水稻植株相比，所述经基因修饰的水稻植株的水稻谷粒中的砷(As)和镉(Cd)减少。
2.根据权利要求1所述的经基因修饰的水稻植株或植株细胞，其中所述OsActin1启动子包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：31所示的核酸序列或其功能序列变体。
3.根据权利要求1或2所述的经基因修饰的水稻植株或植株细胞，其中所述异源P1B型重金属ATP酶基因编码SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列；所述异源ABC转运蛋白基因编码SEQID NO：37所示的氨基酸序列，并且所述植物螯合肽合酶基因编码SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的经基因修饰的水稻植株或植株细胞，其中所述异源P1B型重金属ATP酶基因包含由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO：22所示的多核苷酸序列具有至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或100％序列同一性的核酸序列，所述异源ABC转运蛋白基因包含由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO：36所示的多核苷酸序列具有至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或100％序列同一性的核酸序列，并且所述异源植物螯合肽合酶基因包含由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO：32所示的多核苷酸序列具有至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或100％序列同一性的核酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的经基因修饰的水稻植株或植株细胞，其中所述外源P1B型重金属ATP酶基因、所述外源ABC转运蛋白基因和/或所述外源植物螯合肽合酶基因来自谷类作物。
6.根据权利要求4或5所述的经基因修饰的水稻植株或植株细胞，其中所述异源P1B型重金属ATP酶基因为OsHMA3并且包含SEQ ID NO：22所示的核酸序列，所述异源ABC转运蛋白基因为OsABCC1并且包含SEQ ID NO：36所示的核酸序列，并且所述异源植物螯合肽合酶基因为OsPCS1并且包含SEQ ID NO：32所示的核酸序列。
7.根据权利要求6所述的经基因修饰的水稻植株或植株细胞，其包含可操作地连接到OsActin1启动子的异源OsHMA3基因、可操作地连接到OsActin1启动子的异源OsABCC1基因以及可操作地连接到OsActin1启动子的异源OsPCS1基因。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的经基因修饰的水稻植株或植株细胞，其属于亚洲栽培稻(Oryza sativa L)种。
9.一种构建经基因修饰的水稻植株的方法，与对照水稻植株的水稻谷粒相比，所述经基因修饰的水稻植株的水稻谷粒中的砷(As)和镉(Cd)减少，所述方法包括以下步骤：
a)产生包含可操作地连接到OsActin1启动子的异源P1B型重金属ATP酶基因的经基因修饰的水稻植株；
b)产生包含可操作地连接到OsActin1启动子的异源ATP结合盒(ABC)转运蛋白基因的经基因修饰的水稻植株；
c)产生包含可操作地连接到OsActin1启动子的异源植物螯合肽合酶基因的经基因修饰的水稻植株；
d)选择分别过表达所述外源P1B型重金属ATP酶基因、所述外源ATP结合盒(ABC)转运蛋白基因和所述外源植物螯合肽合酶基因的经基因修饰的水稻植株；
e)将三种经基因修饰的水稻植株中的两种杂交，以产生就外源基因而言的双纯合子植株；以及
f)将步骤(e)中的双纯合子植株与第三种经基因修饰的水稻植株杂交，以产生过表达所述外源基因的三重纯合子植株。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述OsActin1启动子如权利要求2所限定。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述异源基因如权利要求3至6中任一项所限定。
12.一种用于构建经基因修饰的水稻植株的试剂盒，其中与对照水稻植株的水稻谷粒相比，所述经基因修饰的水稻植株的水稻谷粒中的砷(As)和镉(Cd)减少，其中所述试剂盒包括：包含含有可操作地连接到OsActin1启动子的异源重金属ATP酶基因的载体的细菌，和/或包含含有可操作地连接到OsActin1启动子的异源ATP结合盒(ABC)转运蛋白基因的载体的细菌，和/或包含含有可操作地连接到OsActin1启动子的异源植物螯合肽合酶基因的载体的细菌。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述OsActin1启动子包含SEQ ID NO：21或SEQID NO：31所示的核酸序列或其功能序列变体。
14.根据权利要求12或13所述的试剂盒，其中所述异源P1B型重金属ATP酶基因编码SEQID NO：39所示的氨基酸序列；所述异源ABC转运蛋白基因编码SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列，并且所述植物螯合肽合酶基因编码SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述异源P1B型重金属ATP酶基因包含由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO：22所示的多核苷酸序列具有至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或100％序列同一性的核酸序列，所述异源ABC转运蛋白基因包含由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO：36所示的多核苷酸序列具有至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或100％序列同一性的核酸序列，并且所述异源植物螯合肽合酶基因包含由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO：32所示的多核苷酸序列具有至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或100％序列同一性的核酸序列。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的试剂盒，其中所述外源P1B型重金属ATP酶基因、所述外源ABC转运蛋白基因和/或所述外源植物螯合肽合酶基因来自谷类作物。
17.根据权利要求15或16所述的试剂盒，其中所述异源P1B型重金属ATP酶基因为OsHMA3并且包含SEQ ID NO：22所示的核酸序列，所述异源ABC转运蛋白基因为OsABCC1并且包含SEQ ID NO：36所示的核酸序列，并且所述异源植物螯合肽合酶基因为OsPCS1并且包含SEQID NO：32所示的核酸序列。
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