CN120927770A - 一种血清中目标物的电化学发光-光电化学双模式同时检测装置、方法及应用 - Google Patents

一种血清中目标物的电化学发光-光电化学双模式同时检测装置、方法及应用

Info

Publication number
CN120927770A
CN120927770A CN202510707963.3A CN202510707963A CN120927770A CN 120927770 A CN120927770 A CN 120927770A CN 202510707963 A CN202510707963 A CN 202510707963A CN 120927770 A CN120927770 A CN 120927770A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dual
detection
ecl
pec
electrochemiluminescence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202510707963.3A
Other languages
English (en)
Inventor
王玉玲
曹俊涛
赵容榕
胡雪波
付晓龙
王冰
刘彦明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xinyang Normal University
Original Assignee
Xinyang Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xinyang Normal University filed Critical Xinyang Normal University
Priority to CN202510707963.3A priority Critical patent/CN120927770A/zh
Publication of CN120927770A publication Critical patent/CN120927770A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本申请提供一种光诱导光电化学一体化装置，首次在单个传感体系中实现电化学发光和PEC信号的同时输出，并实现了血清中的标志物的双模式同时定量。制备、筛选出波长匹配的ECL/PEC材料对：luminol‑Au/Bi2WO6，利用层层自组装的方式，将Bi2WO6和luminol‑Au标记的探针先后组装在氧化铟锡电极上；施加电压，luminol‑Au发射出强烈的ECL信号，并触发Bi2WO6产生明显的光电流。以标志物miRNA‑21为模型，在系统中引入具有发夹结构的识别分子，采用酶辅助扩增的方法，实现了miRNA‑21灵敏、准确的双模式分析。本申请提供的检测方法不仅可实现目标物的ECL‑PEC双模式同时检测，还具有较强的普适性，可通过传感器的替换识别分子，为精准生物分析提供新的范例。

Description

一种血清中目标物的电化学发光-光电化学双模式同时检测 装置、方法及应用
技术领域
本申请涉及生物技术领域，具体涉及一种血清中目标物的电化学发光-光电化学双模式同时检测装置、方法及应用。
背景技术
生物传感器作为一种可将生物信号转化成可测量的光或者电信号进行定量分析的快捷器件，受到研究者的关注。目前，已经发展了多种用于血清中目标物质定量检测的生物传感器，例如：光电化学(PEC)生物传感器、电化学(EC)生物传感器、电化学发光(ECL)生物传感器、表面等离子体共振(SPR)生物传感器、荧光(FL)生物传感器和酶联免疫分析(ELISA)等等。它们通过生物敏感材料来收集生物信号，并将其转化成单一的光或者电信号进行目标物的定量。然而，这种单一的检测方法虽然提供了快速和方便的检测，但其结果可能会受到复杂的检测环境、共存物质的相似特性的干扰，具有独立信号输出的双模式传感平台成为构建灵敏、准确生物传感器的可靠、有效策略之一。
双模式生物传感器，如PEC-光热，PEC-EC，ECL-PEC，ECL-比色法和FL-ECL等，利用两个独立的信号相互比较和验证，克服了单信号输出假阳性/假阴性高的缺点，显著提高了测试结果的可靠性。其中，ECL-PEC双模式传感检测方法因其灵敏度高、选择性好、抗干扰能力强、响应速度快、操作方便等优点而受到广泛关注。特别是，PEC方法和ECL技术都使用了相同的电化学仪器，这进一步提高了测试结果的准确性，同时降低了成本，简化了操作程序。
目前，已经报道了多种PEC-ECL双模式传感平台用于目标物质的灵敏检测，但均是基于PEC信号和ECL信号的先后输出实现分别的定量。本申请涉及一种可实现血清中目标物质ECL-PEC双模式同时检测新方法，该方法通过一套自组装的装置实现ECL和PEC信号的同时输出，在生命分析领域的应用国内外尚未见报道。
发明内容
为解决现有技术中的问题，本申请提供一种血清中目标物的电化学发光-光电化学双模式同时检测方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1：ECL发光探针的合成；通过HAuCl4、luminol-NaOH和NaBH4制备得到luminol-Au；通过HS-功能化的pDNA与Luminol-Au制备得到ECL发光探针pDNA-luminol-Au；
步骤2：PEC光敏材料的合成；将Bi(NO)3·5H2O和Na2WO4·2H2O分散至纯水中得到Bi(NO3)3悬浮液，将Na2WO4水溶液滴入Bi(NO3)3悬浮液中得到混合溶液，将所述混合溶液高温反应，制备得到PEC光敏材料Bi2WO6；
步骤3：电化学发光-光电化学双模式传感器的构建，所述双模式传感器构建包括：
步骤3-1：将步骤2制备得到的PEC光敏材料Bi2WO6修饰在氧化铟锡电极表面上；
步骤3-2：对Bi2WO6修饰的氧化铟锡电极清洗后，滴加分子信标，孵育，再次清洗后，修饰牛血清白蛋白；
步骤3-3：清洗修饰牛血清白蛋白的电极表面，向电极表面滴加含miRNA-21和含Mg2+的DSN酶混合液，孵育后，使DSN酶失活，终止反应；
步骤3-4：加入步骤1制备得到的ECL发光探针pDNA-luminol-Au溶液，37℃下孵育1h，获得用于血清中目标物的电化学发光-光电化学双模式传感器；
步骤4：进行目标物的测试，以步骤3中获得的电化学发光-光电化学双模式传感器为工作电极、Ag/AgCl为参比电极、铂丝为辅助电极构建三电极体系，将所述三电极体系置于含有5mmol/L H2O2的磷酸盐缓冲溶液(0.01mol/L PBS)的玻璃检测池中，并将所述玻璃检测池转移至电化学发光-光电化学双模式同时检测装置中，其中所述电化学发光-光电化学双模式同时检测装置由LVIUM电化学工作站和BPCL-1-TIC微弱发光检测仪构成，ECL信号和PEC信号分别由LVIUM电化学工作站和BPCL-1-TIC微弱发光检测仪的对应的软件显示收集，进行双模式同时检测分析，得到血清中目标物的信息。
本申请还提供一种运行所述检测方法的电化学发光-光电化学双模式同时检测的装置，其特征在于，所述检测装置包括LVIUM电化学工作站，BPCL-1-TIC微弱发光检测仪，其中，所述BPCL-1-TIC微弱发光检测仪由含有光电倍增管的探测器和信号分析器主机组成，ECL信号由微弱发光检测仪收集和PEC信号由LVIUM电化学工作站收集，BPCL-1-TIC微弱发光检测仪自连接后与电脑相连：探测器中的S-Connector端口与信号分析器主机的S-Input端口相连，V-Connector端口与V-output端口相连，探测器中的电化学发光检测池则通过Cell Connector端口与LVIUM电化学工作站相连，而S-output端口与电脑相连用于传输光电倍增管所探测的ECL信号，并BPCL-1-TIC微弱发光检测仪测量分析系统中实时显示；
LVIUM电化学工作站作为电压供应系统与BPCL-1-TIC微弱发光检测仪相连：先将LVIUM电化学工作站中用于连接光源的Peripheral pot空置，LVIUM电化学工作站的CellConnector端口与BPCL-1-TIC检测系统中的电化学发光检测池相连，为ChronoAmperanetry检测模式下的电极施加发光电压，同时收集电极表面的PEC信号，USB插孔与电脑相连，用于传输实时检测得到的PEC信号。
本申请还提供所述检测方法在血清目标物检测中的应用。
有益效果
本申请提供的一种利用自制的光诱导PEC一体化传感器，在一次测量中，可实现血清中目标物质ECL和PEC双模式同时检测。本申请提供的血清中目标物的电化学发光-光电化学双模式同时检测方法是目前首次实现ECL、PEC信号同时输出的案例。
本申请提供的血清中目标物的电化学发光-光电化学双模式同时检测方法合成并筛选Bi2WO6(具有高PEC性能的半导体纳米材料)为光电极材料、luminol-Au为ECL发光体，利用层层修饰的方法，分别将Bi2WO6、分子信标MB、miRNA-21以及pDNA-luminol-Au探针先后修饰在ITO电极表面。当在电极上施加0.6V(大于luminol的ECL发光电位)的电压时，luminol-Au探针会产生435nm左右的蓝光(该光的波长正处于Bi2WO6的吸光波长范围内)，被Bi2WO6吸收后，促使其载流子发生分离，产生光电流。通过自制的光电系统，可同时收集luminol-Au产生的ECL信号和Bi2WO6产生的PEC信号。
本申请的技术方案解决了一个长期的挑战，即ECL、PEC双模式信号的同时输出，这将推动血清中目标物质的灵敏、准确分析的发展。
通常情况下，要实现目标物的ECL-PEC双模式检测的方式有两种：
(1)用两套三电极装置，分别构建ECL、PEC双传感器体系，且两体系用透光度良好的玻璃物理隔离，分别用ECL、PEC装置进行两信号的同时收集。该方式虽能实现ECL-PEC双模式同时检测，但传感器构建复杂、耗材耗时，且两体系间的物理距离需严格控制，限制其发展。
(2)将ECL、PEC双传感器体系构建在一套三电极装置中，用ECL、PEC装置对两信号进行依次收集，没有实现真正意义上的同时检测。本申请中，为了实现双信号的同时收集，将ECL、PEC装置巧妙集成在一起，施加一个方波型电压后，可利用一套装置实现双信号的同时收集。
本申请极大程度地简化了装置和构建过程，为血清中目标物质的双模式检测提供了更一致的检测环境，实现了更准确、更灵敏的检测。本申请提供的方法有利于精准分析检测，对科学研究提供有机的支持和准确的基础。
附图说明
图1.用于血清中miRNA-21的ECL-PEC双模式一体化传感器的构建示意图。
图2.其中，Bi2WO6光敏材料的(A)XRD、(B)紫外-可见吸收光谱图和(C)SEM表征图；(D)luminol(曲线a)、luminol-Au(曲线b)的紫外-可见吸收光谱图及(E、F)luminol-Au的TEM图，F图及其内插图为luminol-Au的高分辨率TEM图。
图3.其中(A)Bi2WO6紫外-可见吸收光谱图(黑色曲线)与luminol-Au的ECL发射图(红色曲线)；双模式一体化传感器构建过程的(B)EIS表征，(C)ECL表征及(D)PEC表征。
图4.其中(A)孵育不同浓度miRNA-21的生物传感器的ECL信号及(B)ECL强度与miRNA-21浓度的关系图，内插图表示ECL强度与miRNA-21浓度的对数关系；(C)孵育不同浓度miRNA-21的生物传感器的PEC信号及(D)PEC强度与miRNA-21浓度的关系，内插图表示PEC强度与miRNA-21浓度的对数关系。
图5.其中ECL-PEC双模式一体化传感器检测miRNA-21的选择性实验图(A、B)及稳定性实验图(C、D，其中A和C为ECL模式，B和D为PEC模式)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本申请一实施例提供一种血清中目标物的电化学发光-光电化学双模式同时检测的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1：ECL发光探针的合成；通过HAuCl4、luminol-NaOH和NaBH4制备得到luminol-Au；通过HS-功能化的pDNA与Luminol-Au制备得到ECL发光探针pDNA-luminol-Au；
步骤2：PEC光敏材料的合成；将Bi(NO)3·5H2O和Na2WO4·2H2O分散至纯水中得到Bi(NO3)3悬浮液，将Na2WO4水溶液滴入Bi(NO3)3悬浮液中得到混合溶液，将所述混合溶液高温反应，制备得到PEC光敏材料Bi2WO6；
步骤3：电化学发光-光电化学双模式传感器的构建，所述双模式传感器构建包括：
步骤3-1：将步骤2制备得到的PEC光敏材料Bi2WO6修饰在氧化铟锡电极表面上；
步骤3-2：对Bi2WO6修饰的氧化铟锡电极清洗后，滴加分子信标，孵育，再次清洗后，修饰牛血清白蛋白；
步骤3-3：清洗修饰牛血清白蛋白的电极表面，向电极表面滴加含miRNA-21和含Mg2+的DSN酶混合液，孵育后，使DSN酶失活，终止反应；
步骤3-4：加入步骤1制备得到的ECL发光探针pDNA-luminol-Au溶液，37℃下孵育1h，获得用于血清中目标物的电化学发光-光电化学双模式传感器；
步骤4：进行目标物的测试，以步骤3中获得的电化学发光-光电化学双模式传感器为工作电极、Ag/AgCl为参比电极、铂丝为辅助电极构建三电极体系，将所述三电极体系置于含有5mmol/L H2O2的磷酸盐缓冲溶液(0.01mol/L PBS)的玻璃检测池中，并将所述玻璃检测池转移至电化学发光-光电化学双模式同时检测装置中，其中所述电化学发光-光电化学双模式同时检测装置由LVIUM电化学工作站和BPCL-1-TIC微弱发光检测仪构成，ECL信号和PEC信号分别由LVIUM电化学工作站和BPCL-1-TIC微弱发光检测仪的对应的软件显示收集，进行双模式同时检测分析，得到血清中目标物的信息。
在一实施例在，步骤1中，所述通过HAuCl4、luminol-NaOH和NaBH4制备得到luminol-Au为，在冰浴搅拌的条件下，向烧杯中加入HAuCl4，再逐滴加入luminol-NaOH溶液，待搅拌均匀后，逐滴加入NaBH4溶液，反应后撤掉冰浴，室温下继续搅拌6h，在透析袋中透析获得luminol-Au。
在一实施例在，步骤1中，通过HS-功能化的pDNA与Luminol-Au制备得到pDNA-luminol-Au为，将HS-功能化的pDNA与Luminol-Au混合，在摇床中反应；然后，离心去除上清液；将离心产物分散在500μL PBS中获得ECL发光探针pDNA-luminol-Au。
在一实施例在，步骤2中，所述高温反应为，搅拌后将Na2WO4水溶液滴入Bi(NO3)3悬浮液中得到混合溶液，转移到高压釜中，高温反应，反应产物用乙醇和水离心清洗，烘干，得到PEC光敏材料Bi2WO6。
在一实施例在，步骤3-1中，将步骤2制备得到PEC光敏材料Bi2WO6修饰在氧化铟锡电极表面上为，将Bi2WO6溶于0.05mg/mL-0.1mg/mL壳聚糖溶液，修饰在氧化铟锡电极表面，烘干后，在Bi2WO6修饰的氧化铟锡电极表面上滴加的戊二醛，室温下避光放置。
在一实施例在，步骤3-2中，对Bi2WO6修饰的氧化铟锡电极清洗后，滴加分子信标，孵育，再次清洗后，修饰牛血清白蛋白为，对Bi2WO6修饰的氧化铟锡电极清洗后，滴加分子信标，并于37℃下孵育1h，再次用PBS清洗后，在同样的环境下修饰牛血清白蛋白。
在一实施例在，步骤3-3中，清洗修饰牛血清白蛋白的电极表面，向电极表面滴加含miRNA-21和含Mg2+的DSN酶混合液，孵育后，使DSN酶失活，终止反应为，用含Mg2+的PBS溶液清洗电极表面，再向电极表面滴加含miRNA-21和含Mg2+的DSN酶混合液，37℃下孵育1h后，在60℃条件下放置5min使DSN酶失活，终止反应。
在一实施例在，步骤4中，进行双模式同时检测分析为：
步骤S4-1：在LVIUM电化学工作站中使用计时安培法，采用电位阶跃法来激发ECL--激发电位0.6V(持续10s)，无激发状态0V(持续10s)，取样间隔为0.5s；
步骤S4-2：BPCL微弱发光检测仪软件中光电倍增管高压设置为-800V，设置完成后，LVIUM电化学工作站软件和BPCL微弱发光检测仪软件均点击开始，进行双模式同时检测。
本申请一实施例提供一种运行所述检测方法的电化学发光-光电化学双模式同时检测的装置，其特征在于，所述检测装置包括LVIUM电化学工作站，BPCL-1-TIC微弱发光检测仪，其中，所述BPCL-1-TIC微弱发光检测仪由含有光电倍增管的探测器和信号分析器主机组成，ECL信号由微弱发光检测仪收集和PEC信号由LVIUM电化学工作站收集，BPCL-1-TIC微弱发光检测仪自连接后与电脑相连：探测器中的S-Connector端口与信号分析器主机的S-Input端口相连，V-Connector端口与V-output端口相连，探测器中的电化学发光检测池则通过Cell Connector端口与LVIUM电化学工作站相连，而S-output端口与电脑相连用于传输光电倍增管所探测的ECL信号，并BPCL-1-TIC微弱发光检测仪测量分析系统中实时显示；
LVIUM电化学工作站作为电压供应系统与BPCL-1-TIC微弱发光检测仪相连：先将LVIUM电化学工作站中用于连接光源的Peripheral pot空置，LVIUM电化学工作站的CellConnector端口与BPCL-1-TIC检测系统中的电化学发光检测池相连，为ChronoAmperanetry检测模式下的电极施加发光电压，同时收集电极表面的PEC信号，USB插孔与电脑相连，用于传输实时检测得到的PEC信号。
在一实施例中，电化学发光-光电化学双模式同时检测的装置由LVIUM电化学工作站和BPCL-1-TIC微弱发光检测仪共同构成，ECL信号和PEC信号分别由两部件对应的软件显示收集。
在一实施例中，先将微弱发光检测仪自连接后再与电脑相连：探测器中的S-Connector端口与信号分析系统的S-Input端口相连，V-Connector端口与V-output端口相连，探测器中的电化学发光检测池则通过Cell Connector端口与LVIUM电化学工作站相连，而S-output端口与电脑相连用于传输光电倍增管所探测的ECL信号，并在微弱发光检测仪测量分析系统中实时显示出来。然后将LVIUM电化学工作站作为电压供应系统与BPCL-1-TIC微弱发光检测仪相连：先将LVIUM电化学工作站中用于连接光源的Peripheralpot空置，将其Cell Connector端口与BPCL-1-TIC检测系统中的电化学发光检测池相连，为ChronoAmperanetry检测模式下的电极施加发光电压，同时收集电极表面的PEC信号，USB插孔与电脑相连，用于传输实时检测得到的PEC信号。
本申请一实施例提供任一项检测方法在血清目标物检测中的应用。
实施例1：波长适配的ECL/PEC材料对的合成
(1)ECL发光探针的合成：在4℃冰浴、搅拌的条件下，先向小烧杯中加入20mL 2.5×10-4mol/L的HAuCl4，再逐滴加入4mL 0.01mol/L的luminol-NaOH溶液，待搅拌均匀后，逐滴加入0.6mL 0.1mol/L的NaBH4溶液，反应10min后撤掉冰浴，室温下继续搅拌6h，最后，在D＝14000的透析袋中继续透析6h，即获得luminol-Au。最后，将10μL 100μM HS-功能化的pDNA(购买于郑州生工生物工程股份有限公司)与2000μL luminol-Au混合，在20℃、1000rpm条件下于摇床中正当反应16h；然后，在10000rpm条件下离心10min并去除上清液。最后，将离心产物分散在500μL PBS中即可获得具有ECL性能的pDNA-luminol-Au探针。
(2)PEC光敏材料的合成：大力搅拌下，4mmol的Bi(NO)3·5H2O和2mmolNa2WO4·2H2O被分散到30mL纯水中，然后，将Na2WO4水溶液慢慢滴入Bi(NO3)3悬浮液中，搅30min后将混合溶液转移到高压釜中，180℃反应12h，得到的产物用乙醇和水多次离心清洗，80℃下过夜烘干，得到具有PEC响应的Bi2WO6材料。
通过对Bi2WO6材料进行XRD和SEM表征、luminol-Au进行紫外-可见吸收光谱图及TEM表征，结果如图2所示，Bi2WO6光敏材料的图2中(A)XRD、图2中(B)紫外-可见吸收光谱图和图2中(C)SEM表征图；图2中(D)luminol(曲线a)、luminol-Au(曲线b)的紫外-可见吸收光谱图及图2中(E、F)luminol-Au的TEM图，图2中(F)图及其内插图为luminol-Au的高分辨率TEM图。实验结果证明两材料的合成成功。
实施例2：双模式一体化传感器的构建和可行性测试
通过对实施例1中Bi2WO6材料的紫外可见吸收光谱和luminol-Au NPs的ECL发射光谱进行研究，发现luminol-Au NPs的ECL发射波长范围与Bi2WO6材料的紫外可见吸收波长范围有较大的重叠(图3中A)，可证明luminol-Au NPs的ECL信号触发Bi2WO6材料PEC行为的可行性。
进一步进行双模式一体化传感器的构建：将20μL 4mg/mL的Bi2WO6(溶于0.1mg/mL壳聚糖)修饰在氧化铟锡(ITO)电极表面上，烘干后，在其上滴加20μL 2.5％(v/v)的戊二醛，室温下避光放置50min；用PBS清洗后，再滴加20μL 0.5μmol/L的分子信标(MB)并于37℃下孵育1h，再次用PBS清洗后，在同样的环境下修饰0.8％的牛血清白蛋白(BSA)，随后用含5mmol/L Mg2+的PBS溶液清洗电极表面，再向电极表面滴加含miRNA-21和DSN酶(含Mg2+)的混合液，37℃下孵育1h后，在60℃条件下放置5min使DSN酶失活，终止反应；最后，加入pDNA-luminol-Au探针溶液，37℃下孵育1h，即可获得用于miRNA-21检测的双模式传感平台。
利用电化学阻抗谱(EIS)和双模式信号输出行为对逐层修饰的电极进行表征，结果如图3所示。发现，随着上述步骤的逐层修饰，电极表面的电子转移电阻越来越大(图3中B)，这是壳聚糖、戊二醛、MB、BSA、miRNA-21和pDNA-luminol-Au探针较小的电导率和较大的空间位阻导致的，可初步证明传感器的成功构建。
然后测试所述逐层修饰电极的双模式输出信号(即ECL和PEC行为)，如图3中C和3中D所示。当在电极表面修饰了光敏材料Bi2WO6后，双模式一体化检测装置没有收集到光信号(曲线b，图3中C)，但因为施加了0.6V的偏压，产生了一个400nA左右的光电流(曲线b，图3中D)，且该光电流随着逐层的修饰，逐渐减小；当在电极表面孵育了具有ECL发光性能的pDNA-luminol-Au探针后，双模式一体化检测装置不仅收集到一个约10000a.u.的光信号(曲线g，图3中C)，PEC模式的光电流增加了约500nA(曲线g和f间的插值，图3中D)。
以上结果足以证明该传感器的成功构建及用于血清中目标物双模式检测检测的可行性。
实施例3：溶液中目标物miRNA-21的双模式检测
为了使用光诱导PEC一体化装置对溶液中目标物miRNA-21进行双模式定量分析，按照电化学发光-光电化学双模式传感器的构建步骤，将含有不同浓度miRNA-21(0fmol/L，50fmol/L，100fmol/L，500fmol/L，1pmol/L，10pmol/L，100pmol/L 1nmol/L,10nmol/L)分别修饰在工作电极表面构建不同的传感界面，再以步骤5的方式进行测试，同时得到修饰有不同浓度目标物的ECL和PEC信号曲线，参见图4，图4中(A)孵育不同浓度miRNA-21的生物传感器的ECL信号及图4中(B)ECL强度与miRNA-21浓度的关系图，内插图表示ECL强度与miRNA-21浓度的对数关系；图4中(C)孵育不同浓度miRNA-21的生物传感器的PEC信号及图4中(D)PEC强度与miRNA-21浓度的关系，内插图表示PEC强度与miRNA-21浓度的对数关系。
根据本实施例的结果分析可知，当miRNA-21浓度在1.0×10-16～1.0×10-8mol/L范围内时，其ECL信号强度与浓度的对数值呈正相关，线性方程为：YECL＝17911.9+987.31g c(mol/L，R2＝0.997)，检出限低至72.9amol/L(S/N＝3)；同时，当miRNA-21浓度在1.0×10-14～1.0×10-8mol/L范围内时，其PEC信号强度与浓度的对数值也呈正相关，线性方程为：IPEC＝1605.5+102.9lg c(mol/L，R2＝0.996)，检出限低至6.46fmol/L(S/N＝3)。
结果说明所发展的两种分析模式均具有较宽的线性范围和较低的检出限，且两模式所测结果可相互补充、相互印证，进一步提高了检测结果的准确性，为复杂样品中的灵敏、准确检测提供新方法。
实施例4：ECL-PEC双模式一体化传感器检测miRNA-21的选择性和稳定性
为了排除血清中其他序列的miRNA带来的假阳性信号，选择用其他序列的miRNA(包括miRNA-141和miRNA-451)、单碱基错配miRNA-21(MM1)和三碱基错配miRNA-21(MM3)为干扰物(浓度均为1.0nmol/L)，进行了选择性实验。发现修饰有其他序列miRNA的ECL、PEC响应较低；而修饰两干扰物获得的ECL、PEC信号均只有修饰有目标物miRNA-21的一半；最后修饰这些物质混合物(miRNA-141+miRNA-451+MM1+MM3+miRNA-21)的传感器获得ECL、PEC响应与只修饰目标物miRNA-21的相近，见图5中A和B。
此外，还对双模式传感器的稳定性进行了评价。如图5中C和5中D所示，生物传感器(含10nmol/L miRNA-21)的ECL模式在连续扫描10个周期后显示出稳定的光电流，相对标准偏差(RSD)为2.3％；PEC模式的电流信号RSD为1.1％，表明传感器稳定性高。
实验结果说明本申请的方法选择性良好、稳定性高，可实现复杂样品中目标物质的特异性检测。
实施例5：血清中目标物miRNA-21的双模式分析
miRNA-21作为一种潜在的肿瘤标志物，在多种癌症中都有表达，而人血清中miRNA-21浓度较低，在实际样品分析中具有一定的困难。为评价本申请检测方法的适用性，将所研制的双模传感器用于血清中miRNA-21的加标实验分析。将不同浓度的miRNA-21标准液(0.01、0.1和1pmol/L)分别加入2个均10倍稀释的人血清中，进行双模式检测，并根据实施例1获得的校准曲线计算浓度。
如表1所示，ECL模式检测结果显示，miRNA-21的加标回收率为93.2～117.7％，RSD在1.8～3.6％之间；PEC模式检测结果显示，血清中miRNA-21的回收率为87.1～118.5％，RSD为2.6～5.1％。结果表明该发明在血清的目标物检测中具有良好的应用潜力。
表1.ECL-PEC双模式一体化传感器用于血清中miRNA-21的加标回收实验结果。
综上所述，本研究构建了一种新型ECL-PEC双模式一体化传感器，实现了对miRNA-21的灵敏、准确检测。本工作有两处创新：第一，将ECL作为微型化内光源，避免了外光源的使用，既缩短了PEC激发所需光源的距离，显著提升光子利用效率，又降低了背景噪音；第二，利用不同材料在同一电极表面实现光子发射与Bi2WO6光电流收集，同时输出ECL和PEC双信号，所开发的双模式生物传感器实现了miRNA-21的交叉验证检测，相较于单模式传感器，有效降低了假阳性/阴性信号，使检测结果更可靠。该工作不仅为ECL-PEC检测技术的发展作出重要贡献，在生化分析和临床诊断领域展现出应用潜力，更为新型双模式生物传感器的构建提供了新思路。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的原理的前提下，还可以作数若干改进和润饰，这些改进和润饰也应当视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种血清中目标物的电化学发光-光电化学双模式同时检测的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1：ECL发光探针的合成；通过HAuCl4、luminol-NaOH和NaBH4制备得到luminol-Au；通过HS-功能化的pDNA与Luminol-Au制备得到ECL发光探针pDNA-luminol-Au；
步骤2：PEC光敏材料的合成；将Bi(NO)3·5H2O和Na2WO4·2H2O分散至纯水中得到Bi(NO3)3悬浮液，将Na2WO4水溶液滴入Bi(NO3)3悬浮液中得到混合溶液，将所述混合溶液高温反应，制备得到PEC光敏材料Bi2WO6；
步骤3：电化学发光-光电化学双模式传感器的构建，所述双模式传感器构建包括：
步骤3-1：将步骤2制备得到的PEC光敏材料Bi2WO6修饰在氧化铟锡电极表面上；
步骤3-2：对Bi2WO6修饰的氧化铟锡电极清洗后，滴加分子信标，孵育，再次清洗后，修饰牛血清白蛋白；
步骤3-3：清洗修饰牛血清白蛋白的电极表面，向电极表面滴加含miRNA-21和含Mg2+的DSN酶混合液，孵育后，使DSN酶失活，终止反应；
步骤3-4：加入步骤1制备得到的ECL发光探针pDNA-luminol-Au溶液，37℃下孵育1h，获得用于血清中目标物的电化学发光-光电化学双模式传感器；
步骤4：进行目标物的测试，以步骤3中获得的电化学发光-光电化学双模式传感器为工作电极、Ag/AgCl为参比电极、铂丝为辅助电极构建三电极体系，将所述三电极体系置于含有5mmol/L H2O2的磷酸盐缓冲溶液(0.01mol/L PBS)的玻璃检测池中，并将所述玻璃检测池转移至电化学发光-光电化学双模式同时检测装置中，其中所述电化学发光-光电化学双模式同时检测装置由LVIUM电化学工作站和BPCL-1-TIC微弱发光检测仪构成，ECL信号和PEC信号分别由BPCL-1-TIC微弱发光检测仪和LVIUM电化学工作站的对应的软件显示收集，进行双模式同时检测分析，得到血清中目标物的信息。
2.根据权利要求1所述血清中目标物的电化学发光-光电化学双模式同时检测的方法，其特征在于，步骤1中，所述通过HAuCl4、luminol-NaOH和NaBH4制备得到luminol-Au为，在冰浴搅拌的条件下，向烧杯中加入HAuCl4，再逐滴加入luminol-NaOH溶液，待搅拌均匀后，逐滴加入NaBH4溶液，反应后撤掉冰浴，室温下继续搅拌6h，在透析袋中透析获得luminol-Au。
3.根据权利要求1所述血清中目标物的电化学发光-光电化学双模式同时检测的方法，其特征在于，步骤1中，通过HS-功能化的pDNA与Luminol-Au制备得到pDNA-luminol-Au为，将HS-功能化的pDNA与Luminol-Au混合，在摇床中反应；然后，离心去除上清液；将离心产物分散在500μL PBS中获得ECL发光探针pDNA-luminol-Au。
4.根据权利要求1所述血清中目标物的电化学发光-光电化学双模式同时检测的方法，其特征在于，步骤2中，所述高温反应为，搅拌后将Na2WO4水溶液滴入Bi(NO3)3悬浮液中得到混合溶液，转移到高压釜中，高温反应，反应产物用乙醇和水离心清洗，烘干，得到PEC光敏材料Bi2WO6。
5.根据权利要求1所述血清中目标物的电化学发光-光电化学双模式同时检测的方法，其特征在于，步骤3-1中，将步骤2制备得到PEC光敏材料Bi2WO6修饰在氧化铟锡电极表面上为，将Bi2WO6溶于0.05mg/mL－0.1mg/mL壳聚糖溶液，修饰在氧化铟锡电极表面，烘干后，在Bi2WO6修饰的氧化铟锡电极表面上滴加的戊二醛，室温下避光放置。
6.根据权利要求1所述血清中目标物的电化学发光-光电化学双模式同时检测的方法，其特征在于，步骤3-2中，对Bi2WO6修饰的氧化铟锡电极清洗后，滴加分子信标，孵育，再次清洗后，修饰牛血清白蛋白为，对Bi2WO6修饰的氧化铟锡电极清洗后，滴加分子信标，并于37℃下孵育1h，再次用PBS清洗后，在同样的环境下修饰牛血清白蛋白。
7.根据权利要求1所述血清中目标物的电化学发光-光电化学双模式同时检测的方法，其特征在于，步骤3-3中，清洗修饰牛血清白蛋白的电极表面，向电极表面滴加含miRNA-21和含Mg2+的DSN酶混合液，孵育后，使DSN酶失活，终止反应为，用含Mg2+的PBS溶液清洗电极表面，再向电极表面滴加含miRNA-21和含Mg2+的DSN酶混合液，37℃下孵育1h后，在60℃条件下放置5min使DSN酶失活，终止反应。
8.根据权利要求1所述血清中目标物的电化学发光-光电化学双模式同时检测的方法，其特征在于，步骤4中，进行双模式同时检测分析为：
步骤S4-1：在LVIUM电化学工作站中使用计时安培法，采用电位阶跃法来激发ECL——激发电位0.6V(持续10s)，无激发状态0V(持续10s)，取样间隔为0.5s；
步骤S4-2：BPCL微弱发光检测仪软件中光电倍增管高压设置为-800V，设置完成后，LVIUM电化学工作站软件和BPCL微弱发光检测仪软件均点击开始，进行双模式同时检测。
9.一种运行权利要求1-8中任一项检测方法的电化学发光-光电化学双模式同时检测的装置，其特征在于，所述检测装置包括LVIUM电化学工作站，BPCL-1-TIC微弱发光检测仪，其中，所述BPCL-1-TIC微弱发光检测仪由含有光电倍增管的探测器和信号分析器主机组成，ECL信号由微弱发光检测仪收集和PEC信号由LVIUM电化学工作站收集，BPCL-1-TIC微弱发光检测仪自连接后与电脑相连：探测器中的S-Connector端口与信号分析器主机的S-Input端口相连，V-Connector端口与V-output端口相连，探测器中的电化学发光检测池则通过Cell Connector端口与LVIUM电化学工作站相连，而S-output端口与电脑相连用于传输光电倍增管所探测的ECL信号，并BPCL-1-TIC微弱发光检测仪测量分析系统中实时显示；
LVIUM电化学工作站作为电压供应系统与BPCL-1-TIC微弱发光检测仪相连：先将LVIUM电化学工作站中用于连接光源的Peripheral pot空置，LVIUM电化学工作站的CellConnector端口与BPCL-1-TIC检测系统中的电化学发光检测池相连，为ChronoAmperanetry检测模式下的电极施加发光电压，同时收集电极表面的PEC信号，USB插孔与电脑相连，用于传输实时检测得到的PEC信号。
10.权利要求1-8中任一项检测方法在血清目标物检测中的应用。
CN202510707963.3A 2025-05-29 2025-05-29 一种血清中目标物的电化学发光-光电化学双模式同时检测装置、方法及应用 Pending CN120927770A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202510707963.3A CN120927770A (zh) 2025-05-29 2025-05-29 一种血清中目标物的电化学发光-光电化学双模式同时检测装置、方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202510707963.3A CN120927770A (zh) 2025-05-29 2025-05-29 一种血清中目标物的电化学发光-光电化学双模式同时检测装置、方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN120927770A true CN120927770A (zh) 2025-11-11

Family

ID=97585867

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202510707963.3A Pending CN120927770A (zh) 2025-05-29 2025-05-29 一种血清中目标物的电化学发光-光电化学双模式同时检测装置、方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN120927770A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2515112B1 (en) Method for electrochemically detecting analyte
CN106706748B (zh) 检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器及其制备方法
CN114295694B (zh) 一种用于乳腺癌her-2检测的电化学发光适体传感器及其检测方法
CN103454426B (zh) 纳米金/壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝修饰的免疫传感器的制备方法
CN102749452B (zh) 一种近红外的电致化学发光免疫检测方法
Liao et al. Proximity hybridization triggered hybridization chain reaction for label-free electrochemical homogeneous aptasensors
CN105136879B (zh) 一种基于石墨烯量子点的电致化学发光传感器的制备方法及应用
CN110308187B (zh) 一种基于锌和钴掺杂的多孔纳米钒酸铋/硫化铋的光电化学适配体传感器的制备方法及应用
CN102375021A (zh) 一种采用dna为探针的电化学检测环境污染物方法
CN107024520A (zh) 一种基于碳点检测atp的修饰电极及其制备方法
CN110632137A (zh) 基于亚甲基蓝可控释放的免固定免标记光致电化学microRNA传感器及其应用
CN112924662A (zh) 一种电致化学发光免疫传感器的制备方法及其在检测黄曲霉毒素b1中的应用
CN118937457A (zh) Ec-pec双模式适配体传感器及其制备方法和应用
CN108827946B (zh) 一种共用共反应试剂类型的呕吐毒素比率型电致化学发光免疫传感器及其检测方法
CN103048374A (zh) 一种检测多环芳烃蒽的电化学方法
CN104792999A (zh) 一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯片
CN106198503B (zh) 一种电化学发光夹心生物传感器及制备与应用
CN104155289A (zh) 一种检测汞离子的固态电化学发光传感器及其制备方法和应用
CN114047235B (zh) 一种神经元特异性烯醇化酶光电化学传感器的制备方法
Zhang et al. Enzyme‐free Recycling Amplification‐based Sensitive Electrochemical Thrombin Aptasensor
CN106770215B (zh) 一种多功能化的铁钴磁性纳米传感器的制备方法及其产品和应用
CN120927770A (zh) 一种血清中目标物的电化学发光-光电化学双模式同时检测装置、方法及应用
CN107064265A (zh) 一种MPBA修饰的用于HbA1c检测的电化学生物传感器及其制备与应用
Li et al. Electrochemiluminescence detection of silver ion based on trigeminal structure of DNA
CN111830102A (zh) 一种铜掺杂的Tb基MOF检测CYFRA 21-1的电化学发光免疫传感器的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination