CN121299112B

CN121299112B - 一种检测九型hpv疫苗或抗原原液体外相对效力的方法

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Publication number: CN121299112B
Application number: CN202511105925.7A
Authority: CN
Inventors: 黄维金; 胡金盼; 王萌; 徐灵杰; 徐晓昱; 刘朋飞
Original assignee: Nanjing Novozan Biotechnology Co ltd; National Institutes for Food and Drug Control
Current assignee: Nanjing Novozan Biotechnology Co ltd; National Institutes for Food and Drug Control
Priority date: 2024-09-12
Filing date: 2025-08-08
Publication date: 2026-04-17
Anticipated expiration: 2045-08-08
Also published as: CN121299112A

Abstract

本发明涉及一种检测九型HPV疫苗或抗原原液体外相对效力的方法，具体应用酶联免疫法检测HPV‑VLP抗原原液和疫苗成品(6、11、16、18、31、33、45、52和58型)的体外相对效力。本发明的酶联免疫法具有优良的准确度、精密度，提升了HPV疫苗质量评价的标准化水平，预期对推动高质量HPV疫苗的研发奠定基础。

Description

一种检测九型HPV疫苗或抗原原液体外相对效力的方法

技术领域

本发明涉及检测领域，具体涉及一种用于检测HPV疫苗或抗原原液的体外相对效力的酶联免疫吸附方法，尤其是九价(6、11、16、18、31、33、45、52、58型)HPV疫苗的检测。

背景技术

人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)广泛感染人类，能够导致宫颈癌等恶性肿瘤的发生，严重危害人类的健康。HPV疫苗能够有效阻止HPV感染及其导致的疾病，已经进入临床研究的HPV疫苗含多型抗原(2、3、4、9、11、14、15价)。

与体内效力具有良好相关性的体外效力实验，可代替小鼠体内效力实验用于疫苗的放行检测，节约时间、减少动物使用。体外相对效力是HPV疫苗关键的质量属性，质量控制要求测定型特异抗原含量。现阶段各生产企业利用各自的HPV型特异性单抗建立双抗体夹心ELISA方法以检测各自的L1抗原，但检测结果差异大，标准不一致；部分研发单位缺乏识别关键型特异表位的优势单抗体，限制了HPV疫苗研发和检测标准化。需要研发HPV型特异单抗，建立统一和标准化的HPV型特异抗原定量方法，提升HPV疫苗质量评价的标准化水平，推动高质量HPV疫苗的研发。

发明内容

一方面，本发明提供一种HPV疫苗或HPV抗原原液体外相对效力检测方法，其特征在于，包括如下步骤：采用HPV非型别特异性抗体包被酶标板，加入待测样品孵育，洗板；加入酶标记HPV型别特异性抗体孵育，洗板；加入显色液，显色；加入终止液，测定OD值。在一些实施方案中，所述方法进一步包括：标准品的检测，标准品的检测方法同待测样品。在一些实施方案中，所述方法进一步包括根据抗原浓度和OD值拟合四参数曲线Y＝(d-a)/(1+(X/c)^b)+a，其中a为渐近线下限，b为线性区间直线斜率，c为曲线50％反应点(a和d之间)(表示为浓度)，d为渐近线上限，Y为OD值，X为抗原浓度，获得标准品和待测样品的EC50值，待测样品的体外相对效力＝待测样品的EC50/标准品的EC50。在一些实施方案中，酶标板为预制，向HPV非型别特异性抗体包被的预制酶标板加入待测样品孵育，所述检测方法不包括采用HPV非型别特异性抗体包被板的步骤。

另一方面，本发明还提供一种9价HPV疫苗或HPV抗原原液体外相对效力检测方法，其特征在于，包括如下步骤：向HPV非型别特异性抗体包被的酶标板加入待测样品，孵育，洗板；加入酶标记HPV型别特异性抗体孵育，洗板；加入显色液，显色；加入终止液，测定OD值；根据抗原浓度和OD值拟合四参数曲线Y＝(d-a)/(1+(X/c)^b)+a，其中a为渐近线下限，b为线性区间直线斜率，c为曲线50％反应点(a和d之间)(表示为浓度)，d为渐近线上限，Y为OD值，X为抗原浓度，获得标准品和待测样品的EC50值，待测样品的体外相对效力＝待测样品的EC50/标准品的EC50；

所述HPV型别特异性抗体包含HPV 6特异性抗体、HPV 11特异性抗体、HPV 16特异性抗体、HPV 18特异性抗体、HPV 31特异性抗体、HPV 33特异性抗体、HPV 45特异性抗体、HPV 52特异性抗体和HPV 58特异性抗体。

另一方面，本发明还提供一种ELISA试剂盒，所述试剂盒包含以HPV非型别特异性抗体包被的酶标板。在一些实施方案中，所述试剂盒用于HPV疫苗或HPV抗原原液的体外相对效力检测，所述试剂盒还包含检测抗体，所述检测抗体是酶标记HPV型别特异性抗体，其中HPV型别特异性抗体选自HPV 6特异性抗体、HPV 11特异性抗体、HPV 16特异性抗体、HPV18特异性抗体、HPV 31特异性抗体、HPV 33特异性抗体、HPV 45特异性抗体、HPV 52特异性抗体和/或HPV 58特异性抗体。

在一些实施方案中，所述HPV抗原原液是HPV 6型，所述HPV型别特异性抗体为HPV6特异性的HPV抗体，包含如SEQ ID NO：1所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：2所示的CDR-H2，如SEQID NO：3所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：4所示的CDR-L1，如SEQ ID NO：5所示的CDR-L2，和如SEQ ID NO：6所示的CDR-L3。

在一些实施方案中，所述HPV抗原原液是HPV11型，所述HPV型别特异性抗体为HPV11特异性的HPV抗体，包含如SEQ ID NO：7所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：8所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：9所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：10所示的CDR-L1，如SEQ ID NO：11所示的CDR-L2，和如SEQ ID NO：12所示的CDR-L3。

在一些实施方案中，所述HPV抗原原液是HPV16型，所述HPV型别特异性抗体为HPV16特异性的HPV抗体，包含如SEQ ID NO：13所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：14所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：15所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：16所示的CDR-L1，如SEQ ID NO：17所示的CDR-L2，和如SEQ ID NO：18所示的CDR-L3。

在一些实施方案中，所述HPV抗原原液是HPV18型，所述HPV型别特异性抗体为HPV18特异性的HPV抗体，包含如SEQ ID NO：19所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：20所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：21所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：22所示的CDR-L1，如SEQ ID NO：23所示的CDR-L2，和如SEQ ID NO：24所示的CDR-L3。

在一些实施方案中，所述HPV抗原原液是HPV31型，所述HPV型别特异性抗体为HPV31特异性的HPV抗体，包含如SEQ ID NO：25所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：26所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：27所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：28所示的CDR-L1，如SEQ ID NO：29所示的CDR-L2，和如SEQ ID NO：30所示的CDR-L3。

在一些实施方案中，所述HPV抗原原液是HPV33型，所述HPV型别特异性抗体为HPV33特异性的HPV抗体，包含如SEQ ID NO：31所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：32所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：33所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：34所示的CDR-L1，如SEQ ID NO：35所示的CDR-L2，和如SEQ ID NO：36所示的CDR-L3。

在一些实施方案中，所述HPV抗原原液是HPV45型，所述HPV型别特异性抗体为HPV45特异性的HPV抗体，包含如SEQ ID NO：37所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：38所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：39所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：40所示的CDR-L1，如SEQ ID NO：41所示的CDR-L2，和如SEQ ID NO：42所示的CDR-L3。

在一些实施方案中，所述HPV抗原原液是HPV52型，所述HPV型别特异性抗体为HPV52特异性的HPV抗体，包含如SEQ ID NO：43所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：44所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：45所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：46所示的CDR-L1，如SEQ ID NO：47所示的CDR-L2，和如SEQ ID NO：48所示的CDR-L3。

在一些实施方案中，所述HPV抗原原液是HPV58型，所述HPV型别特异性抗体为HPV58特异性的HPV抗体，包含如SEQ ID NO：49所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：50所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：51所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：52所示的CDR-L1，如SEQ ID NO：53所示的CDR-L2，和如SEQ ID NO：54所示的CDR-L3。

在一些实施方案中，所述HPV疫苗是HPV 9价疫苗，所述HPV型别特异性抗体为HPV6特异性抗体、HPV 11特异性抗体、HPV 16特异性抗体、HPV 18特异性抗体、HPV 31特异性抗体、HPV 33特异性抗体、HPV45特异性抗体、HPV 52特异性抗体和HPV 58特异性抗体：

所述HPV 6特异性抗体包含如SEQ ID NO：1所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：2所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：3所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：4所示的CDR-L1，如SEQ ID NO：5所示的CDR-L2，和如SEQ ID NO：6所示的CDR-L3；

所述HPV 11特异性抗体包含如SEQ ID NO：7所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：8所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：9所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：10所示的CDR-L1，如SEQ ID NO：11所示的CDR-L2，和如SEQ ID NO：12所示的CDR-L3；

所述HPV 16特异性抗体包含如SEQ ID NO：13所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：14所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：15所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：16所示的CDR-L1，如SEQ ID NO：17所示的CDR-L2，和如SEQ ID NO：18所示的CDR-L3；

所述HPV 18特异性抗体包含如SEQ ID NO：19所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：20所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：21所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：22所示的CDR-L1，如SEQ ID NO：23所示的CDR-L2，和如SEQ ID NO：24所示的CDR-L3；

所述HPV 31特异性抗体包含如SEQ ID NO：25所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：26所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：27所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：28所示的CDR-L1，如SEQ ID NO：29所示的CDR-L2，和如SEQ ID NO：30所示的CDR-L3；

所述HPV 33特异性抗体包含如SEQ ID NO：31所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：32所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：33所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：34所示的CDR-L1，如SEQ ID NO：35所示的CDR-L2，和如SEQ ID NO：36所示的CDR-L3；

所述HPV 45特异性抗体包含如SEQ ID NO：37所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：38所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：39所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：40所示的CDR-L1，如SEQ ID NO：41所示的CDR-L2，和如SEQ ID NO：42所示的CDR-L3；

所述HPV 52特异性抗体包含如SEQ ID NO：43所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：44所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：45所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：46所示的CDR-L1，如SEQ ID NO：47所示的CDR-L2，和如SEQ ID NO：48所示的CDR-L3；

所述HPV 58特异性抗体包含如SEQ ID NO：49所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：50所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：51所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：52所示的CDR-L1，如SEQ ID NO：53所示的CDR-L2，和如SEQ ID NO：54所示的CDR-L3。

在一些实施方案中，所述方法的可接受标准如下：

①四参数拟合曲线中，要求回归决定系数R²≥0.98，四参数曲线d-a≥2.0，样品曲线与参考品曲线的b值比值位于0.8-1.2之间；

②规定OD上下限的10％-75％值为线性区间：OD10％＝a+10％×(d–a)，OD75％＝a+75％×(d–a)，要求各样品稀释梯度范围内线性有效浓度点≥3个；样品各线性区间复孔间的CV≤30％；

③阴性对照孔OD值≤0.1，阳性对照孔OD值≥0.8。

如果上述标准中有一条不符合，试验无效。

在一些实施方案中，所述HPV型别特异性抗体选自HPV 6特异性抗体、HPV 11特异性抗体、HPV 16特异性抗体、HPV 18特异性抗体、HPV 31特异性抗体、HPV 33特异性抗体、HPV 45特异性抗体、HPV 52特异性抗体和/或HPV 58特异性抗体，其中，

在一些实施方案中，所述HPV 6特异性抗体包含如SEQ ID NO：55所示的VH和如SEQID NO：56所示的VL。

在一些实施方案中，所述HPV 11特异性抗体包含如SEQ ID NO：57所示的VH和如SEQ ID NO：58所示的VL。

在一些实施方案中，所述HPV 16特异性抗体包含如SEQ ID NO：59所示的VH和如SEQ ID NO：60所示的VL。

在一些实施方案中，所述HPV 18特异性抗体包含如SEQ ID NO：61所示的VH和如SEQ ID NO：62所示的VL。

在一些实施方案中，所述HPV 31特异性抗体包含如SEQ ID NO：63所示的VH和如SEQ ID NO：64所示的VL。

在一些实施方案中，所述HPV 33特异性抗体包含如SEQ ID NO：65所示的VH和如SEQ ID NO：66所示的VL。

在一些实施方案中，所述HPV 45特异性抗体包含如SEQ ID NO：67所示的VH和如SEQ ID NO：68所示的VL。

在一些实施方案中，所述HPV 52特异性抗体包含如SEQ ID NO：69所示的VH和如SEQ ID NO：70所示的VL。

在一些实施方案中，所述HPV 58特异性抗体包含如SEQ ID NO：71所示的VH和如SEQ ID NO：72所示的VL。

在一些实施方案中，所述HPV型别特异性抗体包含如：(1)SEQ ID NO：93所示的重链恒定区，和(2)如SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92任一所示的轻链恒定区。

一种多核苷酸，其编码本发明的型别特异性抗体。在一些实施方案中，所述多核苷酸，其选自：(1)SEQ ID NO：73和74；(2)SEQ ID NO：75和76；(3)SEQ ID NO：77和78；(4)SEQID NO：79和80；(5)SEQ ID NO：81和82；(6)SEQ ID NO：83和84；(7)SEQ ID NO：85和86；(8)SEQ ID NO：87和88；(9)SEQ ID NO：89和90。

在一些实施方案中，所述方法为HPV疫苗体外相对效力检测方法，还进一步包括解吸附的步骤。

在一些实施方案中，所述检测抗体是酶标记的检测抗体。在一些实施方案中，所述酶标记的检测抗体是指辣根过氧化酶(Horseradish Peroxidase，HRP)、碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase，AKP)、β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase)、葡萄糖氧化酶(GlucoseOxidase，GOD)、酸性磷酸酶标记的检测抗体。在一些实施方案中，所述酶标记的检测抗体是辣根过氧化酶标记的HPV型别特异性抗体。在一些实施方案中，所述酶标记的检测抗体是辣根过氧化酶标记的HPV 6特异性抗体。在一些实施方案中，所述酶标记的检测抗体是辣根过氧化酶标记的HPV 11特异性抗体。在一些实施方案中，所述酶标记的检测抗体是辣根过氧化酶标记的HPV 16特异性抗体。在一些实施方案中，所述酶标记的检测抗体是辣根过氧化酶标记的HPV 18特异性抗体。在一些实施方案中，所述酶标记的检测抗体是辣根过氧化酶标记的HPV 31特异性抗体。在一些实施方案中，所述酶标记的检测抗体是辣根过氧化酶标记的HPV 33特异性抗体。在一些实施方案中，所述酶标记的检测抗体是辣根过氧化酶标记的HPV 45特异性抗体。在一些实施方案中，所述酶标记的检测抗体是辣根过氧化酶标记的HPV 52特异性抗体。在一些实施方案中，所述酶标记的检测抗体是辣根过氧化酶标记的HPV58特异性抗体。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包括样品稀释液、酶标抗体稀释液、显色液、终止液和洗涤液。

在一些实施方案中，所述检测方法具体包括：

(1)平衡，将所有试剂平衡至室温；

(2)配液，将洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释至使用浓度；

(3)样品处理，对标准品以及待测样品进行预稀释，HPV6预稀释后Sa01浓度为5000-20000ng/mL，HPV11预稀释后Sa01浓度为10000-20000ng/mL，HPV16预稀释后Sa01浓度为2500-10000ng/mL，HPV18预稀释后Sa01浓度为5000-20000ng/mL，HPV31预稀释后Sa01浓度为5000-20000ng/mL，HPV33预稀释后Sa01浓度为5000-20000ng/mL，HPV45预稀释后Sa01浓度为5000-20000ng/mL，HPV52预稀释后Sa01浓度为5000-20000ng/mL，HPV58预稀释后Sa01浓度为5000-20000ng/mL(待测样品标注的浓度视为初始浓度，稀释至前述目标浓度)，再2倍或3倍比系列稀释，共6-11个稀释度；

(4)加样，在酶标板相应孔中加入稀释后的样品，以及阴阳性对照；

(5)温育，37℃恒温孵育箱孵育；

(6)洗涤，孵育完成后，小心揭去封板膜，弃掉孔内液体，加入稀释后洗涤液，洗板；

(7)加酶，用酶标抗体稀释液将检测抗体稀释至使用浓度，每孔加入稀释后的检测抗体；

(8)温育，37℃恒温孵育箱孵育；

(9)洗涤，孵育完成后，小心揭去封板膜，弃掉孔内液体，加入稀释后洗涤液，洗板；

(10)显色，每孔加入显色液，用封板膜封板后37℃恒温孵育箱避光孵育；

(11)终止/读值，揭去封板膜，每孔加入终止液，混匀，读值(设置为620nm波长，并从450nm处的读数中减去620nm处的读数以校正板中的光学缺陷)；(12)数据处理，根据抗原浓度和OD值拟合四参数曲线Y＝(d-a)/(1+(X/c)^b)+a，其中a为渐近线下限，b为线性区间直线斜率，c为曲线50％反应点(a和d之间)(表示为浓度)，d为渐近线上限，Y为OD值，X为抗原浓度。

在一些实施方案中，所述检测方法还包括：(13)计算体外相对效力，体外相对效力＝待测样品的EC50/标准品的EC50。

本领域技术人员能够理解，HPV型别特异性抗体为与待测疫苗或抗原原液型别对应的。例如，当待测疫苗或抗原原液为HPV 6型时，所述的HPV型别特异性抗体为HPV 6特异性抗体；当待测疫苗或抗原原液为HPV 11型时，所述的HPV型别特异性抗体为HPV 11特异性抗体；待测疫苗为HPV 6、HPV162价时，所述的HPV型别特异性抗体为HPV 6特异性抗体、HPV16特异性抗体；待测疫苗为HPV 6、HPV11、HPV16、HPV184价时，所述的HPV型别特异性抗体为HPV 6特异性抗体、HPV11特异性抗体、HPV16特异性抗体、HPV18特异性抗体；待测疫苗为HPV 6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV589价时，所述的HPV型别特异性抗体为HPV 6特异性抗体、HPV11特异性抗体、HPV16特异性抗体、HPV18特异性抗体、HPV31特异性抗体、HPV33特异性抗体、HPV45特异性抗体、HPV52特异性抗体、HPV58特异性抗体。

本领域技术人员能够理解，当待测样品为多价疫苗时(例如9价)，分别采用所含HPV抗原型别对应的检测抗体进行检测。例如，当待测样品为HPV 6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV589价疫苗时，分别采用HPV 6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV58型别特异性的检测抗体进行检测。本发明的ELISA检测试剂盒可以是检测单一型别HPV抗原的试剂盒，例如HPV 6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV58的试剂盒；也可以是检测多价疫苗的试剂盒，例如检测HPV 6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV589价疫苗的试剂盒，试剂盒中包含9种检测抗体。

本发明的方法准确度高、精密度好、专属性高，提升了HPV疫苗质量评价的标准化水平，为推动高质量HPV疫苗的研发奠定基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1显示本发明检测方法所用的酶标板布局例示图；

图2A、图2B、图2C、图2D、图2E、图2F、图2G、图2H、图2I分别显示厂家1的HPV 6、HPV11、HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 45、HPV 52、HPV 58抗原原液检测结果；

图3A、图3B、图3C、图3D、图3E、图3F、图3G、图3H、图3I分别显示HPV 6、HPV 11、HPV16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 45、HPV 52、HPV 58九型VLP理论对数值和效价理论对数值的直线回归方程；

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

在本发明中，从14例完成HPV九价疫苗接种一个月后的成人志愿者采集外周血，通过密度梯度离心法获得上层的血浆和中间的PBMC。用荧光标记的HPV 6、11、16、18、31、33、45、52和58型L1蛋白通过流式分选从PBMC中分离出与上述9种型别蛋白特异性结合的记忆B细胞，并利用巢式PCR获得可转染的具有表达活性的PCR片段，转染CHO细胞进行表达，得到含有分泌抗体的细胞上清液，通过ELISA进行结合活性筛选，获得了2475株结合阳性克隆，其中90株克隆与HPV6型L1蛋白特异性结合，181株克隆与HPV11型L1蛋白特异性结合，130株克隆与HPV16型L1蛋白特异性结合，97株克隆与HPV18型L1蛋白特异性结合，94株克隆与HPV31型L1蛋白特异性结合，87株克隆与HPV33型L1蛋白特异性结合，88株克隆与HPV45型L1蛋白特异性结合，90株克隆与HPV52型L1蛋白特异性结合，79株克隆与HPV58型L1蛋白特异性结合；281株克隆与至少两种型别L1蛋白均结合。根据细胞上清液的结合和假病毒中和结果，以上10种类别抗体分别构建25株、20株、35株、44株、42株、37株、26株、40株、23株和63株重组抗体。综合各重组抗体与对应型别蛋白的结合活性以及与各型别假病毒的中和活性，最终10种类型抗体分别选择抗HPV6抗体F5-222，抗HPV11抗体F5-422，抗HPV16抗体F5-194，抗HPV18抗体F5-212、抗HPV31抗体F5-183、抗HPV33抗体F5-155、抗HPV45抗体F5-160、抗HPV52抗体F5-398、抗HPV58抗体F5-354。型特异抗体均特异性结合和中和该型别蛋白或假病毒，结合活性EC50均低于40ng/mL，中和活性IC50在0.25-51.60ng/mL之间。

表1.氨基酸序列和核酸序列的描述

实施例1：抗HPV抗体的制备

将抗体的轻、重链可变区的编码序列克隆到携带人IgG1恒定区编码序列的真核表达载体中，瞬时转染CHO细胞，进行分泌性表达，通过亲和纯化获得了纯度>90％的9个抗HPV抗体克隆，即F5-222、F5-422、F5-194、F5-212、F5-183、F5-155、F5-160、F5-398、F5-354。

抗体的VH、VL和CL的氨基酸序列显示于表1。

人IgG1恒定区的氨基酸序列：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV

HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK

SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE

DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG

KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC

LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW

QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

实施例2：抗HPV抗体的表征—通过ELISA表征抗原结合特异性

将分别用PBS稀释至2μg/mL的HPV 9型L1蛋白【HPV6(genbank号：UNG35082.1)、HPV11(genbank号：AAA46935.1)、HPV16(genbank号：QGC89586.1)、HPV18(genbank号：ACU01871.1)、HPV31(genbank号：OP900721.1)、HPV33(genbank号：WAN40740.1)、HPV45(genbank号：AAY86494.1)、HPV52(genbank号：BBD06702.1)和HPV58(genbank号：WAN40708.1)】以100μL/孔加入96孔酶标板(NEST，504201)，4℃包被过夜。去除溶液，用PBST清洗2次，并用封闭液(PBS+5％BSA)37℃封闭2小时。去除溶液，将用稀释液(PBS+5％BSA)稀释的抗体(浓度1μg/mL)以100μL/孔加入微孔板，37℃温育1小时。去除溶液，用PBST清洗3次，每孔加入100μL 1W倍稀释的小鼠抗人IgG Fc-HRP(Vazyme自产)，37℃温育1小时。去除溶液，用PBST清洗3次，每孔加入100μL显色底物TMB，37℃避光温育10分钟。去除溶液，用PBST清洗3次，每孔加入50μL 2M硫酸。在多功能酶标仪(Tecan，Spark)上测量450nm的OD值。结果如表2所示。

表2：抗HPV抗体的蛋白结合活性

结果表明，F5-222、F5-422、F5-194、F5-212、F5-183、F5-155、F5-160、F5-398、F5-354只与单一型别蛋白结合，具有特异性。

实施例3：ELISA法检测九价(6、11、16、18、31、33、45、52、58型)人乳头瘤病毒疫苗体外相对效力

材料准备

酶标板：取实施例1制备的非型别特异性抗体三种，用包被液(0.05M碳酸盐缓冲液)等比例添加三种抗体，即混合物总蛋白含量为2μg/ml，96孔酶标板中每孔加100μL，置2-8℃吸附24小时。空去所述包被液，采用包被用洗液(0.2mol/LPBST)进行洗板3次；

酶标试剂：5mg/ml的辣根过氧化物酶标记的F5-222、F5-422、F5-194、F5-212、F5-183、F5-155、F5-160、F5-398、F5-354；

酶标试剂稀释液：0.1mol/L PBS，0.05％吐温20，1％BSA，0.1％P300防腐剂

显色液：TMB显色液(英创生物科技，货号EL0001)

终止液：将1M硫酸加超纯水，制成浓度为2mol/L的溶液

样品稀释液：0.1mol/LPBS，0.05％吐温20，0.5％Casein，0.1％P300防腐剂

浓缩洗涤液：PBST:0.2mol/L，pH7.4的PBS中加入体积比为0.05％的吐温20

阳性对照稀释液：0.1mol/L PBS，0.05％吐温20，0.5％Casein，0.1％P300防腐剂

阴性对照：0.1mol/L PBS，0.05％吐温20，0.5％Casein，0.1％P300防腐剂

标准品：重组HPV6-L1蛋白、HPV11-L1蛋白、HPV16-L1蛋白、HPV18-L1蛋白、HPV31-L1蛋白、HPV33-L1蛋白、HPV45-L1蛋白、HPV52-L1蛋白、HPV58-L1蛋白(厂家1自制，E.coli)

待测样品：来自厂家1的抗原原液(HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV58抗原原液，各3批)。

实验方法

1、平衡：将所有试剂平衡至室温(至少30min)，冷冻样品混匀。

2、配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释。

3、样品处理：对标准品以及待测样品进行预稀释，HPV6预稀释后Sa01浓度为5000-10000ng/mL，HPV11预稀释后Sa01浓度为10000-20000ng/mL，HPV16预稀释后Sa01浓度为2500-10000ng/mL，HPV18预稀释后Sa01浓度为5000-20000ng/mL、HPV31预稀释后Sa01浓度为10000-20000ng/mL、HPV33预稀释后Sa01浓度为10000-20000ng/mL、HPV45预稀释后Sa01浓度为1000-20000ng/mL、HPV52预稀释后Sa01浓度为1000-10000ng/mL、HPV58预稀释后Sa01浓度为1000-10000ng/mL(待测样品标注的浓度视为初始浓度，稀释至前述目标浓度)，再2倍比系列稀释，共11个稀释度(01-11)，每个稀释度2个复孔。

4、加样：按附图1进行排板(每个型别一块对应的酶标板)，在相应孔中加入100μL稀释后的标准品或稀释后的对应的待测样品，以及阴阳性对照各4孔。如稀释后的HPV6型标准品浓度梯度为9.8-10000ng/mL，例示板布局如图1。

5、温育：用封板膜封板后，放入37℃恒温孵育箱孵育30min。

6、洗涤：孵育完成后，小心揭去封板膜，弃掉孔内液体，每孔加入至少300μL 1×洗涤液，静置30s后弃去洗涤液，连续洗板5次，最后一次尽量去除残留液体。

7、加酶：用酶标试剂稀释液将酶标试剂(100×)稀释至1×，每孔加入100μL酶标试剂。

8、温育：用封板膜封板后，放入37℃恒温孵育箱孵育30min。

9、重复步骤6。

10、显色：每孔加入100μL显色液，用封板膜封板后放入37℃恒温孵育箱避光孵育15min。

11、终止/读值：小心揭去封板膜，每孔加入50μL终止液，轻轻混匀，即可读值。设置为620nm波长，并从450nm处的读数中减去620nm处的读数(校正板中的光学缺陷)。

12、数据处理：用Soft Max 4.8版(Perkin Elmer多功能酶标仪自带软件)进行四参数曲线拟合。分析待测样品EC50与标准品EC50之间的差异，评价待测样品的体外相对效力，体外相对效力＝待测样品EC50/标准品EC50，结果见图2A、图2B、图2C、图2D、图2E、图2F、图2G、图2H、图2I。

四参数曲线拟合方程：Y＝(d-a)/(1+(X/c)^b)+a

a＝渐近线下限

b＝线性区间直线斜率

c＝曲线50％反应点(a和d之间)(表示为浓度)

d＝渐近线上限

Y＝OD值

X＝浓度

13、实验可接受标准：

③阴性对照孔OD值≤0.1，阳性对照孔OD值≥0.8。

实施例4：专属性

针对待测HPV单型别抗原中加入HPV不同型抗原加以研究，即考核混合九种HPV型别抗原，型特异检测抗体检测其余八种抗原效价的能力。通过计算测试浓度/理论浓度比值(％)即相对偏倚(％)，进行专属性评估。以30％为标准，九型试剂相对偏倚平均值满足此标准。

检测方法：用实施例3中厂家1的标准品及抗原原液，通过与实施例3基本相同的方法进行检测(不同之处在于每一种型别的抗原在加待测样品时，均加入等比例混合的HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV58抗原原液)。

HPV九型试剂检测专属性结果见表3-11。

表3 HPV6型专属性

表4 HPV11型专属性

表5 HPV16型专属性

表6 HPV18型专属性

表7 HPV31型专属性

表8 HPV33型专属性

表9 HPV45型专属性

表10 HPV52型专属性

表11 HPV58型专属性

实施例5：标准曲线与线性

可接受标准：以理论浓度值对数(横坐标)与浓度测定值对数(纵坐标)作图，采用最小二乘法进行线性回归。直线回归方程的相关系数应不低于0.98。对相对准确度，中间精密度和效价符合水平的浓度水平，该范围应至少涵盖浓度水平的80％-150％。

验证结果：因无HPV-VLP标准品，故采用疫苗厂家1抗原(实施例3的标准品重组HPV6-L1蛋白、HPV11-L1蛋白、HPV16-L1蛋白、HPV18-L1蛋白、HPV31-L1蛋白、HPV33-L1蛋白、HPV45-L1蛋白、HPV52-L1蛋白和HPV58-L1蛋白)，测定其质量浓度，梯度稀释后检测其OD信号，四参数拟合标曲回算质量浓度。每个稀释度实验重复两次，取其回算浓度平均值进行拟合。具体地，HPV6型标曲斜率为0.996，R²为0.9950；HPV11型标曲斜率为0.9448，R²为0.9980；HPV16型标曲斜率为0.9599，R²为0.9985；HPV18型标曲斜率为0.9885，R²为0.9990；HPV31型标曲斜率为0.9942，R²为0.9984；HPV33型标曲斜率为0.9935，R²为0.9988；HPV45型标曲斜率为0.9750，R²为0.9984；HPV52型标曲斜率为0.9649，R²为0.9987；HPV58型标曲斜率为1.008，R²为0.9990(图3A、图3B、图3C、图3D、图3E、图3F、图3G、图3H、图3I)。HPV6型、HPV11型、HPV16型、HPV33型线性范围5-2500ng/ml，HPV18型、HPV31型、HPV45型、HPV52线性范围5-5000ng/ml，HPV58型线性范围5-10000ng/ml，表明该方法具有良好的检测性能。

实施例6：相对准确度

可接受标准：每个效价水平相对效价测定值的相对偏倚应在±12％范围内；以效价理论值的对数(横坐标)对其相应的效价测定值的对数(纵坐标)作直线回归，回归方程的斜率应在范围内。

验证结果：按照《中国药典》2020版9401方法及“一、方法验证的基本要素”中相对准确度评价方法项下计算公式计算每个效价水平相对效价测定值的相对偏倚及其置信区间，结果见表12-20。相对偏倚均在±10％范围内。以效价理论值的对数(横坐标)对其相应的效价测定值的对数(纵坐标)作直线回归。

设置的五浓度质控，以OD1.0附近为100％效价浓度，计算相对的其他效价浓度，九型试剂中相对偏倚均平均值位于±10％区间，相对偏倚平均值均符合要求。HPV6型标曲斜率为0.9775，HPV11型标曲斜率为0.9455，HPV16型标曲斜率为0.9481，HPV16型标曲斜率为0.9985，HPV18型标曲斜率为0.9985，HPV31型标曲斜率为0.9758，HPV33型标曲斜率为0.9733，HPV45型标曲斜率为0.9946，HPV52型标曲斜率为1.028，HPV58型标曲斜率为1.008。

表12 HPV6型相对准确度

表13 HPV11型相对准确度

表14 HPV16型相对准确度

表15 HPV18型相对准确度

表16 HPV31型相对准确度

表17 HPV33型相对准确度

表18 HPV45型相对准确度

表19 HPV52型相对准确度

表20 HPV58型相对准确度

实施例7：中间精密度

可接受标准：每个效价水平相对效价测定值的几何变异系数(GCV，％)应不大于20％。

验证结果：按照药典2020版四部9401指导原则体外效价部分进行计算，相对效价测定方法的精密度一般用几何标准偏差(GSD)或几何变异系数(GCV，％)表示，采用方差分析法(ANONA)进行评价。比较每个效价水平相对效价测定值的几何标准偏差、几何变异系数及其置信上限是否符合要求，结果见表21-29。每个效价水平相对效价测定值的几何变异系数均小于20％。

九型试剂中九种型别测试均通过此标准。

表21 HPV6型中间精密度

表22 HPV11型中间精密度

表23 HPV16型中间精密度

表24 HPV18型中间精密度

表25 HPV31型中间精密度

表26 HPV33型中间精密度

表27 HPV45型中间精密度

表28 HPV52型中间精密度

表29 HPV58型中间精密度

Claims

1.一种HPV疫苗或HPV抗原原液体外相对效力检测方法，其特征在于，包括如下步骤：采用HPV非型别特异性抗体包被酶标板，加入待测样品孵育，洗板；加入酶标记HPV型别特异性抗体孵育，洗板；加入显色液，显色；加入终止液，测定OD值，

进一步包括根据抗原浓度和OD值拟合四参数曲线Y = （d-a）/（1 +（X/c）^b）+ a，其中a为渐近线下限，b为线性区间直线斜率，c为曲线50%反应点，d为渐近线上限，Y为OD值，X为抗原浓度，获得标准品和待测样品的EC50值，待测样品的体外相对效力=待测样品的EC50/标准品的EC50，

所述HPV型别特异性抗体为HPV 6特异性抗体、HPV 11特异性抗体、HPV 16特异性抗体、HPV 18特异性抗体、HPV31特异性抗体、HPV33特异性抗体、HPV45特异性抗体、HPV52特异性抗体和/或HPV58特异性抗体，

所述HPV 6特异性抗体包含如SEQ ID NO：1所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：2所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：3所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：4所示的CDR-L1，氨基酸序列为QAS的CDR-L2，和如SEQ ID NO：6所示的CDR-L3，

所述HPV 11特异性抗体包含如SEQ ID NO：7所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：8所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：9所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：10所示的CDR-L1，如SEQ ID NO：11所示的CDR-L2，和如SEQ ID NO：12所示的CDR-L3，

所述HPV 16特异性抗体包含如SEQ ID NO：13所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：14所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：15所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：16所示的CDR-L1，氨基酸序列为DAS的CDR-L2，和如SEQ ID NO：18所示的CDR-L3，

所述HPV 18特异性抗体包含如SEQ ID NO：19所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：20所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：21所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：22所示的CDR-L1，氨基酸序列为DAS的CDR-L2，和如SEQ ID NO：24所示的CDR-L3，

所述HPV 31特异性抗体包含如SEQ ID NO：25所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：26所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：27所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：28所示的CDR-L1，氨基酸序列为RDT的CDR-L2，和如SEQ ID NO：30所示的CDR-L3，

所述HPV 33特异性抗体包含如SEQ ID NO：31所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：32所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：33所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：34所示的CDR-L1，氨基酸序列为DDS的CDR-L2，和如SEQ ID NO：36所示的CDR-L3，

所述HPV 45特异性抗体包含如SEQ ID NO：37所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：38所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：39所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：40所示的CDR-L1，氨基酸序列为GNT的CDR-L2，和如SEQ ID NO：42所示的CDR-L3，

所述HPV 52特异性抗体包含如SEQ ID NO：43所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：44所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：45所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：46所示的CDR-L1，氨基酸序列为GAS的CDR-L2，和如SEQ ID NO：48所示的CDR-L3，

所述HPV 58特异性抗体包含如SEQ ID NO：49所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：50所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：51所示的CDR-H3，如SEQ ID NO：52所示的CDR-L1，氨基酸序列为DVN的CDR-L2，和如SEQ ID NO：54所示的CDR-L3。

2.一种9价HPV疫苗或HPV抗原原液体外相对效力检测方法，其特征在于，

包括如下步骤：向HPV非型别特异性抗体包被的酶标板加入待测样品，孵育，洗板；加入酶标记HPV型别特异性抗体孵育，洗板；加入显色液，显色；加入终止液，测定OD值；根据抗原浓度和OD值拟合四参数曲线Y = （d-a）/（1 +（X/c）^b）+ a，其中a为渐近线下限，b为线性区间直线斜率，c为曲线50%反应点，d为渐近线上限，Y为OD值，X为抗原浓度，获得标准品和待测样品的EC50值，待测样品的体外相对效力=待测样品的EC50/标准品的EC50；

所述HPV型别特异性抗体包含HPV 6特异性抗体、HPV 11特异性抗体、HPV 16特异性抗体、HPV 18特异性抗体、HPV 31特异性抗体、HPV 33特异性抗体、HPV 45特异性抗体、HPV 52特异性抗体和HPV 58特异性抗体，

3.根据权利要求1所述的方法，其中酶标板为预制，向HPV非型别特异性抗体包被的预制酶标板加入待测样品孵育，所述检测方法不包括采用HPV非型别特异性抗体包被板的步骤。

4.根据权利要求1或权利要求2所述的检测方法，其中，

所述HPV 6特异性抗体包含如SEQ ID NO：55所示的VH和如SEQ ID NO：56所示的VL；

所述HPV 11特异性抗体包含如SEQ ID NO：57所示的VH和如SEQ ID NO：58所示的VL；

所述HPV 16特异性抗体包含如SEQ ID NO：59所示的VH和如SEQ ID NO：60所示的VL；

所述HPV 18特异性抗体包含如SEQ ID NO：61所示的VH和如SEQ ID NO：62所示的VL；

所述HPV 31特异性抗体包含如SEQ ID NO：63所示的VH和如SEQ ID NO：64所示的VL；

所述HPV 33特异性抗体包含如SEQ ID NO：65所示的VH和如SEQ ID NO：66所示的VL；

所述HPV 45特异性抗体包含如SEQ ID NO：67所示的VH和如SEQ ID NO：68所示的VL；

所述HPV 52特异性抗体包含如SEQ ID NO：69所示的VH和如SEQ ID NO：70所示的VL；

所述HPV 58特异性抗体包含如SEQ ID NO：71所示的VH和如SEQ ID NO：72所示的VL。

5.根据权利要求1或2所述检测方法，所述HPV型别特异性抗体包含如：(1)SEQ ID NO：93所示的重链恒定区，和(2)如SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92任一所示的轻链恒定区。

6.根据权利要求1或2所述的检测方法，其中酶标记HPV型别特异性抗体选自辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶或酸性磷酸酶标记的HPV型别特异性抗体。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其中酶标记HPV型别特异性抗体为辣根过氧化酶标记的HPV型别特异性抗体。

8.根据权利要求1或2所述的方法，具体包括：

（1）平衡，将所有试剂平衡至室温；

（2）配液，将洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释至使用浓度；

（3）样品处理，对标准品以及待测样品进行预稀释，HPV6预稀释后浓度为5000-20000ng/mL，HPV11预稀释后浓度为10000-20000ng/mL，HPV16预稀释后浓度为2500-10000ng/mL，HPV18预稀释后浓度为5000-20000ng/mL，HPV31预稀释后浓度为5000-20000ng/mL，HPV33预稀释后浓度为5000-20000ng/mL，HPV45预稀释后浓度为5000-20000ng/mL，HPV52预稀释后浓度为5000-20000ng/mL，HPV58预稀释后浓度为5000-20000ng/mL，再2倍比系列稀释，共6-11个稀释度；

（4）加样，在酶标板相应孔中加入稀释后的样品，以及阴阳性对照；

（5）温育，37℃恒温孵育箱孵育；

（6）洗涤，孵育完成后，小心揭去封板膜，弃掉孔内液体，加入稀释后洗涤液，洗板；

（7）加酶，用酶标抗体稀释液将检测抗体稀释至使用浓度，每孔加入稀释后的检测抗体；

（8）温育，37℃恒温孵育箱孵育；

（9）洗涤，孵育完成后，小心揭去封板膜，弃掉孔内液体，加入稀释后洗涤液，洗板；

（10）显色，每孔加入显色液，用封板膜封板后37℃恒温孵育箱避光孵育；

（11）终止/读值，揭去封板膜，每孔加入终止液，混匀，读值，设置为620 nm波长，并从450 nm处的读数中减去620 nm处的读数以校正板中的光学缺陷；

（12）数据处理，根据抗原浓度和OD值拟合四参数曲线Y =（d-a）/（1 +（X/c）^b）+ a，其中a为渐近线下限，b为线性区间直线斜率，c为曲线50%反应点，d为渐近线上限，Y为OD值，X为抗原浓度。

9.根据权利要求1或2所述方法，其标准如下：

②规定OD上下限的10%-75%值为线性区间：OD10% =a +10%×（d–a），OD75% = a +75%×（d–a），要求各样品稀释梯度范围内线性有效浓度点≥3个；样品各线性区间复孔间的CV≤30%；

③阴性对照孔OD值≤0.1，阳性对照孔OD值≥0.8。