CN121008043A - Axl-gas6复合物的检测方法及在心肌梗死患者中的应用 - Google Patents

Axl-gas6复合物的检测方法及在心肌梗死患者中的应用

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Abstract

本发明涉及AXL‑GAS6复合物的检测方法及在心肌梗死患者中的应用，具体地，本发明涉及检测样品中AXL‑GAS6复合物水平的方法，包括(a)将样品与抗AXL‑GAS6抗体或其抗原结合片段接触；和(b)检测所述AXL‑GAS6抗体或其抗原结合片段与AXL‑GAS复合物的结合并确定样品中AXL‑GAS6复合物的水平；本发明还涉及抗AXL‑GAS6抗体或其抗原结合片段在制备用于诊断心肌梗死或评估心肌梗死风险的药物或试剂盒中的用途。

Description

AXL-GAS6复合物的检测方法及在心肌梗死患者中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及结合AXL-GAS6复合物的抗体，以及AXL-GAS6复合物的检测方法及在心肌梗死患者中的应用。
背景技术
AXL是TAM受体酪氨酸激酶家族的成员之一，1991年首次克隆出其全长cDNA。AXL来源于希腊语anexelekto，意思是“uncontrolled,失去控制的”。AXL包含两个免疫球蛋白样结构域(Immunoglobulin-like，IgL)和两个纤连蛋白III(fibronectin III，FNIII)结构域以及一个激酶结构域，主要以二聚体的形式表达在细胞表面。AXL主要通过结合配体GAS6(Growth arrest-specific protein 6)，连接凋亡细胞表面表达的磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PtdSer)，从而将信号转导至细胞质中。生理条件下，AXL/GAS6主要发挥吞噬清除凋亡细胞，抑制炎症反应发生的作用。
在过去的近三十年间，有上百篇文章报道AXL和其配体的表达与多种癌症相关。这些研究发现，肿瘤细胞过表达或上调AXL的表达通常伴随着肿瘤的不良预后。比如急性髓系白血病(AML)、多形性胶质母细胞瘤、黑色素瘤、胰腺癌、食道癌等。
研究发现，GAS6和AXL的相互作用能够激活PI3K-Akt通路帮助肿瘤细胞存活，激活的Akt导致促凋亡介质Bad被灭活，同时增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达；GAS6/AXL结合后也能够通过直接结合Grb2，继而激活Ras/ERK信号通路，刺激肿瘤细胞的增殖；还可以通过细胞外信号调节激酶ERK上调Slug的磷酸化，刺激肿瘤细胞发生迁移。可见GAS6通过结合AXL激活不同的下游信号通路，促进肿瘤的存活、增殖和迁移，直接影响了肿瘤的预后效果。目前临床上基于以上机制，以AXL为靶点，开发了一系列抗肿瘤药物，包括小分子抑制剂、单抗药物、抗体偶联药物、可溶性受体等。
抗体靶向治疗相对于小分子抑制剂具有更好的特异性，并且能够作为载体，将化学药物、毒素、放射性核素等细胞毒性物质靶向性地携带至肿瘤病灶局部，特异性杀伤肿瘤细胞。目前，靶向AXL的大分子候选药物主要集中于阻断肿瘤细胞表面AXL与配体GAS6的结合，然而实际上配体GAS6与AXL结合的亲和力非常高，申请人前期的实验也证明了高表达AXL的肿瘤细胞多数已经预结合了GAS6，通过抗体竞争GAS6与AXL的结合并不容易。目前通过竞争抑制肿瘤细胞表面AXL与GAS6结合的候选药物只有改造过的AXL融合蛋白进展比较顺利，而竞争性AXL抗体药物并没有表现出喜人的治疗效果。而本发明的抗体不需要竞争GAS6与AXL的结合，其通过直接结合AXL-GAS6复合物从而抑制涉及GAS6与AXL结合的下游信号通路，实现抑制肿瘤细胞的存活、增殖和迁移。
GAS6是维生素K依赖性蛋白，最早于1988年在小鼠胚胎纤维母细胞中发现，其生物学功能是通过与TAM受体相互作用来介导的。TAM受体属于受体酪氨酸激酶家族，目前已经确定的GAS6受体包括Tyro3、AXL和Mer，其中AXL与GAS6亲和力最高。GAS6共678个氨基酸，分子量约75KDa，结构由一个γ-羧基谷氨酸结构域(49-90aa)，四个EGF样结构域(118-278aa)和两个laminin G(LG)样结构域(279-678aa)组成，LG区是和受体结合的区域。
GAS6/AXL在多种肿瘤组织中高表达，GAS6/AXL信号中AXL的活化方式是配体GAS6诱导的AXL二聚化和自身磷酸化。目前研究认为，GAS6调节AXL二聚化的机制为：一分子GAS6的LG区与一分子AXL的IG区结合后，形成GAS6-LG/AXL-IG复合物，通过横向扩散与另一分子GAS6-LG/AXL-IG复合物形成二聚体。GAS6诱导AXL二聚化后，AXL受体胞内激酶区域酪氨酸残端发生自身磷酸化，激活AXL受体自身酪氨酸蛋白酶活性，催化下游信号转导，包括JAK-STAT、PI3K-AKT和RAS-RAF-MEK-ERK，促进肿瘤细胞存活，增殖，迁移，侵袭，血管生成和免疫逃避等。
此外，近年来的研究发现血浆中可溶性AXL(sAXL)水平的差异对于多种疾病具有一定的诊断及预后评估价值。2019年的一项研究发现，在心肌梗死患者中，血浆sAXL水平明显升高，且在心梗合并心衰的患者中，sAXL升高更加显著，进一步分析发现sAXL是心梗后心室重塑的独立危险因素。人血浆中存在游离的sAXL和sAXL-Gas6复合物两种形式，AXL和AXL-GAS6复合物的临床相关性目前还不清楚，目前也没有商品化检测试剂盒可直接检测AXL-Gas6复合物。综上，迫切需要开发可结合AXL-GAS6复合物的新型的AXL抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种针对AXL-GAS6复合物的抗AXL-GAS6抗体或其结合片段。本发明的抗体在不同浓度GAS6存在时，可与表达AXL的细胞结合；在存在人GAS6或小鼠GAS6时，可与表达AXL的细胞结合。本发明的抗体在存在AXL时，可以结合GAS6，也可与表达GAS6的细胞结合。本发明的抗体特异性结合人AXL与哺乳动物源GAS6(例如人GAS6或鼠GAS6)形成的复合物。本发明的抗体在人或小鼠GAS6存在时，与AXL的第一结构域结合。本发明的抗体还可与表达AXL同时表达GAS6的肿瘤细胞结合，或者本发明的抗体可与AXL阳性且GAS6阳性的肿瘤细胞特异性结合，从而用于治疗AXL阳性且GAS6阳性的肿瘤疾病。本发明的抗体仅特异性结合AXL-GAS6复合物，而不结合游离形式的AXL或GAS6，因此本发明的抗体可用于检测AXL-GAS6复合物的存在，并且在动物实验中展示了良好的抗肿瘤药效。
本发明提供了编码本发明抗体或其抗原结合片段的核酸，包含所述核酸的载体，包含所述载体的宿主细胞。
本发明还提供了制备本发明抗体或其抗原结合片段的方法。
本发明还提供了包含本发明抗体的免疫缀合物、药物组合物和组合产品。
一方面，本发明提供应用本发明抗人AXL-GAS6抗体或其抗原结合片段在样品中检测AXL-GAS6复合物的方法和试剂盒，包括例如，用于检测血液或血浆中AXL-GAS6复合物。
再一方面，本发明还提供应用本发明抗体或其抗原结合片段治疗表达AXL肿瘤的方法和用途。本发明的抗体可以作为唯一活性剂，或可以与其它疗法或治疗剂联合施用。
具体地，本发明提供了以下技术方案：
1.检测样品中AXL-GAS6复合物水平的方法，包括
(a)将样品与抗AXL-GAS6抗体或其抗原结合片段接触；和
(b)检测所述AXL-GAS6抗体或其抗原结合片段与AXL-GAS复合物的结合并确定样品中AXL-GAS6复合物的水平；
其中所述抗AXL-GAS6抗体包含重链可变区的3个互补决定区HCDR，以及轻链可变区的3个互补决定区LCDR，其中：
HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；和
LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
2.项目1所述的方法，其中步骤(b)中检测所述抗体或其抗原结合片段与AXL-GAS复合物的结合水平是通过酶联免疫吸附测定法ELISA进行的。
3.根据项目2所述的方法，其中所述ELISA是捕获夹心ELISA。
4.项目1所述的方法，其中所述样品是血浆。
5.抗AXL-GAS6抗体或其抗原结合片段在制备用于诊断心肌梗死或评估心肌梗死风险的药物或试剂盒中的用途。
6.根据项目5所述的用途，其中所述抗AXL-GAS6抗体包含重链可变区的3个互补决定区HCDR，以及轻链可变区的3个互补决定区LCDR，其中：
HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；和
LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
7.根据项目5所述的用途，其中所述心肌梗死为ST段抬高型心肌梗死。
8.根据项目5所述的用途，其中，所述试剂盒还包括ELISA检测试剂。
9.根据项目5所述的用途，其中，所述试剂盒还包括使用说明书，其中，所述说明书指示：
当AXL-GAS复合物水平＞1.8ng/ml时，指示患有心肌梗死或心肌梗死风险高；
当AXL-GAS复合物水平≤1.8ng/ml时，指示不具有心肌梗死或心肌梗死风险低；
其中，所述心肌梗死为ST段抬高型心肌梗死。
术语
本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。
在本文中，术语“抗体”是指至少包含轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽，所述免疫球蛋白可变区特异性识别并结合抗原。该术语涵盖各种抗体结构，包括、但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体或多链抗体、单特异性或多特异性抗体(例如双特异性抗体)、全人源抗体或嵌合抗体或人源化抗体、全长抗体和抗体片段，只要它们呈现期望的抗原结合活性即可。
本发明的抗体包含至少两条重链(H)和两条轻链(L)。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。可变区是抗体的重链或轻链中参与抗体与其抗原结合的结构域。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是显示出多种效应子功能。抗体的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列归入两种类型(称为kappa(κ)和lambda(λ))中的一种。抗体的重链可以取决于其重链恒定区的氨基酸序列而划分为主要5种不同的类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类型中的几种可以进一步划分成亚类，如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1以及IgA2。对应于不同抗体类型的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ和μ。术语“同种型”是指由抗体重链恒定区确定的抗体类型。参见例如Fundamental Immunology，Ch.7(Paul，W.编辑，第二版，Raven Press，N.Y.(1989))。
“抗血管发生剂”指阻断或在某种程度上干扰血管发育的化合物。抗血管发生剂可以是例如结合涉及促进血管发生的生长因子或生长因子受体的小分子或抗体。在一个实施方案中，抗血管发生剂是结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体，诸如贝伐单抗(AVASTIN)。
术语“PD-1轴结合拮抗剂”是指如下的分子，其抑制PD-1轴结合配偶与一种或多种它的结合配偶相互作用，从而去除源自PD-1信号传导轴上的信号传导的T细胞功能障碍，一项结果是恢复或增强T细胞功能(例如增殖，细胞因子生成，靶细胞杀伤)。如本文中使用的，PD-1轴结合拮抗剂包括PD-1结合拮抗剂(例如抗PD-1抗体)，PD-L1结合拮抗剂(例如抗PDL1抗体)和PD-L2结合拮抗剂(例如抗PD-L2抗体)。
在本发明中，所述心肌梗死包括ST段抬高型心肌梗死和非ST段抬高型心肌梗死。其中，所述ST抬高型心肌梗死是指心电图中表现为ST段弓背向上抬高，其累及心室壁的整个厚度，冠状血管急性闭塞，猝死率极高；而非ST段抬高型心肌梗死是指在心电图ST段缺乏特征性改变，部分可表现为ST段压低，其在累及心室程度上属于非透壁型的心肌梗死(没有累及到心外膜)，冠状血管没有完全闭塞，多为90-99％狭窄或者合并斑块破裂，猝死率较高。
在本发明中，sAXL与AXL可互换使用。
在本发明中使用本发明获得的AXL-4#抗体通过捕获夹心ELISA方法检测AXL-GAS6复合物的水平，其中，所述捕获夹心ELISA方法是本领域的常规方法，也称为夹心法ELISA，其是先将捕获抗体AXL-4#抗体包被到96孔板上，然后加入待测抗原(即，AXL-GAS6复合物)，抗原会与捕获抗体特异性结合，洗涤除去未结合的蛋白后加入生物素标记的检测抗体(即，生物素标记的AXL-4#抗体或者商购获得的AXL检测抗体)，两个抗体都能结合抗原形成双抗夹心结构，随后加入HRP标记的亲和素，利用亲和素-生物素反应体系进行后续显色，TMB底物在HRP的作用下产生颜色反应，最后加入终止液完成整个实验。将完成反应的96孔板放入酶标仪中读取数值，再根据标准曲线公开技术获得待测抗原的含量信息。
下面将详细描述本发明。
I.本发明的抗AXL-GAS6抗体
本发明抗体可特异性地结合AXL-GAS6，优选在存在人或小鼠GAS6时，结合人AXL蛋白质(例如Genbank登录号NM_021913.5的人AXL序列)的抗体或其抗原结合片段。本发明抗体的抗原结合片段是选自以下的抗体片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、单链抗体例如scFv、(Fab’)2片段、单结构域抗体、双抗体(dAb)或线性抗体。本发明的抗体或其抗原结合片段在人或小鼠GAS6存在时，与AXL的第一结构域结合。本发明的抗体可以与表达GAS6的AXL的肿瘤细胞结合。
本发明提供了针对人AXL-GAS6复合物的抗人AXL-GAS6抗体。本发明的抗体在不同浓度GAS6存在时，可与表达AXL的细胞结合；在存在人GAS6或小鼠GAS6时，可与表达AXL的细胞结合。本发明的抗体在存在AXL时，可以结合GAS6，也可与表达GAS6的细胞结合。本发明的抗体在人或小鼠GAS6存在时，与AXL的第一结构域结合。本发明的抗体还可与表达AXL同时表达GAS6的肿瘤细胞结合。本发明的抗体可用于检测AXL-GAS6复合物的存在，并且在动物实验中展示了良好的抗肿瘤药效。
抗体CDR区
“互补决定区”或“CDR区”，是抗体可变区中主要负责与抗原表位结合的氨基酸区域。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。
下表1中给出了本发明的一些示例性抗体的VH和VL序列组合：
本领域公知多种用于在一个给定的VH或VL氨基酸序列中确定其CDR序列的方案。例如，Kabat互补决定区(CDR)是基于序列变异性确定的并且是最常用的(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,美国国立卫生研究院,Bethesda,Md.(1991))。而Chothia指的是结构环的位置(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR是Kabat HVR和Chothia结构环之间的折中，并且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。“接触性”(Contact)HVR基于对可获得的复杂晶体结构的分析。IMGT定义了抗体和T细胞受体(Lefranc,Leukemmia,17:260-206(2003))可变结构域的独特方案。根据不同的CDR确定方案，这些CDR残基如下表2。
本发明的抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)根据IMGT编号系统确定。下表3给出了本发明的示例性CDR序列：
表3
一个实施方案中，本发明的抗体或其结合片段包含重链可变区的3个互补决定区HCDR，以及轻链可变区的3个互补决定区LCDR，其中
HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成，HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由其组成，LCDR1包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列或由其组成，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由其组成，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由其组成。
抗体可变区
在一个实施方案中，本发明的抗体包含表2所列抗体的重链可变区VH序列，或由所述氨基酸序列组成。在另一实施方案中，本发明的抗体包含所述VH序列的变体。
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含表2所列抗体的轻链可变区VL序列，或由所述氨基酸序列组成。在再一实施方案中，本发明的抗体包含所述VL序列的变体。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区包含：SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列、或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。VH序列的变体在氨基酸序列上，与参考VH序列相比，(优选地，在全长上或在CDR1、2和3三个区域上)，包含至少一个且不超过30个、10个、或5、4、3、2、1、0氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)。优选地序列差异不发生在CDR区中。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述轻链可变区包含：SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列、或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。VL序列的变体在氨基酸序列上，与参考VL序列相比，(优选地，在全长上或在CDR1、2和3三个区域上)，包含至少一个且不超过30个、10个、或5、4、3、2、1、0氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)。优选地序列差异不发生在CDR区中。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的轻链可变区。
抗体重链和轻链
本发明的抗体包含重链恒定区和/或轻链恒定区。在一些实施方案中，本发明抗体包含人重链Fc区，例如人IgG1,IgG2，IgG3或IgG4同种型的Fc区，优选人IgG1和IgG4。在另一些实施方案中，本发明抗体小鼠重链Fc区，例如小鼠IgG1,IgG2a，IgG2b或IgG3同种型的Fc区，优选小鼠IgG1或IgG2a。在再一些实施方案中，本发明抗体包含κ轻链恒定区，例如人κ轻链恒定区，或小鼠κ轻链恒定区。重链恒定区和轻链恒定区序列是公知的，例如可以从Genbank获得。
“IgG形式的抗体”是指抗体的重链恒定区所属于的IgG形式。所有同一型的抗体的重链恒定区都是相同的，不同型的抗体之间的重链恒定区不同。例如，IgG1形式的抗体是指其重链恒定区Ig结构域为IgG1的Ig结构域。
II.多核苷酸、载体和宿主
本发明提供编码以上任何抗人AXL-GAS6抗体或其片段的核酸。本发明还提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。还提供包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞或293细胞)。在另一个实施方案中，宿主细胞是原核的。
核酸可以包含编码抗体的轻链可变区和/或重链可变区的氨基酸序列的核酸，或包含编码抗体的轻链和/或重链的氨基酸序列的核酸。示例性的编码抗体重链可变区的核酸序列包含与选自SEQ ID NO:9的核酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核酸序列。示例性的编码抗体轻链可变区的核酸序列包括与选自SEQ ID NO:10的核酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核酸序列。
本发明中还提供多核苷酸，所述多核苷酸编码来自上文所述的结合人AXL-GAS6抗体的重链VH或轻链VL序列的通常全部三个CDR区。多核苷酸编码上文所述的结合人AXL-GAS6抗体的重链和/或轻链的完整或基本上完整可变区序列。本领域技术人员知道，因为密码子简并性，每一个抗体或多肽氨基酸序列可以由多种核酸序列编码。
可以采用本领域熟知的方法，通过从头固相DNA合成，或通过PCR诱变，编码结合AXL-GAS6的抗体或其抗原结合片段的核酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供包含本发明核酸的一个或多个载体。载体是表达载体，例如真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。
在一个实施方案中，提供包含所述载体的宿主细胞。用于克隆或表达编码抗体的载体的适当宿主细胞包括原核或真核细胞。例如，抗体可在细菌中产生，如在大肠杆菌中的表达。在表达后，抗体可以从可溶级分中的细菌细胞糊状物分离，并且可以进一步纯化。
在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞。有用哺乳动物宿主细胞系如293,CHO等。
III.抗体的制备
本发明的针对人AXL-GAS6复合物的抗体通过权威的单克隆抗体制备方法(例如，Paterson,H.M.V.a.Y.(Jone Wiley and Sons,Inc.New York,1995).Production ofAntibodies.Current Protocols in Immunology)制备得到。制备单克隆抗体所用的抗原AXL可以是合成的AXL基因，连接到表达载体上，也可以从表达AXL的细胞中提取RNA，通过AXL特异性引物反转录PCR方法获得后连接到表达载体上。表达载体可以是真核表达载体，也可以是原核表达载体。免疫动物的AXL抗原可以是表达纯化的蛋白质，也可以是瞬时转染的表达AXL的细胞，如293细胞、L929细胞，也可以是制备的稳定表达AXL的细胞，如慢病毒感染的细胞等。
制备杂交瘤优选的动物是小鼠。用小鼠产生杂交瘤是非常完善确立的程序。免疫程序和用于融合的免疫脾细胞的分离技术是本领域公知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是公知的。
除了通过在体内或体外扩增杂交瘤细胞获得抗抗体，还可以将本发明的针对人AXL-GAS6的抗体的编码基因利用传统的分子克隆方法克隆到真核表达载体，通过真核表达纯化的方法获得抗体。
IV免疫缀合物
本发明提供通过将本发明抗体缀合于异源分子而产生的免疫缀合物。在一个实施方案中，在免疫缀合物中，本发明的抗体(或其抗原结合片段)与治疗剂或诊断剂缀合。在一些实施方案中，本发明抗体可以以全长抗体或抗体片段的形式与异源分子缀合。例如，以Fab片段、Fab’片段、F(ab)’2片段、单链scFab抗体、单链scFv等片段形式进行缀合。
本发明的抗体可以与诊断剂或可检测剂缀合。这类缀合物可以作为临床检验方法的部分(如确定特定疗法的效力)，用于监测或预测疾病或病症的发作、形成、进展和/或严重性。可以通过将抗体与可检测剂偶联实现这类诊断和检测，所述可检测剂包括但不限于多种酶，如但不限于辣根过氧化物酶；辅基，如但不限于链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光物质；发光物质；放射性物质；和用于各种正电子发射成像术中的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。
V.药物组合物和药物制剂
本发明还包括包含抗AXL-GAS6抗体或其免疫缀合物组合物(包括药物组合物或药物制剂)和包含编码抗AXL-GAS6抗体或其免疫缀合物的多核苷酸的组合物。这些组合物还可以任选地包含合适的药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。
VI.方法和用途
本发明提供应用本发明的抗AXL-GAS6抗体或其抗原结合片段的方法和用途。例如，本发明的方法和用途涉及在受试者个体的疾病治疗。本发明的方法和用途还涉及在来自例如受试者的样品中检测AXL-GAS6复合物的存在。本发明也提供本发明AXL-GAS6抗体或其抗原结合片段在制备用于上述用途的产品(例如药物组合物或药物产品或检测产品)中的用途。
本发明的抗人AXL-GAS6抗体可用于制备用于治疗癌症的药物，所述癌症包括表达GAS6和AXL的血液癌症和实体瘤。所述血液癌症包括，白血病，如慢性淋巴细胞白血病、髓性白血病、急性髓系白血病和慢性髓系白血病；淋巴瘤，如非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤。表达GAS6和AXL的实体瘤包括肺癌、表皮样癌、结肠直肠癌如结肠直肠癌和结肠直肠腺瘤、膀胱癌、骨癌如软骨肉瘤、乳腺癌如三阴性乳腺癌、中枢神经洗脱的癌症如胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤、宫颈癌、结缔组织癌、子宫内膜癌、成纤维细胞癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肌肉癌、神经组织癌、卵巢、癌、胰腺癌、皮肤癌如恶性黑色素瘤和软组织肉瘤等。
附图说明
图1显示了抗AXL-GAS6抗体的结合情况；其中，图1A显示抗AXL-GAS6抗体在GAS6存在时流式水平上结合细胞膜表面表达的AXL；图1B显示抗AXL-GAS6抗体在不同浓度人GAS6存在时流式水平上与hGAS6的结合。
图2显示抗AXL-GAS6抗体与不同浓度的hGAS6作用的ELISA结果。
图3显示抗AXL-GAS6抗体在流式水平上在存在分泌型AXL时与膜表达的GAS6的结合。
图4显示表达全长AXL和表达结构域1和表达结构域234的构建体的示意图。
图5显示抗AXL-GAS6抗体AXL-4#结合AXL的结构域1。
图6显示抗AXL-GAS6抗体在人GAS6或小鼠GAS6存在时，与表达人AXL或表达小鼠AXL的细胞结合的结果。其中，6A为流式检测结果，其表明了抗AXL-GAS6抗体AXL-4#可结合人AXL与人GAS6的复合物，或人AXL与小鼠GAS6的复合物，而不与小鼠AXL与人GAS6的复合物，或小鼠AXL与小鼠GAS6的复合物结合。图6B显示图6A流式检测结果的统计数据。
图7显示抗AXL-GAS6抗体与表达AXL的癌细胞的结合。
图8显示AXL-GAS6抗体AXL-4#重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列，图中黑色阴影区域标出了信号肽区、CDR1区(SEQ ID NO:1)、CDR2区(SEQ ID NO:2)和CDR3区(SEQ IDNO:3)。
图9显示抗AXL-GAS6抗体AXL-4#轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列，图中黑色阴影区域标出了信号肽区、CDR1区(SEQ ID NO:4)、CDR2区(SEQ ID NO:5)和CDR3区(SEQID NO:6)。
图10显示抗AXL-GAS6抗体AXL-4#重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)与小鼠氨基酸序列的对比结果。AXL-GAS6单克隆抗体的重链可变区组成为：V基因为IGHV5-17，D基因为IGHD1-2，J基因为IGHJ4。
图11显示抗AXL-GAS6抗体AXL-4#轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)与小鼠氨基酸序列的对比结果。抗AXL-GAS6单克隆抗体的轻链可变区组成为：V基因为IGKV8-30，J基因为IGKJ2。
图12A和图12B显示使用抗人AXL-GAS6抗体包被，捕获夹心ELISA检测AXL-GAS6复合物的结果。
图13显示了示例性的ESLIA标准曲线。
图14显示使用抗人AXL-GAS6抗体检测的心梗患者中AXL-GAS6复合物水平。
图15显示了ROC曲线。
图16显示了STEMI患者AXL-Gas6、AXL与临床指标(A：AXL-Cr；B：PLT；C：WBC；D：HDL；E：CMKB；F：So-FMC)的相关性。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试剂如无特别说明均为可商购的试剂。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、表达人AXL的细胞、表达小鼠AXL的细胞，表达膜结合人GAS6的细胞的制备
1.表达人全长AXL细胞的制备
分别构建了本发明中使用的稳定表达全长人AXL的细胞，表达AXL结构域1的细胞，或表达AXL结构域234(即，结构域2、3和4，在本文中简称为结构域234)的细胞。
根据Genbank登录号NM_021913.5，设计引物
hAXL-F:5’-ccgaattcgccaccatggcgtggcggtgccccaggatgggc-3’(SEQ ID NO:11)
hAXL-R:5’-ccagcagccccagggcaggaggatggtgcctgaggatccgcc-3’(SEQ ID NO:12)
从离体人CD5+树突状细胞(人CD5+树突状细胞的分离参见Yin Xiangyun,YuHaisheng,Jin Xiaoyang,et al,Human Blood CD1c+Dendritic Cells EncompassCD5high and CD5low Subsets That Differ Significantly in Phenotype,GeneExpression,and Functions,J Immunol(2017)198(4):1553-1564)，使用TRIzol(Invitrogen)提取总RNA，根据制造商说明，使用Oligo(dT)和MMLV反转录酶(Promega,M1705)合成cDNA，以cDNA为模板，引物hAXL-F和hAXL-R进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物，即为全长人AXL核苷酸序列。
用限制性内切酶EcoRI和BamHI酶切PCR扩增产物并与同样酶切处理的pEGFP-N1(Addgene)载体连接，得到pEGFP-N1-hAXL质粒。在该质粒中，AXL序列下游有EGFP基因，当AXL表达时，可以观察到GFP信号。利用lipofectamine转染试剂(ThermoFisher)，将pEGFP-N1-hAXL质粒转染293T细胞(购自ATCC)，得到表达hAXL的细胞系293T-hAXL。
2.表达人AXL结构域1或结构域234的细胞的制备
以含有全长hAXL的质粒(例如，本实施例上述制备的pEGFP-N1-hAXL质粒)为模板，分别通过如下引物
P1u-EcoRI:5’-gcGAATTCGCCACCatggcgtggcggtgcccca-3’(SEQ ID NO:13)
P2d6s,5’-CCCTGGGCGCCAcaagccctccagcccaacatagcc-3’(SEQ ID NO:14)
扩增得到片段1；
并使用如下引物
P6u-5’-TGGCGCCCAGGGCAAGCAC-3’(SEQ ID NO:15)
p6d-BamHI:5’-cgGGATCCTCAGGCACCATCCTCCTGCCCT-3’(SEQ ID NO:16)
扩增得到片段2。
以片段1和片段2的混合物为模板，通过引物P1u-EcoRI(SEQ ID NO:13)和p6d-BamHI(SEQ ID NO:16)，进行重叠PCR，扩增得到片段3，即为缺失了结构域234，含有结构域1的AXL片段。将其通过EcoRI和BamHI酶切，与经过同样酶切处理的pEGFP-N1载体连接，得到pEGFP-N1-AXL-D1质粒。
以含有全长hAXL的质粒(例如，本实施例上述制备的pEGFP-N1-hAXL质粒)为模板，分别通过如下引物
P1u:5’-gcGAATTCGCCACCatggcgtggcggtgcccca-3’(SEQ ID NO:17)
P1d-3s:5’-CAGCCCAACATAGCCcgtgcccctgggggccatgc-3’(SEQ ID NO:18)
扩增得到片段4；
并使用如下引物
P3u:5’-GGCTATGTTGGGCTGGAGGGCTTG-3’(SEQ ID NO:19)
p6d-BamHI:5’-cgGGATCCTCAGGCACCATCCTCCTGCCCT-3’(SEQ ID NO:20)
扩增得到片段5。
以片段4和片段5的混合物为模板，通过引物P1u-EcoRI(SEQ ID NO:13)和p6d-BamHI(SEQ ID NO:20)，进行重叠PCR，扩增得到片段6，即为缺失了结构域1，含有结构域234的AXL片段。将其通过EcoRI和BamHI酶切，与经过同样酶切处理的载体pEGFP-N1连接，得到pEGFP-N1-AXL-D234质粒。其中，表达全长AXL和表达结构域1和表达结构域234的构建体的示意图如图4所示。
利用lipofectamine转染试剂(ThermoFisher)，将pEGFP-N1-AXL-D1质粒或pEGFP-N1-AXL-D234质粒分别转染293T细胞(购自ATCC)，分别得到表达293T-hAXL-结构域1或293T-hAXL-结构域234的细胞。
3.表达小鼠AXL(mAXL)的细胞的制备
在本步骤中，构建了本发明中使用的表达全长mAXL的细胞。
根据Genbank登录号NM_009465.4,合成全长mAXL，与质粒pEGFP-N1连接(上海捷瑞生物工程公司合成)。在该质粒中，mAXL序列下游有EGFP基因，当mAXL表达时，可以观察到GFP信号。参考实施例1.1的方法，制备获得质粒pEGFP-N1-mAXL。利用lipofectamine转染试剂(ThermoFisher)，将pEGFP-N1-mAXL质粒转染293T细胞(购自ATCC)得到表达mAXL的细胞系293T-mAXL。
4.表达膜结合的GAS6(MemGAS6)的细胞的制备
在本步骤中，构建了本发明中使用的稳定表达膜结合的GAS6(MemGAS6)的细胞。
根据Genbank登录号NM_000820.4，合成hGAS6基因，并在合成hGAS6基因的5’上游加入了EcoRI酶切位点和信号肽序列SEQ ID NO:21，hGAS6基因的下游3’加入血小板衍生生长因子受体(PDGFR)跨膜区SEQ ID NO:22和AvaI酶切位点，将合成的基因通过EcoRI和AvaI酶切，与同样酶切处理的载体pDisplay(购自Thermo)连接，构建质粒pDisplay-hGAS6。将该质粒转染293T细胞，得到表达膜结合的GAS6的细胞293T-memGAS6。
其中，上述信号肽序列SEQ ID NO:21的序列如下：
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC(SEQID NO:21)
所述血小板衍生生长因子受体(PDGFR)跨膜区SEQ ID NO:22的序列如下：
AATGCTGTGGGCCAGGACACGCAGGAGGTCATCGTGGTGCCACACTCCTTGCCCTTTAAGGTGGTGGTGATCTCAGCCATCCTGGCCCTGGTGGTGCTCACCATCATCTCCCTTATCATCCTCATCATGCTTTGGCAGAAGAAGCCACGTTAG(SEQ ID NO:22)
实施例2、分泌型AXL的制备
以实施例1中含有全长人AXL的质粒(即，pEGFP-N1-hAXL质粒)为模板，使用以下引物：
上游引物hAXL-F-EcoRI:
5’-GCGAATTCGCCACCATGGCGTGGCGGTGCCCCAGGATGGGCAGGGTC-3’(SEQ ID NO:23)，和
下游引物hAXL-R-his:
5’-CGGGATCCTTAGTGATGGTGGTGGTGATGTGGGCGCCAGGCCTCCAGG-3’(SEQ ID NO:24)，
用高保真酶PrimStar(购自宝生物)进行PCR扩增，将PCR产物通过EcoRI和BamHI双酶切，与同样酶切的载体pTT3(购自Thermo)连接，构建融合有his的人AXL胞外段的表达质粒pTT3-hAXL-his。
用去内毒素质粒大提试剂盒(购自天根生物)提取质粒，将质粒与转染试剂PEI混合均匀后静置，然后加入到293T细胞(购自ATCC)中，37℃，5％CO2摇床培养4天后，离心取上清，通过镍柱进行蛋白纯化，10mM咪唑洗脱。将洗脱的蛋白加入30KD超滤管，加入PBS，4000rpm离心，得到纯化的AXL-his抗原。
实施例3、小鼠中抗AXL-GAS6抗体的产生
1.免疫原的制备
将全长人AXL片段与载体pEGFP-C1(Clontech，Cat:#6084-1)连接，得到质粒pEGFPAXL，参考制造商说明书，使用Lipofectamine2000(Invitrogen)转染进入小鼠L细胞(ATCC，货号：CRL-2648TM)中，转染48小时后，得到膜表面表达人AXL胞外区的小鼠L细胞。通过分析转染人AXL胞外区的小鼠L细胞中EGFP的表达情况确定转染效率并用于下述小鼠免疫实验。其中，在本实施例中，以表达人AXL胞外区的小鼠L细胞作为免疫原，实际上，小鼠L细胞本身可产生GAS6，并且由于AXL与GAS6的亲和力很强，因此，在实际免疫过程中是存在人AXL-GAS6复合物作为免疫原的。
2.Balb/C小鼠的免疫
将步骤1获得的表达人AXL胞外区的小鼠L细胞作为人AXL的免疫原。将5000,000个表达人AXL胞外区的小鼠L细胞与20μg CpG1826(InvivoGen)混合，形成0.5ml的悬液，通过腹腔注射的方式免疫6周龄Balb/c小鼠。每个月免疫一次，共免疫4次。最后，使用同样方法进行加强免疫，并在4天后进行杂交瘤融合。
3.杂交瘤的融合
将免疫后待融合的小鼠处死，并取出脾脏细胞。通过细胞计数，将小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0(ATCC，CRL1581)按1:3的比例进行混合，并使用50％ PEG(Sigma)融合细胞。将融合后的细胞加入到60ml含1xHAT的RPMI培养基(Gibco，货号：C11875500BT)(含10％胎牛血清)中，按每孔1～2滴的量加入到96孔细胞培养板中。随后，将杂交瘤细胞在37℃，5％CO2的条件下进行培养，3～4天进行半量换液。约10天后进行抗体筛选。
实施例4、AXL和GAS6抗体的筛选
1.AXL和GAS6抗体的筛选和亚克隆
将96孔细胞培养板中的上清吸出约100μl至96孔U形底的培养板中，并在原孔补入100μl新鲜的含1xHAT的RPMI培养基，继续培养所述杂交瘤细胞。
将用含有2mM EDTA的PBS消化的293T-hAXL细胞(该细胞于实施例1.1中制备获得)悬液中加入重组人GAS6蛋白(R&D，NP_000811)，室温放置30分钟后，加至96孔U形底培养板中，104个细胞/100μl/孔。2200rpm，3分钟离心后，甩出含有重组人GAS6蛋白的上清液，加入100μL/孔杂交瘤细胞培养上清，重悬后4℃孵育30分钟。使用FACS缓冲液(含2％FBS和2mMEDTA的PBS)洗涤细胞2次。然后与100μL/孔的PE标记的羊抗小鼠IgG抗体(BioLegend，Poly4053，405307)(1:500稀释)在4℃、避光条件下孵育30分钟。使用FACS缓冲液洗涤细胞2次。最终洗涤后，使用流式细胞仪(Thermo attune)分析细胞GFP与PE信号。GFP与PE双阳性孔为结合AXL和GAS6的复合物的阳性孔。
选择来自FACS阳性杂交瘤孔的细胞在96孔板中进行有限稀释。使这些细胞生长7天。当达到足够的细胞量时，收集每个孔的上清液，使用如上所述用重组GAS6蛋白处理的293T-hAXL细胞(即，可产生AXL-GAS6复合物)，通过与细胞的结合进行重新筛选。其中，图1显示了抗AXL-GAS6抗体的结合情况。
从每个96孔板中，将具有细胞结合活性的单克隆细胞扩增，进行第二轮有限稀释。7天后，通过FACS试验分析来自96孔板的细胞的上清液。亚克隆进行3次。得到稳定表达的单克隆杂交瘤细胞株，其能够稳定表达AXL-4#抗体。筛选得到的阳性克隆进一步扩增和培养以产生抗体，使用小鼠单克隆抗体分型试剂盒(义翘神州SEK003)确定抗体的亚型为mIgG2a。关于所述AXL-4#抗体序列的详细信息，请参见实施例9。
2.小规模抗体的制备
使用无血清培养基PFHMII(ThermoFisher)培养所述杂交瘤细胞株。收集杂交瘤细胞培养上清，蛋白A填料(CaptivaTM PriMAB,cat:CA-PRI-1000)装入柱子中，通过亲和层析柱吸附抗体，0.1M甘氨酸(pH2.7)洗脱液从亲和层析柱洗脱结合的抗体AXL-4#，收集管中的抗体测定蛋白质浓度，将含有蛋白质的管中的液体合并，用PBS稀释抗体，加入30KD超滤离心管，3000rpm，4℃离心浓缩，将溶解抗体的溶液置换为PBS。
实施例5、AXL-4#抗体与人或小鼠GAS6的相互作用
1.酶联免疫吸附测定(ELISA)检测AXL-4#抗体与人GAS6的作用
通过ELISA方法检测抗体AXL-4#与人GAS6的作用，简而言之，将最高浓度为2μg/mL的hGAS用PBS进行2倍系列稀释，以每孔100ul包被ELISA板，4℃过夜。用0.2％的牛血清白蛋白(北京兰博利德生物技术公司)室温孵育1小时封闭。加入2μg/mL纯化的抗体AXL-4#100ul，同时设抗小鼠IgG2a同种型对照(BioLegend)和人GAS6抗体(R&D，AF885)阳性对照；室温孵育1小时。将ELISA板洗涤后，每孔加入1：10000封闭液稀释的HRP-山羊抗小鼠IgG(中杉金桥)100ul，室温孵育1小时。每孔加入100ul TMB(ThermoFisher)，显色2-10min。每孔加入50μL的2M H2SO4终止反应，ELISA读数仪(BioTek)测定450nm的OD值。
如图2所示，在不存在AXL时，抗体AXL-4#不与GAS6作用。
2.流式细胞术检测AXL-4#抗体与GAS6的相互作用
将用含有2mM EDTA的PBS消化的293T-hGAS6细胞(即，实施例1的“4.表达膜结合的GAS6(MemGAS6)的细胞的制备”中获得的293T-memGAS6细胞)悬液加至96孔U形底培养板中，104个细胞/100μl/孔。2200rpm，3分钟离心后，甩出上清，在存在5μg/mL分泌型的AXL(纯化的sAXL-Fc或sAXL-his)的条件下，加入5μg/mL的AXL-4#抗体、5μg/mL的人GAS6抗体或抗IgG2a同型对照抗体，重悬后4℃孵育30分钟。使用FACS缓冲液(含2％ FBS和2mM EDTA的PBS)洗涤细胞2次。然后与100μL/孔的PE标记的羊抗小鼠IgG抗体(Biolegend，Poly4053，405307)(1:500稀释)在4℃、避光条件下孵育30分钟。使用FACS缓冲液洗涤细胞2次。最终洗涤后，使用流式细胞仪(Thermo attune)分析细胞GFP与PE信号。
如图3所示，抗体AXL-4#在有分泌型AXL-his存在的条件下，可以结合GAS6，在不存在分泌型AXL-his时，不能结合表达人GAS6的细胞，表明了抗体AXL-4#仅在AXL存在时才能够与GAS6结合，即抗体AXL-4#仅结合AXL-GAS6复合物。
实施例6、AXL-4#抗体结合AXL的结构域1
为了进一步了解所述抗体AXL-4#结合AXL-GAS6复合物中AXL的结合部位，分别使用实施例1制备的表达全长人AXL的细胞293T-hAXL、表达AXL结构域1的细胞293T-hAXL-结构域1和表达AXL结构域234的293T细胞293T-hAXL-结构域234。通过流式细胞术评价AXL-4#抗体与这些细胞的结合(参见实施例1)。将细胞与抗体，在存在1μg/mL的人GAS6或不存在GAS6的条件下，4℃、避光孵育30分钟。加入PE标记的羊抗小鼠IgG抗体(Biolegend，Poly4053，405307)(1:500稀释)在4℃、避光条件下孵育30分钟。使用FACS缓冲液洗涤细胞2次。最终洗涤后，使用流式细胞仪(Thermo attune)分析。
图5示出AXL-4#抗体在人GAS6存在下，可以与全长AXL结合和结构域1结合，其表明了所述抗体与AXL-GAS6复合物中的AXL结构域1结合。
实施例7、AXL-4#抗体与人hAXL-人GAS6复合物或人hAXL-小鼠GAS6复合物的结合
使用表达全长人AXL和表达全长小鼠AXL的293T细胞，通过流式细胞术评价AXL-4#抗体在存在或不存在GAS6的条件下与细胞的结合。293T-hAXL细胞悬液或者293T-mAXL细胞悬液中分别加入抗体AXL-4#，抗体AXL-4#+hGAS6，抗体AXL-4#+mGAS6，如上所述进行结合实验，4℃孵育30分钟，加入PE标记的羊抗小鼠IgG抗体(BioLegend，Poly4053，405307)(1:500稀释)在4℃、避光条件下孵育30分钟。使用FACS缓冲液洗涤细胞2次。最终洗涤后，使用流式细胞仪(Thermo attune)分析细胞GFP与PE信号。
如图6A和图6B所示，抗体AXL-4#在存在人或小鼠GAS6时，可结合293T-hAXL细胞，但是不结合293T-mAXL细胞，表明了抗体AXL-4#可结合人hAXL-人/鼠GAS6复合物，但不结合鼠AXL-人/鼠GAS6复合物。
实施例8、AXL-4#抗体与肿瘤细胞的结合
通过流式细胞术测定了AXL-4#抗体与人乳腺癌细胞HS578T(购自ATCC),人肾癌细胞SN12C(购自上海钰博生物科技有限公司),人肺癌细胞Calu-1(购自中国科学院上海细胞库)和人乳腺癌细胞SK-BR-3购自中国科学院上海细胞库)中AXL的结合，其中所述细胞均表达GAS6和AXL。
将乳腺癌细胞HS578T，人肾癌细胞SN12C，人肺癌细胞Calu-1和人乳腺癌细胞SK-BR-3细胞分别用含2mMEDTA的PBS消化获得单细胞悬液。将细胞与AXL-4#抗体4℃、避光条件下孵育30分钟。加入PE标记的羊抗小鼠IgG抗体(BioLegend，Poly4053，405307)(1:500稀释)在4℃、避光条件下孵育30分钟。使用FACS缓冲液洗涤细胞2次。最终洗涤后，使用流式细胞仪(Thermo attune)分析细胞中AXL的表达以及AXL-4#抗体与细胞的结合情况。
如图7所示，AXL-4#抗体可以与表达AXL的癌细胞结合。由于所述癌细胞本身均同时表达GAS6，因此，本发明的抗体能够与AXL-GAS6复合物结合从而与所述癌细胞结合，即本发明的抗体能够结合同时表达AXL和GAS6的肿瘤细胞。
实施例9、AXL-4#抗体序列的测定
1、RNA的提取
利用Trizol(Invitrogen)裂解杂交瘤细胞株AXL-4#，提取杂交瘤细胞株AXL-4#的RNA。RNA提取的具体操作步骤如下：
每1ml Trizol加入200μl三氯甲烷，充分震荡后静置10分钟；13000rpm/4℃/15分钟离心；吸取400μl上清加至400μl预冷异丙醇中，混匀后-20℃静置过夜；13000rpm/4℃/15分钟离心；去除上清，加入70％乙醇；13000rpm/4℃/10分钟离心；去除上清，加入70％乙醇；去除上清，加入40μl水溶解，得到RNA溶液。
2、cDNA的获得
将步骤1获得的RNA进行反转录，得到cDNA。反转录的具体操作步骤如下：吸取16μl步骤1制备的RNA溶液，加入1μl浓度为100nM的Oligo dT(Invitrogen)；70℃反应5分钟；立即放置冰上；分别加入1μl RNA酶抑制剂(Takara)，1μl浓度为10mM的dNTP(Takara)，1μlMLV反转录酶和5μl 5X缓冲液(Promega)；42℃反应60分钟；80℃处理10分钟。
3、PCR扩增及测序
AXL-4#抗体的亚型为mIgG2a(参见实施例4)，根据Genbank登录号D78344.1的IgG2a序列，设计重链引物R；根据Genbank登录号LC522515.1，设计轻链引物R。
以步骤2获得的cDNA为模板，分别采用重链引物F和重链引物R、轻链引物F和轻链引物R进行PCR扩增，分别获得编码重链和轻链的片段并对其进行测序。引物序列如下：
轻链引物F：GAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA(SEQ ID NO:25)；
轻链引物R：GGATACAGTTGGTGCAGCATC(SEQ ID NO:26)；
重链引物F：SARGTNMAGCTGSAGSAGTC(SEQ ID NO:27)；
重链引物R：CTTGACCAGGCATCCTAGAGTCA(SEQ ID NO:28)；
其中，R＝a,g；Y＝c,t；M＝a,c；K＝g,t；S＝c,g；W＝a,t；V＝a,c,g；N＝a,c,g,t。
上述PCR反应条件：预变性，98℃，2分钟；变性，98℃，30秒；退火，54℃；延伸72℃，1分钟；共35循环，最后增加延伸10分钟。
测序结果如下：
AXL单克隆抗体AXL-4#的重链可变区核苷酸和氨基酸序列显示于图8中，AXL单克隆抗体AXL-4#的重链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO:9，AXL单克隆抗体AXL-4#的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:7；将测得的序列通过https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast进行分析，根据IMGT编号方案，将AXL单克隆抗体AXL-4#的重链可变区氨基酸序列的第26位-第33位所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)命名为AXL-4#HCDR1，将AXL单克隆抗体AXL-4#的重链可变区氨基酸序列的第51位-第58位所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)命名为AXL-4#HCDR2，将AXL单克隆抗体AXL-4#的重链可变区氨基酸序列的第97位-第111位所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)命名为AXL-4#HCDR3。
AXL单克隆抗体AXL-4#的轻链可变区核苷酸和氨基酸序列显示于图9中，AXL单克隆抗体AXL-4#的轻链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO:10，AXL单克隆抗体AXL-4#的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:8；将测得的序列通过https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast进行分析，根据IMGT编号方案，将AXL单克隆抗体AXL-4#的轻链可变区氨基酸序列的第27位-第38位所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)命名为AXL-4#LCDR1，将AXL单克隆抗体AXL-4#的轻链可变区氨基酸序列的第56位-第58位所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)命名为AXL-4#LCDR2，将AXL单克隆抗体AXL-4#的轻链可变区氨基酸序列的第95位-第103位所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)命名为AXL-4#LCDR3。
4、抗体序列分析
将AXL-GAS6单克隆抗体AXL-4#的核酸片段在抗体序列分析工具igBlast tool(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)中进行分析发现：AXL-GAS6单克隆抗体AXL-4#重链编码基因的V基因、D基因和J基因分别对应于小鼠IGHV5-17基因、IGHD1-2基因和IGHJ4基因，AXL单克隆抗体AXL-4#的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)与小鼠VDJ区氨基酸序列的对比结果如图10所示。AXL单克隆抗体AXL-4#轻链编码基因的V基因和J基因分别对应于小鼠IGKV8-30基因和IGKJ2基因，AXL单克隆抗体AXL-4#的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)与小鼠VJ区氨基酸序列的对比结果如图11所示。
实施例10.AXL-4#抗体检测AXL-GAS6复合物方法的建立
1.AXL-GAS6复合物的制备
参考现有技术已知的公开报道(PMID:20088931)制备AXL-Gas6复合物，将250ng/ml Gas6(HY-P70470,MCE)与30ng/ml AXL(DY154,R&D system混合，总体积为20μL，37℃水浴加热1小时，即得到AXL-Gas6复合物，然后将上述标准品混合物用PBS(含0.1％ BSA和0.05％ TWEEN20)稀释至使用浓度。
2.捕获夹心ELISA方法的建立
在本实施例中使用捕获夹心ELISA方法检测AXL-GAS6复合物的水平，其中所述捕获夹心ELISA方法是现有技术中常规方法，在本实施例中使用本发明筛选获得的AXL-4#抗体作为包被抗体进行检测，具体如下所述。使用初始浓度为1μg/mL，用PBS进行2倍系列稀释的AXL-4#抗体每孔100μL包被ELISA板，4℃孵育过夜。使用200μL PBS洗板2次。加入200μL封闭液(含有0.05％吐温20和0.1％BSA的PBS)，室温孵育1小时，PBST洗板5次。加入AXL-GAS6复合物作为对照样品(其由AXL标准品(DY154,R&D system)和GAS6(HY-P70470,MCE)形成)室温孵育2小时。同上洗板5次，加入生物素化的山羊抗人AXL检测抗体(DY154,R&Dsystem)，室温孵育1小时。同上洗板5次，加入HRP-链亲和素(DY154,R&D system)100μL，室温孵育1小时。同上洗板5次，每孔加入100μl TMB，显色15min。每孔加入50μL的2M H2SO4终止反应，ELISA读数仪(BioTek)测定450nm的OD值。根据OD值和AXL-GAS6复合物的浓度绘制标准曲线(示例性标准曲线可参见图13)。
在测试待测样品中的AXL-GAS6复合物浓度时，根据上述ELISA方法测量获得450nm的OD值，然后将所述OD值输入标准曲线，即可获得其所对应的AXL-GAS6复合物的浓度。
进一步地，为了验证本发明的AXL-4#抗体仅与AXL-Gas6复合物结合而不与游离形式的AXL或Gas6结合，即，上述测量方法能够准确反映样品中AXL-Gas6复合物的浓度，发明人进行了以下验证：
结果如图12A所示，为了在ELISA水平验证AXL-4#是否特异性与AXL-Gas6复合物(即，不与游离形式的AXL或Gas6结合)结合，当待测样本仅含有Gas6时(即，图12A中白色透明组“AXL-0μg/ml”)时，AXL-4#抗体检测不出GAS6浓度，提示AXL-4#不与Gas6结合；当待测样本中加入固定浓度的AXL(1000ng/ml)时，随着Gas6浓度增加(从而使得样本中AXL-Gas6复合物浓度增加)，OD值也呈线性增加，表明AXL-4可在ELISA水平与AXL-Gas6复合物结合而不与游离形式的GAS6结合。
另外，如图12B所示，在待测样本仅含有AXL时(即，图12B中白色透明组“GAS6-0μg/ml”，无Gas6存在)，AXL-4#抗体无法检测样本中AXL浓度，可见AXL为0ug/ml时，OD值极低，说明AXL-4#不与AXL结合；当待测样本中有固定浓度的GAS6时(0.25μg/ml，图12B中红色组)，随AXL浓度提高(即，样本中AXL-Gas6复合物浓度增加)，OD相应呈线性增加，进一步说明在ELISA水平，AXL-4#可与AXL-Gas6复合物结合，而不与游离形式的AXL结合。因此以上结果表明，本发明的AXL-4#抗体可用于检测AXL-GAS6复合物的水平。
实施例11.AXL-4#抗体检测心梗患者中AXL-Gas6复合物水平
使用AXL-4#抗体，通过实施例10建立的捕获夹心ELISA方法检测了心梗患者中AXL-Gas6复合物水平，并与商品化的AXL抗体(R&D system)(其不仅能够结合AXL-Gas6复合物水平还能够结合游离的AXL)检测AXL-Gas6复合物水平进行了比较。
将1μg/mL的AXL-4#抗体或商品化捕获AXL抗体，每孔100μL包被ELISA板，4℃过夜。用稀释液孵育1小时封闭。加入健康人群(CAG)、ST段抬高型心肌梗死患者血浆(STEMI)或非ST段抬高型心肌梗死患者血浆(NSTEMI)100μL，室温孵育2小时。将ELISA板洗涤后，每孔加入生物素标记的AXL检测抗体(即商品化的AXL抗体)，室温孵育1小时。将ELISA板洗涤后，加入HRP-链亲和素(DY154,R&D system)100μL，室温孵育1小时。每孔加入100μl TMB，显色15min。每孔加入50μL的2M H2SO4终止反应，ELISA读数仪(BioTek)测定450nm的OD值。
结果如图14所示，ST段抬高型心肌梗死患者(STEMI)中，AXL-Gas6复合物水平较健康对照(CAG)组明显升高；而采用商品化抗体检测结果(RD组)，ST段抬高型心肌梗死患者AXL水平较健康对照升高，但无统计学差异。非ST段抬高型心肌梗死患者中sAXL-Gas6变化不明显，提示AXL-Gas6复合物主要参与的是ST段抬高型心肌梗死。
实施例12.STEMI患者发病危险因素的单因素及多因素Logistic回归分析
本发明进一步对入选2014年10月至2016年12月在中国人民解放军总医院第九医学中心(原战略支援部队特色医学中心)行急诊或紧急PCI救治的AMI患者64例(排除溶栓治疗未成功行PCI补救者、存在手术禁忌者、临床及检验资料不完善者)进行了研究，其中包含STEMI患者40例和NSTEMI患者24例。选取同期就诊且冠脉造影阴性者(狭窄程度＜50％)24例为对照组，构建了一个回顾性病例对照研究，通过分别收集患者的基础流行病学资料信息、既往史、心脏超声、化验指标和AXL-Gas6复合物、sAXL等数据的基础上，以是否发生心肌梗死为自变量，探究基础资料、既往史、心脏彩超检查结果、临床指标和AXL-Gas6复合物、sAXL等，通过现有技术常规方法构建logistic回归模型。在Logistic回归模型中，首先进行单变量筛选因素。逐个计算OR(odds ratio,OR)值，并进行统计学检验，将P<0.05的变量纳入到多变量模型中。使用手动逐步回归的方法，根据赤池准则，利用似然比检验(likelihood ratio test,LRT)进行变量的筛选和最终模型的确定，从而得到患者罹患心肌梗死的影响因素Logistics回归模型。
在Logistics回归模型的分析结果如表4所示。其中单因素分析结果中表明，AXL-Gas6复合物、AXL、Gas6、高脂血症、左室射血分数(LVEF)、白细胞数量、中性粒细胞百分比、血糖、ALT、AST、LDL、HDL、BNP等和发生心肌梗死相关(P<0.05)，其他因素无统计学意义(P>0.05)。在纳入上述变量进一步行多因素Logisitc回归发现，发生心肌梗死和AXL-Gas6复合物、高脂血症、左室射血分数(LVEF)这三个因素相关，其中罹患高脂血症、AXL-Gas6复合物水平显示为正相关，即为危险因素，其OR值分别为157.045(7.171 -3439.520，P<0.001)和3.307(1.209-9.051，P＝0.020)，左室射血分数(LVEF)显示为负相关，即为保护性因素，其OR值为0.660(0.508 -0.856，P＝0.002)。因此，该模型证明了AXL-Gas6复合物水平与ST段抬高型心肌梗死正相关，是发生ST段抬高型心肌梗死的危险因素。
表4心梗患者单因素及多因素Logistic回归
为了验证该Logistics回归模型的效能，采用受试者工作特征曲线(Receiveroperating characteristic curve，ROC)曲线方法，计算受试者工作特征曲线下面积(Areaunder the receiver operating characteristic curve，AUC)值(参见图15)。对于上述构建的模型，根据ROC曲线分析，AUC值为97.50％，根据AUC判别标准，表明了模型的效能优良；另外模型的灵敏度为92.50％，特异度为91.30％，显示模型可靠性比较好，即该模型可靠地验证了AXL-Gas6复合物水平能够反应ST段抬高型心肌梗死的风险，检测AXL-Gas6复合物水平能够评估ST段抬高型心肌梗死的风险。
为了进一步研究在ST段抬高型心肌梗死的诊断中AXL-Gas6复合物水平的阈值，我们采用ROC分析和Logistics回归建模的方法。我们针对STEMI组和AXL-Gas6复合物的平均值为基础1.7，以AXL-Gas6复合物增加0.1为间隔，手动进行逐步回归，将AXL-Gas6复合物进行二值化，重新纳入模型分析，使用赤池准则判断法进行不同的模型筛选和评价。最终得到的AXL-Gas6复合物以1.8为间隔(＞1.8和≤1.8为分组间隔)，即当AXL-Gas6水平大于1.8ng/ml时，提示心肌梗死风险增加。
发明人进一步验证了该阈值在临床诊断中的准确性，即对上述64例患者根据上述ELISA方法检测AXL-Gas6复合物水平并根据所述AXL-Gas6复合物水平进行分组(即，＞1.8分组为STMEI心肌梗死，≤1.8分组为NSTMEI心肌梗死)，然后与现有技术中的诊断金标准心电图结果进行对比。结果发现，本发明的诊断方法的灵敏度为90.00％，特异度为86.96％，AUC＝97.66％，即本发明的诊断方法能够准确且灵敏地对STMEI进行诊断。
实施例13.STEMI患者中sAXL-Gas6复合物与其他因素的相关性分析
进一步分析分析STMEI患者中sAXL-Gas6复合物或游离sAXL与患者一般资料、既往史、心脏超声、化验指标等相关性发现，游离sAXL与水平与肌酐呈正相关(图16A)。与游离sAXL不同的是，sAXL-Gas6复合物与目前临床中使用的诊断STMEI心肌梗死的生化指标例如CMKB、白细胞计数WBC、血小板PLT呈正相关，与首次发病至就诊时间(So-FMC)、高密度脂蛋白HDL呈负相关(见图16B-16F)，提示sAXL-Gas6复合物在评估疾病严重程度上相比于游离sAXL更具有一定的优势。
综上，通过抗体AXL-4#，本发明可实现对血浆中AXL-Gas6复合物的特异性检测，且AXL-Gas6复合物对于疾病的评估具有一定的意义。在STMEI心肌梗死患者血浆中，与常规方法检测的游离AXL相比，AXL-Gas6复合物升高更敏感、更显著。AXL-Gas6复合物升高是ST段抬高型心肌梗死发病的重要危险因素之一，且其升高与梗死面积大小、心功能减低显著正相关，与具有保护作用的HDL呈负相关，可用于诊断ST段抬高型心肌梗死或评估患有ST段抬高型心肌梗死的风险。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
HCDR1
SEQ ID NO:1:
GFTFSSFG
HCDR2
SEQ ID NO:2:
INSGSTLI
HCDR3
SEQ ID NO:3:
ARSPLLRLRGDAMDY
LCDR1
SEQ ID NO:4:
QSLLYSTNQKNY
LCDR2
SEQ ID NO:5:
WAS
LCDR3
SEQ ID NO:6:
QQYYRFPYT
SEQ ID NO:7:
重链可变区的氨基酸序列
DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQPPEKGLEWVAYINSGSTLIYYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQLTSLRSEDTAMYYCARSPLLRLRGDAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:8
轻链可变区的氨基酸序列
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMNCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISTVEAEDLAVYYCQQYYRFPYTFGGGTKL
SEQ ID NO:9
重链可变区的核苷酸序列
gatgtgcagctggtggagtctgg
gggaggcttagtgcagcctggagggtcccggaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtagctttggaatgcactgggttcgtcagcctccagagaaggggctggagtgggtcgcatacattaatagtggcagtactcttatctactatgcagacacagtgaagggccgattcaccatctccagagacaatcccaagaacaccctgttcctgcaattgaccagtctaaggtctgaggacacggccatgtattactgtgcaagatccccattactacggctacgaggcgatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca
SEQ ID NO:10
轻链可变区核苷酸序列
gacattgtgatgtcacagtc
tccatcctccctagctgtgtcagttggagagaaggttactatgaactgcaagtccagtcagagccttttatatagtaccaatcaaaagaactacttggcctggtaccagcagaaaccagggcagtctcctaaactgttgatttactgggcatccactagggaatctggggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcactgtggaggctgaagacctggcagtttattactgtcagcaatattataggtttccgtacacattcggaggggggaccaagctg
SEQ ID NO:11
hAXL-F:5’-ccgaattcgccaccatggcgtggcggtgccccaggatgggc-3’
SEQ ID NO:12
hAXL-R:5’-ccagcagccccagggcaggaggatggtgcctgaggatccgcc-3’
SEQ ID NO:13
P1u-EcoRI:5’-gcgaattcGCCACCatggcgtggcggtgcccca-3’
SEQ ID NO:14
P2d6s,5’-CCCTGGGCGCCAcaagccctccagcccaacatagcc-3’
SEQ ID NO:15
P6u-5’-TGGCGCCCAGGGCAAGCAC-3’
SEQ ID NO:16
p6d-BamHI:5’-cgGGATCCTCAGGCACCATCCTCCTGCCCT-3’
SEQ ID NO:17
P1u:5’-gcGAATTCGCCACCatggcgtggcggtgcccca-3’
SEQ ID NO:18
P1d-3s:5’-CAGCCCAACATAGCCcgtgcccctgggggccatgc-3’(SEQ ID NO:18)
SEQ ID NO:19
P3u:5’-GGCTATGTTGGGCTGGAGGGCTTG-3’(SEQ ID NO:19)
SEQ ID NO:20
p6d-BamHI:5’-cgGGATCCTCAGGCACCATCCTCCTGCCCT-3’
SEQ ID NO:21
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC
SEQ ID NO:22
AATGCTGTGGGCCAGGACACGCAGGAGGTCATCGTGGTGCCACACTCCTTGCCCTTTAAGGTGGTGGTGATCTCAGCCATCCTGGCCCTGGTGGTGCTCACCATCATCTCCCTTATCATCCTCATCATGCTTTGGCAGAAGAAGCCACGTTAG
SEQ ID NO:23
GCGAATTCGCCACCATGGCGTGGCGGTGCCCCAGGATGGGCAGGGTC-3’
SEQ ID NO:24
CGGGATCCTTAGTGATGGTGGTGGTGATGTGGGCGCCAGGCCTCCAGG
SEQ ID NO:25
GAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA
SEQ ID NO:26
GGATACAGTTGGTGCAGCATC
SEQ ID NO:27
SARGTNMAGCTGSAGSAGTC
SEQ ID NO:28
CTTGACCAGGCATCCTAGAGTCA。

Claims (9)

1.检测样品中AXL-GAS6复合物水平的方法，包括
(a)将样品与抗AXL-GAS6抗体或其抗原结合片段接触；和
(b)检测所述AXL-GAS6抗体或其抗原结合片段与AXL-GAS复合物的结合并确定样品中AXL-GAS6复合物的水平；
其中所述抗AXL-GAS6抗体包含重链可变区的3个互补决定区HCDR，以及轻链可变区的3个互补决定区LCDR，其中：
HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；和
LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
2.权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中检测所述抗体或其抗原结合片段与AXL-GAS复合物的结合水平是通过酶联免疫吸附测定法ELISA进行的。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述ELISA是捕获夹心ELISA。
4.权利要求1所述的方法，其中所述样品是血浆。
5.抗AXL-GAS6抗体或其抗原结合片段在制备用于诊断心肌梗死或评估心肌梗死风险的药物或试剂盒中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述抗AXL-GAS6抗体包含重链可变区的3个互补决定区HCDR，以及轻链可变区的3个互补决定区LCDR，其中：
HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；和
LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
7.根据权利要求5所述的用途，其中所述心肌梗死为ST段抬高型心肌梗死。
8.根据权利要求5所述的用途，其中，所述试剂盒还包括ELISA检测试剂。
9.根据权利要求5所述的用途，其中，所述试剂盒还包括使用说明书，其中，所述说明书指示：
当AXL-GAS复合物水平＞1.8ng/ml时，指示患有心肌梗死或心肌梗死风险高；
当AXL-GAS复合物水平≤1.8ng/ml时，指示不具有心肌梗死或心肌梗死风险低；
其中，所述心肌梗死为ST段抬高型心肌梗死。
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