CN121488043A

CN121488043A - 一种利用Cas切口酶制备单链DNA的方法

Info

Publication number: CN121488043A
Application number: CN202480040357.4A
Authority: CN
Inventors: 周帆; 张璐; 叶露萌; 李竑
Original assignee: Nanjing Jinsirui Science and Technology Biology Corp
Current assignee: Nanjing Jinsirui Science and Technology Biology Corp
Priority date: 2023-06-21
Filing date: 2024-06-21
Publication date: 2026-02-06
Also published as: EP4733401A1; WO2024260438A1

Abstract

一种利用Cas切口酶制备单链DNA的方法，所述方法解决了传统缺刻酶使用时酶切位点受限的问题，并且可以一个酶切体系中使用多个gRNA，进行多点缺刻，提高质粒缺刻效率的同时，也有效的提高了后续核酸外切酶的消化效率。

Description

一种利用Cas切口酶制备单链DNA的方法

相关申请的交叉引用

本发明要求2023年06月21日向中国国家知识产权局提交的专利申请号为2023107431619、发明名称为“一种利用Cas切口酶制备单链DNA的方法”的在先申请的优先权。该件在先申请的全文通过引用的方式结合于本发明中。

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及单链DNA尤其是环状单链DNA的制备方法、相关产物及试剂盒。

背景技术

CRISPR/Cas系统是现代生物科学领域的一个非常重要的角色，它的出现彻底改变了基因组编辑技术。基于同源定向修复(homology directed repair,HDR)途径的基因敲入就是其重要应用之一。模板依赖的方式使得合适的HDR模板决定了它的基因敲入成败与效率。常用的双链DNA(dsNDA)模板就存在效率低、脱靶率高、细胞毒性大的问题。单链DNA(ssDNA)被证实是基于HDR的基因敲入实验中理想的敲入模板。ssDNA作为敲入模板，表现出了优越的编辑效率、较小的细胞毒性、更低的脱靶效应等优点。而相较于线性单链DNA(lssDNA)，环状单链DNA(cssDNA)又具有更高的稳定性，可以有效且稳定的插入目的片段，靶向率高，cssDNA供体在目标位点的模板驱动修复中也胜过lssDNA供体。

目前，ssDNA的合成方法可分为化学合成法、基于细菌的合成法和酶合成法(参见：doi：10.3390/genes11020116；US10940171B2)。化学合成法对ssDNA长度有限制，成本昂贵，并且需要额外的纯化方法。基于噬菌体的合成法可以在生物反应器中大量生产任意序列的ssDNA，但该方法耗时长，不适合进行快速原型制作(参见：US20200362332)。酶合成法相对是一种低成本、快速的ssDNA合成方法，该方法对合成序列长度的限制小，可以有效的合成更长的序列。

针对传统的cssDNA酶合成法，一种方法是先获得lssDNA，再以连接酶环化获得cssDNA(参见：EP2610352B1；CN107002292A。另一种方法是以缺刻酶(例如Nb.BtsI、Nt.BspQI、Nb.Bpu10I)将双链质粒中的非目标链打上缺口，再以核酸外切酶将断裂的DNA链消化，最终获得目标cssDNA(Zhang et al.,Engineering BspQI nicking enzymes and application of N.BspQI in DNA labeling and production of single-strand DNA.Protein Expr Purif.2010Feb；69(2):226-34.doi:10.1016/j.pep.2009.09.003；WO 2023069948；WO1995009915A1)。

虽然本领域已经存在多种制备单链DNA的方法，但这些方法具有成本昂贵、耗时长、或较高的dsDNA残留污染等缺点，因此本领域仍然需要简单易操作的方法来制备高纯度的单链DNA。

发明内容

本发明第一方面提供一种制备环状单链DNA的方法，包括如下步骤：

1)提供模板DNA，所述模板DNA为包含目标链和互补链的环状双链DNA；

2)向模板DNA中加入gRNA和Cas切口酶，所述gRNA和互补链的部分区域互补配对，其中Cas切口酶在gRNA的引导下在互补链上形成一个或多个缺口；

3)使用核酸外切酶对含有缺口的互补链进行消化，获得含有环状单链DNA形式的目标链的消化产物。

一个实施方式中，gRNA为sgRNA。另一个具体实施方式中，所述Cas切口酶是Cas9切口酶，例如所述Cas9切口酶是选自下组的一个或多个：D10A，H840A，N863A、和N854A。

一个实施方式中，所述核酸外切酶是选自下组的一个或多个：核酸外切酶T7、核酸外切酶ExoIII、和Lambda Exo。

另一个实施方式中，所述模板DNA是质粒。在更具体的实施方式中，所述质粒包含复制起始位点和目的基因，并且不包含筛选标签基因。所述复制起始位点例如选自pUC复制起始位点、pMB1及其衍生物复制起始位点、ColE1复制起始位点和R6Kγ复制起始位点。

一个实施方式中，所述一个或多个缺口是大于或等于两个缺口。

另一个实施方式中，所述模板DNA的序列长度及缺口的数量比例小于10kb 1个缺口，优选小于5kb 1个缺刻位点，进一步优选小于3kb 1个缺刻位点，进一步优选小于2kb 1个缺刻位点，最优选小于1kb 1个缺刻位点。

一个实施方式中，所述Cas切口酶和gRNA以及模板DNA的摩尔比为3：3：1-12：12：1，优选4：4：1-11：11：1，最优选5：5：1-10：10：1。

一个实施方式中，在步骤3)之后还包括如下步骤：对所述消化产物进行纯化，获得高纯度的环状单链DNA。

本发明第二方面提供一种制备线性单链DNA的方法，包括如下步骤：对根据本发明上述第一方面所述的方法获得的环状单链(css)DNA进行切割以获得线性单链(lss)DNA。

本发明第三方面提供一种用于制备环状或线性单链DNA的试剂盒，含有Cas切口酶和核酸外切酶。

一个实施方式中，所述Cas切口酶是Cas9切口酶，例如所述Cas9切口酶是选自下组的一个或多个：D10A，H840A，N863A、和N854A。

另一个实施方式中，所述试剂盒还含有阳性参照模板DNA和阳性gRNA。再一个实施方式中，所述试剂盒还含有模板DNA和gRNA。另一个实施方式中，所述试剂盒还含有缓冲液。另一个实施方式中，所述试剂盒还含有用于对环状或线性单链DNA进行纯化的试剂。

本发明第四方面提供一种环状或线性单链DNA，包含复制起始位点和目的基因，并且不包含筛选标签基因。一个实施方式中，所述复制起始位点选自pUC复制起始位点、pMB1及其衍生物复制起始位点、ColE1复制起始位点和R6Kγ复制起始位点。

本发明第五方面提供一种组合物，包含如本发明第四方面所述的环状或线性单链DNA。一个实施方式中，所述组合物为药物组合物。

本发明第六方面提供根据本发明第一方面所述方法获得的含有环状单链DNA形式的目标链的消化产物。

本发明第七方面提供如本发明第四方面所述的环状或线性单链DNA，或如本发明第五方面所述的组合物，或如本发明第六方面所述的消化产物在基因治疗、基因重组、DNA文库构建、DNA折纸或DNA存储元件中的应用。

有益的技术效果

在DNA序列中，5’-NGG-3’或其他PAM序列是普遍存在的，可根据实验需求，设计多个gRNA序列对双链DNA进行缺刻，这解决了传统缺刻酶使用时酶切位点受限的问题。另外，一个酶切体系中使用多个gRNA，进行多点缺刻，提高缺刻效率的同时，也有效的提高了后续核酸外切酶的消化效率。因而，使用本发明的方法制备环状单链或线性单链DNA，简单易操作、高效、可得到高纯度的单链DNA。

附图说明

图1：闭合环状单链DNA(cssDNA)模板质粒(图1a：Nt.BspQI缺刻位点；图1b：sgRNA缺刻位点)

图2：Nt.BspQI缺刻酶酶切产物

图3：Cas9_Nickase缺刻酶酶切产物

图4：核酸外切酶ExoIII消化处理Nt.BspQI缺刻质粒结果

图5：核酸外切酶ExoIII消化处理Cas9_Nickase缺刻质粒结果

图6：模板质粒缺刻结果

图7：ExoIII消化2h结果

图8：Nt.BspQI组ExoIII消化7h结果

图9：闭合环状单链DNA(cssDNA)回收产物纯度对比结果

图10：不同sgRNA个数的闭合环状单链DNA(cssDNA)制备效率

具体实施方式

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。出于方便理解本文提供的技术方案的目的，以下对部分技术术语进行简要说明。

技术术语

ssDNA

单链DNA(ssDNA)

lssDNA

线性单链DNA(lssDNA)

cssDNA

闭合环状单链DNA(cssDNA)

本申请中，“模板DNA“是指作为制备单链DNA的起始材料的环状双链DNA。类似地，“模板质粒”是指作为制备单链DNA的起始材料的质粒。模板DNA或模板质粒为环状双链，包含目标链和互补链。

“环状”，例如“环状双链DNA”、“环状单链DNA”，是指所述的DNA是共价闭合的。

模板DNA中的“目标链”和“互补链”分别是指意于保留(即作为产物)的那条DNA链，以及要进行缺刻的DNA链。

本申请上下文中，术语“切口酶”和“缺刻酶”(Nicking endonuclease，也称为NEases或nickases)可互换使用。切口酶识别双链DNA中的特定位点，但与核酸酶不同，切口酶仅在相对于识别位点的某个位置上断裂DNA双链中的一条链(doi:10.3390/biom11101420)。以Cas9蛋白为例，Cas9核酸酶断裂DNA双链中的两条链，而Cas9切口酶是Cas9核酸酶的突变体(突变两个或更多个催化性结构域中的一个或多个使其失活，例如通过向HNH结构域引入H840A或者向Ruv C结构域引入D10A突变)，这种突变体保留了基于gRNA特异性而结合DNA的能力，但仅能够切割(或称为缺刻(nicking))DNA双链中的一条链，从而产生单链缺口(nick)(DOI:10.1101/gr.162339.113)。对多种Cas切口酶的描述请另参见WO2023060256A1。

本发明的发明人经过研究发现，当前的技术中使用Nb.BtsI等缺刻酶将双链质粒中的非目标链打上缺口、再以核酸外切酶将断裂的DNA链消化、最终获得目标cssDNA的方法虽然理论上是一种简单、方便的方法，但实际操作中该方法存在显著的缺陷，例如，该方法对酶切位点的要求非常高，为了后续仅对dsDNA的非目标链进行缺刻及消化，需要该非目标链上存在至少一个目标酶切位点(不是所有dsDNA片段都可以轻易满足这个条件)，而且这些目标酶切位点均位于该非目标链上、而完全不存在于目标链上。由于上述缺点，该方法经常需要对dsDNA序列加以修饰，去除多余酶切位点，仅保留目标位置的酶切位点，该过程延长了生产周期。由于缺刻效率、消化效率低下，导致终产物中存在较高的dsDNA残留污染，影响下游实验。

为了克服上述以及单链RNA生产中的其他缺陷，本发明使用Cas切口酶体系(即Cas切口酶以及与其配合的gRNA)来缺刻(nicking)环状双链DNA模板中的一条链，在该链上产生一个或多个缺口。Cas切口酶是Cas核酸酶的突变形式，只能切割双链DNA中的一条链。以Cas9_D10A Cas切口酶为例，Cas9_D10A Nickase是Cas9核酸酶的突变形式，它使Cas9核酸酶的一个活性域失活，因此它只能依赖引导RNA识别PAM位点、并在与引导RNA互补的单链DNA上产生单链切割。其中PAM位点是位于靶DNA 3’末端的一个短序列(5’-NGG-3’)，引导RNA识别并结合该序列的互补链，随后Cas9_D10A Nickase剪切被识别的靶点DNA。在DNA序列中PAM位点(例如5’-NGG-3’)是普遍存在的，因此可根据需求，在多个位点，3’末端含有PAM序列(例如GG序列)的上游选择20nt或其他合适长度作为gRNA序列，这解决了传统缺刻酶使用时酶切位点受限的问题。另外，一个酶切体系中使用多个sgRNA，进行多点缺刻，提高缺刻效率的同时，也有效的提高了后续核酸外切酶的消化效率。

本发明提供一种制备环状单链DNA的方法，包括如下步骤：

1)提供(包括但不限于，提供、获得、产生)模板DNA，所述模板DNA为包含目标链和互补链的环状双链DNA；

本发明所属领域的技术人员可以理解，本发明中使用的gRNA可以是sgRNA(single guide RNA)即单分子形式的引导RNA，也可以是双分子形式的引导RNA。本申请中提及gRNA时，在上下文允许的情况下，理解为也明确提及了sgRNA。一个优选实施方式中，所述gRNA为sgRNA。根据模板序列设计gRNA包括sgRNA的方法，例如其优选长度、序列等等，是本领域已知的。

本发明的方法中，优选针对模板DNA序列设计一个或多个gRNA，优选多个,从而这些gRNA可以在模板DNA上找到多个缺刻位点，产生多个切口。优选实施方式中，步骤2)中向模板DNA中加入多个gRNA，例如2-10个gRNA，或2-5个gRNA，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个gRNA。Cas切口酶的数目也可以是一种或多种，例如1、2、3、或4种。

本发明中使用的Cas切口酶可以是任何具有切口酶功能的Cas蛋白，即其能够被gRNA引导至特定的(即与gRNA互补配对的)目标DNA序列并能够行使切口酶功能切断并且仅切断双链DNA中的一条链。优选实施方式中，所述Cas切口酶是Cas9切口酶。本发明中使用的Cas9切口酶可以是任何具有切口酶功能的Cas9蛋白，例如，包括但不限于在以下氨基酸位点中的一个或多个进行突变：D10,G12,G17,E762,H840,N854,N863,H982,H983,A984,D986,和A987，例如包括但不限于以下Cas9切口酶：D10A，H840A，N863A、和N854A。多种切口酶可以单独或组合使用。

Cas蛋白的非限制性实例包括：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8，Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Cas12、Cas13、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同系物、或其功能性变体(例如经过密码子优化)或修饰形式。在一些实施方式中，Cas9可以是来自化脓链球菌或肺炎链球菌的Cas9。

在一些实施方式中，所述Cas切口酶是Cas12切口酶(例如Cas12a切口酶)或Cas13切口酶。

本发明中可以使用任何合适的核酸外切酶对经过缺刻产生缺口的DNA链进行酶切消化，例如，包括但不限于以下核酸外切酶：核酸外切酶T7、核酸外切酶ExoIII、和Lambda Exo。由于核酸外切酶的特性，其仅仅或主要作用于具有游离的5’或3’端的DNA，而不会或很少作用于没有游离的5’或3’端的DNA(例如共价闭合的环状DNA)，因此核酸外切酶能够将模板DNA双链中经过缺刻具有缺口的那条DNA链消化降解，而不影响或不显著影响另一条没有缺口的、共价闭合的环状DNA链。

一个优选实施方式中，所述模板DNA是质粒，即质粒双链DNA。所述质粒可以是常规质粒，例如包括骨架序列，启动子、复制起始位点、筛选标签基因(例如抗生素抗性基因或其他筛选标签基因)、多克隆位点、目的基因序列等。

一个优选的实施方式中，所述模板质粒包含复制起始位点和目的基因，并且不包含筛选标签基因。所述复制起始位点例如选自pUC复制起始位点、pMB1及其衍生物复制起始位点、ColE1复制起始位点和R6Kγ复制起始位点。另一个优选的实施方式中，所述质粒仅包含复制起始位点和目的基因，并且不包含筛选标签基因，即，所述质粒由复制起始位点和目的基因组成，不包含筛选标签基因。另一个优选的实施方式中，所述质粒基本由复制起始位点和目的基因组成，不包含筛选标签基因。所述质粒的制备方式可参见PCT/CN2021/133141，该申请全文引用作为参考。

一个实施方式中，所述一个或多个缺口是大于或等于两个缺口，例如2-10个，或2-5个缺口，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个缺口。另一个实施方式中，所述模板DNA的序列长度及缺口的数量比例小于10kb 1个缺口，优选小于5kb 1个缺口，进一步优选小于3kb 1个缺口，进一步优选小于2kb 1个缺口，最优选小于1kb 1个缺口。

一个实施方式中，所述Cas切口酶例如Cas9切口酶和gRNA以及模板DNA的摩尔比为3：3：1-12：12：1，优选4：4：1-11：11：1，最优选5：5：1-10：10：1。

一个优选实施方式中，在步骤3)之后还包括如下步骤：对所述消化产物进行纯化，获得高纯度环状单链DNA。高纯度是指不含、或基本不含杂质，或不含显著量的杂质，例如按质量(mass)计算，纯化后得到的终产物中至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％、或100％的总DNA是环状单链DNA。在使用核酸外切酶对含有缺口的互补链进行消化之后，可以用合适的纯化方法去除消化产物中除环状单链DNA之外的杂质，所述纯化方法包括但不限于，醇沉法、柱回收法、磁珠回收法、苯酚/氯仿/异戊醇回收法等等。

本发明还提供用本发明上述方法获得的含有环状单链DNA形式的目标链的消化产物。所述消化产物含有环状单链DNA、缺刻的DNA链经外切酶消化后的产物、gRNA和Cas切口酶。

本发明还提供一种制备线性单链DNA的方法，包括如下步骤：对根据本发明方法获得的环状单链(css)DNA进行切割以获得线性单链(lss)DNA。该步骤可以使用本领域所知的用于对环状单链DNA进行切割以获得线性单链DNA的任何方法。优选实施方式中，在选定的位点进行切割，例如使用切割单链DNA的Cas9系统进行定点切割。

本发明还提供一种用于制备环状或线性单链DNA的试剂盒，含有Cas切口酶和核酸外切酶。一个实施方式中，所述试剂盒还含有阳性参照模板DNA和阳性gRNA，用于确定试剂盒所含组分可以按照预定方式(例如试剂盒带有的说明书中描述的方式)产生环状或线性单链DNA。再一个实施方式中，所述试剂盒还含有模板DNA和gRNA。另一个实施方式中，所述试剂盒还含有缓冲液，以有利于缺刻反应和/或核酸外切酶消化反应的进行。另一个实施方式中，所述试剂盒还含有用于对环状或线性单链DNA进行纯化的试剂。

本发明还提供一种环状或线性单链DNA，包含复制起始位点和目的基因，并且不包含筛选标签基因。一个实施方式中，所述复制起始位点选自pUC复制起始位点、pMB1及其衍生物复制起始位点、ColE1复制起始位点和R6Kγ复制起始位点。另一个优选的实施方式中，所述质粒仅包含复制起始位点和目的基因，并且不包含筛选标签基因，即，所述质粒由复制起始位点和目的基因组成，不包含筛选标签基因。另一个优选的实施方式中，所述质粒基本由复制起始位点和目的基因组成，不包含筛选标签基因。所述质粒的制备方式可参见PCT/CN2021/133141，该申请全文引用作为参考。

本发明还提供一种组合物，包含如上所述的环状或线性单链DNA。一个实施方式中，所述组合物为药物组合物，所述药物组合物还包含药剂学上常用的赋形剂，例如，包括但不限于，填充剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、色素等等。

根据本发明的环状或线性单链DNA、含有环状单链DNA的消化产物、以及含有环状或线性单链DNA的组合物可合适地应用于基因治疗、基因重组(例如基因敲入)、DNA文库(例如DNA筛选文库)的构建、DNA折纸或DNA存储元件。

本申请引用的所有参考文献均通过引用并入本文，就如同每个单独的文献被单独地指明通过引用而并入本文。

下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步详细的说明。除非另有说明，下文描述的实施例的方法和材料均为可以通过市场购买获得的常规产品。本发明所属领域的技术人员将会理解，下文描述的方法和材料，仅是示例性的，而不应视为以任何方式限定本发明的范围。本发明的范围仅由权利要求限定。

通用实验方法

(1)构建可用于制备cssDNA的模板质粒，根据该质粒的全长序列设计并合成特异性的sgRNA。sgRNA引导Cas9_Nickase缺刻酶对模板质粒进行多位点的定点缺刻。作为对照，该质粒上也携带有3个串联的位于同一条DNA链上的Nt.BspQI酶切位点，用于提高缺刻酶Nt.BspQI的缺刻效率。

(2)实验组中，以Cas9_Nickase酶切处理模板质粒，获得一条链上多处断裂的开环DNA；对照组中，以Nt.BspQI酶切处理模板质粒，获得一条链上发生一处断裂的开环DNA。以核酸外切酶ExoIII分别消化处理Cas9_Nickase来源和Nt.BspQI来源的开环DNA，获得目标环状单链DNA，对比两者的纯度。

实施例

实施例1：构建cssDNA模板质粒并设计sgRNA

构建用于制备cssDNA的模板质粒pMF5-GFP-BspQI(图1b)，该质粒全长3553bp，由南京金斯瑞生物科技有限公司基因部合成，序列参见序列表。在sgRNA设计网站(http://crispor.tefor.net/)中导入pMF5-GFP-BspQI质粒全长序列，根据自己所需靶标位点及质粒全长选择多个sgRNA序列。本实施例中共选取5条sgRNA，每条间隔约700bp，序列参见序列表。由南京金斯瑞生物科技有限公司核酸部合成。

同时作为对照组Nt.BspQI的模板质粒(图1a)，pMF5-GFP-BspQI的正链上携带有三个紧密相连的Nt.BspQI酶切位点，用以提高对照组Nt.BspQI缺刻酶的缺刻效率。

实施例2：缺刻酶Nt.BspQI/Cas9_Nickase制备cssDNA

1.缺刻质粒的制备

1.1对照组：缺刻酶Nt.BspQI制备缺刻质粒。

对照组中选择传统的缺刻酶Nt.BspQI进行缺刻质粒的制备。以Nt.BspQI处理pMF5-GFP-BspQI质粒，获得一条链发生一处断裂的开环DNA。酶切体系如表1所示。Nt.BspQI购自纽英伦生物技术有限公司，货号：R0644S。

表1 Nt.BspQI酶切体系

50℃，500rpm，酶切反应2.5h。取1ul样品进行跑胶验证，酶切结果如图2所示，确认酶切反应完全。80℃，20min热灭活。取20ul灭活样品存于4℃冰箱，用于后续跑胶对照。

苯酚/氯仿/异戊醇回收酶切样品：

1)添加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，涡旋10s，然后5000g离心5min；

2)将上层水相转移到新管中并添加等体积的氯仿/异戊醇(24:1)。涡旋10s，5000g离心5min；

3)重复步骤2；

4)将上层水相转移到新管中。加入1/10体积的3M醋酸钠和2.5体积的冰乙醇，混合后-20℃孵育1h；

5)10000rpm离心10min；

6)倒掉上清液，用2000μL的75％冰乙醇轻轻清洗沉淀，蒸发残留乙醇；

7)加入适量无DNase/RNase H₂O溶解质粒。

1.2实验组：缺刻酶Cas9_Nickase制备缺刻质粒。

为对比传统缺刻内切酶的缺刻效率，实验组中选择Cas9_Nickase处理pMF5-GFP-BspQI质粒，获得一条链上发生5处断裂的开环DNA。酶切体系如表2所示。Engenpy Cas9_Nickase购自纽英伦生物技术有限公司，货号：M0650S。

表2 Cas9_Nickase酶切体系

取5ul样品加入1ul proteinase K，室温静置15min，进行跑胶验证，酶切结果如图3所示，确认酶切反应完全。总反应中加入100ul proteinase K，室温静置15min，95℃，10min进行热灭活。取20ul灭活样品存于4℃冰箱，用于后续跑胶对照。

苯酚/氯仿/异戊醇回收酶切样品步骤同1.1。

2.cssDNA的制备

以核酸外切酶ExoIII消化处理步骤1.1、步骤1.2中制备所得的缺刻质粒，对比两种不同来源的缺刻质粒经过ExoIII消化处理后产物的纯度。ExoIII购自纽英伦生物技术有限公司，货号：M0206L。

2.1核酸外切酶ExoIII消化处理Nt.BspQI来源的缺刻质粒

核酸外切酶ExoIII消化处理步骤1.1中制备所得缺刻质粒，消化体系如表3所示。

表3 ExoIII消化处理Nt.BspQI来源缺刻质粒体系

在0.25h、0.5h、0.75h、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h、7h、24h时分别取出20ul样品，各自加入11mM EDTA，70℃，20min热灭活，暂存于4℃冰箱，待消化时间结束后跑胶验证使用。

消化结果如图4所示，消化5h时仍有明显缺刻质粒的残留；消化24h后，缺刻质粒也仍未消化完全。而cssDNA含量也随着消化时长加长逐渐降低。以Tanon GIS系列数码凝胶图像处理系统分析跑胶结果，具体cssDNA与残留缺刻质粒比例如表4所示。

表4 Nt.BspQI缺刻ExoIII消化产物中cssDNA与残留缺刻质粒比例

2.2核酸外切酶ExoIII消化处理Cas9_Nickase来源的缺刻质粒

核酸外切酶ExoIII消化处理步骤1.2中制备所得缺刻质粒，消化体系如表5所示。

表5 ExoIII消化处理Cas9_Nickase来源缺刻质粒体系

在0.25h、0.5h、0.75h、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h、7h、24h时分别取出20ul样品，各自加入11mM EDTA，70℃，20min热灭活，暂存于4℃冰箱，后续跑胶验证使用。

消化结果如图5所示，消化0.25h时有微弱的缺刻质粒残留，0.5h时完全消化，未检测到缺刻质粒残留。消化24h后，cssDNA含量随着消化时长加长有所降低，但条带稳定。以Tanon GIS系列数码凝胶图像处理系统分析跑胶结果，具体cssDNA与残留缺刻质粒比例如表6所示。

表6 Cas9_Nickase缺刻ExoIII消化产物中cssDNA与残留缺刻质粒比例

对比传统缺刻酶Nt.BspQI和本发明的Cas9_Nickase，选择sgRNA依赖性缺刻内切酶Cas9_Nickase对模板质粒进行多点缺刻，并以核酸外切酶ExoIII消化缺刻质粒，可以在更短时间内获得纯度更高的cssDNA。同时，由于大大的缩短了核酸外切酶消化时长，核酸外切酶对于产物cssDNA的降解也是微弱的，有效的提高了cssDNA的制备效率。

实施例3：Nt.BspQI组/Cas9_Nickase组制备cssDNA的回收率对比

本实施例以产物纯度作为回收标准对Nt.BspQI组/Cas9_Nickase组制备cssDNA的回收率进行对比。

3.1缺刻质粒的制备

以缺刻酶Nt.BspQI和Cas9_Nickase分别制备缺刻质粒。模板质粒的初始投入量均为300ug。

表7 Nt.BspQI酶切体系

50℃，500rpm，酶切反应3h。取1ul样品进行跑胶验证，酶切结果如图6泳道2所示，确认酶切反应完全。80℃，20min热灭活。取20ul灭活样品存于4℃冰箱，用于后续跑胶对照。

表8 Cas9_Nickase酶切体系

取3ul样品加入1ul proteinase K，室温静置15min，进行跑胶验证，酶切结果如图6泳道3所示，确认酶切反应完全。总反应中加入100ul proteinase K，室温静置15min，95℃，10min进行热灭活。取20ul灭活样品存于4℃冰箱，用于后续跑胶对照。

3.2缺刻质粒回收

苯酚/氯仿/异戊醇回收酶切样品：

3)重复步骤2；

5)10000rpm离心10min；

7)两组分别加入200ul DNase/RNase H₂O溶解产物；

8)两组各取1ul样品以NanoDrop^TMOne Microvolume UV-Vis Spectrophotometers.测定浓度。

表9缺刻质粒回收效率

3.3 cssDNA制备

以核酸外切酶ExoIII分别消化处理步骤3.2中两组的回收产物，所有回收产物均投入消化体系。消化体系见表10。最终以产物纯度作为回收标准进行cssDNA的回收。

表10 ExoIII消化体系

37℃，500rpm，消化至2h时，两组各取1ul样品进行琼脂糖凝胶跑胶验证，结果如图7所示。其中，Cas9_Nickase组经过2h消化后，泳道3中的缺刻DNA条带转化为泳道5中纯度较高的cssDNA条带；而Nt.BspQI组经过2h的消化后，泳道6的css DNA中仍然存在较重的缺刻DNA条带污染。将Cas9_Nickase组的产物放至4℃冰箱暂存。

Nt.BspQI组继续消化，分别在5h、6h、7h时取样，跑胶观察消化情况，结果如图8所示。消化至7h时，残余Nicked DNA仍未被消化完全，而目标产物cssDNA的含量也随消化时长延长而降低。

Nt.BspQI组消化继续消化至8h，与Cas9_Nickase组消化2h的产物一同进行苯酚/氯仿/异戊醇回收，回收后产物进行回收率比较，并再次进行琼脂糖凝胶跑胶验证产物纯度。回收率如表11所示，跑胶结果如图9所示。

表11 cssDNA回收效率对比

由Nt.BspQI组的消化结果可知，核酸外切酶ExoIII除了消化降解带缺口的ssDNA，对于环状的ssDNA也具有一定的降解效果。当选择Nt.BspQI作为缺刻酶对模板质粒进行单个位点缺刻时，待消化ssDNA片段长度过长，核酸外切酶ExoIII的消化效率达不到理想状态，产物纯度较低，污染较重。而企图通过延长消化时长来提高产物纯度时，又会导致目标产物cssDNA的降解，导致最终回收效率的降低。

对比Nt.BspQI组，Cas9_Nickase组通过多位点缺刻，较大程度的缩短待消化片段的长度，提高了核酸外切酶ExoIII短时间内的消化效率，有效地减少消化时长的同时提高产物纯度，终产物的回收效率也远高于Nt.BspQI组。

实施例4：Cas9_Nickase制备cssDNA时sgRNA的设计

以图1b(右)中的质粒序列为模板设计不同的sgRNA，共设计4组。每组中由Cas9_Nickase-sgRNA产生的缺刻位点及每个缺刻位点间间隔的序列长度如表12所示。4组分别进行缺刻DNA及cssDNA的制备，制备过程同实施例2。

表12缺刻位点数及每段的长度

制备结果如图10所示。泳道2-5分别为sgRNA个数是5个、3个、2个、1个时的缺刻DNA制备结果，泳道7-10分别为sgRNA个数是5个、3个、2个、1个时的cssDNA制备结果。

如泳道9、泳道10的结果所示，当选择2个或1个sgRNA进行缺刻、ExoIII消化时，得到的产物中有3种形态的DNA，条带从上往下包括，产物1：未被ExoIII消化完全的缺刻DNA，产物2：残留的亲本质粒DNA，以及产物3：占主要比例的目标产物cssDNA。其中1个sgRNA组(泳道10)中产物1、2占比又明显高于2个sgRNA组(泳道9)。该结果表明在根据模板质粒的实际大小设计sgRNA时，sgRNA个数、缺刻产生的断裂链的长度对于最终cssDNA的制备效率及纯度都有着至关重要的影响，其中sgRNA个数不小于2个，断裂链的长度小于1.7kb。

本发明的实施方式并不限于上述实施例所述，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可以在形式和细节上对本发明做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。

pMF5-GFP-BspQI(SEQ ID NO:1)：

Claims

一种制备环状单链DNA的方法，包括如下步骤：

1)提供模板DNA，所述模板DNA为包含目标链和互补链的环状双链DNA；

2)向模板DNA中加入gRNA和Cas切口酶，所述gRNA和互补链的部分区域互补配对，其中Cas切口酶在gRNA的引导下在互补链上形成一个或多个缺口；

3)使用核酸外切酶对含有缺口的互补链进行消化，获得含有环状单链DNA形式的目标链的消化产物。
如权利要求1所述的方法，其中gRNA为sgRNA。
如权利要求1或2所述的方法，所述Cas切口酶是Cas9切口酶。
如权利要求3所述的方法，所述Cas9切口酶是选自下组的一个或多个：D10A，H840A，N863A、和N854A。
如以上权利要求任一项所述的方法，所述核酸外切酶是选自下组的一个或多个：核酸外切酶T7、核酸外切酶ExoIII、和Lambda Exo。
如以上权利要求任一项所述的方法，所述模板DNA是质粒。
如权利要求6所述的方法，所述质粒包含复制起始位点和目的基因，并且不包含筛选标签基因。
如权利要求7所述的方法，所述复制起始位点选自pUC复制起始位点、pMB1及其衍生物复制起始位点、ColE1复制起始位点和R6Kγ复制起始位点。
如以上权利要求任一项所述的方法，所述一个或多个缺口是大于或等于两个缺口。
如以上权利要求任一项所述的方法，所述模板DNA的序列长度及缺口的数量比例小于10kb 1个缺口，优选小于5kb 1个缺刻位点，进一步优选小于3kb 1个缺刻位点，进一步优选小于2kb 1个缺刻位点，最优选小于1kb 1个缺刻位点。
如以上权利要求任一项所述的方法，所述Cas切口酶和gRNA以及模板DNA的摩尔比为3：3：1-12：12：1，优选4：4：1-11：11：1，最优选5：5：1-10：10：1。
如以上权利要求任一项所述的方法，在步骤3)之后还包括如下步骤：对所述消化产物进行纯化，获得高纯度的环状单链DNA。
一种制备线性单链DNA的方法，包括如下步骤：对根据以上权利要求任一项所述的方法获得的环状单链(css)DNA进行切割以获得线性单链(lss)DNA。
一种用于制备环状或线性单链DNA的试剂盒，含有Cas切口酶和核酸外切酶。
如权利要求14所述的试剂盒，所述Cas切口酶是Cas9切口酶。
如权利要求15所述的试剂盒，所述Cas9切口酶是选自下组的一个或多个：D10A，H840A，N863A、和N854A。
如权利要求14-16任一项所述的试剂盒，所述核酸外切酶是选自下组的一个或多个：核酸外切酶T7、核酸外切酶ExoIII、和Lambda Exo。
如权利要求14-17任一项所述的试剂盒，还含有阳性参照模板DNA和阳性gRNA。
如权利要求14-18任一项所述的试剂盒，还含有模板DNA和gRNA。
如权利要求14-19任一项所述的试剂盒，还含有缓冲液。
如权利要求14-20任一项所述的试剂盒，还含有用于对环状或线性单链DNA进行纯化的试剂。
一种环状或线性单链DNA，包含复制起始位点和目的基因，并且不包含筛选标签基因。
如权利要求22所述的环状或线性单链DNA，所述复制起始位点选自pUC复制起始位点、pMB1及其衍生物复制起始位点、ColE1复制起始位点和R6Kγ复制起始位点。
一种组合物，包含如权利要求22或23所述的环状或线性单链DNA。
权利要求24所述的组合物，所述组合物为药物组合物。
根据权利要求1-11任一项所述方法获得的含有环状单链DNA形式的目标链的消化产物。
如权利要求22或23所述的环状或线性单链DNA，或如权利要求24或25所述的组合物，或如权利要求26所述的消化产物在基因治疗、基因重组、DNA文库构建、DNA折纸或DNA存储元件中的应用。