CN120795112B

CN120795112B - 一种接枝多糖的医用丝素蛋白溶液及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN120795112B
Application number: CN202511282837.4A
Authority: CN
Inventors: 刘也卓; 杨文华
Original assignee: Fuxiang Sitai Medical Technology Suzhou Co ltd
Current assignee: Fuxiang Sitai Medical Technology Suzhou Co ltd
Priority date: 2025-09-09
Filing date: 2025-09-09
Publication date: 2025-11-21
Anticipated expiration: 2045-09-09
Also published as: CN120795112A

Abstract

本发明涉及一种接枝多糖的医用丝素蛋白溶液及其制备方法和应用，属于医用材料技术领域。本发明首先对蚕丝进行蛋白酶酶解，在简化工艺的同时得到了高β‑折叠的丝素蛋白沉淀，然后通过低浓度的第二有机溶剂处理丝素蛋白沉淀，在末端氨基暴露的同时保持内部氨基的空间屏蔽；同时用三唑啉二酮活化多糖的羧基，得到含有高活性酸酐的多糖；将丝素蛋白与含有高活性酸酐的多糖反应，即可得到本发明的接枝多糖的医用丝素蛋白溶液。本发明的医用丝素蛋白溶液能够长期稳定储存且保持溶液状态，并具有良好的性能，在组织工程材料的制备中具有广泛的应用。

Description

一种接枝多糖的医用丝素蛋白溶液及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医用材料技术领域，尤其是指一种接枝多糖的医用丝素蛋白溶液及其制备方法和应用。

背景技术

蚕丝由70%左右的丝素蛋白和25%左右的丝胶蛋白构成。丝素蛋白是从蚕丝中提取的天然高分子材料，其分子结构由高度有序的β-折叠结晶区和松散无序的非晶区交替组成。其中，结晶区主要由甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸等小分子氨基酸残基重复排列，形成紧密堆积的反平行β-折叠片层结构，赋予丝素蛋白优异的力学强度和稳定性；而非结晶区则富含苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等大侧链氨基酸，使材料具备一定的柔韧性和功能可修饰性。

常规丝素蛋白的酶解是从再生丝素蛋白溶液开始，而获得再生丝素蛋白溶液需要蚕丝先脱胶、干燥形成脱胶丝，向脱胶丝溶解、纯化形成的再生丝素蛋白溶液加入蛋白酶进行酶解即可得到丝素蛋白，此工艺包括多步工艺，不仅流程复杂，且耗费了大量的化学试剂，产生了大量的工业废水。

丝素蛋白经过酶切后，非结晶区和结晶区之间的连接位点被切除，具有重复GAGAGS（G表示甘氨酸，A表示丙氨酸，S表示丝氨酸）的高β-折叠含量的丝素蛋白由于分子量大而沉淀，这些沉淀在材料学和生物医学领域具有独特的应用优势。但是由于酶切导致大量疏水区域暴露，丝素蛋白表面亲水性显著降低进而影响其溶解性。为改善丝素蛋白的溶解性，常利用多糖对丝素蛋白进行接枝改性来提高其亲水性，在这一过程中，丝素蛋白与多糖通过交联或者静电作用形成凝胶，从而提高丝素蛋白的溶解性。然而，这些改性技术均以凝胶形态为目标产物，稳定性不佳，且制备过程中β-折叠大量损失，因此由凝胶状态的丝素蛋白产物制备得到固体材料刚性不足，应用受限。

因此亟需寻求一种新的制备方法在简化工艺流程的同时获得具有良好溶液稳定性和力学性能的丝素蛋白溶液。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中缺乏一种稳定性好、制备过程简单且具有良好力学性能的丝素蛋白溶液的问题。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种接枝多糖的医用丝素蛋白溶液及其制备方法和应用。在丝素蛋白的制备过程中，常通过对蚕丝进行酶解来分离丝素蛋白，传统酶解技术从再生丝素蛋白溶液（即蚕丝脱胶后的丝素蛋白溶液）开始，耗费了大量的化学试剂，产生了大量的工业废水。本发明优化了工艺，将蚕丝直接溶解后酶解，提升了工艺效率，减少了试剂和废水的污染。同时，将蚕丝在未脱胶的情况下进行酶解能够获得高β-折叠结构的丝素蛋白沉淀。另外，在现有技术中，高β-折叠结构的丝素蛋白疏水区暴露在外，导致丝素蛋白沉淀在水中的溶解性较差，难以直接作为原料应用。本发明将多糖定向接枝于丝素蛋白末端氨基而内部氨基不受影响，既能够增加丝素蛋白的水溶性，又能避免丝素蛋白和多糖过度交联形成凝胶。具体地，本发明通过低浓度溶剂处理丝素蛋白沉淀，在保证末端氨基暴露的同时保持内部氨基的空间屏蔽，同时用三唑啉二酮活化多糖的羧基，羧基转化成高反应性的酸酐，该中间体极易与含有活性氨基的丝素蛋白反应，丝素蛋白末端氨基与多糖的酸酐形成酰胺键，以增强丝素蛋白的亲水性，并有效抑制自交联现象的发生，从而实现其溶液的长期稳定储存。除此以外，本发明的接枝多糖的医用丝素蛋白溶液能够促进细胞增殖且具有良好的力学性能，在组织工程材料的制备也具有潜在的应用价值。

本发明的第一个目的是提供了一种接枝多糖的医用丝素蛋白溶液的制备方法，包括以下步骤：

S1、将蚕丝溶于浓度为6-10M的第一有机溶剂中，再加入蛋白酶溶液孵育，孵育后灭活蛋白酶，离心后得到丝素蛋白沉淀，将丝素蛋白沉淀溶于浓度为4-6M的第二有机溶剂中，得到酶切丝素蛋白溶液；

S2、在第三有机溶剂存在的条件下将至少含有一个羧基的多糖与三唑啉二酮混合反应，得到活化的多糖；

S3、将S1中酶切丝素蛋白溶液与S2中活化的多糖混合反应，透析，得到接枝多糖的医用丝素蛋白溶液。

进一步地，步骤S1中所述第一有机溶剂和第二有机溶剂独立地选自溴化锂、硫氰酸钠、氯化锌、氯化钙-乙醇-水三元溶剂中的一种或多种。所述第一有机溶液的浓度大于所述第二有机溶剂的浓度。

进一步地，步骤S1中所述蛋白酶选自α-糜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶的一种或多种。

进一步地，步骤S1中所述蛋白酶和蚕丝的质量比为1：（5-500）。

进一步地，步骤S2中所述多糖选自海藻酸钠、透明质酸、羧甲基壳聚糖、琼脂糖、几丁糖、羧甲基纤维素中的一种或多种。

进一步地，步骤S2中所述第三有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮中的一种或多种。

进一步地，步骤S2中所述三唑啉二酮和多糖的质量比为（10-1）：1。

进一步地，步骤S2中反应温度为4-40℃，反应时间为10-180 min。

进一步地，步骤S2中多糖与三唑啉二酮混合反应后加入反应调停剂终止反应，所述反应调停剂选自β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、半胱氨酸、甘氨酸中的一种或多种。反应调停剂能够与三唑啉二酮快速反应，形成稳定的加合物（如硫酯或二硫键），阻止三唑啉二酮继续活化羧基。

进一步地，步骤S3中酶切丝素蛋白中溶解的丝素蛋白沉淀与所述多糖的质量比为1：（1-10）。

进一步地，所述三唑啉二酮的质量与第三有机溶剂的体积比为1g：（5-10）mL。

进一步地，步骤S3所述反应温度为2-8℃，反应时间为5-60 min。

本发明的第二个目的是提供了一种上述制备方法制备得到的接枝多糖的医用丝素蛋白溶液。

本发明的第三个目的是提供了一种上述医用丝素蛋白溶液在制备组织工程材料中的应用。

进一步地，所述组织工程材料包括骨组织材料和细胞增殖材料。

本发明的机理为：

蚕丝一步法酶解：直接将蚕丝溶解于第一有机溶剂中，加入蛋白酶孵育酶解。蚕丝主要由丝胶蛋白和丝素蛋白构成，第一有机溶剂能够溶解丝胶蛋白和丝素蛋白并使其分子链舒展开，蛋白酶同时对两者进行酶切。因丝胶蛋白和丝素蛋白结构上的差异，只有丝素蛋白中具有重复GAGAGS片段的高β-折叠的结晶区沉淀下来，形成丝素蛋白沉淀，丝素蛋白无定形区和丝胶蛋白则留在上层清液中。

经过酶解后的丝素蛋白沉淀具有高度重复GAGAGS的二级结构，分子链中氨基一部分位于末端，一部分位于内部侧链上，尤其是赖氨酸侧链上。溶解丝素蛋白沉淀的常规方式是利用高浓度的第二有机溶剂进行溶解，这导致丝素蛋白内部赖氨酸的ε-氨基暴露，进而导致多糖的过度交联和凝胶化。而本发明通过低浓度的第二有机溶剂使得丝素蛋白只暴露末端氨基，而不过分暴露内部氨基；同时，利用三唑啉二酮将多糖的羧基转变为高反应性的酸酐，丝素蛋白的末端氨基与多糖的酸酐形成酰胺键，以增强丝素蛋白的亲水性，并有效抑制自交联现象的发生，从而实现其溶液的长期稳定储存。

本发明的有益效果：

（1）工艺更为简化。传统的多糖与丝素蛋白末端氨基反应形成酰胺键，从而得到定向接枝多糖的丝素蛋白溶液。丝素蛋白酶解需要经过蚕丝脱胶、溶解、纯化步骤获得再生丝素蛋白溶液，而后在再生丝素蛋白溶液中加入蛋白酶进行酶解。本发明采用了一步法酶解，直接将蚕丝溶解后加入蛋白酶酶解，省略了脱胶、溶解和纯化的工艺步骤，极大的减少了化学试剂和工业污染物，工艺更为简化，生产效率更高，成本更低。

（2）溶液稳定性高。本发明制备的接枝多糖的医用丝素蛋白溶液具有良好的稳定性，在90天内未观察到沉淀析出，既超过了传统再生丝素蛋白溶液和EDC/NHS修饰丝素蛋白溶液的稳定性，又避免了多糖过度交联形成凝胶，有利于后续的进一步开发和使用。

（3）多糖定向接枝赋予了丝素蛋白溶液良好的性能。本发明采用了低浓度的第二有机溶剂，只暴露部分丝素蛋白氨基，尤其是末端氨基，而不暴露内部侧链的氨基，从而将多糖定向接枝到丝素蛋白末端氨基上，避免了过度交联带来的副产物和凝胶化。

（4）力学性能优，应用前景广。由本发明的接枝多糖的医用丝素蛋白溶液制备得到的薄膜具有良好的力学性能以及促进细胞增殖效果，在组织工程材料，特别是骨组织工程材料以及细胞增殖材料的制备中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明和对比例1的工艺流程图，左图为本发明接枝多糖的医用丝素蛋白溶液的工艺流程图，右图为对比例1的丝素蛋白产品的工艺流程图；

图2是本发明实施例1-6和对比例1丝胶残留测定结果图；

图3是本发明实施例1多糖接枝丝素蛋白前后的红外光谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

试剂来源与货号如下所示。

溴化锂（LiBr）购于阿拉丁，货号为L108934；

硫氰酸钠（NaSCN）购于济南汇丰达，货号为HFD-248；

氯化锌（ZnCl₂）购于国药，货号为H1L0491；

氯化钙（CaCl₂）-乙醇-水三元溶剂，其中CaCl₂购于吉业升化工，货号为JYS1545；

乙醇购于百奥莱博，货号为L11024-VZU；

胰蛋白酶购于阿拉丁，货号为T274333；

α-糜蛋白酶购自麦克林，货号为C804761；

胃蛋白酶购自阿拉丁，货号为P110928；

蛋白酶K购自上海经科化学科技有限公司，货号为JK-038；

木瓜蛋白酶购自Sigma，货号为P3250；

碱性蛋白酶购自北京百奥莱博，货号为QN0397；

海藻酸钠购自西安晋湘药用辅料有限公司，货号为0045；

透明质酸购自Solarbio，货号为S7020；

羧甲基壳聚糖购自Sigma，货号为926043；

琼脂糖购自Sigma，货号为A9045；

几丁糖购自北京百奥莱博，货号为QN0147；

羧甲基纤维素购自阿拉丁，货号为C104977；

N,N-二甲基甲酰胺购自麦克林，货号为N807509；

二甲基亚砜购自麦克林，货号为D806645；

N,N-二甲基乙酰胺购自麦克林，货号为N807171；

N-甲基吡咯烷酮购自麦克林，货号为M814045；

β-巯基乙醇购自麦克林，货号为M828395；

二硫苏糖醇购自麦克林，货号为D806827；

半胱氨酸购自麦克林，货号为D831312；

甘氨酸购自Sigma，货号为G8790；

磷酸盐缓冲溶液（PBS缓冲溶液）购于便诊生物，货号为bzw2106f；

三唑啉二酮购自STANDARDS，货号为ZC68005；

碳酸钠（Na₂CO₃）购自国药，货号为10019260。

实施例1

S1、蚕丝一步法酶解：取10 g蚕丝溶于100 mL 9.3 M溴化锂溶液中，过滤后和3mg/g的胰蛋白酶溶液等体积混合（胰蛋白酶与蚕丝的质量比为3：100），37℃反应20 h，100℃加热10 min灭活酶，5000 rpm离心10 min，取下层、清洗，获得丝素蛋白沉淀。

取丝素蛋白沉淀溶于10 mL 4.0 M溴化锂溶液中，得到酶切丝素蛋白溶液。

S2、三唑啉二酮活化多糖羧基：将2 g三唑啉二酮溶于10 mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入2 g海藻酸钠混合溶解，三唑啉二酮与海藻酸钠的质量比为1：1，在4℃下反应180min，再加入β-巯基乙醇终止反应。

S3、多糖定向接枝丝素蛋白：将S1中酶切丝素蛋白溶液和S2中活化的多糖溶液混合，丝素蛋白沉淀与多糖的质量比为1：1，在2℃下反应60 min。

反应混合物置于截留分子量为10 kDa的透析袋中，以水介质透析24 h，得到接枝多糖的医用丝素蛋白溶液。

实施例2

S1、蚕丝一步法酶解：取50 g蚕丝溶于100 mL 6.0 M硫氰酸钠溶液中，过滤后和1mg/g的α-糜蛋白酶溶液等体积混合（α-糜蛋白酶与蚕丝的质量比为1：500），37℃反应24 h，100 ℃加热15 min灭活酶，6000 rpm离心5 min，取下层、清洗，获得丝素蛋白沉淀。

取丝素蛋白沉淀溶于50 mL 4.5 M硫氰酸钠溶液中，得到酶切丝素蛋白溶液。

S2、三唑啉二酮活化多糖羧基：将10 g三唑啉二酮溶于50 mL二甲基亚砜中，加入1g透明质酸混合溶解，三唑啉二酮与透明质酸的质量比为10：1，两者混合在15℃下反应120min，再加入二硫苏糖醇终止反应。

S3、多糖定向接枝丝素蛋白：将S1中酶切丝素蛋白溶液和S2中活化的多糖溶液混合，丝素蛋白沉淀与多糖的质量比为1：10，在4℃下反应15 min。

反应混合物置于截留分子量为14 kDa的透析袋中，以PBS缓冲液为介质透析18 h，得到接枝多糖的医用丝素蛋白溶液。

实施例3

S1、蚕丝一步法酶解：取30 g蚕丝溶于100 mL 8 M氯化锌溶液中，过滤后和3 mg/g的胃蛋白酶溶液等体积混合（胃蛋白酶与蚕丝的质量比为1：100），37℃反应18 h，100 ℃加热20 min灭活酶，8000 rpm离心5 min，取下层、清洗，获得丝素蛋白沉淀。

取丝素蛋白沉淀溶于30 mL 5.0 M氯化锌溶液中，得到酶切丝素蛋白溶液。

S2、三唑啉二酮活化多糖羧基：将5 g三唑啉二酮溶于30 mL N,N-二甲基乙酰胺中，加入1 g羧甲基壳聚糖混合溶解，三唑啉二酮与羧甲基壳聚糖质量比为5：1，在40℃下反应10 min，再加入半胱氨酸终止反应。

S3、多糖定向接枝丝素蛋白：将S1中酶切丝素蛋白溶液和S2中活化的多糖溶液混合反应，丝素蛋白沉淀与多糖的质量比为1：5，在8℃下反应5 min。

反应混合物置于截留分子量为20 kDa的透析袋中，以水为介质透析36 h，得到接枝多糖的医用丝素蛋白溶液。

实施例4

S1、蚕丝一步法酶解：取15 g蚕丝溶于100 mL 10.0 M氯化钙-乙醇-水三元溶剂（摩尔比1：2：8）中，过滤后和3 mg/g的蛋白酶K溶液等体积混合（蛋白酶K与蚕丝的质量比为1：50），37℃反应16 h，95 ℃加热15 min灭活酶，4000 rpm离心10 min，取下层、清洗，获得丝素蛋白沉淀。

取丝素蛋白沉淀溶于溶于15 mL 6.0 M氯化钙-乙醇-水三元溶剂（摩尔比1：2：8）中，得到酶切丝素蛋白溶液。

S2、三唑啉二酮活化多糖羧基：将4 g三唑啉二酮溶于24 mL N-甲基吡咯烷酮中，加入2 g琼脂糖混合溶解，三唑啉二酮与琼脂糖质量比为2：1，在25℃下反应60 min，再加入甘氨酸终止反应。

S3、多糖定向接枝丝素蛋白：将S1中酶切丝素蛋白溶液和S2中活化的多糖溶液混合。丝素蛋白沉淀与多糖的质量比为1：3，在4℃下反应10 min。

反应混合物置于截留分子量为10 kDa的透析袋中，以PBS缓冲液为介质透析20 h，得到接枝多糖的医用丝素蛋白溶液。

实施例5

S1、蚕丝一步法酶解：取15 g蚕丝溶于100 mL 9.0 M溴化锂溶液中，过滤后和3mg/g的木瓜蛋白酶溶液等体积混合（木瓜蛋白酶与蚕丝的质量比为1：50），37℃反应24 h，100 ℃加热15 min灭活酶，5000 rpm离心10 min，取下层、清洗，获得丝素蛋白沉淀。

取丝素蛋白沉淀溶于15 mL 5.5 M溴化锂溶液中，得到酶切丝素蛋白溶液。

S2、三唑啉二酮活化多糖羧基：将4 g三唑啉二酮溶于24 mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入2 g几丁糖混合溶解，三唑啉二酮与几丁糖的质量比为2：1，在4℃下反应180 min，再加入β-巯基乙醇终止反应。

S3、多糖定向接枝丝素蛋白：将S1中酶切丝素蛋白溶液和S2中活化的多糖溶液混合，丝素蛋白沉淀与多糖的质量比为1：4，在4℃下反应20 min。

实施例6

S1、蚕丝一步法酶解：取20 g蚕丝溶于100 mL 9.3 M溴化锂溶液中，过滤后和3mg/g的碱性蛋白酶溶液等体积混合（碱性蛋白酶与蚕丝的质量比为3：200），37℃反应18 h，100 ℃加热10 min灭活酶，4000 rpm离心10 min，取下层、清洗，获得丝素蛋白沉淀。

取丝素蛋白沉淀溶于20 mL 4.5 M溴化锂溶液中，得到酶切丝素蛋白溶液。

S2、三唑啉二酮活化多糖羧基：将5 g三唑啉二酮溶于50 mL二甲基亚砜中，加入1g羟甲基纤维素混合溶解，三唑啉二酮与羟甲基纤维素的质量比为5：1，在4℃下反应150min，再加入甘氨酸终止反应。

S3、多糖定向接枝丝素蛋白：将S1中酶切丝素蛋白溶液和S2中活化的多糖溶液混合，丝素蛋白沉淀与多糖的质量比为1：5，在4℃下反应15 min。

反应混合物置于截留分子量为20 kDa的透析袋中，以PBS缓冲液为介质透析18 h，得到接枝多糖的医用丝素蛋白溶液。

对比例1

本对比例提供了一种丝素蛋白产品的制备方法，与实施例1类似，区别仅在于：在步骤S1中先将蚕丝加入到0.5 g/L Na₂CO₃溶液中煮沸1 h后，将脱胶丝捞出，水洗3次后烘干，再溶解于9.3M溴化锂溶液中，透析纯化，得到再生丝素蛋白溶液，再加入蛋白酶孵育，其余步骤与实施例1一致。工艺流程的对比如图1所示。

对比例2

本对比例提供了一种丝素蛋白产品的制备方法，与实施例1类似，区别仅在于：在步骤S1中将丝素蛋白沉淀溶解于水中，而未溶解于溴化锂溶液中，其余步骤与实施例1一致。

对比例3

本对比例提供了一种丝素蛋白产品的制备方法，与实施例1类似，区别仅在于：在步骤S1中将丝素蛋白沉淀溶解于9.3 M溴化锂溶液中，其余步骤与实施例1一致。

对比例4

本对比例提供了一种丝素蛋白产品的制备方法，与实施例1类似，区别仅在于：在步骤S2中，直接将海藻酸钠溶于水，然后在S3中和酶切丝素蛋白溶液混合反应，其余步骤与实施例1一致。

对比例5

本对比例提供了一种丝素蛋白产品的制备方法，与实施例1类似，区别仅在于：步骤S2中使用0.6 g 1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）与1.2 g N-羟基丁二酰亚胺（NHS）对多糖羧基进行活化，其余步骤与实施例1一致。

测试例

将上述实施例和对比例得到的样品进行相关测试，测试项目如下。

（1）丝胶蛋白残留量测定：采用专利号为CN20201056391.7，题为《用于直接检测蚕丝丝胶蛋白的多肽抗体及制备方法及应用》的专利中所提到的方法测定实施例1-6步骤S1中的丝素蛋白沉淀和对比例1中步骤S1制备得到的丝素蛋白沉淀中丝胶蛋白的残留量，结果如图2所示。

（2）性状观察：将实施例1-6制备得到的接枝多糖的医用丝素蛋白溶液和对比例1-5制备的丝素蛋白产品分别在无背景干扰的无色冷白光下，用肉眼观测丝素蛋白溶液的性状。

（3）溶液稳定性：将实施例1-6制备得到的接枝多糖的医用丝素蛋白溶液和对比例1-5制备的丝素蛋白产品分别放入4℃冰箱中冷藏，在90天内观察溶液的状态并记录。

（4）红外光谱法测定实施例1接枝多糖的医用丝素蛋白溶液中丝素蛋白的接枝状态，定性判断是否化学接枝成功。从图3可以看出，多糖定向接枝丝素蛋白后，丝素蛋白β-折叠特征峰1620cm^-1和1520cm^-1明显减弱，3296cm^-1处叠加了糖类分子中羟基的氢键振动而呈现宽峰‌，1031cm^-1处强峰为多糖中糖苷键（C-O-C）的伸缩振动峰，说明多糖成功化学接枝到丝素蛋白上。

（5）力学性能测试：将实施例1-6制备的接枝多糖的医用丝素蛋白溶液置于表面皿中自然静置成膜，将对比例1-5的丝素蛋白产品同样置于表面皿静置成膜，使用TST-01M型智能电子拉力试验仪测试拉伸断裂强度及断裂伸长率，拉伸速度10 mm/min，样品宽度10mm，夹持长度10 mm。结果如表1所示。

表1 稳定性以及力学性能测试结果

对比例1从蚕丝开始，经过脱胶、干燥处理获得脱胶丝，然后溶解于第一有机溶剂，再经过纯化获得传统再生丝素蛋白溶液，然后再进行酶解，最终所形成的丝素蛋白产品和实施例1-6一样，多糖成功化学接枝到酶切后的丝素蛋白上，形成稳定性大于90天的澄清透明溶液，同时力学性能也相似。但对比例1所代表的传统酶解法均是从再生丝素蛋白溶液开始酶解，从蚕丝到再生丝素蛋白溶液需要增加多道工艺，耗费大批量的化学试剂和工业废水，尤其是脱胶过程，无论是碱性溶液煮沸还是酸性溶液煮沸，都会对蚕丝造成非特异性的水解（不同于酶的特定点位水解）。从图2的脱胶效果看，实施例1-6和对比例1的丝胶残留量无显著性差异，均低于20 ng/mg，即0.002%。

对比例2采用纯水去溶解丝素蛋白沉淀。第二有机溶剂的缺失，导致丝素蛋白沉淀以不稳定的悬浮液状态存在，后续加入的活化的多糖并不能与其进行有效的化学接枝改性，因此最终没有形成溶液，而以沉淀的形式存在，无法进行后续使用。

对比例3采用高浓度的第二有机溶剂溶解丝素蛋白沉淀。高浓度的第二有机溶剂使得丝素蛋白沉淀的二级结构β-折叠完全打开，丝素蛋白链完全舒展开来，丝素蛋白末端和内部氨基充分暴露，后续加入的活化多糖与其进行了多点位的化学改性和交联，接枝多糖形成“分子刷”结构，结果导致改性的溶液过度交联化最终形成凝胶，不利于后续的进一步使用。同时因过度接枝改性，使得丝素蛋白维持无规卷曲构象，导致薄膜刚性（断裂强度）下降，柔性（断裂伸长率）增加。而实施例1-6的接枝多糖的医用丝素蛋白溶液在制备过程中，由于步骤S1的丝素蛋白沉淀溶解于低浓度的第二有机溶剂中，导致丝素蛋白暴露末端的氨基，末端氨基与活化的多糖反应形成酸酐，减少了内源性交联位点的形成，从而有效抑制自交联现象的发生。

对比例4采用未活化的多糖与酶切丝素蛋白溶液共混。未活化的多糖与丝素蛋白不能进行化学接枝改性，其本质是两者的物理共混，后续透析步骤能够将多糖完全透析除去，因此丝素蛋白分子间氢键复又占据主导地位，进而产生了絮状物沉淀，不能形成稳定性的溶液供进一步使用。

对比例5采用EDC/NHS将丝素蛋白和多糖进行接枝。丝素蛋白和多糖本身在温和条件下反应效率很低，EDC和NHS作为一对“搭档”催化剂，先将多糖链上的羧基激活成一个高反应活性的中间体，这个中间体再与丝素蛋白链上的氨基发生高效的酰胺化反应，从而通过共价键将两条大分子链连接起来，极易形成一个三维网络结构，将水分子包裹其中，最终形成水凝胶。

实施例7

将实施例1-6的接枝多糖的医用丝素蛋白溶液通过冷冻干燥法制备成多孔支架，具体步骤为将接枝多糖的医用丝素蛋白溶液放入-20℃冰箱，完全冷冻后放入冻干机，负压抽真空至完全形成固体粉末，将粉末溶于含血清的培养基中并接种L929成纤维细胞，通过细胞增殖毒性检测法（CCK-8法）检测3天的细胞增殖。实施例1-6制备的接枝多糖的医用丝素蛋白溶液的细胞增殖率最高达到124.4%，展示出极佳的促细胞增殖效果，其原因在于由实施例1-6的医用丝素蛋白溶液制备而成的丝素蛋白多孔支架不仅能增加比表面积以容纳更多细胞，还能提供接触引导，促进细胞伸展，并激活粘着斑激酶（FAK）和细胞外调节蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶（ERK/MAPK）信号通路，促进细胞铺展与增殖，多糖进一步提供营养物质为细胞提供能量。对比例3的丝素蛋白产品呈凝胶状态，采用相同方法接种L929成纤维细胞并通过细胞增殖毒性检测法（CCK-8法）检测3天的细胞增殖，凝胶态比表面积较低，其增殖效果并不如实施例1-6。测试结果见表2。

表2 细胞增殖率实验结果

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种接枝多糖的医用丝素蛋白溶液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将蚕丝溶于浓度为6-10M的第一有机溶剂中，再加入蛋白酶溶液孵育，孵育后灭活蛋白酶，离心得到丝素蛋白沉淀，将丝素蛋白沉淀溶于浓度为4-6M的第二有机溶剂中，得到酶切丝素蛋白溶液；

S2、在第三有机溶剂存在的条件下将至少含有一个羧基的多糖与三唑啉二酮混合反应，得到活化的多糖，其中，所述多糖选自海藻酸钠、透明质酸、羧甲基壳聚糖、琼脂糖、几丁糖、羧甲基纤维素中的一种或多种；

S3、将S1中的酶切丝素蛋白溶液与S2中活化的多糖混合反应，透析，得到接枝多糖的医用丝素蛋白溶液；

其中步骤S1中所述第一有机溶剂和第二有机溶剂独立地选自溴化锂、硫氰酸钠、氯化锌、氯化钙-乙醇-水三元溶剂中的一种或多种；步骤S2中第三有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述蛋白酶选自α-糜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述蛋白酶和蚕丝的质量比为1：（5-500）。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述三唑啉二酮和多糖的质量比为（10-1）：1。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述酶切丝素蛋白溶液中溶解的丝素蛋白沉淀与所述多糖的质量比为1：（1-10）。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述三唑啉二酮的质量与所述第三有机溶剂的体积比为1g：（5-10）mL。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述反应温度为2-8℃，反应时间为5-60 min。

8.权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到接枝多糖的医用丝素蛋白溶液。

9.权利要求8所述的医用丝素蛋白溶液在制备组织工程材料中的应用。