CN121021663A - 一种从乳原料中提取目标产物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从乳原料中提取目标产物的方法，涉及食品加工技术领域。该方法在进行强阴离子交换层析前，引入了超滤和电导调整的协同预处理步骤，实现了层析过程的“提速、增效、提质、降本”，克服了传统离子交换色谱法在处理乳原料时存在的速度慢、易污染、不稳定等技术瓶颈，为β‑乳球蛋白和α‑乳白蛋白的高效、高纯度、规模化生产提供了解决方法。该方法还可以将强阴离子交换层析和弱阴离子交换层析结合，能进一步提高β‑乳球蛋白和α‑乳白蛋白的提取纯度；此外，该方法还能够同步实现酪蛋白胶束、乳糖及乳矿物盐等多种目标物质的高效提取，从而大幅提升乳源副产品的附加值和资源利用效率。

Description

一种从乳原料中提取目标产物的方法

技术领域

本发明涉及食品加工技术领域，具体而言，涉及一种从乳原料中提取目标产物的方法。

背景技术

乳制品是人类重要的营养来源，其核心价值不仅在于提供基础营养素，更在于含有多种具有高生物活性和高附加值的功能成分，如β-乳球蛋白（β-Lg）、α-乳白蛋白（α-La）、酪蛋白胶束、乳糖以及乳矿物盐等。这些物质在食品工业、婴幼儿配方食品、运动营养品、制药及保健品等领域具有广泛的应用前景。例如，β-乳球蛋白和α-乳白蛋白是优质的蛋白质来源，具有特定的氨基酸组成和生理功能；酪蛋白胶束因其独特的结构在食品质构改良中作用显著；乳糖是许多食品的重要配料；而乳矿物盐则是一种天然、高生物利用度的钙质补充剂。

目前，从乳原料（如脱脂奶、乳清等）中分离提取上述目标物质的技术已有诸多报道，但大多存在一定的局限性，难以实现高效、高纯度、多组分的协同提取。

关于乳清蛋白（β-乳球蛋白和α-乳白蛋白）的分离：传统方法主要采用色谱法，尤其是离子交换色谱和疏水相互作用色谱。目前，色谱法存在处理量小、工艺流程长、设备投资大、洗脱剂消耗多，导致生产成本高昂，难以适用于大规模工业化生产。膜分离技术（如超滤、微滤）也被广泛应用，但常规的超滤膜在分离分子量相近的β-乳球蛋白和α-乳白蛋白时选择性较差，难以获得高纯度的单一组分。

关于酪蛋白胶束的分离：目前主要通过超速离心或微滤技术从脱脂乳中分离酪蛋白胶束。然而，超速离心能耗极高，且存在胶束结构被破坏的风险，产量有限。微滤法虽然较为温和，但面临通量衰减快、操作周期短等问题，影响了生产效率和经济效益。同时，在分离过程中如何有效避免乳清蛋白的混杂，保持酪蛋白胶束结构的完整性，仍是技术难点。

关于乳糖和乳矿物盐的提取：乳糖通常通过乳清的浓缩、结晶方式获得，但此过程易受杂质离子影响，导致结晶纯度不高、晶体形态不佳。乳矿物盐（主要是乳钙）的提取多采用酸沉淀或离子交换法，但这些方法可能引入化学试剂，存在产品纯度低、有异味、或天然构象被破坏等问题，影响了其在高端食品中的应用。

现有技术大多侧重于从乳原料中单一或少量几种成分的分离，缺乏能够系统化、连续化地从同一原料中高效协同提取多种高价值组分（包括酪蛋白胶束、乳清蛋白、乳糖和乳矿物盐）的整合工艺。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从乳原料中提取目标产物的方法。

本发明是这样实现的：

一种从乳原料中提取目标产物的方法，所述目标产物包括β-乳球蛋白和/或α-乳白蛋白，其包括以下步骤：

获取脱脂奶经微滤后的第一透过液；

对所述第一透过液进行超滤，获得第二透过液和第二截留液；

将所述第二截留液的电导调整至3~8 mS/cm后进行强阴离子交换层析，获得含α-乳白蛋白的流穿液和含β-乳球蛋白的洗脱液。

本发明具有以下有益效果：

（1）本申请开发了一种新型的提取方法，在强阴离子交换层析前，引入了超滤和电导调整的协同预处理步骤，实现了层析过程的“提速、增效、提质、降本”，克服了传统离子交换色谱法在处理乳原料时存在的速度慢、易污染、不稳定等技术瓶颈，为β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的高效、高纯度、规模化生产提供了解决方法。

（2）将强阴离子交换层析和弱阴离子交换层析结合，能进一步提高β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的提取纯度，纯度分别达到98.65%和97.39%以上；

（3）该提取方法还能够同步实现酪蛋白胶束、乳糖及乳矿物盐等多种目标产物的高效提取，从而大幅提升乳源副产品的附加值和资源利用效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为从乳原料中提取目标产物的方法的工艺流程图；

图2为图1中的层析步骤的流程图；

图3为实施例1目标蛋白质谱图；其中，A为α-乳白蛋白的质谱图；B为β-乳球蛋白的质谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”、“1”、“2”、“3”、“4”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

本发明提供的从乳原料中提取目标蛋白的方法，特别是通过在强阴离子交换层析前引入超滤和电导调整的协同预处理步骤，带来了显著且预料不到的协同技术效果，主要具体体现在以下几个方面：

显著提升层析速度与效率：超滤有效去除了乳原料中除目标产物以外的其他不溶性杂质的干扰，极大减轻了对层析柱的堵塞和污染，使得层析过程柱压稳定、流速显著提高，允许以更高的流速进行上样和洗脱，从而大幅缩短了提取时长，提高了设备利用率；同时，精确的电导调整将原料液的电导率优化至目标蛋白与填料结合动力最强的区间，极大地改善了蛋白质分子的传质效率。超滤和电导调整的结合，使得目标蛋白能够以更高的流速、更短的平衡时间完成层析过程，层析速度得到了倍增式的提升，从而大幅提高了单位时间的原料处理量。

显著提高目标产物纯度：超滤预处理在去除不溶性杂质的同时，也去除了大量可与目标蛋白竞争结合位点的可溶性杂蛋白，实现了样品的初步纯化。此基础上，精准的电导调整进一步“锐化”了目标蛋白（β-乳球蛋白和α-乳白蛋白）与残余杂质蛋白在电荷性质上的差异。

提高工艺的稳定性：超滤对填料的“保护效应”与电导调整对过程的“稳定效应”相结合，使得整个纯化工艺的重复性和稳定性极大增强。这不仅降低了昂贵的层析填料更换频率和生产成本，更保证了规模化生产中产品质量的高度一致性，为工业化应用奠定了坚实基础。

此外，本发明将强阴离子层析和弱阴离子层析相组合应用，结合膜过滤技术，显著提高了弱阴离子层析的层析效率和通量，实现了β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的高纯度提取，β-乳球蛋白的纯度可达到98.65%以上，α-乳白蛋白的纯度可达到97.39%以上。

本发明的实施例提供了一种从乳原料中提取目标产物的方法，所述目标产物包括β-乳球蛋白和/或α-乳白蛋白，其包括以下步骤：

获取脱脂奶经微滤后的第一透过液；

对所述第一透过液进行超滤，获得第二透过液和第二截留液；

将所述第二截留液的电导调整至3~8 mS/cm后进行强阴离子交换层析，获得含α-乳白蛋白的流穿液和含β-乳球蛋白的洗脱液。

在可选的实施例中，所述方法还包括：对脱脂奶进行微滤，获得第一透过液和第一截留液。

在可选的实施例中，所述微滤的滤膜孔径为0.05~0.2 μm，具体可以为0.05、0.1、0.12、0.14、0.16、0.18和0.2μm中的任意一种或任意两者之间的范围。

在可选的实施例中，所述微滤的温度为10~60℃，具体可以为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55和60℃中的任意一种或任意两者之间的范围。

在可选的实施例中，所述微滤的跨膜压差控制在1~2bar，具体可以为1、1.2、1.4、1.6、1.8和2bar中的任意一种或任意两种之间的范围。跨膜压差计算公式为：

。

在可选的实施例中，所述微滤的体积浓缩倍数为2~5倍，具体可以为2、3、4和5倍中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施例中，所述方法还包括对微滤后的截留液进行洗滤，以获得最终的第一截留液用于后续步骤；其中，洗滤液可以为RO水，洗滤倍数为脱脂乳体积的1~5倍，具体可以为1、2、3、4和5倍中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施例中，所述方法还包括：获取脱脂奶经所述微滤后的第一截留液；

对所述第一截留液进行超滤，获得含乳糖的第三透过液和含酪蛋白胶束的第三截留液。

在可选的实施例中，对所述第一截留液进行超滤的滤膜分子截留量为3~30 kDa，具体可以为3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 kDa中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施例中，对所述第一截留液进行超滤的温度可以为10~25℃，具体可以为10、12、14、16、18、20、22、24和25℃中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施例中，对所述第一截留液进行超滤的体积浓缩倍数为2~5倍，具体可以为2、3、4和5倍中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施方式中，对所述第一截留液进行超滤后，所述方法包括对该超滤后的第三截留液进行洗滤，以获得洗滤后的第三截留液用于后续步骤。其中，洗滤的洗滤液可以为RO水，洗滤倍数为脱脂乳体积的1~5倍，优选为1~2倍。

在可选的实施例中，所述方法还包括：对所述第三截留液进行干燥，获得酪蛋白胶束粉。

在可选的实施例中，所述干燥可以为喷雾干燥。

在可选的实施例中，对所述第一透过液进行超滤的滤膜分子截留量为3~30 kDa，具体可以为3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28和30 kDa中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施例中，对所述第一透过液进行超滤的滤膜分子截留量为5~15 kDa。

在可选的实施例中，对所述第一透过液进行超滤的条件包括：温度为10~25℃，体积浓缩倍数为2~5倍。该温度具体可以为10、12、14、16、18、20、22、24、25℃中的任意一种或任意两种之间的范围，体积浓缩倍数可以为2、3、4、5倍中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施例中，对所述第一透过液进行超滤后，所述方法还包括对第二截留液进行洗滤，获得洗滤后的第二截留液用于后续步骤。其中，洗滤液可以为RO水，洗滤倍数为脱脂乳体积的1~5倍，具体可以为1、2、3、4和5倍中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施例中，调整电导前，所述方法还包括：对所述第二截留液进行浓缩，使第二截留液中的蛋白浓度为0.4%~0.8%（w/w），该浓度具体可以为0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%中的任意一种或任意两种之间的范围。正常微滤后得到的天然乳清液蛋白浓度为0.2%~0.3%，在蛋白总量一致的情况下，蛋白浓度越高，乳清液的总体积越小，乳清液作为层析的直接原料，体积越小在相同上样流速的情况下，所用时间越短，可有效提高层析效率。

在可选的实施例中，将所述第二截留液的电导调整至3、4、5、6、7、8 mS/cm中的任意一种或任意两种之间的范围后进行强阴离子交换层析。

在可选的实施例中，所述电导调整采用的溶液为氯化钠溶液。氯化钠溶液的浓度可以为1%、2%、4%、5%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%、22%、24%、26%、28%和30%（w/w）中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施例中，所述方法还包括：将所述第二透过液和/或所述第三透过液进行纳滤，获含乳糖的第四截留液和含乳矿物盐的第四透过液。

在可选的实施例中，所述纳滤采用的滤膜分子截留量为300~1000 Da，具体可以为300、400、500、600、700、800、900、1000 Da中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施例中，所述纳滤的温度可以为10~25℃，具体可以为10、12、14、16、18、20、22、24和25℃中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施例中，所述纳滤的体积浓缩倍数为2~5倍，具体可以为2、3、4和5倍中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施例中，进行纳滤后，所述方法还包括对纳滤后的第四截留液进行洗滤。洗滤的条件同前述任意实施例所述的洗滤。

在可选的实施例中，所述方法还包括：对所述第四截留液进行干燥，获得乳糖粉；

在可选的实施例中，所述方法还包括：对所述第四透过液进行干燥，获得乳矿物盐粉。

在可选的实施例中，所述强阴离子交换层析的层析程序为平衡-上样-柱后平衡-洗脱1-洗脱2-柱CIP-柱冲洗。

在可选的实施例中，强阴离子交换层析的平衡程序为：A相平衡2-5倍柱体积-B相平衡2-5倍柱体积-A相平衡3-10倍柱体积，流速均为240-500cm/h；优选地为A相平衡2倍柱体积-B相平衡2倍柱体积-A相平衡3倍柱体积，流速均为400-500cm/h；

在可选的实施例中，所述A相：15~35 mmol/L pH 7.8~8.2的Tris-HCl溶液。

在可选的实施例中，所述B相：含15~35 mmol/L pH7.8~8.2 Tris-HCl溶液和0.1~1mol/L氯化钠的混合液。B相的制备包括：在15~35 mmol/L pH7.8~8.2 Tris-HCl溶液添加0.1~1 mol/L氯化钠获得，0.1~1 mol/L为氯化钠在B相中的浓度。

在可选的实施例中，所述15~35 mmol/L具体可以为15、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、35mmol/L中的任意一种或任意两者之间的范围。

在可选的实施例中，pH7.8~8.2具体可以为7.8、7.9、8.0、8.1、8.2中的任意一种或任意两者之间的范围。

在可选的实施例中，所述0.1~1 mol/L具体可以为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mol/L中的任意一种或任意两者之间的范围。

在可选的实施例中，强阴离子交换层析的上样程序为电导为3~8mS/cm的浓缩乳清液，流速为500~700cm/h，优选地为700cm/h，上样体积为100倍柱体积。

在可选的实施例中，强阴离子交换层析的柱后平衡程序为A相以500~700cm/h流速，优选地为700cm/h，冲洗2-5倍柱体积，优选地为2倍柱体积。

在可选的实施例中，进行所述洗脱1后获得含α-乳白蛋白的洗脱液；进行所述洗脱2后获得含β-乳球蛋白的洗脱液。

在可选的实施例中，所述洗脱1的洗脱液包括：采用由92%~94%（v/v）的A相和6%~8%（v/v）的B相组成的混合液。该92%~94%具体可以为92%、93%、93.2%、93.4%、93.6%、93.8%、94%中的任意一种或任意两种之间的范围。该6%~8%具体可以为6%、6.2%、6.4%、6.6%、6.8%、7%、8%中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施例中，所述洗脱1采用3~8倍柱体积的洗脱液洗脱；该3~8倍具体可以为3、4、5、6、7和8倍中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施例中，所述洗脱2的洗脱液包括所述B相。

在可选的实施例中，所述洗脱2采用5~10倍柱体积的洗脱液洗脱；该5~10倍具体可以为5、6、7、8、9和10倍中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施例中，所述洗脱1和/或所述洗脱2的流速240~500cm/h，具体可以为240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480和500 cm/h中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施例中，强阴离子交换层析的柱CIP程序为使用0.5mol/L的氢氧化钠溶液清洗3-5倍柱体积，优选地为4倍柱体积，流速为240-500cm/h，优选地为400-500cm/h。

在可选的实施例中，强阴离子交换层析的柱冲洗程序为100% B相洗脱2~5倍柱体积，优选地为5倍柱体积，流速为240~500cm/h，优选地为400~500cm/h。

在可选的实施例中，所述强阴离子交换层析采用的强阴离子交换层析柱为TA-QXL BB 层析柱。

在可选的实施例中，所述方法还包括：对所述流穿液和/或洗脱1的洗脱液进行弱阴离子交换层析。

在可选的实施例中，所述方法还包括：将所述流穿液和/或洗脱1的洗脱液超滤后获得的截留液再进行所述弱阴离子交换层析。

在可选的实施例中，所述流穿液和/或洗脱1的洗脱液的超滤采用的分子截留量为3~5kDa，具体可以为3、3.5、4、4.5、5kDa中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施例中，所述流穿液和/或洗脱1的洗脱液超滤的体积浓缩倍数为2~5倍，具体可以为2、3、4、5倍中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施例中，对所述流穿液和/或洗脱1的洗脱液进行超滤后，所述方法还包括对该超滤后的截留液进行洗滤。该洗滤采用的洗滤液可以为前述任意实施例所述的A相，洗滤至截留液电导与A相电导一致（1.5mS/cm）。

在可选的实施例中，所述弱阴离子交换层析的层析程序为平衡-上样-柱后平衡-洗脱3-洗脱4-柱CIP-柱冲洗。

在可选的实施例中，弱阴离子交换层析的平衡程序为A相平衡2-5倍柱体积-B相平衡2-5倍柱体积-A相平衡3-10倍柱体积，流速均为240-500cm/h，优选地为A相平衡2倍柱体积-B相平衡2倍柱体积-A相平衡3倍柱体积，流速均为240-360cm/h。A相和B相同前述实施例中所述。

在可选的实施例中，弱阴离子交换层析的上样程序为所述流穿液和/或洗脱1的洗脱液或其超滤后的截留液全部上样，流速为500-700cm/h，优选地为600cm/h；柱后平衡程序为A相以500-700cm/h流速，优选地为600cm/h，冲洗2-5倍柱体积，优选地为2倍柱体积。

在可选的实施例中，进行洗脱3后获得含α-乳白蛋白的洗脱液，进行洗脱4后获得含β-乳球蛋白的洗脱液。

在可选的实施例中，所述洗脱3的洗脱液包括：采用由92%~94%（v/v）的A相和6%~8%（v/v）的B相组成的混合液。该92%~94%具体可以为92%、93%、93.2%、93.4%、93.6%、93.8%、94%中的任意一种或任意两种之间的范围。该6%~8%具体可以为6%、6.2%、6.4%、6.6%、6.8%、7%、8%中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施例中，所述洗脱3采用3~8倍柱体积的洗脱液洗脱；该3~8倍具体可以为3、4、5、6、7和8倍中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施例中，所述洗脱4的洗脱液包括所述B相；

在可选的实施例中，所述洗脱4采用5~10倍柱体积的洗脱液洗脱；该5~10倍具体可以为5、6、7、8、9和10倍中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施例中，所述洗脱3和/或所述洗脱4的流速240~500cm/h，具体可以为240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480和500 cm/h中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施例中，弱阴离子交换层析的柱CIP程序为使用0.5mol/L的氢氧化钠溶液清洗3-5倍柱体积，优选地为4倍柱体积，流速为240-500cm/h，优选地为240-360cm/h。

在可选的实施例中，弱阴离子交换层析的柱冲洗程序为100% B相洗脱2-5倍柱体积，优选地为5倍柱体积，流速为240-500cm/h，优选地为240-360cm/h。

在可选的实施例中，所述弱阴离子交换层析采用的弱阴离子交换层析柱为TA-SPXL BB层析柱。

在可选的实施例中，所述方法还包括：对所述强阴离子交换层析和/或所述弱阴离子交换层析中获得的含α-乳白蛋白的流穿液和/或洗脱液进行超滤和/或干燥；

在可选的实施例中，对含α-乳白蛋白的流穿液和/或洗脱液进行超滤采用的滤膜分子截留量为3~5kDa，具体可以为3、3.5、4、4.5、5kDa中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施例中，对含α-乳白蛋白的流穿液和/或洗脱液进行超滤的体积浓缩倍数为2~5，具体可以为2、3、4、5倍中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施例中，对含α-乳白蛋白的流穿液和/或洗脱液进行超滤后，还包括对该超滤后的截留液进行洗滤，洗滤液可以为RO水，洗滤至截留液电导≤0.1mS/cm。

在可选的实施例中，所述方法还包括：对所述强阴离子交换层析和/或所述弱阴离子交换层析中获得的含β-乳球蛋白的洗脱液进行超滤、pH调整和干燥中的至少一种；

在可选的实施例中，所述pH调整是指将溶液的pH调整至2.5~3.5；

在可选的实施例中，对含β-乳球蛋白的洗脱液进行超滤采用的滤膜分子截留量为3~5 kDa，具体可以为3、3.5、4、4.5、5kDa中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施例中，对含β-乳球蛋白的洗脱液进行超滤的浓缩倍数为2~5倍，具体可以为2、3、4、5倍中的任意一种或任意两种之间的范围。

在可选的实施例中，对含β-乳球蛋白的洗脱液进行超滤后，进行pH调整前，所述方法还包括对该超滤后的截留液进行洗滤，获得洗滤后的截留液用于后续pH调整。洗滤液可以为RO水，洗滤至截留液电导≤0.1mS/cm。

在可选的实施例中，所述目标产物还包括：酪蛋白胶束、乳糖和乳矿物盐中的至少一种。

在可选的实施例中，前述任意实施例所述的微滤、超滤、纳滤的滤膜可以为有机卷式膜，膜材料可以为PES。

提取方法的工艺流程图参照图1，其中的层析步骤的流程图参照图2。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例中采用的强阴离子交换层析柱：填料：TA-Q XL BB；层析柱柱床高20cm；层析柱内直径20cm；长径比1：1；填料压缩比1：1.15；填料体积6.28L；工作压力0.25MPa。

实施例中采用的弱阴离子交换层析柱：填料：TA-SP XL BB；层析柱柱床高20cm；层析柱内直径40cm；长径比1：2；填料压缩比1：1.20；填料体积25L；工作压力0.28MPa。A相为25mmol/L pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）溶液；

B相为含25mmol/L pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）溶液和0.5mol/L的氯化钠的混合液。

实施例1

一种从乳原料中提取目标产物的方法，其包括以下步骤。

（1）步骤1：

脱脂乳使用0.1微米PES有机卷式膜进行微滤，获得第一透过液（天然乳清蛋白液）和第一截留液（酪蛋白胶束液）；其中，微滤温度为50℃；跨膜压差控制在1.4bar，浓缩倍数为3倍。

对第一截留液进行洗滤，洗滤液为RO水，洗滤倍数为脱脂乳体积的1.5倍，以获得洗滤后的第一截留液（酪蛋白胶束液）。

（2）步骤2：

将步骤1获得的第一截留液使用10kDa PES有机卷式膜进行超滤，获得第三截留液和第三透过液（乳糖液）；其中，超滤温度为15℃；浓缩倍数为3倍；

对第三截留液进行洗滤，洗滤液为RO水，洗滤倍数为步骤1脱脂乳体积的1倍，获得洗滤后的第三截留液（酪蛋白胶束液）。

（3）步骤3：

将步骤2获得的第三截留液（酪蛋白胶束液）使用喷雾干燥后可制得酪蛋白胶束粉。

（4）步骤4：

将步骤1的第一透过液（天然乳清蛋白液）使用10kDa PES有机卷式膜进行超滤，获得第二截留液和第二透过液；其中，超滤温度为15℃；浓缩倍数为3倍；

对第二截留液进行洗滤，洗滤液为RO水，洗滤倍数为步骤1脱脂乳体积的1倍；

对洗滤后的第二截留液进行浓缩，使料液中蛋白浓度为0.6%（w/w），获得浓缩后的第二截留液（浓缩乳清液）。

（5）步骤5：

将步骤2的第三透过液和步骤4的第二透过液混合后使用500Da PES有机卷式膜进行纳滤，获得第四截留液（浓缩乳糖液）和第四透过液（乳矿物盐液）；其中，纳滤温度为20℃，浓缩倍数为3倍；

对第四截留液进行洗滤，获得洗滤后的第四截留液；其中，洗滤液为RO水，洗滤倍数为初始体积的2倍。

（6）步骤6：

对步骤5的第四透过液使用喷雾干燥后可制得乳矿物盐粉；

对步骤5的第四截留液使用喷雾干燥后可制得乳糖粉。

（7）步骤7：

将步骤4的浓缩乳清液使用26%（w/w）浓度的氯化钠溶液调整电导为4mS/cm。

（8）步骤8：

将步骤7经调整电导的浓缩乳清液使用强阴离子交换树脂进行层析，层析程序为平衡-上样-柱后平衡-洗脱1-洗脱2-柱CIP-柱冲洗；其中：

平衡程序为A相平衡2倍柱体积-B相平衡2倍柱体积-A相平衡3倍柱体积，流速均为500cm/h；

上样程序为电导为4mS/cm的浓缩乳清液，流速为700cm/h，上样体积为100倍柱体积；

柱后平衡程序为A相以700cm/h流速，冲洗2倍柱体积；

洗脱1程序为93.4%的A相和6.6%的B相洗脱3倍柱体积，流速为500cm/h；

洗脱2程序为100%B相洗脱5倍柱体积，流速为500cm/h；

柱CIP程序为使用0.5mol/L的氢氧化钠溶液清洗4倍柱体积，流速为500cm/h；

柱冲洗程序为100% B相洗脱5倍柱体积，流速为500cm/h。

（9）步骤9：

将步骤8中上样程序中的柱流穿液（含α-乳白蛋白的流穿液）和洗脱1的洗脱液（含α-乳白蛋白的洗脱液）收集混合，使用5kDa PES有机卷式膜进行超滤；其中，超滤温度为常温；浓缩倍数为3倍；

对超滤获得的截留液进行洗滤，洗滤液为A相，洗滤至截留液电导与A相电导一致（1.5mS/cm）。

（10）步骤10：

将步骤9中截留液进行弱阴离子交换层析，层析程序为平衡-上样-柱后平衡-洗脱3-洗脱4-柱CIP-柱冲洗，其中：

平衡程序为A相平衡2倍柱体积-B相平衡2倍柱体积-A相平衡3倍柱体积，流速均为360cm/h，A相为25mmol/L pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）溶液，B相为含25mmol/L pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）溶液和0.5mol/L的氯化钠的混合液；

上样程序为步骤9中获得的截留液全部上样，流速为600cm/h；

柱后平衡程序为A相以600cm/h流速，冲洗2倍柱体积；

洗脱3程序为93.4%的A相和6.6%的B相洗脱6倍柱体积，流速为360cm/h；

洗脱4程序为100%B相洗脱5倍柱体积，流速为360cm/h；

柱CIP程序为使用0.5mol/L的氢氧化钠溶液清洗4倍柱体积，流速为240cm/h；

柱冲洗程序为100% B相洗脱5倍柱体积，流速为360cm/h。

（11）步骤11

将步骤10中洗脱3的洗脱液使用5kDa PES有机卷式膜进行超滤，获得截留液；其中，超滤温度为常温；浓缩倍数为3倍；

对截留液进行洗滤，洗滤液为RO水，洗滤至截留液电导≤0.1mS/cm。

（12）步骤12：

将步骤8中洗脱2的洗脱液和步骤10中洗脱4的洗脱液混合后使用5kDa PES有机卷式膜进行超滤，获得截留液；其中，超滤温度为常温；浓缩倍数为3倍；

对截留液进行洗滤，洗滤液为RO水，洗滤至截留液电导≤0.1mS/cm。

（13）步骤13：

将步骤11中获得的截留液使用喷雾干燥后，制得高纯度α-乳白蛋白粉。

（14）步骤14：

将步骤12中获得的截留液使用3mol/L盐酸将pH调整至3后再使用喷雾干燥后，制得高纯度β-乳球蛋白粉。

实施例2

一种从乳原料中提取目标产物的方法，与实验例1大致相同，区别在于：

（1）不进行步骤9和步骤10；

（2）步骤11：将“步骤10中洗脱3的洗脱液”替换为步骤8中上样程序中的柱流穿液（含α-乳白蛋白的流穿液）和洗脱1的洗脱液（含α-乳白蛋白的洗脱液）的混合液；

（3）步骤12：省略涉及“步骤10中洗脱4的洗脱液”的方案。

实施例3

一种从乳原料中提取目标产物的方法，与实验例1大致相同，区别在于：

（1）不进行步骤7、步骤8和步骤9；

（2）步骤10：将“步骤9中截留液”替换为“步骤4获得的第二截留液（浓缩乳清液）”；

（3）步骤12：省略涉及“步骤8中洗脱2的洗脱液”的方案。

实施例4

一种从乳原料中提取目标产物的方法，与实验例1大致相同，区别在于：步骤14不进行pH调整。

实施例5

根据实施例1~4的方法从乳原料中提取目标产物，使用高效液相色谱－质谱联用法对α-乳白蛋白和β-乳球蛋白进行检测，具体方法如下：

1、标准品：牛α-乳白蛋白特异肽段标准品（序列:VGINYWLAHK，分子量 1200.4Da，纯度>99%）；牛α-乳白蛋白同位素标记特异肽段标准品（序列:VGI*NYWL*AHK，分子量1214.4Da，纯度>95%）；牛α-乳白蛋白同位素标记内标（序列:KIDKVGI*NYWL*AHKALCSEK，分子量2443.9 Da，纯度>95%）；牛β-乳球蛋白特异肽段标准标准品（序列:IDALNENK，分子量916.0Da，纯度>99%）；牛β-乳球蛋白同位素标记特异肽段标准品（序列:I*DAL*NENK,分子量930.0 Da，纯度≥95%）；牛β-乳球蛋白同位素标记内标（序列:KIPAVFKI*DAL*NENKVIVLDTDYK,分子量2761.2 Da,纯度>95%）；注：上述所示肽段序列中注有*的氨基酸为同位素氨基酸。

2、称取固体试样约2 g或液体试样约10 g（精确至0.01 g，内含蛋白质约200 mg）于500 mL烧杯中，分次用900 mL水将试样充分溶解，转移到1000 mL，容量瓶中，并用水定容至刻度，置于涡旋混合器上充分溶解后备用。准确移取200 μL上述样液和50 μL，同位素内标中间混合溶液于2 mL离心管中，混匀后加入150 μL碳酸氢铵溶液、10 μL二硫苏糖醇溶液，混匀后置75℃下恒温水浴30 min；冷却至室温,加入30 μL碘代乙酰胺溶液，暗处静置30min；再加入10 μL氯化钙溶液、50 μL胰蛋白酶溶液，充分混匀后置于37℃恒温水浴中酶解5小时。用10 μL甲酸混匀，室温下静置15 min，加入490 μL水，涡旋混匀，用0.22 μm滤膜过滤供液相色谱串联质谱仪检测。

3、色谱柱:硅烷基 C18 柱，柱长 100 mm，柱内径2.1 mm；填料粒径 1.7 um，孔径30 nm（300）或柱效相当者。

4、流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脱：按表1给出的参考条件洗脱。

6、流动相流速:0.3 mL/min。

7、色谱柱柱温:40℃；

8、试液温度:10 ℃。

9、进样体积:10 μL。

10、质谱参考条件

电喷雾模式：ESI；质谱扫描方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压：3.5kV，锥孔电压：35 V，脱溶剂温度：500℃，脱溶剂气流量：800 L/h，锥孔反吹气流量：30 L/h，碰撞室压力：3.0×mbar。

11.质谱检测条件如表2所示:

检测结果如图3和下表所示。

表3 实施例1的α-乳白蛋白粉和β-乳球蛋白粉的检测结果

表4 实施例1的酪蛋白胶束粉、乳糖粉和乳矿物盐粉的检测结果

表5 实施例2的α-乳白蛋白粉和β-乳球蛋白粉的检测结果

表6 实施例3的α-乳白蛋白粉和β-乳球蛋白粉的检测结果

备注：实施例3的结果为进行5次重复实验后的结果。

表7 实施例4的α-乳白蛋白粉和β-乳球蛋白粉的检测结果

表8 各实施例的离子交换层析的流速对比

由结果可知：

对比实施例1和实施例2可知，只进行1步强阴离子层析可以得到纯度86.97%和97.32%的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，α-乳白蛋白纯度相比于实验例1两步层析有显著降低，但可作为生产普通纯度的α-乳白蛋白工艺所使用。

对比实施例1和实施例3可知，只进行弱阴离子层析通过多次实验发现，结果受到原料波动影响较大，α-乳白蛋白纯度波动较大，且无法生产95%以上纯度产品，弱阴离子层析的整体层析流速约为实验例1弱阴离子层析流速的1/3，弱阴离子层析的上样量为70倍柱体积约为实验例1强阴离子层析的上样量的7/10。

对比实施例1和实施例4可知，不进行实施例1中的步骤14中的pH调整会导致β-乳球蛋白的溶解度明显下降。

实施例6

一种从乳原料中提取目标产物的方法，与实验例1大致相同，区别在于：

（1）不进行步骤9；

（2）步骤10：将“步骤9中截留液”替换为步骤8流穿液和洗脱1的混合液。

对目标产物进行检测，检测方法见实施例5，结果如下。

表9 实施例6的α-乳白蛋白粉和β-乳球蛋白粉的检测结果

由结果可知，不进行步骤9会导致料液电导过高不适合第二步层析，α-乳白蛋白挂柱能力降低从而导致回收率降低，各蛋白在洗脱时不易被分开。且不进行步骤9料液未浓缩，料液由实施例1的约40L增加为约120L，会导致步骤10的层析用时也增加3倍。

实施例7

一种从乳原料中提取目标产物的方法，与实验例1大致相同，区别在于：

将强阴离子层析的原料液变更为步骤1的第一透过液（天然乳清液）。

对目标产物进行检测，检测方法见实施例5，结果如下。

表10 实施例7的α-乳白蛋白粉和β-乳球蛋白粉的检测结果

由结果可知，直接使用天然乳清做为原料回收率和蛋白纯度都有显著降低，强阴离子层析上样时的流速由700cm/h降低为500cm/h，否则会导致柱压超过工作压力，增加约25%-35%的上样时间；实施例1中0.6%蛋白浓度的原料液上样100CV约630L，蛋白总量约为3.78kg，本实施例中天然乳清液的蛋白浓度约为0.3%，上样100CV约630L，蛋白总量约为1.89kg，批处理量降低一半，若达到相同蛋白处理量则工艺用时需增加1.25-1.35倍。

实施例8

一种从乳原料中提取目标产物的方法，与实验例1大致相同，区别在于：

将步骤8层析中的洗脱1省略；

将步骤10层析中的洗脱3省略。

对目标产物进行检测，检测方法见实施例5，结果如下。

表11 实施例8的α-乳白蛋白粉和β-乳球蛋白粉的检测结果

由结果可知，α-乳白蛋白回收率相比实施例1降低，β-乳球蛋白纯度降低。

实施例9

一种从乳原料中提取目标产物的方法，与实验例1大致相同，区别在于：

将步骤8层析中的柱冲洗省略；

将步骤10层析中的柱冲洗省略。

对目标产物进行检测，检测方法见实施例5，结果如下。

省略两步层析程序中的柱冲洗步骤后对于目标蛋白的纯度和回收率没有显著影响，但会大幅度延长下一批次的柱平衡时间，第二批次步骤8平衡程序为A相平衡5倍柱体积，流速360cm/h -B相平衡3倍柱体积，流速120cm/h -A相平衡7倍柱体积，流速360cm/h；第二批次步骤10平衡程序为A相平衡5倍柱体积，流速360cm/h -B相平衡3倍柱体积，流速240cm/h -A相平衡7倍柱体积，流速360cm/h。

实施例10

一种从乳原料中提取目标产物的方法，与实验例1大致相同，区别在于：

将步骤8层析中的柱后平衡省略；

将步骤10层析中的柱后平衡省略。

对目标产物进行检测，检测方法见实施例5，结果如下。

表12 实施例10的α-乳白蛋白粉和β-乳球蛋白粉的检测结果

由结果可知，省略后目标蛋白纯度降低但回收率有所提高。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种从乳原料中提取目标产物的方法，所述目标产物包括β-乳球蛋白和/或α-乳白蛋白，其特征在于，其包括以下步骤：

获取脱脂奶经微滤后的第一透过液；

对所述第一透过液进行超滤，获得第二透过液和第二截留液；

将所述第二截留液的电导调整至3~8 mS/cm后进行强阴离子交换层析，获得含α-乳白蛋白的流穿液和含β-乳球蛋白的洗脱液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述第一透过液进行超滤的滤膜分子截留量为5~20 kDa。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，调整电导前，所述方法还包括：对所述第二截留液进行浓缩，使第二截留液中的蛋白浓度为0.4%~0.8%（w/w）；

和/或，将所述第二截留液的电导调整至3~5 mS/cm后进行所述强阴离子交换层析。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述强阴离子交换层析的洗脱步骤包括洗脱1和洗脱2，进行所述洗脱1后获得含α-乳白蛋白的洗脱液；进行所述洗脱2后获得含β-乳球蛋白的洗脱液；

和/或，所述洗脱1的洗脱液包括：采用由92%~94%（v/v）的A相和6%~8%（v/v）的B相组成的混合液；其中，所述A相：15~35 mmol/L pH 7.8~8.2的Tris-HCl溶液；所述B相：含15~35mmol/L pH7.8~8.2 Tris-HCl溶液和0.1~1 mol/L氯化钠的混合液；

和/或，所述洗脱2的洗脱液包括所述B相；

和/或，所述强阴离子交换层析采用的层析柱为TA-Q XL BB层析柱；

和/或，所述强阴离子交换层析的层析程序为平衡-上样-柱后平衡-洗脱1-洗脱2-柱CIP-柱冲洗。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：对所述流穿液和/或洗脱1的洗脱液进行弱阴离子交换层析；

和/或，所述弱阴离子交换层析的洗脱步骤包括洗脱3和洗脱4，进行洗脱3后获得含α-乳白蛋白的洗脱液，进行洗脱4后获得含β-乳球蛋白的洗脱液；

和/或，所述洗脱3的洗脱液包括：采用由92%~94%（v/v）的A相和6%~8%（v/v）的B相组成的混合液；其中，所述A相：15~35 mmol/L pH 7.8~8.2的Tris-HCl溶液；所述B相：含15~35mmol/L pH7.8~8.2 Tris-HCl溶液和0.1~1 mol/L氯化钠的混合液；

和/或，所述洗脱4的洗脱液包括所述B相；

和/或，所述弱阴离子交换层析采用的层析柱为TA-SP XL BB层析柱；

和/或，所述弱阴离子交换层析的层析程序为平衡-上样-柱后平衡-洗脱3-洗脱4-柱CIP-柱冲洗；

和/或，所述方法还包括：将所述流穿液和/或洗脱1的洗脱液超滤后再进行所述弱阴离子交换层析；

和/或，所述流穿液和/或洗脱1的洗脱液的超滤采用的分子截留量为3~5kDa；

和/或，对所述流穿液和/或洗脱1的洗脱液进行超滤后，进行所述弱阴离子交换层析前，所述方法还包括对该超滤后的截留液洗滤至截留液电导与A相电导一致。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：对所述强阴离子交换层析和/或所述弱阴离子交换层析中获得的含β-乳球蛋白的洗脱液进行超滤、pH调整和干燥中的至少一种；

和/或，所述pH调整是指将溶液的pH调整至2.5~3.5；

和/或，对含β-乳球蛋白的洗脱液进行超滤采用的滤膜分子截留量为3~5 kDa。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：对所述强阴离子交换层析和/或所述弱阴离子交换层析中获得的含α-乳白蛋白的流穿液和/或洗脱液进行超滤和/或干燥；

和/或，对含α-乳白蛋白的流穿液和/或洗脱液进行超滤采用的滤膜分子截留量为3~5kDa。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标产物还包括：酪蛋白胶束、乳糖和乳矿物盐中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述微滤的滤膜孔径为0.05~0.2 μm；

和/或，所述方法还包括：获取脱脂奶经所述微滤后的第一截留液；

对所述第一截留液进行超滤，获得含乳糖的第三透过液和含酪蛋白胶束的第三截留液；

和/或，对所述第一截留液进行超滤的滤膜分子截留量为3~30 kDa；

和/或，所述方法还包括：对所述第三截留液进行干燥，获得酪蛋白胶束粉。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将所述第二透过液和/或所述第三透过液进行纳滤，获含乳糖的第四截留液和含乳矿物盐的第四透过液；

和/或，所述纳滤采用的滤膜分子截留量为300~1000 Da；

和/或，所述方法还包括：对所述第四截留液进行干燥，获得乳糖粉；

和/或，所述方法还包括：对所述第四透过液进行干燥，获得乳矿物盐粉。