CN121532425A

CN121532425A - 靶向pd-l1的免疫球蛋白单可变结构域

Info

Publication number: CN121532425A
Application number: CN202480046189.XA
Authority: CN
Inventors: C·布顿; P·德沙赫特; A·E·M·范·纽文海泽; K·F·G·范·莱尔; T·赫尔曼
Original assignee: Ablinks Co ltd
Current assignee: Ablinks Co ltd
Priority date: 2023-06-22
Filing date: 2024-06-24
Publication date: 2026-02-13
Also published as: TW202515916A; AU2024314576A1; MX2025015408A; EP4731667A1; WO2024261338A1; AR133055A1; JP2026522424A; IL325480A; KR20260030116A

Abstract

本技术提供了结合PD‑L1的多肽。本技术还提供核酸、载体和组合物。

Description

靶向PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域

1技术领域

本技术涉及靶向PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），并且更特别地涉及包含一个或多个此类ISVD或基本上由一个或多个此类ISVD组成的多肽和构建体。它还涉及编码ISVD和多肽的核酸分子和包含这些核酸的载体，并且涉及包含该ISVD、多肽、核酸或载体的组合物。本技术进一步涉及这些产物用于在治疗患有癌症的受试者的方法中使用。本技术还涉及生产这些产物的方法。

2技术背景

PD-1（程序性细胞死亡-1）受体（CD279）在活化的T细胞表面表达。其配体PD-L1（B7-H1；CD274）和PD-L2（B7-DC；CD273）是属于B7家族的跨膜蛋白，通常在树突状细胞和巨噬细胞上表达。PD-1和PD-L1/PD-L2属于充当共抑制因子的免疫检查点蛋白家族，其可以阻止或限制T细胞应答的发展。PD-1/PD-L1相互作用确保免疫系统仅在适当的时间活化，以最大限度地减少慢性自身免疫炎症的可能性。PD-L1生物学及其在癌症免疫学和免疫治疗中的作用描述于Sun等人 2018（Immunity[免疫] 48: 434）和Salmaninejad等人2019 (J.Cell Physiol.[细胞生理学杂志]234: 16824）。

许多旨在阻断PD-L1的生物化合物已被批准用于治疗癌症。阿特珠单抗（Tecentriq；罗氏公司（Roche））是一种经Fc修饰的人源化IgG1单克隆抗体，已被批准用于尿路上皮癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肝细胞癌、黑色素瘤、肺泡软组织肉瘤和三阴性乳腺癌。德瓦鲁单抗（Imfinzi；英商梅迪缪思有限公司/阿斯利康）是一种人源化IgG1κ单克隆抗体，已被批准用于某些类型的膀胱癌、肺癌和胆道癌。BMS-936559 / MDX-1105（Medarex/BMS）是一种人源化IgG4单克隆抗体。阿维鲁单抗（Bavencio；默克KGaA/辉瑞）是一种全人源单克隆抗体，已被批准用于治疗默克尔细胞癌、尿路上皮癌和肾细胞癌。

Shuguang等人2018（Protein Cell[蛋白细胞], 9:135）描述了这些抗PD-L1单克隆抗体的结合特性的比较研究，阐明了抗PD-L1生物制剂的结合特性规则。由于单克隆抗体体积大和肿瘤微环境的复杂性，其渗透效率较低，这推动了具有优异渗透效率的小分子生物制剂的开发。恩伐利单抗（Envafolimab）（KN035；3D医药公司（3D Medicines）/康宁杰瑞公司（Alphamab Oncology）/先声药业集团）是一种单结构域-Fc融合蛋白，目前上市用于治疗晚期胆道癌和软组织肉瘤。WO 2008/071447中已经描述了靶向PD-L1的其他免疫球蛋白单可变结构域。

仍然需要改进的针对PD-L1的小分子生物制剂。此类小分子生物制剂还可用于与单链中的其他（癌症）靶结合物组合，同时除良好的制造产率之外还保持相对小的尺寸、高的亲和力、效力和/或功效。此外，生物药物还应表现出安全性、便利性、患者依从性并改善患者的生活质量。

3现有技术概要

在一些实施例中，本技术涉及特异性靶向PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域。在一些实施例中，本技术涉及特异性靶向PD-L1的高亲和力免疫球蛋白单可变结构域。在一些实施例中，本技术涉及特异性靶向PD-L1的高效力免疫球蛋白单可变结构域。在一些实施例中，本技术涉及特异性靶向PD-L1的高功效免疫球蛋白单可变结构域。

用小的（在尺寸上）生物制剂（诸如单价或二价免疫球蛋白单可变结构域）靶向PD-L1并且保持高的亲和力、效力和/或功效在其中期望非常小的结合物的某些应用中可以是有利的。小的结合物可以是有利的，例如，对于在肿瘤环境中进行渗透而言，或者当在相同的构建体中牵涉到针对其他（肿瘤）靶标的另外的结合物时，有利于对治疗性化合物的制造和进一步处置。

本技术提供了特异性靶向PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域，其阻断PD1和PD-L1的相互作用（具有与基准相当或更好的IC50）。本技术提供了特异性靶向PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域，其阻断CD80和PD-L1的相互作用（具有与基准相当或更好的IC50）。本技术提供了特异性地靶向PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域，这些免疫球蛋白单可变结构域在生物测定中以与一种或多种基准相当或比一种或多种基准更好的IC50显示出效力，诸如在流式细胞术中与PD1的竞争或在破伤风类毒素自生抗原特异性共培养测定（破伤风类毒素（TT）测定）中的功能性。

本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合人、食蟹猴和小鼠PD-L1，KD差异最大5倍。本技术提供了不结合PD-L2和/或以高于/低于10^-4M的K_D结合PD-L2的免疫球蛋白单可变结构域。本技术提供了不结合该B7家族的其他成员和/或以高于/低于10^-4M的K_D结合该B7家族的其他成员的免疫球蛋白单可变结构域。

本技术的免疫球蛋白单可变结构域以及包含所述免疫球蛋白单可变结构域的多肽和构建体在用PD-1和CD80进行的竞争测定中显示出高的效力并在TT测定中显示出高的效力和功效，并且可有效地产生（例如在微生物宿主诸如毕赤酵母属（Pichia）（例如巴斯德毕赤酵母（P. pastoris））中）。

具体地，本技术提供以下实施例：

3.1实施例系列7

在一些实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD是阻断PD-L1与PD1相互作用的ISVD。特异性结合PD-L1的ISVD与PD-L1上的PD1结合位点结合。在一些实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD与PD-L1上的构象表位相互作用。在一些实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD是与PD-L1蛋白的以下氨基酸相互作用的ISVD：Y56、E58、E60、D62、N63、Q66、H78和/或R113。通过单价免疫球蛋白单可变结构域阻断PD-L1蛋白上的这个表位已经可以非常有效地阻止PD1结合和随后的信号转导

实施例1.一种与人PD-L1特异性地结合的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，与PD-L1蛋白的选自Y56、E58、E60、D62、N63、Q66、H78和R113的一个或多个氨基酸相互作用。

实施例2.如实施例1所述的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），其与PD-L1蛋白的下列氨基酸相互作用：Y56、E58、D62、N63、Q66和H78。

实施例3.如实施例1或2中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），其与PD-L1蛋白的以下氨基酸相互作用：Y56、E58、E60、D62、N63、Q66、H78和R113。

实施例4.如实施例1至3中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），其中CDR2和CDR3与PD-L1蛋白的选自Y56、E58、E60、D62、N63、Q66、H78和R113的一个或多个氨基酸相互作用。

实施例5.如实施例1至4中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），其中CDR2和CDR3与PD-L1蛋白的以下氨基酸相互作用：Y56、E58、D62、N63、Q66和H78。

实施例6.如实施例1至5中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），其中CDR2和CDR3与PD-L1蛋白的以下氨基酸相互作用：Y56、E58、E60、D62、N63、Q66、H78和R113。

实施例7.如实施例1至6中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），其中CDR2中的S51、S53和N56（Kabat编号）形成与PD-L1蛋白的氨基酸的相互作用位点。

实施例8.如实施例1至7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），其中CDR3中的A98、A99、A100、A100a、I100d和I100g（Kabat编号）形成与PD-L1蛋白的氨基酸的相互作用位点。

实施例9.如实施例1至8中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），其中CDR2中的S51、S53和N56（Kabat编号）以及CDR3中的A98、A99、A100、A100a、I100d和I100g（Kabat编号）形成与PD-L1蛋白上的表位的相互作用位点。

实施例10.如实施例1至9中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），其中CDR2中的S51、S53和N56（Kabat编号）以及CDR3中的A98、A99、A100、A100a、I100d和I100g（Kabat编号）形成与PD-L1蛋白的选自Y56、E58、E60、D62、N63、Q66、H78和R113的一个或多个氨基酸的相互作用位点。

实施例11.如实施例1至8中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），其中CDR2中的S51、S53和N56（Kabat编号）以及CDR3中的A98、A99、A100、A100a、I100d和I100g（Kabat编号）形成与PD-L1蛋白的以下氨基酸的相互作用位点：Y56、E58、D62、N63、Q66和H78。

实施例12.如实施例1至8中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），其中CDR2中的S51、S53和N56（Kabat编号）以及CDR3中的A98、A99、A100、A100a、I100d和I100g（Kabat编号）形成与PD-L1蛋白的以下氨基酸的相互作用位点：Y56、E58、E60、D62、N63、Q66、H78和R113。

实施例13.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

-CDR2（AbM编号）由氨基酸序列X₁X₂SX₃SX₄X₅NX₆X₇（SEQ ID NO: 600）组成，其中X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆和X₇是独立选择的任何氨基酸。

以及

-CDR3（AbM编号）由氨基酸序列X₁X₂X₃AAAAX₄X₅IX₆X₇IX₈X₉X₁₀（SEQ ID NO: 603）组成，其中X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉和X₁₀为独立地选择的任何氨基酸。

实施例14.如实施例13所述的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），其中

-CDR2（AbM编号）由氨基酸序列X₁X₂SX₃SX₄X₅NX₆X₇（SEQ ID NO: 600）组成，其中X₁选自A、S、T、P和G，X₂选自M、L、I、V和C，X₃选自A、S、T、P和G，X₄选自A、S、T、P和G，X₅选自R、H和K，X₆选自A、S、T、P和G，并且X₇选自N和Q；

以及

-CDR3（AbM编号）由氨基酸序列X₁X₂X₃AAAAX₄X₅IX₆X₇IX₈X₉X₁₀（SEQ ID NO: 603）组成，其中X₁选自A、S、T、P和G，X₂选自A、S、T、P和G，X₃选自F、Y和W，X₄选自A、S、T、P和G，X₅选自A、S、T、P和G，X₆选自A、S、T、P和G，X₇选自N、Q、I、L、M、V和C，X₈选自F、Y和W，X₉选自D和E，并且X₁₀选自F、Y和W。

实施例15.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 13或14的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 13或14的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 13或14的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 17或109的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 17或109的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 17或109的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

实施例16.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)X₁ISSX₂GRX₃TN（SEQ ID NO: 598）的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和G，该氨基酸残基X₂选自S和T，并且该氨基酸残基X₃选自N、T和F；

b)与X₁ISSX₂GRX₃TN（SEQ ID NO: 598）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和G，该氨基酸残基X₂选自S和T，并且该氨基酸残基X₃选自N、T和F；

c)与X₁ISSX₂GRX₃TN（SEQ ID NO: 598）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和G，该氨基酸残基X₂选自S和T，并且该氨基酸残基X₃选自N、T和F；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)氨基酸序列SSWAAAX₁GTX₂X₃X₄IYDY（SEQ ID NO: 601），其中该氨基酸残基X₁选自A和P，该氨基酸残基X₂选自I、L和T，该氨基酸残基X₃选自A、P和S，并且该氨基酸残基X₄选自N和I；

e)与氨基酸序列SSWAAAX₁GTX₂X₃X₄IYDY（SEQ ID NO: 601）具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和P，该氨基酸残基X₂选自I、L和T，并且该氨基酸残基X₃选自N和I；

f)与氨基酸序列SSWAAAX₁GTX₂X₃X₄IYDY（SEQ ID NO: 601）具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和P，该氨基酸残基X₂选自I、L和T，并且该氨基酸残基X₃选自N和I。

实施例17.如实施例13至16所述的ISVD，其中该CDR2和CDR3（AbM编号）的氨基酸序列与带有选自SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 311-324的氨基酸序列的ISVD的CDR2和CDR3的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

实施例18.如实施例13至17中任一项所述的ISVD，其中

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 13的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 14的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 109的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 103的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 109的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 14的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 103的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 110的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 13的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 111的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 104的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 112的氨基酸序列组成。

实施例19.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 23或24的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 23或24的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 23或24的氨基酸序列具有6、5、4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 17或109的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 17或39的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

实施例20.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)X₁ISSX₂GRX₃TNYADX₄VX₅X₆（SEQ ID NO: 605）的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自G和A，其中该氨基酸残基X₂选自S和T，其中该氨基酸残基X₃选自T、N和F，其中该氨基酸残基X₄选自S和P，其中该氨基酸残基X₅选自E和K，并且其中该氨基酸残基X₆选自G、V和A；

b)与X₁ISSX₂GRX₃TNYADX₄VX₅X₆（SEQ ID NO: 605）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自G和A，其中该氨基酸残基X₂选自S和T，其中该氨基酸残基X₃选自T、N和F，其中该氨基酸残基X₄选自S和P，其中该氨基酸残基X₅选自E和K，并且其中该氨基酸残基X₆选自G、V和A；

c)与X₁ISSX₂GRX₃TNYADX₄VX₅X₆（SEQ ID NO: 605）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自G和A，其中该氨基酸残基X₂选自S和T，其中该氨基酸残基X₃选自T、N和F，其中该氨基酸残基X₄选自S和P，其中该氨基酸残基X₅选自E和K，并且其中该氨基酸残基X₆选自G、V和A；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SSWAAAX₁GTX₂X₃X₄IYDY（SEQ ID NO: 601）的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自A和P，其中该氨基酸残基X₂选自I、L和T，其中该氨基酸残基X₃选自A、P和S，并且其中该氨基酸残基X₄选自I和N；

e)与SSWAAAX₁GTX₂X₃X₄IYDY（SEQ ID NO: 601）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自A和P，其中该氨基酸残基X₂选自I、L和T，其中该氨基酸残基X₃选自A、P和S，并且其中该氨基酸残基X₄选自I和N；

f)与SSWAAAX₁GTX₂X₃X₄IYDY（SEQ ID NO: 601）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自A和P，其中该氨基酸残基X₂选自I、L和T，其中该氨基酸残基X₃选自A、P和S，并且其中该氨基酸残基X₄选自I和N。

实施例21.如实施例19或20所述的ISVD，其中该CDR2和CDR3（Kabat编号）的氨基酸序列与带有选自SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 311-324的氨基酸序列的ISVD的CDR2和CD3的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

实施例22.如实施例19至21中任一项所述的ISVD，其中

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 23的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 24的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 109的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 120的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 109的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 24的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 120的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 122的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 110的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 123的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 111的氨基酸序列组成。

实施例23.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 11或98的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 11或98的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 11或98的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 13或14的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 13或14的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 13或14的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 17或109的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO: 17或109的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO: 17或109的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

实施例24.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)氨基酸序列GRX₁FSX₂NX₃MG（SEQ ID NO: 596），其中该氨基酸残基X₁选自T、K和G，该氨基酸残基X₂选自G和R，并且该氨基酸残基X₃选自T和A；

b)与氨基酸序列GRX₁FSX₂NX₃MG（SEQ ID NO: 596）具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自T、K和G，该氨基酸残基X₂选自G和R，并且该氨基酸残基X₃选自T和A；

c)与氨基酸序列GRX₁FSX₂NX₃MG（SEQ ID NO: 596）具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自T、K和G，该氨基酸残基X₂选自G和R，并且该氨基酸残基X₃选自T和A；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)X₁ISSX₂GRX₃TN（SEQ ID NO: 598）的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和G，该氨基酸残基X₂选自S和T，并且该氨基酸残基X₃选自N、T和F；

e)与X₁ISSX₂GRX₃TN（SEQ ID NO: 598）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和G，该氨基酸残基X₂选自S和T，并且该氨基酸残基X₃选自N、T和F；

f)与X₁ISSX₂GRX₃TN（SEQ ID NO: 598）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和G，该氨基酸残基X₂选自S和T，并且该氨基酸残基X₃选自N、T和F；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)氨基酸序列SSWAAAX₁GTX₂X₃X₄IYDY（SEQ ID NO: 601），其中该氨基酸残基X₁选自A和P，该氨基酸残基X₂选自I、L和T，该氨基酸残基X₃选自A、P和S，并且该氨基酸残基X₄选自N和I；

h)与氨基酸序列SSWAAAX₁GTX₂X₃X₄IYDY（SEQ ID NO: 601）具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和P，该氨基酸残基X₂选自I、L和T，并且该氨基酸残基X₃选自N和I；

i)与氨基酸序列SSWAAAX₁GTX₂X₃X₄IYDY（SEQ ID NO: 601）具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和P，该氨基酸残基X₂选自I、L和T，并且该氨基酸残基X₃选自N和I。

实施例25.如实施例23或24所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与带有选自SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 311-324的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

实施例26.如实施例23至25中任一项所述的ISVD，其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 11的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 13的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1由SEQ ID NO: 11的氨基酸序列组成；

-CDR2由SEQ ID NO: 13和14的氨基酸序列之一组成；以及

-CDR3由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 98的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 14的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 109的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 98的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 103的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 109的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 99的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 103的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 109的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 99的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 14的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 109的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 11的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 14的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 100的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 103的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 110的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 100的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 13的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 111的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 101的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 104的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 112的氨基酸序列组成。

实施例27.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 22的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 22的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 22的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 23或24的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 23或24的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 23或24的氨基酸序列具有6、5、4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 17或109的氨基酸序列；

实施例28.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)X₁NX₂MG（SEQ ID NO: 604）的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自G和R并且其中该氨基酸残基X₂选自T和A；

b)与X₁NX₂MG（SEQ ID NO: 604）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自G和R并且其中该氨基酸残基X₂选自T和A；

c)与氨基酸序列X₁NX₂MG（SEQ ID NO: 604）具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自G和R并且其中该氨基酸残基X₂选自T和A；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)X₁ISSX₂GRX₃TNYADX₄VX₅X₆（SEQ ID NO: 605）的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自G和A，其中该氨基酸残基X₂选自S和T，其中该氨基酸残基X₃选自T、N和F，其中该氨基酸残基X₄选自S和P，其中该氨基酸残基X₅选自E和K，并且其中该氨基酸残基X₆选自G、V和A；

e)与X₁ISSX₂GRX₃TNYADX₄VX₅X₆（SEQ ID NO: 605）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自G和A，其中该氨基酸残基X₂选自S和T，其中该氨基酸残基X₃选自T、N和F，其中该氨基酸残基X₄选自S和P，其中该氨基酸残基X₅选自E和K，并且其中该氨基酸残基X₆选自G、V和A；

f)与X₁ISSX₂GRX₃TNYADX₄VX₅X₆（SEQ ID NO: 605）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自G和A，其中该氨基酸残基X₂选自S和T，其中该氨基酸残基X₃选自T、N和F，其中该氨基酸残基X₄选自S和P，其中该氨基酸残基X₅选自E和K，并且其中该氨基酸残基X₆选自G、V和A；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SSWAAAX₁GTX₂X₃X₄IYDY（SEQ ID NO: 601）的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自A和P，其中该氨基酸残基X₂选自I、L和T，其中该氨基酸残基X₃选自A、P和S，并且其中该氨基酸残基X₄选自I和N；

h)与SSWAAAX₁GTX₂X₃X₄IYDY（SEQ ID NO: 601）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自A和P，其中该氨基酸残基X₂选自I、L和T，其中该氨基酸残基X₃选自A、P和S，并且其中该氨基酸残基X₄选自I和N；

i)与SSWAAAX₁GTX₂X₃X₄IYDY（SEQ ID NO: 601）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自A和P，其中该氨基酸残基X₂选自I、L和T，其中该氨基酸残基X₃选自A、P和S，并且其中该氨基酸残基X₄选自I和N。

实施例29.如实施例27或28所述的ISVD，其中该CDR（Kabat编号）的氨基酸序列与带有选自SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 311-324的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

实施例30.如实施例27至29中任一项所述的ISVD，其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 22的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 23和24的氨基酸序列之一组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 22的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 23的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 22的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 24的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 109的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 22的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 120的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 109的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 22的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 24的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 109的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 22的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 120的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 118的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 122的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 110的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 118的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 123的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 111的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 118的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 123的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 111的氨基酸序列组成。

实施例31.如实施例1至30中任一项所述的ISVD，其氨基酸序列

i)与SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 311-324的氨基酸序列中的一个具有80%氨基酸序列同一性，其中出于确定氨基酸同一性的程度的目的，形成这些CDR序列的氨基酸残基被忽略；

并且其中：

ii)优选地，根据Kabat编号，位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108处的一个或多个氨基酸残基选自表1中提到的标志残基。

实施例32.如实施例1至31中任一项所述的ISVD，其基本上由衍生自常规四链抗体的重链可变结构域序列组成，或者基本上由衍生自重链抗体的重链可变结构域序列组成。

实施例33.如实施例1至32中任一项所述的ISVD，其基本上由VHH、人源化VHH、骆驼化VH、结构域抗体、单结构域抗体或dAb组成。

实施例34.如实施例1至33中任一项所述的ISVD，其为人源化ISVD，该人源化ISVD选自由以下组成的组：SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 311-321，或者选自由以下组成的组：与SEQ ID NO: 4、5和SEQ ID NO: 311-321的氨基酸序列中的至少一个具有大于80%、优选地大于90%、更优选地大于95%、诸如99%或更高氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

实施例35.如实施例1至34中任一项所述的ISVD，其中该氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 311-339。

实施例36.如实施例1至35中任一项所述的ISVD，其中该ISVD特异性结合人PD-L1，解离常数（K_D）为5.10^-9至10^-11摩尔/升或更低，优选为10^-9至5.10^-11摩尔/升或5.10^-10至10^-10摩尔/升，或更优选为10^-10至10^-11摩尔/升，如通过表面等离子体共振测定的。

实施例37.如实施例1至36中任一项所述的ISVD，其中该ISVD特异性结合人PD-L1，k_on速率在10⁵M^-1s^-1至约10⁷M^-1s^-1之间、优选在5.10⁵M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、更优选在10⁶M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、例如在10⁶M^-1s^-1和5.10⁶M^-1s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

实施例38.如实施例1至37中任一项所述的ISVD，其中该ISVD特异性结合人PD-L1，k_off速率在10^-3s^-1（t1/2 = 0.69 s）和10^-6s^-1（提供t1/2为多天的接近不可逆的复合物）之间，优选在10^-3s^-1和5.10^-6s^-1之间，更优选在5.10^-4s^-1和5.10^-6s^-1之间，例如在5.10^-4s^-1和10^-5s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

实施例39.如实施例1至38中任一项所述的ISVD，其中该ISVD与人和食蟹猴PD-L1特异性地结合并且不与该B7家族的其他成员结合。

实施例40.如实施例1至39中任一项所述的ISVD，其中该ISVD特异性结合人和食蟹猴PD-L1并且不结合PD-L2。

实施例41.如实施例1至40中任一项所述的ISVD，其中该ISVD在通过IFN-γ产生监测的TT测定（例如如实例中所述）中的效力（EC50值）为10^-8M或更低，更优选为10^-9M或更低，或甚至为5.10^-10M或更低。例如，在这样的TT测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和10^-8M之间，例如10^-10M和10^-8M之间、10^-10M和10^-9M之间或10^-11M和10^-9M之间的效力（EC50值）。

实施例42.如实施例1至41中任一项所述的ISVD，其中该ISVD在经由IFN-γ产生进行监测的TT测定（例如如实例中所述）中具有至少50%、诸如至少60%、70%、80%、90%、95%的功效。

实施例43.一种多肽或构建体，其包含一种或多种如实施例1至42中任一项所述的ISVD或基本上由该一种或多种ISVD组成，并且任选地进一步包含任选地经由一个或多个接头连接的一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元。

实施例44.如实施例43所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元为氨基酸序列，诸如选自SEQ ID NO: 526、529、533、541、542、546、547、548、551、552、554、560、563、572、582、583、590和593的多肽中的一个。

实施例45.如实施例43至44中任一项所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个接头是一个或多个氨基酸序列。

实施例46.如实施例43至45中任一项所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元是免疫球蛋白序列。

实施例47.如实施例43至46中任一项所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元是ISVD。

实施例48.如实施例43至47中任一项所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自由以下组成的组：VHH、人源化VHH、骆驼化VH、结构域抗体、单结构域抗体和dAb。

实施例49.如实施例43至48中任一项所述的多肽或构建体，其是多价构建体。

实施例50.如实施例43至49中任一项所述的多肽或构建体，其是多特异性构建体。

实施例51.如实施例46至50中任一项所述的多肽或构建体，其中与没有该一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元的ISVD相比，所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元为该多肽或构建体提供增加的半衰期。

实施例52.如实施例51所述的多肽或构建体，其中为该多肽或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自由以下组成的组：聚乙二醇分子（PEG）、血清蛋白或其片段、与血清蛋白特异性地结合的结合单元、Fc部分以及与血清蛋白特异性地结合的小的蛋白质或肽。

实施例53.如实施例52所述的多肽或构建体，其中为该多肽或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自由以下组成的组：人血清白蛋白或其片段。

实施例54.如实施例52所述的多肽或构建体，其中为该多肽或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自由以下组成的组：与血清白蛋白（诸如人血清白蛋白）或血清免疫球蛋白（诸如IgG）特异性地结合的结合单元。

实施例55.如实施例54所述的多肽或构建体，其中为该多肽或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自由以下组成的组：与血清白蛋白（诸如人血清白蛋白）或血清免疫球蛋白（诸如IgG）特异性地结合的ISVD、VHH、人源化VHH、骆驼化VH、结构域抗体、单结构域抗体或dAb。

实施例56.如实施例55所述的多肽或构建体，其中为该多肽或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元是特异性结合人血清白蛋白的ISVD。

实施例57.如实施例56所述的多肽或构建体，其中特异性地结合人血清白蛋白的所述ISVD基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

-CDR1（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

a)SEQ ID NO: 43的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 43的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；以及

c)与SEQ ID NO: 43的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

d)SEQ ID NO: 45的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 45的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 45的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

g)SEQ ID NO: 47的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO: 47的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO: 47的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

实施例58.如实施例57所述的多肽或构建体，其中CDR1由SEQ ID NO: 43的氨基酸序列组成，CDR2由SEQ ID NO: 45的氨基酸序列组成，并且CDR3由SEQ ID NO: 47的氨基酸序列组成。

实施例59.如实施例54所述的多肽或构建体，其中特异性地结合人血清白蛋白的所述ISVD选自由以下组成的组：ALB8（SEQ ID NO: 27）、ALB23（SEQ ID NO: 28）、ALBX00001（SEQ ID NO: 41）和ALB23002（SEQ ID NO: 42）。

实施例60.如实施例43至59中任一项所述的多肽或构建体，其中所述接头选自由SEQ ID NO: 53至69组成的组。

实施例61.如实施例43至60中任一项所述的多肽或构建体，其进一步包含C末端延伸。

实施例62.如实施例61所述的多肽或构建体，其中所述C末端延伸为C末端延伸(X)_n，其中n为1至10、优选地1至5、诸如1、2、3、4或5（以及优选地1或2，诸如1）；并且每个X为独立地选择的、并且优选地独立地选自由以下组成的组的（优选地天然存在的）氨基酸残基：丙氨酸（A）、甘氨酸（G）、缬氨酸（V）、亮氨酸（L）或异亮氨酸（I）。

实施例63.一种核酸，其编码如实施例1至42中任一项所述的ISVD或如实施例43至60中任一项所述的多肽。

实施例64.如实施例63所述的核酸，其为遗传构建体的形式。

实施例65.一种非人宿主或宿主细胞，其表达或在合适的情况下能够表达如实施例1至42中任一项所述的ISVD或如实施例43至62中任一项所述的多肽；和/或包含如实施例63或64中任一项所述的核酸。

实施例66.一种用于产生如实施例1至42中任一项所述的ISVD或如实施例43至62中任一项所述的多肽的方法，该方法至少包括以下步骤：

a)在合适的宿主细胞或非人宿主生物体中或在另一合适的表达系统中表达如实施例63或64中任一项所述的核酸；

任选地接着：

b)分离和/或纯化如实施例1至42中任一项所述的ISVD，或如实施例43至62中任一项所述的多肽。

实施例67.一种用于产生如实施例1至42中任一项所述的ISVD或如实施例43至62中任一项所述的多肽的方法，所述方法至少包括以下步骤：

a)在使得如实施例65所述的非人宿主或宿主细胞表达和/或产生至少一种如实施例1至42中任一项所述的ISVD或至少一种如实施例43至62中任一项所述的多肽的条件下培养和/或维持所述非人宿主或宿主细胞；

任选地接着：

实施例68.一种组合物，其包含至少一种如实施例1至42中任一项所述的ISVD、至少一种如实施例43至62中任一项所述的多肽或构建体、或至少一种如实施例63或64中任一项所述的核酸。

实施例69.如实施例68所述的组合物，其是药物组合物。

实施例70.如实施例68或69中任一项所述的组合物，其为药物组合物，该药物组合物进一步包含至少一种药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，并且任选地包含一种或多种另外的药学上活性的多肽和/或化合物。

实施例71.如实施例1至42中任一项所述的ISVD、如实施例43至62中任一项所述的多肽或构建体、或如实施例68至70中任一项所述的组合物，其用作药物。

实施例72.如实施例1至42中任一项所述的ISVD、如实施例43至62中任一项所述的多肽或构建体、或如实施例68至70中任一项所述的组合物，其用于诊断、预防和/或治疗至少一种疾病和/或障碍。

实施例73.如实施例1至42中任一项所述的ISVD、如实施例43至62中任一项所述的多肽或构建体、或如实施例68至70中任一项所述的组合物，其用于诊断、预防和/或治疗与PD-L1、与该PD-L1的生物学或药理学活性、和/或与其中涉及PD-L1的生物学途径或信号传导相关联的至少一种疾病和/或障碍。

实施例74.如实施例1至42中任一项所述的ISVD、如实施例43至62中任一项所述的多肽或构建体、或如实施例68至70中任一项所述的组合物，其用于诊断、预防和/或治疗癌症。

实施例75.一种用于诊断、预防和/或治疗至少一种疾病和/或障碍的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用药学上活性的量的如实施例1至42中任一项所述的ISVD、如实施例43至62中任一项所述的多肽或构建体、或如实施例68至70中任一项所述的组合物。

实施例76.如实施例75所述的方法，该方法用于诊断、预防和/或治疗与PD-L1、与该PD-L1的生物学或药理学活性、和/或与其中涉及PD-L1的生物学途径或信号传导相关联的至少一种疾病或障碍，所述方法包括向对其有需要的受试者施用药学上活性的量的至少一种如实施例1至42中任一项所述的ISVD、如实施例43至62中任一项所述的多肽或构建体、或如实施例68至70中任一项所述的组合物。

实施例77.如实施例75或76中任一项所述的方法，该方法用于诊断、预防和/或治疗癌症，所述方法包括向对其有需要的受试者施用药学上活性的量的至少一种如实施例1至42中任一项所述的ISVD、如实施例43至62中任一项所述的多肽或构建体、或如实施例68至70中任一项所述的组合物。

3.2实施例系列42

实施例1.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 132的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 132的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 132的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 134或136的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 134或136的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 134或136的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 143或145的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO: 143或145的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO: 143或145的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

实施例2.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)氨基酸序列GGTFRHYVMG（SEQ ID NO: 132）；

b)与氨基酸序列GGTFRHYVMG（SEQ ID NO: 132）具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与氨基酸序列GGTFRHYVMG（SEQ ID NO: 132）具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)X₁X₂SWSGSGX₃Y（SEQ ID NO: 607）的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A或G，该氨基酸残基X₂选自I、S和V，并且该氨基酸残基X₃选自T和Q；

e)与X₁X₂SWSGSGX₃Y（SEQ ID NO: 607）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A或G，该氨基酸残基X₂选自I、S和V，并且该氨基酸残基X₃选自T和Q；

f)与X₁X₂SWSGSGX₃Y（SEQ ID NO: 607）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A或G，该氨基酸残基X₂选自I、S和V，并且该氨基酸残基X₃选自T和Q；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)DX₁TSX₂VX₃X₄AVEAYDY（SEQ ID NO: 608）的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A、V、R、K和E，该氨基酸残基X₂选自Q和G，该氨基酸残基X₃选自V、K、Q、H和E，并且该氨基酸残基X₄选自L和R；

h)与DX₁TSX₂VX₃X₄AVEAYDY（SEQ ID NO: 608）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A、V、R、K和E，该氨基酸残基X₂选自Q和G，该氨基酸残基X₃选自V、K、Q、H和E，并且该氨基酸残基X₄选自L和R；；

i)与DX₁TSX₂VX₃X₄AVEAYDY（SEQ ID NO: 608）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A、V、R、K和E，该氨基酸残基X₂选自Q和G，该氨基酸残基X₃选自V、K、Q、H和E，并且该氨基酸残基X₄选自L和R。

实施例3.如实施例1或2所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 340-379的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

实施例4.如实施例1至3中任一项所述的ISVD，其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 134的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 143的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 135的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 144的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 135的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 145的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 136的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 146的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 135的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 147的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 135的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 148的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 135的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 149的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 135的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 150的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 136的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 149的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 135的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 146的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 136的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 145的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 136的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 147的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 136的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 149的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 136的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 150的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 136的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 144的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 135的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 151的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 137的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 152的氨基酸序列组成。

实施例5.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 159的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 159的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 159的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 160或162的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 160或162的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 160或162的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 143或145的氨基酸序列；

实施例6.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)HYVMG（SEQ ID NO: 159）的氨基酸序列；

b)与HYVMG（SEQ ID NO: 159）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与HYVMG（SEQ ID NO: 159）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)X₁X₂SWSGSGX₃YYADSVKG（SEQ ID NO: 610）的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自G和A，其中该氨基酸残基X₂选自I、S和V，并且其中该氨基酸残基X₃选自T和Q；

e)与X₁X₂SWSGSGX₃YYADSVKG（SEQ ID NO: 610）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自G和A，其中该氨基酸残基X₂选自I、S和V，并且其中该氨基酸残基X₃选自T和Q；

f)与X₁X₂SWSGSGX₃YYADSVKG（SEQ ID NO: 610）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自G和A，其中该氨基酸残基X₂选自I、S和V，并且其中该氨基酸残基X₃选自T和Q；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)DX₁TSX₂VX₃X₄AVEAYDY（SEQ ID NO: 608）的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自A、V、R、K或E，其中该氨基酸残基X₂选自Q或G，其中该氨基酸残基X₃选自V、K、Q、H或E，并且其中该氨基酸残基X₄选自R或L；

h)与DX₁TSX₂VX₃X₄AVEAYDY（SEQ ID NO: 608）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自A、V、R、K或E，其中该氨基酸残基X₂选自Q或G，其中该氨基酸残基X₃选自V、K、Q、H或E，并且其中该氨基酸残基X₄选自R或L；

i)与DX₁TSX₂VX₃X₄AVEAYDY（SEQ ID NO: 608）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自A、V、R、K或E，其中该氨基酸残基X₂选自Q或G，其中该氨基酸残基X₃选自V、K、Q、H或E，并且其中该氨基酸残基X₄选自R或L。

实施例7.如实施例5或6所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 340-379的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

实施例8.如实施例5至7中任一项所述的ISVD，其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 160的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 143的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 161的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 144的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 161的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 145的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 162的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 146的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 161的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 147的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 161的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 148的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 161的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 149的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 161的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 150的氨基酸序列组成。

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 162的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 148的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 161的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 146的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 162的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 144的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 161的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 146的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 166的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 145的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 162的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 147的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 162的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 149的氨基酸序列组成。

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 162的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 147的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 162的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 150的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 161的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 151的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 163的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 152的氨基酸序列组成。

实施例9.如实施例1至8中任一项所述的ISVD，其氨基酸序列

i)与SEQ ID NO: 340-379的氨基酸序列中的一个具有80%氨基酸序列同一性，其中出于确定氨基酸同一性的程度的目的，形成这些CDR序列的氨基酸残基被忽略；

并且其中：

实施例10.如实施例1至9中任一项所述的ISVD，其基本上由衍生自常规四链抗体的重链可变结构域序列组成，或者基本上由衍生自重链抗体的重链可变结构域序列组成。

实施例11.如实施例1至10中任一项所述的ISVD，其基本上由VHH、人源化VHH、骆驼化VH、结构域抗体、单结构域抗体或dAb组成。

实施例12.如实施例1至11中任一项所述的ISVD，其为人源化ISVD，该人源化ISVD选自由以下组成的组：SEQ ID NO: 341-378，或者选自由以下组成的组：与SEQ ID NO:341-378的氨基酸序列中的至少一个具有大于80%、优选地大于90%、更优选地大于95%、诸如99%或更高氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

实施例13.如实施例1至12中任一项所述的ISVD，其中该氨基酸序列选自由SEQ IDNO: 340-419组成的组。

实施例14.如实施例1至13中任一项所述的ISVD，其中该ISVD特异性结合人PD-L1，解离常数（K_D）为5.10^-9至10^-11摩尔/升或更低，优选为10^-9至5.10^-11摩尔/升或5.10^-10至10^-10摩尔/升，或更优选为10^-10至10^-11摩尔/升，如通过表面等离子体共振测定的。

实施例15.如实施例1至14中任一项所述的ISVD，其中该ISVD特异性结合人PD-L1，k_on速率在10⁴M^-1s^-1至约10⁷M^-1s^-1之间、优选在10⁵M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、更优选在5.10⁵M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、例如在10⁵M^-1s^-1和5.10⁶M^-1s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

实施例16.如实施例1至15中任一项所述的ISVD，其中该ISVD特异性结合人PD-L1，k_off速率在10^-3s^-1（t1/2 = 0.69 s）和10^-6s^-1（提供t1/2为多天的接近不可逆的复合物）之间，优选在10^-3s^-1和5.10^-6s^-1之间，更优选在5.10^-4s^-1和5.10^-6s^-1之间，例如在5.10^-4s^-1和10^-5s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

实施例17.如实施例1至16中任一项所述的ISVD，其中该ISVD与人和食蟹猴PD-L1特异性地结合并且不与该B7家族的其他成员结合。

实施例18.如实施例1至17中任一项所述的ISVD，其中该ISVD特异性结合人和食蟹猴PD-L1并且不结合PD-L2。

实施例19.如实施例1至16中任一项所述的ISVD，其中该ISVD在通过IFN-γ产生监测的TT测定（例如如实例中所述）中的效力（EC50值）为10^-8M或更低，更优选为10^-9M或更低，或甚至为5.10^-10M或更低。例如，在这样的TT测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和10^-8M之间，例如10^-10M和10^-8M之间、10^-10M和10^-9M之间或10^-11M和10^-9M之间的效力（EC50值）。

实施例20.如实施例1至19中任一项所述的ISVD，其中该ISVD在经由IFN-γ产生进行监测的TT测定（例如如实例中所述）中具有至少50%、诸如至少60%、70%、80%、90%、95%的功效。

实施例21.一种多肽或构建体，其包含一种或多种如实施例1至20中任一项所述的ISVD或基本上由该一种或多种ISVD组成，并且任选地进一步包含任选地经由一个或多个接头连接的一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元。

实施例22.如实施例21所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元为氨基酸序列，诸如选自SEQ ID NO: 559、561、568、575、578、580、585、587、589、591和595的多肽中的一个。

实施例23.如实施例21至22中任一项所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个接头是一个或多个氨基酸序列。

实施例24.如实施例21至23中任一项所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元是免疫球蛋白序列。

实施例25.如实施例21至24中任一项所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元是ISVD。

实施例26.如实施例21至25中任一项所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自由以下组成的组：VHH、人源化VHH、骆驼化VH、结构域抗体、单结构域抗体和dAb。

实施例27.如实施例21至26中任一项所述的多肽或构建体，其是多价构建体。

实施例28.如实施例21至27中任一项所述的多肽或构建体，其是多特异性构建体。

实施例29.如实施例24至28中任一项所述的多肽或构建体，其中与没有该一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元的ISVD相比，所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元为该多肽或构建体提供增加的半衰期。

实施例30.如实施例29所述的多肽或构建体，其中为该多肽或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自由以下组成的组：聚乙二醇分子（PEG）、血清蛋白或其片段、与血清蛋白特异性地结合的结合单元、Fc部分以及与血清蛋白特异性地结合的小的蛋白质或肽。

实施例31.如实施例30所述的多肽或构建体，其中为该多肽或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自由以下组成的组：人血清白蛋白或其片段。

实施例32.如实施例30所述的多肽或构建体，其中为该多肽或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自由以下组成的组：与血清白蛋白（诸如人血清白蛋白）或血清免疫球蛋白（诸如IgG）特异性地结合的结合单元。

实施例33.如实施例32所述的多肽或构建体，其中为该多肽或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自由以下组成的组：与血清白蛋白（诸如人血清白蛋白）或血清免疫球蛋白（诸如IgG）特异性地结合的VHH、人源化VHH、骆驼化VH、结构域抗体、单结构域抗体或dAb。

实施例34.如实施例33所述的多肽或构建体，其中为该多肽或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元是特异性结合人血清白蛋白的ISVD。

实施例35.如实施例34所述的多肽或构建体，其中特异性地结合人血清白蛋白的所述ISVD基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

-CDR1（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

a)SEQ ID NO: 43的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

d)SEQ ID NO: 45的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

g)SEQ ID NO: 47的氨基酸序列；

实施例36.如实施例35所述的多肽或构建体，其中CDR1由SEQ ID NO: 43的氨基酸序列组成，CDR2由SEQ ID NO: 45的氨基酸序列组成，并且CDR3由SEQ ID NO: 47的氨基酸序列组成。

实施例37.如实施例34所述的多肽或构建体，其中特异性地结合人血清白蛋白的所述ISVD选自由以下组成的组：ALB8（SEQ ID NO: 27）、ALB23（SEQ ID NO: 28）、ALBX00001（SEQ ID NO: 41）和ALB23002（SEQ ID NO: 42）。

实施例38.如实施例21至37中任一项所述的多肽或构建体，其中所述接头选自由SEQ ID NO: 53至69组成的组。

实施例39.如实施例21至38中任一项所述的多肽或构建体，其进一步包含C末端延伸。

实施例40.如实施例39所述的多肽或构建体，其中所述C末端延伸为C末端延伸(X)_n，其中n为1至10、优选地1至5、诸如1、2、3、4或5（以及优选地1或2，诸如1）；并且每个X为独立地选择的、并且优选地独立地选自由以下组成的组的（优选地天然存在的）氨基酸残基：丙氨酸（A）、甘氨酸（G）、缬氨酸（V）、亮氨酸（L）或异亮氨酸（I）。

实施例41.一种核酸，其编码如实施例1至20中任一项所述的ISVD或如实施例21至40中任一项所述的多肽。

实施例42.如实施例41所述的核酸，其为遗传构建体的形式。

实施例43.一种非人宿主或宿主细胞，其表达或在合适的情况下能够表达如实施例1至20中任一项所述的ISVD或如实施例21至40中任一项所述的多肽；和/或包含如实施例41或42中任一项所述的核酸。

实施例44.一种用于产生如实施例1至20中任一项所述的ISVD或如实施例21至40中任一项所述的多肽的方法，该方法至少包括以下步骤：

a)在合适的宿主细胞或非人宿主生物体中或在另一合适的表达系统中表达如实施例41或42中任一项所述的核酸；

任选地接着：

b)分离和/或纯化如实施例1至20中任一项所述的ISVD，或如实施例21至40中任一项所述的多肽。

实施例45.一种用于产生如实施例1至20中任一项所述的ISVD或如实施例21至40中任一项所述的多肽的方法，所述方法至少包括以下步骤：

a)在使得如实施例43所述的非人宿主或宿主细胞表达和/或产生至少一种如实施例1至20中任一项所述的ISVD或至少一种如实施例21至40中任一项所述的多肽的条件下培养和/或维持所述非人宿主或宿主细胞；

任选地接着：

实施例46.一种组合物，其包含至少一种如实施例1至20中任一项所述的ISVD、至少一种如实施例21至40中任一项所述的多肽或构建体、或至少一种如实施例41或42中任一项所述的核酸。

实施例47.如实施例46所述的组合物，其是药物组合物。

实施例48.如实施例46或47中任一项所述的组合物，其为药物组合物，该药物组合物进一步包含至少一种药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，并且任选地包含一种或多种另外的药学上活性的多肽和/或化合物。

实施例49.如实施例1至20中任一项所述的ISVD、如实施例21至40中任一项所述的多肽或构建体、或如实施例46至47中任一项所述的组合物，其用作药物。

实施例50.如实施例1至20中任一项所述的ISVD、如实施例21至40中任一项所述的多肽或构建体、或如实施例46至47中任一项所述的组合物，其用于诊断、预防和/或治疗至少一种疾病和/或障碍。

实施例51.如实施例1至20中任一项所述的ISVD、如实施例21至40中任一项所述的多肽或构建体、或如实施例46至47中任一项所述的组合物，其用于诊断、预防和/或治疗与PD-L1、与该PD-L1的生物学或药理学活性、和/或与其中涉及PD-L1的生物学途径或信号传导相关联的至少一种疾病和/或障碍。

实施例52.如实施例1至20中任一项所述的ISVD、如实施例21至40中任一项所述的多肽或构建体、或如实施例46至47中任一项所述的组合物，其用于诊断、预防和/或治疗癌症。

实施例53.一种用于诊断、预防和/或治疗至少一种疾病和/或障碍的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用药学上活性的量的如实施例1至20中任一项所述的ISVD、如实施例21至40中任一项所述的多肽或构建体、或如实施例46至47中任一项所述的组合物。

实施例54.如实施例53所述的方法，该方法用于诊断、预防和/或治疗与PD-L1、与该PD-L1的生物学或药理学活性、和/或与其中涉及PD-L1的生物学途径或信号传导相关联的至少一种疾病或障碍，所述方法包括向对其有需要的受试者施用药学上活性的量的至少一种如实施例1至20中任一项所述的ISVD、如实施例21至40中任一项所述的多肽或构建体、或如实施例46至47中任一项所述的组合物。

实施例55.如实施例53或54中任一项所述的方法，该方法用于诊断、预防和/或治疗癌症，所述方法包括向对其有需要的受试者施用药学上活性的量的至少一种如实施例1至20中任一项所述的ISVD、如实施例21至40中任一项所述的多肽或构建体、或如实施例46至47中任一项所述的组合物。

3.3实施例系列18

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 169的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 169的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 169的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 171或175的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 171或175的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 171或175的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 192或193的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO: 192或193的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO: 192或193的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)氨基酸序列GSIFTSAVME（SEQ ID NO: 169）；

b)与氨基酸序列GSIFTSAVME（SEQ ID NO: 169）具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与氨基酸序列GSIFTSAVME（SEQ ID NO: 169）具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)RIGSGGRX₁A（SEQ ID NO: 611）的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自I、R、H、E、K、T、Q、A、S、P和G；

e)与RIGSGGRX₁A（SEQ ID NO: 611）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自I、R、H、E、K、T、Q、A、S、P和G；

f)与RIGSGGRX₁A（SEQ ID NO: 611）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自I、R、H、E、K、T、Q、A、S、P和G；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)VX₁GGYIY（SEQ ID NO: 612）的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自M和I；

h)与VX₁GGYIY（SEQ ID NO: 612）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自M和I；

i)与VX₁GGYIY（SEQ ID NO: 612）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自M和I。

实施例3.如实施例1或2所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 420-450的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

实施例4.如实施例1至3中任一项所述的ISVD，其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 169的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 171的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 192的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 169的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 172的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 169的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 173的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 169的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 174的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 169的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 175的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 169的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 176的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 169的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 177的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 169的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 178的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 169的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 171的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 169的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 179的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 169的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 180的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 169的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 181的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成。

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 197的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 197的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 197的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 198或202的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 198或202的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 198或202的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 192或193的氨基酸序列；

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SAVME（SEQ ID NO: 197）的氨基酸序列；

b)与SAVME（SEQ ID NO: 197）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SAVME（SEQ ID NO: 197）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)RIGSGGRX₁AYX₂DSVKG（SEQ ID NO: 613）的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自I、R、H、E、K、T、Q；A、S、P和G，并且其中该氨基酸残基X₂选自P和V；

e)与RIGSGGRX₁AYX₂DSVKG（SEQ ID NO: 613）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自I、R、H、E、K、T、Q；A、S、P和G，并且其中该氨基酸残基X₂选自P和V；

f)与RIGSGGRX₁AYX₂DSVKG（SEQ ID NO: 613）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自I、R、H、E、K、T、Q；A、S、P和G，并且其中该氨基酸残基X₂选自P和V；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)VX₁GGYIY（SEQ ID NO: 612）的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自M和I；

h)与VX₁GGYIY（SEQ ID NO: 612）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自M和I；

i)与VX₁GGYIY（SEQ ID NO: 612）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自M和I。

实施例7.如实施例5或6所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 420-450的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

实施例8.如实施例5至7中任一项所述的ISVD，其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 198的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 192的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 199的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 200的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 201的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 202的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 203的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 204的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 205的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成。

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 198的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 206的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 207的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 208的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 209的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成。

实施例9.如实施例1至8中任一项所述的ISVD，其氨基酸序列

i)与SEQ ID NO: 420-450的氨基酸序列中的一个具有80%氨基酸序列同一性，其中出于确定氨基酸同一性的程度的目的，形成这些CDR序列的氨基酸残基被忽略；

并且其中：

实施例12.如实施例1至11中任一项所述的ISVD，其为人源化ISVD，该人源化ISVD选自由以下组成的组：SEQ ID NO: 421-449，或者选自由以下组成的组：与SEQ ID NO:421-449的氨基酸序列中的至少一个具有大于80%、优选地大于90%、更优选地大于95%、诸如99%或更高氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

实施例13.如实施例1至12中任一项所述的ISVD，其中该氨基酸序列选自由SEQ IDNO: 420-481组成的组。

实施例14.如实施例1至13中任一项所述的ISVD，其中该ISVD特异性结合人PD-L1，解离常数（K_D）为5.10^-9至10^-11摩尔/升或更低，优选为10^-9至5.10^-11摩尔/升或10^-9至10^-10摩尔/升，或更优选为10^-9至10^-11摩尔/升，如通过表面等离子体共振测定的。

实施例15.如实施例1至14中任一项所述的ISVD，其中该ISVD特异性结合人PD-L1，k_on速率在10⁴M^-1s^-1至约10⁷M^-1s^-1之间、优选在5.10⁴M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、更优选在10⁵M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、例如在5.10⁵M^-1s^-1和5.10⁶M^-1s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

实施例16.如实施例1至15中任一项所述的ISVD，其中该ISVD特异性结合人PD-L1，k_off速率在10^-3s^-1（t1/2 = 0.69 s）和10^-6s^-1（提供t1/2为多天的接近不可逆的复合物）之间，优选在10^-3s^-1和5.10^-6s^-1之间，更优选在10^-4s^-1和10^-6s^-1之间，例如在10^-4s^-1和10^-5s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

实施例19.如实施例1至16中任一项所述的ISVD，其中该ISVD在通过IFN-γ产生监测的TT测定（例如如实例中所述）中的效力（EC50值）为10^-8M或更低，更优选为10^-9M或更低，或甚至为5.10^-10M或更低。例如，在这样的TT测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和10^-8M之间，例如10^-10M和10^-8M之间、10^-10M和5.10^-9M之间或10^-11M和5.10^-9M之间的效力（EC50值）。

实施例22.如实施例21所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元为氨基酸序列，诸如选自SEQ ID NO: 535、536、538、570、576、581、586、588、592、和594的多肽中的一个。

-CDR1（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

a)SEQ ID NO: 43的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

d)SEQ ID NO: 45的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

g)SEQ ID NO: 47的氨基酸序列；

实施例42.如实施例41所述的核酸，其为遗传构建体的形式。

任选地接着：

实施例47.如实施例46所述的组合物，其是药物组合物。

3.4实施例系列16

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 218的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 218的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 218的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 222的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 222的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 222的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 234的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO: 234的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO: 234的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)氨基酸序列ERTFX₁SYSMG（SEQ ID NO: 617），其中该氨基酸残基X₁选自S和G；

b)与氨基酸序列ERTFX₁SYSMG（SEQ ID NO: 617）具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自S和G；

c)与氨基酸序列ERTFX₁SYSMG（SEQ ID NO: 617）具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自S和G；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)X₁IX₂YRGAGPY（SEQ ID NO: 614）的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自V和P，并且其中该氨基酸残基X₂选自G和F；

e)与X₁IX₂YRGAGPY（SEQ ID NO: 614）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自V和P，并且其中该氨基酸残基X₂选自G和F；

f)与X₁IX₂YRGAGPY（SEQ ID NO: 614）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自V和P，并且其中该氨基酸残基X₂选自G和F；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)RDGAVASIPQAFX₁S（SEQ ID NO: 615）的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和T；

h)与RDGAVASIPQAFX₁S（SEQ ID NO: 615）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和T；

i)与RDGAVASIPQAFX₁S（SEQ ID NO: 615）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和T。

实施例3.如实施例1或2所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 482-497的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

实施例4.如实施例1至3中任一项所述的ISVD，其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 218的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 222的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 234的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 218的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 223的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 234的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 218的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 224的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 234的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 219的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 222的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 235的氨基酸序列组成。

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 241的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 241的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 241的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 242的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 242的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 242的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 234的氨基酸序列；

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SYSMG（SEQ ID NO: 241）的氨基酸序列；

b)与SYSMG（SEQ ID NO: 241）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SYSMG（SEQ ID NO: 241）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)X₁IX₂YRGAGPYYEDSVKG（SEQ ID NO: 616）的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自V和P，并且其中该氨基酸残基X₂选自G和F；

e)与X₁IX₂YRGAGPYYEDSVKG（SEQ ID NO: 616）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自V和P，并且其中该氨基酸残基X₂选自G和F；

f)与X₁IX₂YRGAGPYYEDSVKG（SEQ ID NO: 616）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自V和P，并且其中该氨基酸残基X₂选自G和F；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)RDGAVASIPQAFX₁S（SEQ ID NO: 615）的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自A和T；

h)与RDGAVASIPQAFX₁S（SEQ ID NO: 615）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自A和T；

i)与RDGAVASIPQAFX₁S（SEQ ID NO: 615）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自A和T。

实施例7.如实施例5或6所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 482-497的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

实施例8.如实施例5至7中任一项所述的ISVD，其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 241的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 242的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 234的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 241的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 243的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 234的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 241的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 244的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 234的氨基酸序列组成，

或其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 241的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 242的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 235的氨基酸序列组成。

实施例9.如实施例1至8中任一项所述的ISVD，其氨基酸序列

i)与SEQ ID NO: 482-497的氨基酸序列中的一个具有80%氨基酸序列同一性，其中出于确定氨基酸同一性的程度的目的，形成这些CDR序列的氨基酸残基被忽略；

并且其中：

实施例12.如实施例1至11中任一项所述的ISVD，其为人源化ISVD，该人源化ISVD选自由以下组成的组：SEQ ID NO: 483-496，或者选自由以下组成的组：与SEQ ID NO:483-496的氨基酸序列中的至少一个具有大于80%、优选地大于90%、更优选地大于95%、诸如99%或更高氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

实施例13.如实施例1至12中任一项所述的ISVD，其中该氨基酸序列选自由SEQ IDNO: 482-513组成的组。

实施例14.如实施例1至13中任一项所述的ISVD，其中该ISVD特异性结合人PD-L1，解离常数（K_D）为5.10^-9至10^-11摩尔/升或更低，优选为10^-9至5.10^-11摩尔/升或5.10^-10至10^-10摩尔/升，或更优选为10^-9至10^-10摩尔/升，如通过表面等离子体共振测定的。

实施例15.如实施例1至14中任一项所述的ISVD，其中该ISVD特异性结合人PD-L1，k_on速率在10⁵M^-1s^-1至约10⁷M^-1s^-1之间、优选在5.10⁵M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、更优选在10⁶M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、例如在10⁶M^-1s^-1和5.10⁶M^-1s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

实施例16.如实施例1至15中任一项所述的ISVD，其中该ISVD特异性结合人PD-L1，k_off速率在10^-3s^-1（t1/2 = 0.69 s）和10^-6s^-1（提供t1/2为多天的接近不可逆的复合物）之间，优选在10^-3s^-1和5.10^-5s^-1之间，更优选在5.10^-4s^-1和5.10^-5s^-1之间，例如在10^-4s^-1和10^- ⁵s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

实施例22.如实施例21所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元为氨基酸序列，诸如选自SEQ ID NO: 531、549、567、574、579、584的多肽中的一个。

-CDR1（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

a)SEQ ID NO: 43的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

d)SEQ ID NO: 45的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

g)SEQ ID NO: 47的氨基酸序列；

实施例42.如实施例41所述的核酸，其为遗传构建体的形式。

任选地接着：

实施例47.如实施例46所述的组合物，其是药物组合物。

3.5实施例系列17

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 256的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 256的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 256的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 267的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 267的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 267的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 279的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO: 279的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO: 279的氨基酸序列具有43、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

实施例2.如实施例1所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 514的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

实施例3.如实施例1至2中任一项所述的ISVD，其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 256的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 267的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 279的氨基酸序列组成。

实施例4.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 293的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 293的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 293的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 299的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 299的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 299的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 279的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO: 279的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

实施例5.如实施例4所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 514的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

实施例6.如实施例4至5中任一项所述的ISVD，其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 293的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 299的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 279的氨基酸序列组成。

实施例7.如实施例1至6中任一项所述的ISVD，其氨基酸序列

i)与SEQ ID NO: 514的氨基酸序列中的一个具有80%氨基酸序列同一性，其中出于确定氨基酸同一性的程度的目的，形成这些CDR序列的氨基酸残基被忽略；

并且其中：

实施例8.如实施例1至7中任一项所述的ISVD，其基本上由衍生自常规四链抗体的重链可变结构域序列组成，或者基本上由衍生自重链抗体的重链可变结构域序列组成。

实施例9.如实施例1至8中任一项所述的ISVD，其基本上由VHH、人源化VHH、骆驼化VH、结构域抗体、单结构域抗体或dAb组成。

实施例10.如实施例1至9中任一项所述的ISVD，其为人源化ISVD，该人源化ISVD选自由以下组成的组：SEQ ID NO: 514，或者选自由以下组成的组：与SEQ ID NO: 514的氨基酸序列具有大于80%、优选地大于90%、更优选地大于95%、诸如99%或更高氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

实施例11.如实施例1至10中任一项所述的ISVD，其中氨基酸序列选自由SEQ IDNO: 514和520组成的组。

实施例12.如实施例1至11中任一项所述的ISVD，其中该ISVD特异性结合人PD-L1，解离常数（K_D）为10^-8至10^-11摩尔/升或更低，优选为5.10^-9至5.10^-11摩尔/升或5.10^-9至10^-10摩尔/升，或更优选为10^-8至10^-10摩尔/升，如通过表面等离子体共振测定的。

实施例13.如实施例1至12中任一项所述的ISVD，其中该ISVD特异性结合人PD-L1，k_on速率在10⁵M^-1s^-1至约10⁷M^-1s^-1之间、优选在5.10⁵M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、更优选在10⁶M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、例如在10⁶M^-1s^-1和5.10⁶M^-1s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

实施例14.如实施例1至13中任一项所述的ISVD，其中该ISVD特异性结合人PD-L1，k_off速率在10^-2s^-1（t1/2 = 0.69 s）和10^-6s^-1（提供t1/2为多天的接近不可逆的复合物）之间，优选在5.10^-3s^-1和5.10^-6s^-1之间，更优选在5.10^-3s^-1和10^-5s^-1之间，例如在10^-3s^-1和10^- ⁵s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

实施例15.如实施例1至14中任一项所述的ISVD，其中该ISVD与人和食蟹猴PD-L1特异性地结合并且不与该B7家族的其他成员结合。

实施例16.如实施例1至15中任一项所述的ISVD，其中该ISVD特异性结合人和食蟹猴PD-L1并且不结合PD-L2。

实施例17.如实施例1至16中任一项所述的ISVD，其中该ISVD在通过IFN-γ产生监测的TT测定（例如如实例中所述）中的效力（EC50值）为10^-7M或更低，更优选为5.10^-8M或更低，或甚至为10^-8M或更低。例如，在这样的TT测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和10^-7M之间，例如10^-10M和10^-7M之间、10^-10M和5.10^-8之间的效力（EC50值）。

实施例18.如实施例1至17中任一项所述的ISVD，其中该ISVD在经由IFN-γ产生进行监测的TT测定（例如如实例中所述）中具有至少50%、诸如至少60%、70%、80%、90%、95%的功效。

实施例19.一种多肽或构建体，其包含一种或多种如实施例1至18中任一项所述的ISVD或基本上由该一种或多种ISVD组成，并且任选地进一步包含任选地经由一个或多个接头连接的一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元。

实施例20.如实施例19所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元为氨基酸序列，诸如选自SEQ ID NO: 543、545、和548的多肽中的一个。

实施例21.如实施例19至20中任一项所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个接头是一个或多个氨基酸序列。

实施例22.如实施例19至21中任一项所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元是免疫球蛋白序列。

实施例23.如实施例19至22中任一项所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元是ISVD。

实施例24.如实施例19至23中任一项所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自由以下组成的组：VHH、人源化VHH、骆驼化VH、结构域抗体、单结构域抗体和dAb。

实施例25.如实施例19至24中任一项所述的多肽或构建体，其是多价构建体。

实施例26.如实施例19至25中任一项所述的多肽或构建体，其是多特异性构建体。

实施例27.如实施例22至26中任一项所述的多肽或构建体，其中与没有该一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元的ISVD相比，所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元为该多肽或构建体提供增加的半衰期。

实施例28.如实施例27所述的多肽或构建体，其中为该多肽或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自由以下组成的组：聚乙二醇分子（PEG）、血清蛋白或其片段、与血清蛋白特异性地结合的结合单元、Fc部分以及与血清蛋白特异性地结合的小的蛋白质或肽。

实施例29.如实施例28所述的多肽或构建体，其中为该多肽或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自由以下组成的组：人血清白蛋白或其片段。

实施例30.如实施例28所述的多肽或构建体，其中为该多肽或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自由以下组成的组：与血清白蛋白（诸如人血清白蛋白）或血清免疫球蛋白（诸如IgG）特异性地结合的结合单元。

实施例31.如实施例30所述的多肽或构建体，其中为该多肽或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自由以下组成的组：与血清白蛋白（诸如人血清白蛋白）或血清免疫球蛋白（诸如IgG）特异性地结合的VHH、人源化VHH、骆驼化VH、结构域抗体、单结构域抗体或dAb。

实施例32.如实施例31所述的多肽或构建体，其中为该多肽或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元是特异性结合人血清白蛋白的ISVD。

实施例33.如实施例32所述的多肽或构建体，其中特异性地结合人血清白蛋白的所述ISVD基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

-CDR1（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

a)SEQ ID NO: 43的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

d)SEQ ID NO: 45的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

g)SEQ ID NO: 47的氨基酸序列；

实施例34.如实施例33所述的多肽或构建体，其中CDR1由SEQ ID NO: 43的氨基酸序列组成，CDR2由SEQ ID NO: 45的氨基酸序列组成，并且CDR3由SEQ ID NO: 47的氨基酸序列组成。

实施例35.如实施例32所述的多肽或构建体，其中特异性地结合人血清白蛋白的所述ISVD选自由以下组成的组：ALB8（SEQ ID NO: 27）、ALB23（SEQ ID NO: 28）、ALBX00001（SEQ ID NO: 41）和ALB23002（SEQ ID NO: 42）。

实施例36.如实施例19至35中任一项所述的多肽或构建体，其中所述接头选自由SEQ ID NO: 53至69组成的组。

实施例37.如实施例19至36中任一项所述的多肽或构建体，其进一步包含C末端延伸。

实施例38.如实施例37所述的多肽或构建体，其中所述C末端延伸为C末端延伸(X)_n，其中n为1至10、优选地1至5、诸如1、2、3、4或5（以及优选地1或2，诸如1）；并且每个X为独立地选择的、并且优选地独立地选自由以下组成的组的（优选地天然存在的）氨基酸残基：丙氨酸（A）、甘氨酸（G）、缬氨酸（V）、亮氨酸（L）或异亮氨酸（I）。

实施例39.一种核酸，其编码如实施例1至18中任一项所述的ISVD或如实施例19至38中任一项所述的多肽。

实施例40.如实施例39所述的核酸，其为遗传构建体的形式。

实施例41.一种非人宿主或宿主细胞，其表达或在合适的情况下能够表达如实施例1至18中任一项所述的ISVD或如实施例19至39中任一项所述的多肽；和/或包含如实施例39或40中任一项所述的核酸。

实施例42.一种用于产生如实施例1至18中任一项所述的ISVD或如实施例19至38中任一项所述的多肽的方法，该方法至少包括以下步骤：

a)在合适的宿主细胞或非人宿主生物体中或在另一合适的表达系统中表达如实施例39或40中任一项所述的核酸；

任选地接着：

b)分离和/或纯化如实施例1至18中任一项所述的ISVD，或如实施例19至38中任一项所述的多肽。

实施例43.一种用于产生如实施例1至18中任一项所述的ISVD或如实施例19至38中任一项所述的多肽的方法，所述方法至少包括以下步骤：

a)在使得如实施例43所述的非人宿主或宿主细胞表达和/或产生至少一种如实施例1至18中任一项所述的ISVD或至少一种如实施例19至38中任一项所述的多肽的条件下培养和/或维持所述非人宿主或宿主细胞；

任选地接着：

实施例44.一种组合物，其包含至少一种如实施例1至18中任一项所述的ISVD、至少一种如实施例19至38中任一项所述的多肽或构建体、或至少一种如实施例39或40中任一项所述的核酸。

实施例45.如实施例44所述的组合物，其是药物组合物。

实施例46.如实施例44或45中任一项所述的组合物，其为药物组合物，该药物组合物进一步包含至少一种药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，并且任选地包含一种或多种另外的药学上活性的多肽和/或化合物。

实施例47.如实施例1至18中任一项所述的ISVD、如实施例19至38中任一项所述的多肽或构建体、或如实施例44至45中任一项所述的组合物，其用作药物。

实施例48.如实施例1至18中任一项所述的ISVD、如实施例19至38中任一项所述的多肽或构建体、或如实施例44至45中任一项所述的组合物，其用于诊断、预防和/或治疗至少一种疾病和/或障碍。

实施例49.如实施例1至18中任一项所述的ISVD、如实施例19至38中任一项所述的多肽或构建体、或如实施例44至45中任一项所述的组合物，其用于诊断、预防和/或治疗与PD-L1、与该PD-L1的生物学或药理学活性、和/或与其中涉及PD-L1的生物学途径或信号传导相关联的至少一种疾病和/或障碍。

实施例50.如实施例1至18中任一项所述的ISVD、如实施例19至38中任一项所述的多肽或构建体、或如实施例44至45中任一项所述的组合物，其用于诊断、预防和/或治疗癌症。

实施例51.一种用于诊断、预防和/或治疗至少一种疾病和/或障碍的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用药学上活性的量的如实施例1至18中任一项所述的ISVD、如实施例19至38中任一项所述的多肽或构建体、或如实施例44至45中任一项所述的组合物。

实施例52.如实施例51所述的方法，该方法用于诊断、预防和/或治疗与PD-L1、与该PD-L1的生物学或药理学活性、和/或与其中涉及PD-L1的生物学途径或信号传导相关联的至少一种疾病或障碍，所述方法包括向对其有需要的受试者施用药学上活性的量的至少一种如实施例1至18中任一项所述的ISVD、如实施例19至38中任一项所述的多肽或构建体、或如实施例44至45中任一项所述的组合物。

实施例53.如实施例51或52中任一项所述的方法，该方法用于诊断、预防和/或治疗癌症，所述方法包括向对其有需要的受试者施用药学上活性的量的至少一种如实施例1至18中任一项所述的ISVD、如实施例19至38中任一项所述的多肽或构建体、或如实施例44至45中任一项所述的组合物。

3.6实施例系列6

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 257的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 257的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 257的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 268的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 268的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 268的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 280的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO: 280的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO: 280的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

实施例2.如实施例1所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 515的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

实施例3.如实施例1至2中任一项所述的ISVD，其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 257的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 268的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 280的氨基酸序列组成。

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 294的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 294的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 294的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 300的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 300的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 300的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 280的氨基酸序列；

实施例5.如实施例4所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 515的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

实施例6.如实施例4至5中任一项所述的ISVD，其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 294的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 300的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 280的氨基酸序列组成。

实施例7.如实施例1至6中任一项所述的ISVD，其氨基酸序列

i)与SEQ ID NO: 515的氨基酸序列中的一个具有80%氨基酸序列同一性，其中出于确定氨基酸同一性的程度的目的，形成这些CDR序列的氨基酸残基被忽略；

并且其中：

实施例11.如实施例1至10中任一项所述的ISVD，其中氨基酸序列选自由SEQ IDNO: 515和521组成的组。

实施例12.如实施例1至11中任一项所述的ISVD，其中该ISVD特异性结合人PD-L1，解离常数（K_D）为10^-8至10^-11摩尔/升或更低，优选为10^-8至10^-10摩尔/升或5.10^-9至10^-11摩尔/升，或更优选为5.10^-9至10^-10摩尔/升，如通过表面等离子体共振测定的。

实施例14.如实施例1至13中任一项所述的ISVD，其中该ISVD特异性结合人PD-L1，k_off速率在10^-2s^-1（t1/2 = 0.69 s）和10^-6s^-1（提供t1/2为多天的接近不可逆的复合物）之间，优选在10^-2s^-1和5.10^-6s^-1之间，更优选在5.10^-3s^-1和5.10^-6s^-1之间，例如在5.10^-3s^-1和10^-5s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

实施例17.如实施例1至16中任一项所述的ISVD，其中该ISVD在通过IFN-γ产生监测的TT测定（例如如实例中所述）中的效力（EC50值）为10^-8M或更低，更优选为10^-9M或更低，或甚至为5.10^-10M或更低。例如，在这样的TT测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和10^-8M之间，例如10^-10M和10^-8M之间、10^-10M和10^-9M之间或10^-11M和10^-9M之间的效力（EC50值）。

实施例20.如实施例19所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元为氨基酸序列，诸如选自SEQ ID NO: 530和539的多肽中的一个。

-CDR1（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

a)SEQ ID NO: 43的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

d)SEQ ID NO: 45的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

g)SEQ ID NO: 47的氨基酸序列；

实施例40.如实施例39所述的核酸，其为遗传构建体的形式。

任选地接着：

实施例45.如实施例44所述的组合物，其是药物组合物。

3.7实施例系列44

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 258的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 258的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 258的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 269的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 269的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 269的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 281的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO: 281的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO: 281的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

实施例2.如实施例1所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 516的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

实施例3.如实施例1至2中任一项所述的ISVD，其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 258的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 269的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 281的氨基酸序列组成。

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 295的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 295的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 295的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 301的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 301的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 301的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 281的氨基酸序列；

实施例5.如实施例4所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 516的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

实施例6.如实施例4至5中任一项所述的ISVD，其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 295的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 301的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 281的氨基酸序列组成。

实施例7.如实施例1至6中任一项所述的ISVD，其氨基酸序列

i)与SEQ ID NO: 516的氨基酸序列中的一个具有80%氨基酸序列同一性，其中出于确定氨基酸同一性的程度的目的，形成这些CDR序列的氨基酸残基被忽略；

并且其中：

实施例10.如实施例1至9中任一项所述的ISVD，其为人源化ISVD，该人源化ISVD选自由以下组成的组：SEQ ID NO: 516，或者选自由以下组成的组：与SEQ ID NO: 516的氨基酸序列具有大于80%、优选地大于90%、更优选地大于95%、诸如99%或更高氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

实施例11.如实施例1至10中任一项所述的ISVD，其中氨基酸序列选自由SEQ IDNO: 516和522组成的组。

实施例17.如实施例1至16中任一项所述的ISVD，其中该ISVD在通过IFN-γ产生监测的TT测定（例如如实例中所述）中的效力（EC50值）为10^-7M或更低，更优选为5.10^-8M或更低，或甚至为10^-8M或更低。例如，在这样的TT测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和5.10^-8M之间，例如10^-10M和5.10^-8M之间、10^-10M和10^-8M之间或10^-11M和10^-8M之间的效力（EC50值）。

实施例20.如实施例19所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元为氨基酸序列，诸如选自SEQ ID NO: 556和562的多肽中的一个。

-CDR1（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

a)SEQ ID NO: 43的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

d)SEQ ID NO: 45的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

g)SEQ ID NO: 47的氨基酸序列；

实施例40.如实施例39所述的核酸，其为遗传构建体的形式。

任选地接着：

实施例45.如实施例44所述的组合物，其是药物组合物。

3.8实施例系列43

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 259的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 259的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 259的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 270的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 270的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 270的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 282的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO: 282的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO: 282的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

实施例2.如实施例1所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 517的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

实施例3.如实施例1至2中任一项所述的ISVD，其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 259的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 270的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 282的氨基酸序列组成。

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 296的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 296的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 296的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 302的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 302的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 302的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 282的氨基酸序列；

实施例5.如实施例4所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 517的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

实施例6.如实施例4至5中任一项所述的ISVD，其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 296的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 302的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 282的氨基酸序列组成。

实施例7.如实施例1至6中任一项所述的ISVD，其氨基酸序列

i)与SEQ ID NO: 517的氨基酸序列中的一个具有80%氨基酸序列同一性，其中出于确定氨基酸同一性的程度的目的，形成这些CDR序列的氨基酸残基被忽略；

并且其中：

实施例10.如实施例1至9中任一项所述的ISVD，其为人源化ISVD，该人源化ISVD选自由以下组成的组：SEQ ID NO: 517，或者选自由以下组成的组：与SEQ ID NO: 517的氨基酸序列具有大于80%、优选地大于90%、更优选地大于95%、诸如99%或更高氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

实施例11.如实施例1至10中任一项所述的ISVD，其中氨基酸序列选自由SEQ IDNO: 517和523组成的组。

实施例12.如实施例1至11中任一项所述的ISVD，其中该ISVD特异性结合人PD-L1，解离常数（K_D）为10^-8至10^-11摩尔/升或更低，优选为10^-9至5.10^-11摩尔/升或10^-8至10^-10摩尔/升，或更优选为10^-9至10^-10摩尔/升，如通过表面等离子体共振测定的。

实施例20.如实施例19所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元为氨基酸序列，诸如选自SEQ ID NO: 557和565的多肽中的一个。

-CDR1（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

a)SEQ ID NO: 43的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

d)SEQ ID NO: 45的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

g)SEQ ID NO: 47的氨基酸序列；

实施例40.如实施例39所述的核酸，其为遗传构建体的形式。

任选地接着：

实施例45.如实施例44所述的组合物，其是药物组合物。

3.9实施例系列46

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 260的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 260的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 260的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 271的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 271的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 271的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 283的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO: 283的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO: 283的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

实施例2.如实施例1所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 518的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

实施例3.如实施例1至2中任一项所述的ISVD，其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 260的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 271的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 283的氨基酸序列组成。

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 297的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 297的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 297的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 303的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 303的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 303的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 283的氨基酸序列；

实施例5.如实施例4所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 518的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

实施例6.如实施例4至5中任一项所述的ISVD，其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 297的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 303的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 283的氨基酸序列组成。

实施例7.如实施例1至6中任一项所述的ISVD，其氨基酸序列

i)与SEQ ID NO: 518的氨基酸序列中的一个具有80%氨基酸序列同一性，其中出于确定氨基酸同一性的程度的目的，形成这些CDR序列的氨基酸残基被忽略；

并且其中：

实施例10.如实施例1至9中任一项所述的ISVD，其为人源化ISVD，该人源化ISVD选自由以下组成的组：SEQ ID NO: 518，或者选自由以下组成的组：与SEQ ID NO: 518的氨基酸序列具有大于80%、优选地大于90%、更优选地大于95%、诸如99%或更高氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

实施例11.如实施例1至10中任一项所述的ISVD，其中氨基酸序列选自由SEQ IDNO: 518和524组成的组。

实施例20.如实施例19所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元是氨基酸序列，如具有SEQ ID NO: 558的多肽。

-CDR1（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

a)SEQ ID NO: 43的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

d)SEQ ID NO: 45的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

g)SEQ ID NO: 47的氨基酸序列；

实施例40.如实施例39所述的核酸，其为遗传构建体的形式。

任选地接着：

实施例45.如实施例44所述的组合物，其是药物组合物。

3.10实施例系列45

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 262的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 262的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 262的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 272的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 272的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 272的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 284的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO: 284的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO: 284的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

实施例2.如实施例1所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 519的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

实施例3.如实施例1至2中任一项所述的ISVD，其中

-CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 262的氨基酸序列组成；

-CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 272的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 284的氨基酸序列组成。

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 298的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 298的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 298的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 304的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 304的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 304的氨基酸序列具有6、5、4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 284的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO: 284的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

实施例5.如实施例4所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 519的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

实施例6.如实施例4至5中任一项所述的ISVD，其中

-CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 298的氨基酸序列组成；

-CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 304的氨基酸序列组成；以及

-CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 284的氨基酸序列组成。

实施例7.如实施例1至6中任一项所述的ISVD，其氨基酸序列

i)与SEQ ID NO: 519的氨基酸序列中的一个具有80%氨基酸序列同一性，其中出于确定氨基酸同一性的程度的目的，形成这些CDR序列的氨基酸残基被忽略；

并且其中：

实施例10.如实施例1至9中任一项所述的ISVD，其为人源化ISVD，该人源化ISVD选自由以下组成的组：SEQ ID NO: 519，或者选自由以下组成的组：与SEQ ID NO: 519的氨基酸序列具有大于80%、优选地大于90%、更优选地大于95%、诸如99%或更高氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

实施例11.如实施例1至10中任一项所述的ISVD，其中氨基酸序列选自由SEQ IDNO: 519和525组成的组。

实施例20.如实施例19所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元为氨基酸序列，诸如选自SEQ ID NO: 566和573的多肽中的一个。

-CDR1（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

a)SEQ ID NO: 43的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

d)SEQ ID NO: 45的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

g)SEQ ID NO: 47的氨基酸序列；

实施例40.如实施例39所述的核酸，其为遗传构建体的形式。

任选地接着：

实施例45.如实施例44所述的组合物，其是药物组合物。

4附图说明

图1：独特测序的抗PD-L1克隆对人、食蟹猴和小鼠PD-L1的解离速率。使用Proteon上的表面等离子共振测量解离速率。(A) 点图；(B) 显示交叉反应性的点图。

图2：一些纯化的抗PD-L1 VHH在表达人PD-L1的CHO细胞上的FACS竞争谱。竞争物是人PD-1。

图3：一些纯化的抗PD-L1 VHH在ES-2细胞上的FACS竞争谱。竞争物是人PD-1。

图4：不同批次的单价ISVD10F11（ISVD86）、二价ISVD10F11（ISVD87）、二价ISVD36E11（ISVD84）和基准1在ES-2细胞上的FACS竞争谱，以人PD-1作为竞争物。

图5：与基准1相比，用单价和二价36E11、10F11和52A01的TT测定中的IFN-γ生产。

图6：与基准5相比，用单价ISVD10F11（ISVD40）的TT测定中的IFN-γ生产。

图7：用包含亲本CDR序列的单价ISVD和包含序列优化的CDR序列的ISVD的TT测定中的IFN-γ生产。(A) A025502469、A025503388和二价基准；(B) A025502469、A025503357、A025503359；(C) A025501511、A025502467、A02552469；(D) A025501511、A025502470、A02552471。

图8：通过低温电子显微镜（cryo-EM）确定ISVD10F11/PD-L1相互作用位点的结构。ISVD10F11被作为顶部分子描绘。下面显示的延伸环是CDR3。右边的环是ISVD10F11的CDR2。底部所示的分子是PD-L1。

5具体实施方式

5.1定义

除非另有说明或定义，所使用的所有术语均具有其在本领域中的通常含义，这对于技术人员来说是清楚的。例如参考标准手册，例如Sambrook等人（Molecular Cloning: ALaboratory Manual [分子克隆：实验室手册]（第二版）第1至3卷, 冷泉港实验室出版社,1989）、F. Ausubel等人（Current protocols in molecular biology [分子生物学实验指南], Green Publishing[格林出版社]和Wiley Interscience[威利交叉科学出版社], 纽约, 1987）、Lewin（Genes II [基因II], John Wiley&Sons[约翰·威利父子出版公司],纽约, 纽约州, 1985）、Old等人（Principles of Gene Manipulation: An Introductionto Genetic Engineering[基因操作原理：基因工程导论]（第二版）加州大学出版社, 伯克利, 加利福尼亚州, 1981）；Roitt等人（Immunology [免疫学] (第6版) Mosby/爱思唯尔,爱丁堡, 2001）、Roitt等人（Roitt's Essential Immunology [Roitt免疫学基础](第10版) 布莱克威尔出版社, 英国, 2001）和Janeway等人（Immunobiology [免疫生物学] (第6版) 格兰科学出版社[Garland Science Publishing]/丘吉尔利文斯通出版社[Churchill Livingstone], 纽约, 2005）以及本文所引用的一般背景技术。

如对于技术人员而言将清楚的是，除非另有说明，否则所有未具体地详细描述的方法、步骤、技术和操作都可以本身已知的方式被执行以及已经以本身已知的方式被执行。例如，再次参考本文提到的标准手册和一般背景技术以及其中引用的进一步参考文献；以及例如以下综述Presta（Adv. Drug Deliv. Rev. . [先进药物递送综述]58 (5-6): 640-56, 2006），Levin和Weiss（Mol. Biosyst.[分子生物系统]2(1): 49-57, 2006）、Irving等人（J. Immunol. Methods [免疫学方法杂志] 248(1-2): 31-45, 2001）、Schmitz等人（Placenta 21 [胎盘21]增刊A: S106-12, 2000）、Gonzales等人（Tumour Biol. [肿瘤生物学] 26(1): 31-43, 2005），它们描述了用于蛋白质工程（诸如亲和力成熟）的技术以及用于改善蛋白质（诸如免疫球蛋白）的特异性和其他期望特性的其他技术。

如本文所用，术语“序列”（例如在术语如“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白质序列”中）一般应理解为包括相关氨基酸序列以及编码该相关氨基酸序列的核酸或核苷酸序列两者，除非上下文需要更有限的解释。

氨基酸残基将根据标准的三字母或一字母氨基酸代码来表示。参考WO 08/020079第48页的表A-2。

当核酸或氨基酸已与所述来源或介质中该核酸或氨基酸通常与其相关联的至少一种其他组分（诸如另一核酸、另一蛋白质/多肽、另一生物学组分或大分子、或至少一种污染物、杂质或微量组分）分离时，该核酸或氨基酸被认为是“（呈）（基本上）分离的（形式）”，例如，与已从其获得该核酸或氨基酸的反应介质或培养基相比。特别地，当核酸或氨基酸已被纯化至少2倍、特别地至少10倍、更特别地至少100倍、以及高达1000倍或更多倍时，该核酸或氨基酸被认为是“（基本上）分离的”。“呈（基本上）分离的形式”的核酸或氨基酸优选地是基本上均质的，如使用合适的技术（诸如合适的色谱技术，诸如聚丙烯酰胺-凝胶电泳）所确定的。

当核苷酸序列或氨基酸序列分别被称为“包含”另一核苷酸序列或氨基酸序列，或被称为“基本上由”另一核苷酸序列或氨基酸序列“组成”时，这可意味着后一核苷酸序列或氨基酸序列分别已被掺入到首先提到的核苷酸序列或氨基酸序列中，但更通常地，这一般意味着首先提到的核苷酸序列或氨基酸序列分别在其序列内包含分别具有与后一序列相同的核苷酸序列或氨基酸序列的一段核苷酸或氨基酸残基，而不管首先提到的序列已如何实际上生成或获得（这可例如通过本文所述的任何合适的方法来实现）。通过非限制性实例，当多肽被称为包含免疫球蛋白单可变结构域时，这可意味着所述免疫球蛋白单可变结构域序列已被掺入到该多肽的序列中，但更通常地，这一般意味着该多肽在其序列内含有这些免疫球蛋白单可变结构域的序列，而不管所述多肽已如何生成或获得。此外，当核酸或核苷酸序列被称为包含另一核苷酸序列时，首先提到的核酸或核苷酸序列优选地为使得当其被表达成表达产物（例如多肽）时，由后一核苷酸序列编码的氨基酸序列形成所述表达产物的一部分（换言之，该后一核苷酸序列与首先提到的较大的核酸或核苷酸序列处于相同的阅读框中）。

提及“（基本上）由……组成”意味着后一核酸序列或氨基酸序列与多肽（例如CDR区；ISVD）完全相同或与多肽（例如CDR区；ISVD）相对应，其具有添加在免疫球蛋白单可变结构域的氨基末端处、羧基末端处、或氨基末端和羧基末端两者处的有限数量的氨基酸残基，诸如1至20个氨基酸残基、例如1至10个氨基酸残基、以及优选地1至6个氨基酸残基、诸如1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸残基。

出于比较两个或更多个氨基酸序列的目的，第一氨基酸序列与第二氨基酸序列之间的“序列同一性”的百分比可通过将[该第一氨基酸序列中与该第二氨基酸序列中的对应位置处的氨基酸残基相同的氨基酸残基的数量]除以[该第一氨基酸序列中的氨基酸残基的总数]并且乘以[100%]来计算，其中该第二氨基酸序列中的氨基酸残基的每个缺失、插入、取代或添加（与该第一氨基酸序列相比）被认为是单一氨基酸残基处（即单一位置处）的差异。通常，出于根据上文概述的计算方法来确定两个氨基酸序列之间的“序列同一性”百分比的目的，将把带有最大数量的氨基酸残基的氨基酸序列作为该“第一”氨基酸序列，并且将把另一个氨基酸序列作为该“第二”氨基酸序列。

如本文所用，“氨基酸差异”是指相对于参考序列单个氨基酸残基的缺失、插入或取代。在一个实施例中，“氨基酸差异”是取代。在一个实施例中，氨基酸取代是保守取代。此类保守取代是其中以下组 (a) - (e) 内的一个氨基酸被同一组内的另一氨基酸残基取代的取代：(a) 小的脂肪族、非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b) 极性、带负电的残基及其（不带电的）酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c) 极性、带正电荷的残基：His、Arg和Lys；(d) 大的脂肪族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；和 (e) 芳香族残基：Phe、Tyr和Trp。在一个实施例中，保守取代如下：Ala取代为Gly或取代为Ser；Arg取代为Lys；Asn取代为Gln或His；Asp取代为Glu；Cys取代为Ser；Gln取代为Asn；Glu取代为Asp；Gly取代为Ala或Pro；His取代为Asn或取代为Gln；Ile取代为Leu或取代为Val；Leu取代为Ile或取代为Val；Lys取代为Arg、取代为Gln或取代为Glu；Met取代为Leu、取代为Tyr或取代为Ile；Phe取代为Met、取代为Leu或取代为Tyr；Ser取代为Thr；Thr取代为Ser；Trp取代为Tyr；Tyr取代为Trp；和/或Phe取代为Val、取代为Ile或取代为Leu。

如本说明书中所用，“VHH家族”是指一组VHH序列，该组VHH序列具有相同的长度（即它们在它们的序列内具有相同数量的氨基酸），并且其中位置8与位置106（根据Kabat编号）之间的氨基酸序列具有89%或更高的氨基酸序列同一性。

术语“表位”和“抗原决定簇”可以可互换地使用，是指被抗原结合分子（诸如免疫球蛋白、常规抗体或免疫球蛋白单可变结构域）、并且更特别地被所述分子的该抗原结合位点识别的大分子（诸如多肽或蛋白质（例如，PD-L1））的部分。表位定义了免疫球蛋白的最小结合位点，因此代表了免疫球蛋白的特异性的靶标。抗原结合分子（例如免疫球蛋白、常规抗体、免疫球蛋白单可变结构域）识别表位的部分称为“互补位”。

可变结构域（诸如免疫球蛋白单可变结构域）的这些框架区形成提供该结构域的结构框架的β片，而这些高变序列与β桶的外边缘处的在折叠结构域中并置的三个环相对应。这些高变环聚集在一起，在分子尖端形成单个高变位点。这是抗原的结合位点、抗原结合位点或互补位。三个高变环通过形成与抗原互补的表面来确定抗原特异性，并且更通常称为互补决定区或CDR（CDR1、CDR2和CDR3）。因此，CDR并置形成的抗体分子表面产生了抗原结合位点。

抗体通常仅识别大分子（例如蛋白质）表面的小区域。抗体识别的结构称为抗原决定簇或表位。这些位点可能由来自多肽链不同部分的氨基酸构成，这些氨基酸通过蛋白质折叠聚集在一起。这种抗原决定簇被称为构象或不连续表位，因为所识别的结构是由在该抗原的氨基酸序列中不连续但在该三维结构中聚集在一起的蛋白质片段构成的。相反，由单个多肽链区段构成的表位被称为连续或线性表位。

抗体抗原结合位点（互补位）与其表位之间的结合是可逆的非共价相互作用。参与这些非共价相互作用的力或键是静电力、氢键、范德华力和疏水力。静电相互作用发生在带电氨基酸侧链之间，如盐桥。电偶极子之间也会发生相互作用，如氢键，或者可能涉及短程范德华力。当两个疏水表面聚集在一起排除水时，就会发生疏水相互作用。对于某些抗原，疏水相互作用可能占大部分结合能。

这些力中的每一个对整体相互作用的贡献取决于所涉及的特定抗体和抗原。抗体与蛋白质抗原的相互作用和大多数其他天然蛋白质-蛋白质相互作用之间的显著区别是抗体在其抗原结合位点具有许多芳香族氨基酸。这些氨基酸主要参与范德华力和疏水相互作用，有时也参与氢键。一般来说，疏水力和范德华力在非常短的范围内起作用，并将两个形状互补的表面拉在一起：一个表面上的丘必须适合另一表面上的谷，以实现良好的结合。相反，带电侧链之间的静电相互作用以及桥接氧和/或氮原子的氢键可适应特定的特征或反应基团，同时增强整体相互作用。

该抗体抗原结合位点（互补位）与其表位之间的这些非共价相互作用中的一个中所涉及的氨基酸也被称为“形成”抗原结合位点（互补位）与表位之间的“相互作用位点”。

可“与”某一表位、抗原或蛋白质（或对于其至少一部分、片段或表位）“结合”、或“与”某一表位、抗原或蛋白质（或对于其至少一部分、片段或表位）“特异性地结合”、“具有针对”某一表位、抗原或蛋白质（或对于其至少一部分、片段或表位）“的亲和力”和/或“具有针对”某一表位、抗原或蛋白质（或对于其至少一部分、片段或表位）“的特异性”的多肽（诸如免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、或一般地抗原结合分子或其片段）被称为是“针对（against）”或“针对（directed against）”所述表位、抗原或蛋白质的，或者是与此类表位、抗原或蛋白质有关的“结合”分子，或者被称为是“抗”表位、“抗”抗原或“抗”蛋白质（例如，“抗”PD-L1）。

术语“特异性”、“特异性地结合”或“特异性结合”是指来自相同生物体的不同靶分子（诸如抗原）的数目，特定结合单元（诸如ISVD）可以以足够高的亲和力与这些靶分子结合（参见下文）。“特异性”、“特异性地结合”或“特异性结合”在本文中可与“选择性”、“选择性地结合”或“选择性结合”互换使用。结合单元，例如ISVD，特异性结合到它们的指定靶标。结合单元的特异性/选择性可基于亲和力来确定。亲和力表示分子相互作用的强度或稳定性。亲和力通常由KD或解离常数给出，单位为摩尔/升（或M）。亲和力也可以表示为缔合常数KA，其等于1/KD，单位为（mol/升）^-1（或M^-1）。

亲和力是部分和靶分子上的结合位点之间的结合强度的量度：KD值越低，靶分子与靶向部分之间的结合强度越强。通常，本技术中使用的结合单元（例如ISVD）将以10^-5至10^-12摩尔/升或更低、10^-7至10^-12摩尔/升或更低、或10^-8至10^-12摩尔/升的解离常数（KD）与其靶标结合（即，缔合常数（KA）为10⁵至10¹²升/摩尔或更多、10⁷至10¹²升/摩尔或更多、或10⁸至10¹²升/摩尔）。任何大于10^-4mol/L的KD值（或任何低于10⁴升/mol的KA值）通常被认为表明非特异性结合。被认为是特异性的生物相互作用（例如免疫球蛋白序列与抗原的结合）的KD通常在10^-5摩尔/升（10000 nM或10 µM）至10^-12摩尔/升（0.001 nM或1 pM）或更低的范围内。

因此，特异性/选择性结合可以指 - 使用相同的测量方法，例如SPR-结合单元（或包含其的多肽）以10^-5至10^-12摩尔/升或更低的KD值结合PD-L1，并以大于10^-4摩尔/升的KD值结合相关的B7家族成员。相关B7家族成员的实例是PD-L2。因此，在本技术的实施例中，ISVD以10^-5至10^-12摩尔/升或更低的KD值与（人）PD-L1结合，并以大于10^-4摩尔/升的KD值与同一物种的PD-L2结合。

与来自某一物种的某一靶标的特异性结合并不排除结合单元也可以与来自不同物种的类似靶标特异性结合。例如，与人PD-L1的特异性结合并不排除结合单元或包含其的多肽也可以与来自食蟹猴（“cyno”）的PD-L1特异性结合。

结合单元与其指定靶标的特异性结合可以通过本身已知的任何合适的方式（包括例如Scatchard分析和/或竞争性结合测定，诸如放射免疫测定（RIA）、酶免疫测定（EIA）和三明治竞争测定法）和本领域本身已知的其不同变体；以及本文进一步提到的其他技术。

解离常数可以是本领域技术人员清楚的实际或表观解离常数。用于确定解离常数的方法对本领域技术人员来说是清楚的，并且例如包括本文提到的技术。在这方面，还清楚的是，可能无法测量超过10^-4摩尔/升或10^-3摩尔/升（例如，10^-2摩尔/升）的解离常数。任选地，如对于本领域技术人员还将清楚的，该（实际或表观）解离常数可基于该（实际或表观）缔合常数（KA）通过关系式[KD = 1/KA]来计算。

氨基酸序列被称为对于两种不同的抗原或抗原决定簇（诸如例如，来自两个不同的哺乳动物物种的血清白蛋白，诸如例如，人血清白蛋白和食蟹猴血清白蛋白，诸如例如，来自不同的哺乳动物物种的PD-L1，诸如例如，人PD-L1、食蟹猴PD-L1和小鼠PD-L1）是“交叉反应性的”，前提是如果其对于（如本文所定义）这些不同的抗原或抗原决定簇是特异性的。

术语“阻断”、“拮抗”、“竞争（compete）”、“进行竞争（competing）”和“竞争（competition）”在本文中可互换地用于意指免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合剂干扰另一蛋白质、多肽、配体或结合剂与给定靶标的结合的能力。免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合剂能够干扰另一配体与靶标的结合的程度以及因此是否其可被称为“阻断”可使用竞争结合测定来确定。特别合适的定量竞争性阻断测定在实例中描述并且包括例如使用细胞上表达的PD-L1进行荧光活化细胞分选（FACS）结合测定。阻断的程度可以通过（减少的）通道荧光来测量。

下面一般描述了用于确定免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合剂是否阻断或能够进行阻断的合适的FACS测定。应当理解，该测定可以与本文描述的任何免疫球蛋白单可变结构域和多肽一起使用。FACS仪器（例如，FACS Canto；碧迪公司（Becton-Dickinson））按照制造商的建议进行操作。

为了评估两种结合剂（诸如免疫球蛋白单可变结构域与天然配体或另一结合剂）之间对于结合PD-L1的“阻断”或“竞争”，可使用过表达人PD-L1的细胞（诸如例如Flp-In™-293细胞）和作为背景细胞系的亲代细胞来执行FACS竞争实验。可使用不同的检测试剂，包括例如单克隆ANTI-FLAG® M2抗体（西格玛奥德里奇公司（Sigma-Aldrich），目录号F1804）、单克隆抗C-myc抗体（西格玛奥德里奇公司，目录号WH0004609M2）、单克隆抗HIS标签抗体（西格玛奥德里奇公司，目录号SAB1305538），每种检测试剂以不同的方式标记。广泛范围的荧光团可用作流式细胞术中的标记（例如PE（R-藻红蛋白）、7-氨基放线菌素D（7-AAD）、吖啶橙、各种形式的Alexa Fluor、别藻蓝蛋白（APC）、AmCyan、氨基香豆素、APC Cy5、APC Cy7、APC-H7、APC/Alexa Fluor 750、AsRed2、阿扎米绿（Azami-Green）、石青、B ODIPYFL C5-神经酰胺、BCECF-AM、双氧喏DiBAC2(3)、BODIPY-FL、钙黄绿素、钙黄绿素AM、Caroxy-H2DCFDA、层叠蓝、层叠黄、细胞示踪绿、天蓝、CFSE、色霉素A3、CM-H2DCFDA、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy3B、Cy5、Cy5.5、Cy7、CyPet、DAF-FM DAF-FM二乙酸酯、DAPI、DCFH（2'7'二氯二氢荧光素）、DHR、二氢钙黄绿素AM、二氢罗丹明、二氢噻啶、DiLC1(5)、DiOC6(3)、DiOC7(3)、dKeima-红、DRAQ5、Dronpa-绿、各种形式的DsRed dTomato、各种形式的DyLight、大肠杆菌生物颗粒AF488、E2-深红、E2-橙、EBFP2、ECFP、各种形式的eFluor、EGFP、EGFP、翠绿、eqFP650、eqFP670、ER-示踪蓝-白DPX、溴化乙锭、Express2、EYFP、Fc OxyBurst绿、Fc OxyBurstGreen 123、FITC、氟-3、氟-4、荧光素、Fura-2、Fura-红、GFPuv、H2DCFDA、HcRed1、Hoechst蓝（33258）、Hoechst红（33342）、羟基香豆素、HyPer、Indo-1、Indo-1蓝（低Ca2+）、Indo-1紫（高Ca2+）、iRFP、J-红、JC-1、JC-9、Katushka（TurboFP635）、Katushka2 Kusabira-橙、LDS 751、丽丝胺罗丹明B、各种形式的生/死、Lucifer黄、Lucifer黄CH、Lyso示踪蓝、Lyso示踪绿、Lyso示踪红、mAmertrine、玛丽娜蓝、mBanana、mCFP、mCherry、mCitrine、甲氧基香豆素、mHoneyDew、Midoriishi-青、光神霉素、Mito示踪深红、Mito示踪绿、Mito示踪橙、Mito示踪红、MitoFluor绿、mKate（TagFP635）、mKate2、mKeima、mKeima-红、mKO、mKOk、mNeptune、Monochlorobimane、mOrange、mOrange2、mRaspberry、mPlum、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTarquoise、mTFP1、mTFP1（Teal）、NBD、OxyBurst绿H2DCFDA、OxyBurst绿H2HFFBSA、太平洋蓝、PE（R-藻红蛋白）、PE Cy5、PE Cy5.5、PE Cy7、PE德克萨斯红、PE-Cy5缀合物、PE-Cy7缀合物、PerCP（多甲藻素叶绿素蛋白）、PerCP Cy5.5、PhiYFP、PhiYFP-m、碘化丙啶（PI）、各种形式的Qdot、红613、RFP Tomato、Rhod-2、S65A、S65C、S65L、S65T、单态氧传感器绿、Sirius、SNARF、Superfolder GFP、SYTOX蓝、SYTOX绿、SYTOX橙、T-天蓝、TagBFP、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagRFP657、TagYFP、tdTomato、德克萨斯红、噻唑橙、TMRE、TMRM,Topaz、TOTO-1、TO-PRO-1、TRITC、TRITC TruRed、TurboFP602、TurboFP635、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、Venus、Vybrant CycleDye紫、野生型GFP、X-罗丹明、Y66F、Y66H、Y66W、YOYO-1、YPet、ZsGreen1、ZsYellow1、Zymosan A生物颗粒AF488（更多信息请访问：http://www.thefcn.org/flow- Fluorochromes）。荧光团，或简称为“荧光体”，通常附接在识别PD-L1的抗体（例如免疫球蛋白单可变结构域）或用作检测试剂的抗体上。多种缀合抗体是可用的，例如（但不限于）与Alexa Fluor®、DyLight®、罗丹明、PE、FITC和Cy3缀合的抗体。每个荧光团都有一个特征峰值激发和发射波长。可以使用的标记组合将取决于用于激发荧光团的一个或多个灯或一个或多个激光的波长以及可用的检测器。

为了评估两种测试结合剂（被称为A和B）之间对于与PD-L1结合的竞争，将稀释系列的冷（没有任何标记）的结合剂A与经标记的结合剂B一起添加到（例如，200 000个）细胞。测试混合物中结合剂B的浓度应足够高，以轻松饱和细胞上表达的PD-L1上的结合位点。使针对这些细胞上表达的PD-L1上的该结合剂的这些结合位点饱和的结合剂B的浓度可用这些PD-L1细胞上的滴定系列的结合剂B以及对针对结合的EC50值的确定来确定。为了在饱和浓度下工作，结合剂B可以以100x EC50浓度使用。

将细胞与结合剂A和结合剂B的混合物一起孵育并洗涤细胞后，可以在FACS上进行读数。首先，根据散射谱对完整细胞设置门，并记录通道荧光的总量。还制备了结合剂B的单独溶液。该溶液中的结合剂B应与测试混合物（具有结合剂A和B）处于相同的缓冲液中且浓度相同。该单独溶液也被添加到细胞。孵育和细胞洗涤后，可以在FACS上进行读数。首先，根据散射谱对完整细胞设置门，并记录通道荧光的总量。与用单独的结合剂B溶液孵育的细胞的荧光相比，用结合剂A和B的混合物孵育的细胞的荧光的减少表明结合剂A阻断通过结合剂B与这些细胞上表达的PD-L1的结合。

交叉阻断性免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合剂是这样的结合剂，其将在上述竞争FACS中与PD-L1结合，使得在该测定期间以及在该第二结合剂的存在下，所记录的荧光为最大荧光（针对单独的经标记的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合剂所测量的）的80%与0.1%（例如80%与4%）之间、具体地该最大荧光的75%与0.1%（例如75%与4%）之间、以及更具体地最大荧光的70%与0.1%（例如70%与4%）之间（如上文刚刚定义的）。

两种测试结合剂（被称为A和B）针对与PD-L1结合的竞争也可通过将两种结合剂（每种用不同的荧光团标记）添加到这些PD-L1表达细胞来评估。孵育和细胞洗涤后，可以在FACS上进行读数。为每个荧光团设置门，并记录通道荧光的总量。荧光团之一的荧光减少和/或缺失表明结合剂阻断了与细胞上表达的PD-L1的结合。

用于确定针对靶标阻断的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合剂是否能够阻断、竞争性地结合或具有竞争性（如本文所定义）的其他方法描述于例如Xiao-Chi Jia等人（Journal of Immunological Methods [免疫学方法杂志] 288: 91-98, 2004）、Miller等人（Journal of Immunological Methods [免疫学方法杂志]365:118-125, 2011）中。

如本文所用，术语“效力”是药剂例如ISVD或多肽的生物活性的量度。药剂的效力可以通过本领域已知的任何合适的方法来确定，例如实验部分中所描述的。基于细胞培养的效力测定通常是用于确定生物学活性的首选形式，因为它们测量由试剂引发的生理应答并且可在相对短的时间段内生成结果。基于产物的作用机制，可使用各种类型的基于细胞的测定，诸如例如，破伤风类毒素自生抗原特异性共培养测定或NFAT报告基因测定（如实例部分中进一步描述的）。

相反，诸如ISVD或多肽的药剂的“功效”衡量在饱和药剂浓度下其效果本身的最大强度。功效表示药剂可实现的最大应答。它是指药剂产生所期望（治疗）效果的能力。可以使用体外功能测定或体内模型来评估药剂的功效。

5.2免疫球蛋白单可变结构域

本技术旨在提供治疗与PD-L1相关的疾病的新颖药物。发明人出人意料地发现，免疫球蛋白单可变结构域（ISVD）包含由SEQ ID NO: 11的氨基酸序列组成的CDR1；由SEQ IDNO: 13或14的氨基酸序列组成的CDR2；以及由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成的CDR3可用于更强力和有效地阻断PD-L/PD-1相互作用以及治疗与PD-L1相关联的疾病。发明人确定了ISVD与PD-L之间的相互作用（对该相互作用的阻断引起对PD1/PD-L1信号传导非常有效和强力的抑制）中所涉及的PD-L1上的位点。阻断该相互作用位点足以抑制PD1/PD-L1信号传导。此外，PD-L1或表位上的这个相互作用位点可以被单可变结构域阻断。出人意料的是，发明人确定免疫球蛋白单可变结构域中仅2个CDR参与跟PD-L1的这种相互作用以及PD/PD-L1相互作用的阻断。因此，发明人观察到免疫球蛋白可变结构域的仅2个CDR（CDR2和CD3）足以阻断PD/PD-L1相互作用。

术语“免疫球蛋白单可变结构域”（ISVD）可与“单可变结构域”互换使用，定义了其中抗原结合位点存在于单个免疫球蛋白结构域上并由其形成的免疫球蛋白分子。这将免疫球蛋白单一可变结构域与“常规”免疫球蛋白（例如单克隆抗体）或其片段（诸如Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、di-scFv）分开，其中两个免疫球蛋白结构域，特别是两个可变结构域相互作用以形成抗原结合位点。通常，在常规免疫球蛋白中，重链可变结构域（VH）和轻链可变结构域（VL）相互作用以形成抗原结合位点。在这种情况下，VH和VL的互补决定区（CDR）将有助于抗原结合位点，即总共6个CDR将参与抗原结合位点的形成。

鉴于上述定义，常规4链抗体（诸如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子；本领域已知）的抗原结合结构域或Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段（诸如二硫键连接的Fv或scFv片段）或衍生自此类常规4链抗体的双抗体（所有均为本领域已知）的抗原结合结构域通常不被认为是免疫球蛋白单一可变结构域，因为在这些情况下，与抗原的相应表位的结合通常不是通过一个（单一）免疫球蛋白结构域发生的，而是通过一对（缔合）免疫球蛋白结构域诸如轻链和重链可变结构域发生的，即通过免疫球蛋白结构域的VH-VL对，其共同结合至相应抗原的表位。

相反，免疫球蛋白单一可变结构域能够特异性结合至抗原的表位而不与额外的免疫球蛋白可变结构域配对。免疫球蛋白单一可变结构域的结合位点由单一VH、单一VHH或单一VL结构域形成。

因此，单可变结构域可以是轻链可变结构域序列（例如，VL序列）或其合适的片段；或重链可变结构域序列（例如，VH序列或VHH序列）或其合适的片段；只要其能够形成单一抗原结合单元（即，基本上由单一可变结构域组成的功能性抗原结合单元，使得单一抗原结合结构域不需要与另一可变结构域相互作用以形成功能性抗原结合单元）。

免疫球蛋白单可变结构域（ISVD）可以例如是重链ISVD，诸如VHH（包括人源化VHH）、VH（包括骆驼化VH和人VH）。在一个实施例中，它是VHH、骆驼化VH或人源化VHH。重链ISVD可衍生自常规四链抗体或衍生自重链抗体。

例如，免疫球蛋白单可变结构域可以是单结构域抗体（或适合用作单结构域抗体的氨基酸序列）、“dAb”或dAb（或适合用作dAb的氨基酸序列）或Nanobody® ISVD（如本文所定义，并且包括但不限于VHH）；其他单一可变结构域，或其中任何一种的任何合适片段。

具体地，免疫球蛋白单可变结构域可以是NANOBODY® ISVD（例如VHH，包括人源化VHH或骆驼化VH）或其合适的片段。[注意：NANOBODY ®和NANOBODIES®是阿博利恩公众有限公司（Ablynx N.V.）的注册商标]

“VHH结构域”，也称为VHH、VHH抗体片段，最初被描述为“重链抗体”（即“无轻链抗体”；Hamers-Casterman等人 Nature [自然] 363: 446-448, 1993）的抗原结合免疫球蛋白可变结构域。选择术语“VHH结构域”是为了将这些可变结构域与存在于常规4链抗体中的重链可变结构域（本文称为“VH结构域”）和存在于常规4链抗体中的轻链可变结构域（本文称为“VL结构域”）区分开来。对于VHH的进一步描述，请参考Muyldermans的综述文章（Reviews in Molecular Biotechnology[分子生物技术综述]74: 277-302, 2001）。

免疫球蛋白序列例如VHH的生成已在多种出版物中广泛描述，其中包括WO 94/04678、Hamers-Casterman等人1993和Muyldermans等人2001（Reviews in MolecularBiotechnology[分子生物技术综述]74: 277-302, 2001）。在这些方法中，用靶抗原免疫骆驼科动物以诱导针对所述靶抗原的免疫应答。进一步筛选从所述免疫获得的VHH库中结合靶抗原的VHH。

在这些情况下，抗体的生成需要纯化的抗原用于免疫和/或筛选。抗原可以从天然来源纯化，或者在重组生产过程中纯化。可以使用此类抗原的肽片段进行免疫和/或免疫球蛋白序列的筛选。

不同来源的免疫球蛋白序列，包括小鼠、大鼠、兔、驴、人和骆驼免疫球蛋白序列，都可以用于本技术。另外，可以使用完全人序列、人源化序列或嵌合序列。例如，骆驼科动物免疫球蛋白序列和人源化骆驼科动物免疫球蛋白序列，或骆驼化结构域抗体，例如如Ward等人（参见例如WO 94/04678和Riechmann, Febs Lett.[欧洲生化学会联合会快报], 339:285-290, 1994 和Prot. Eng[蛋白质工程]., 9:531-537, 1996）所描述的骆驼化dAb可以在本文中使用。ISVD可以融合形成多价和/或多特异性构建体（对于含有一个或多个VHH结构域的多价和多特异性多肽及其制备，还参考Conrath等人2001（J. Biol. Chem.[生物化学杂志], 第276卷, 10.7346-7350），以及例如WO 96/34103和WO 99/23221）。

然而，应当注意的是，包含在本技术中的ISVD不限于ISVD序列（或用于表达它的核苷酸序列）的来源，也不限于生成或获得（或已经生成或获得）ISVD序列或核苷酸序列的方式。因此，ISVD序列可以是天然存在的序列（来自任何合适的物种）或合成或半合成的序列。在具体但非限制性方面，ISVD序列是天然存在的序列（来自任何合适的物种）或合成或半合成的序列，包括但不限于“人源化”（如本文所定义）免疫球蛋白序列（例如部分或完全人源化的骆驼科、小鼠或兔免疫球蛋白序列，特别是部分或完全人源化的VHH序列）、“骆驼化”（如本文所定义）免疫球蛋白序列（特别是骆驼化VH序列），以及通过技术（诸如亲和力成熟（例如，从合成的、随机的或天然存在的免疫球蛋白序列开始）、CDR移植、贴面、组合衍生自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物的PCR组装和技术人员熟知的用于工程改造免疫球蛋白序列的类似技术）获得的ISVD；或任何上述的任何合适的组合。

类似地，核苷酸序列可以是天然存在的核苷酸序列或合成或半合成的序列，并且可以例如是通过PCR从合适的天然存在的模板分离的序列（例如从细胞分离的DNA或RNA），从文库（特别是表达文库）中分离的核苷酸序列，通过将突变引入天然存在的核苷酸序列而制备的核苷酸序列（使用本身已知的任何合适技术，如错配PCR），使用重叠引物通过PCR制备的核苷酸序列，或使用本身已知的DNA合成技术制备的核苷酸序列。

“人源化VHH”包含对应于天然存在的VHH结构域的氨基酸序列的氨基酸序列，但其已经“人源化”，即通过用出现在来自人的常规4链抗体的VH结构域的一个或多个相应位置（例如上文所示）的一个或多个氨基酸残基替换所述天然存在的VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基（特别是框架序列中的一个或多个氨基酸残基）。这可以以本身已知的方式进行，这对于技术人员来说是清楚的，例如基于现有技术（例如，WO 2008/020079）。再次，应当注意，这样的人源化VHH可以以本身已知的任何合适的方式获得，因此并不严格限于使用包含天然存在的VHH结构域的多肽作为起始材料获得的多肽。

“骆驼化VH”包含对应于天然存在的VH结构域的氨基酸序列的氨基酸序列，但其已经“骆驼化”，即通过用（骆驼）重链抗体的VHH结构域中一个或多个相应位置上出现的一个或多个氨基酸残基替换常规4链抗体的天然存在的VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可以以本身已知的方式来执行，这对于技术人员来说是清楚的，例如基于现有技术（例如，Davies和Riechman（1994和1996），同上）中的描述。这种“骆驼化”取代插入到形成和/或存在于VH-VL界面的氨基酸位置处，和/或所谓的骆驼科标志残基处，如本文所定义（参见例如WO 94/04678以及Davies和Riechmann（1994和1996），同上）。在一个实施例中，用作生成或设计骆驼化VH的起始材料或起始点的VH序列是来自哺乳动物的VH序列，例如人的VH序列，例如VH3序列。然而，应当注意的是，这样的骆驼化VH可以以本身已知的任何合适的方式获得，因此并不严格限于使用包含天然存在的VH结构域的多肽作为起始材料获得的多肽。

免疫球蛋白单可变结构域序列的结构可以被认为由四个框架区（“FR”）构成，其在本领域和本文中分别被称为“框架区1”（“FR1”）；“框架区2”（“FR2”）；“框架区3”（“FR3”）；和“框架区4”（“FR4”）；这些框架区被三个互补决定区（“CDR”）中断，其在本领域和本文中分别被称为“互补决定区1”（“CDR1”）；“互补决定区2”（“CDR2”）；和“互补决定区3”（“CDR3”）。

如WO 08/020079第58和59页上第q) 段中进一步描述的，ISVD的这些氨基酸残基可根据由Kabat等人（“Sequence of proteins of immunological interest [具有免疫学意义的蛋白质序列]”, 美国公共卫生服务部, NIH 贝塞斯达, 马里兰州, 出版号91）给出的针对V_H结构域的通用编号进行编号，如Riechmann和Muyldermans, 1999（J.Immunol.Methods [免疫学方法杂志] 231: 25-38；例如参见该出版物的图2）的文章中应用于来自骆驼科动物的V_HH结构域。应当注意的是（如本领域中对于V_H结构域以及对于V_HH结构域众所周知的），这些CDR中的每一个中的氨基酸残基的总数可发生变化并且可不与由Kabat编号所指示的氨基酸残基的总数相对应。也就是说，根据Kabat编号的一个或多个位置可能在该实际序列中未被占据，或者该实际序列可能含有比为Kabat编号所允许的数量更多的氨基酸残基。这意味着，通常，根据Kabat的编号可能对应于也可能不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。V_H结构域和V_HH结构域中的氨基酸残基总数通常在110至120的范围内，通常在112至115之间。然而，应当注意，更小和更长的序列也可以适合于本文描述的目的。

在本申请中，除非另有说明，否则CDR序列是根据如Kontermann和Dübel（2010版,Antibody Engineering [抗体工程], 第2卷, 柏林海德堡施普林格出版社, Martin, 第3章, 第33至51页）中所述的AbM编号来确定的。根据该方法，ISVD的FR1包含在位置1-25处的氨基酸残基，ISVD的CDR1包含在位置26-35处的氨基酸残基，ISVD的FR2包含在位置36-49处的氨基酸，ISVD的CDR2包含在位置50-58处的氨基酸残基，ISVD的FR3包含在位置59-94处的氨基酸残基，ISVD的CDR3包含在位置95-102处的氨基酸残基，并且ISVD的FR4包含在位置103-113处的氨基酸残基。

CDR区的确定也可以根据不同的方法进行。在根据Kabat的CDR确定中，ISVD的FR1包含在位置1-30处的氨基酸残基，ISVD的CDR1包含在位置31-35处的氨基酸残基，ISVD的FR2包含在位置36-49处的氨基酸，ISVD的CDR2包含在位置50-65处的氨基酸残基，ISVD的FR3包含在位置66-94处的氨基酸残基，ISVD的CDR3包含在位置95-102处的氨基酸残基，并且ISVD的FR4包含在位置103-113处的氨基酸残基。

框架序列是免疫球蛋白框架序列或衍生自免疫球蛋白框架序列（例如，通过人源化或骆驼化）的框架序列（的合适组合）。例如，框架序列可以是衍生自轻链可变区（例如VL序列）和/或重链可变区（例如VH序列或VHH序列）的框架序列。在一个特定方面，框架序列是衍生自VHH-序列的框架序列（其中所述框架序列可以任选地已经部分或完全人源化）或者是已经骆驼化的常规VH序列（如本文所定义）。

具体地，本文所述方法中使用的ISVD序列中存在的框架序列可以含有一个或多个标志残基（如本文所定义），使得ISVD序列是NANOBODY®ISVD，例如VHH，包括人源化VHH或骆驼化VH。此类框架序列（的合适组合）的非限制性实例将从本文的进一步披露中变得清楚。

一般来说，NANOBODY® ISVD（特别是VHH序列，包括（部分）人源化VHH序列和骆驼化VH序列）的特征在于在一个或多个框架序列（同样如本文进一步描述）中存在一个或多个“标志残基”（如本文所述）。因此，一般来说，NANOBODY® ISVD可以定义为具有以下（一般）结构的免疫球蛋白序列

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

其中FR1至FR4分别指框架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别指互补决定区1至3，并且其中这些标志残基中的一个或多个如本文进一步定义。

特别地，NANOBODY® ISVD可以是具有以下（一般）结构的免疫球蛋白序列

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

其中FR1至FR4分别指框架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别指互补决定区1至3，并且其中框架序列如本文进一步定义。

更具体地，NANOBODY® ISVD可以是具有以下（一般）结构的免疫球蛋白序列

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

其中FR1至FR4分别指框架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别指互补决定区1至3，并且其中：

根据Kabat编号在位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108处的氨基酸残基中的一个或多个选自以下表1提到的标志残基。

表1：NANOBODY® ISVD中的标志残基

本技术涉及特异性结合PD-L1的ISVD。因此，ISVD的靶分子是PD-L1蛋白。例如哺乳动物PD-L1。除人PDL1（SEQ ID NO: 1）之外，来自其他物种的型式也适用于本技术，例如来自小鼠、大鼠、兔、猫、狗、山羊、绵羊、马、猪、非人灵长类动物诸如食蟹猴（cynomolgusmonkey）（本文也称为“食蟹猴（cyno）”）、或骆驼科动物诸如美洲驼或羊驼的PD-L1。

在一些实施例中，本技术的ISVD结合人PD-L1（hPD-L1；SEQ ID NO: 1）。在一些实施例中，本技术的ISVD结合人PD-L1和食蟹猴PD-L1（cPD-L1；SEQ ID NO: 2）。在一些实施例中，本技术的ISVD结合人PD-L1和小鼠PD-L1（mPD-L1；SEQ ID NO: 3）。在一些实施例中，本技术的ISVD结合人PD-L1、食蟹猴PD-L1和小鼠PD-L1。人、食蟹猴和小鼠PD-L1的序列描述于表A-1中（SEQ ID NO: 1-3）。

本技术的免疫球蛋白单可变结构域作为（单价）单可变结构域显示出对PD-L1的高亲和力（例如，通过表面等离子共振测量）。在一些实施例中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域作为（单价）单可变结构域显示出对PD-L1的高效力（例如，如在（FACS）竞争测定、TT测定中所测量的）。在一些实施例中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域作为（单价）单可变结构域显示出对PD-L1的高功效（例如，在（FACS）竞争测定、Alphascreen、TT测定中测量的）。在一些实施例中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域甚至当被与其他靶标的结合物包围时也有效地产生（例如，在微生物宿主诸如毕赤酵母属（Pichia）（例如巴斯德毕赤酵母（P. pastoris））中），并且具有良好的稳定性。

由于其尺寸小，（单价）免疫球蛋白单可变结构域对于穿透肿瘤环境更有效。此外，当打算同时靶向多个（癌症）靶标时，例如作为多价ISVD构建体，它们很容易与单链中的其他（癌症）靶标结合物结合。免疫球蛋白单可变结构域的高产量和更好的稳定性使其非常适合皮下施用。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域作为（单价）单可变结构域显示出对PD-L1的高亲和力。两个分子之间的分子相互作用的亲和力可以通过本身已知的不同技术来测量，诸如公知的表面等离子体共振（SPR）生物传感器技术（参见例如Ober等人2001, Intern. Immunology [国际免疫学] 13: 1551-1559）。如本文所用，术语“表面等离子共振”是指允许通过检测生物传感器基质内蛋白质浓度的变化来分析实时生物特异性相互作用的光学现象，其中一个分子固定在生物传感器芯片上，另一个分子在流动条件下穿过固定的分子，从而产生kon、koff测量值，并因此得到KD（或KA）值。这可以例如使用公知的BIAcore®系统（BIAcore International AB，GE医疗公司（GE Healthcare company），瑞典乌普萨拉和新泽西州皮斯卡塔韦）进行。详细描述请参见Jonsson等人1993（Ann. Biol.Clin.[临床生物学年刊] 51: 19-26）, Jonsson等人1991（Biotechniques[生物技术] 11:620-627）, Johnsson等人. 1995（J.Mol.Recognit.[分子识别杂志]8: 125-131）和Johnnson等人1991（Anal. Biochem. [分析生物化学]198: 268-277）。

另一种公知的用于确定生物分子相互作用的亲和力的生物传感器技术是生物层干涉法（BLI）（参见例如Abdiche等人 2008, Anal. Biochem.[分析生物化学] 377: 209-217）。如本文所用，术语“生物层干涉法”或“BLI”是指分析从两个表面反射的光的干涉模式的无标记光学技术：内部参考层（参考光束）和生物传感器尖端上的固定化蛋白质层（信号光束）。结合到生物传感器尖端的分子数量的变化引起干涉模式的偏移，其被报告为波长偏移（nm），偏移的幅度是结合到生物传感器尖端表面的分子数量的直接量度。由于可以实时测量相互作用，因此可以确定缔合和解离速率以及亲和力。BLI可以例如使用公知的Octet®系统（ForteBio，颇尔生命科学公司（Pall Life Sciences）的分公司，美国门洛帕克）进行。

替代性地，可以使用KinExA®平台（萨皮蒂尼仪器公司（Sapidyne InstrumentsInc），美国博伊西）在动力学排阻测定（KinExA）中测量亲和力（参见例如Drake等人 2004,Anal. Biochem.[分析生物化学], 328: 35-43）。如本文所用，术语“KinExA”是指一种基于溶液的方法，其测量未修饰分子的真正平衡结合亲和力和动力学。使抗体/抗原复合物的平衡溶液通过带有用抗原（或抗体）预包被的珠的色谱柱，从而使游离抗体（或抗原）与包被的分子结合。用结合抗体（或抗原）的荧光标记蛋白完成对如此捕获的抗体（或抗原）的检测。

GYROLAB®免疫分析系统提供了用于自动化生物分析和快速样品周转的平台（Fraley等人 2013, Bioanalysis [生物分析] 5: 1765-74）。

5.2.1系列7

特异性结合PD-L1的ISVD是阻断PD-L1与PD1相互作用的ISVD。在一些实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD是结合PD-L1上的PD1结合位点的ISVD。在一些实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD是与PD-L1上的构象表位相互作用的ISVD。在一些实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD是与PD-L1蛋白的选自Y56、E58、E60、D62、N63、Q66、H78和R113的一个或多个氨基酸相互作用的ISVD。在具体实施例中，本发明的ISVD特异性结合的PD-L1上的表位包含以下氨基酸：Y56、E58、D62、N63、Q66和H78。在另一个具体实施例中，本技术的ISVD特异性结合的PD-L1上的表位包含以下氨基酸：Y56、E58、E60、D62、N63、Q66、H78和R113。

与PD-L1上的该表位特异性结合的ISVD在PD-L1上仅用CDR2和CDR3形成相互作用位点（互补位）。因此，ISVD的仅CDR2和CDR参与与PD-L1蛋白的相互作用。ISVD的仅CDR2和CDR3形成ISVD的互补位（ISVD与PD-L1分子相互作用的位点）的一部分。在一些实施例中，形成该相互作用位点的一部分的氨基酸选自CDR2中的S52、S53和N56（Kabat编号）。在一些实施例中，形成该相互作用位点的一部分的氨基酸选自CDR3中的A98、A99、A100、A100a、I100d和I100g（Kabat编号）。在一些实施例中，形成该相互作用位点的一部分的氨基酸选自CDR2中的S52、S53和N56（Kabat编号）以及选自CDR3中的A98、A99、A100、A100a、I100d和I100g（Kabat编号）。在一些实施例中，形成该相互作用位点的一部分的氨基酸是CDR2中的S52、S53和N56（Kabat编号）。在一些实施例中，形成该相互作用位点的一部分的氨基酸是CDR3中的A98、A99、A100、A100a、I100d和I100g（Kabat编号）。在一些实施例中，形成该相互作用位点一部分的氨基酸是CDR2中的S52、S53和N56（Kabat编号）以及CDR3中的A98、A99、A100、A100a、I100d和I100g（Kabat编号）。

与PD-L1上的该表位特异性结合的ISVD是包含4个框架区（分别为FR1至FR4）和三个互补决定区（分别为CDR1至CDR3）的ISVD，其中：

并且/或者

以及

在一些实施例中，与PD-L1上的表位特异性地结合的ISVD是包含4个框架区（分别为FR1至FR4）和三个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）的ISVD，其中：

并且/或者

以及

-CDR2（AbM编号）由氨基酸序列X₁X₂SX₃SX₄X₅NX₆X₇（SEQ ID NO: 600）组成，其中X₁选自A、T和G，X₂选自L和I，X₃选自T和S，X₄选自A、P和G，X₅选自R、H和K，X₆选自T和S，并且X₇选自N和Q；

并且/或者

-CDR3（AbM编号）由氨基酸序列X₁X₂X₃AAAAX₄X₅IX₆X₇IX₈X₉X₁₀（SEQ ID NO: 603）组成，其中X₁选自S和T，X₂选自S和T，X₃选自F、Y和W，X₄选自A、P和G，X₅选自S和T，X₆选自A、S、T、P和G，X₇选自N、Q、I和L，X₈选自F、Y和W，X₉选自D和E，并且X₁₀选自F、Y和W。

以及

特异性结合PD-L1的ISVD的具体实例是包含4个框架区（分别为FR1至FR4）和三个互补决定区（分别为CDR1至CDR3）的ISVD，其中：

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 13或14的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 17或109的氨基酸序列；

在一些实施例中，ISVD包含4个框架区（分别为FR1至FR4）和三个互补决定区（分别为CDR1至CDR3），其中：

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 13的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 13的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 13的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 17的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 17的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 17的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

--CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 14的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 14的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 14的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 17的氨基酸序列；

fi)与SEQ ID NO: 17的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 14的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 109的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 109的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 109的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

优选地，这些CDR2和CDR3序列与SEQ ID NO: 13、14、103或104的CDR2序列和/或SEQ ID NO: 17、109、110、111或112的CDR3序列具有至少90%氨基酸序列同一性、更优选地至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

在一些实施例中，ISVD包含CDR2和CDR3（AbM编号），其氨基酸序列与具有选自SEQID NO: 4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 311-324的氨基酸序列的ISVD的CDR2和CDR3的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性、优选至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

在一些实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD的具体实例是包含4个框架区（分别为FR1至FR4）和三个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）的ISVD，其中：

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

在一些实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD是包含4个框架区（分别为FR1至FR4）和三个互补决定区（分别为CDR1至CDR3）的ISVD，其中：

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)X₁ISSX₂GRNTN（SEQ ID NO: 599）的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和G，并且该氨基酸残基X₂选自S和T；

b)与X₁ISSX₂GRNTN（SEQ ID NO: 599）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和G，并且该氨基酸残基X₂选自S和T；

c)与X₁ISSX₂GRNTN（SEQ ID NO: 599）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和G，并且该氨基酸残基X₂选自S和T；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)氨基酸序列SSWAAAAGTIAX₄IYDY（SEQ ID NO: 602），其中氨基酸残基X₄选自N和I；

e)与氨基酸序列SSWAAAAGTIAX₄IYDY（SEQ ID NO: 602）具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₄选自N和I；

f)与氨基酸序列SSWAAAAGTIAX₄IYDY（SEQ ID NO: 602）具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₄选自N和I；

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）以及作为SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）以及作为SEQ ID NO: 109的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 103的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）以及作为SEQ ID NO: 109的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）以及作为SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 103的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）以及作为SEQ ID NO: 110的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）以及作为SEQ ID NO: 111的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 104的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）以及作为SEQ ID NO: 112的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

上述CDR序列的SEQ ID NO基于根据AbM定义的CDR定义（参见表A-3）。值得注意的是，同样可以使用根据Kabat定义而定义的CDR序列的SEQ ID NO（参见表A-4）。因此，由本技术提供的、如上所述使用AbM定义与PD-L1特异性结合的ISVD也可以使用Kabat定义来描述。

同样在一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD是包含4个框架区（分别为FR1至FR4）和三个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）的ISVD，其中：

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 23或24的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 17或109的氨基酸序列；

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 23的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 23的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 23的氨基酸序列具有6、5、4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 17的氨基酸序列；

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 24的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 24的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 24的氨基酸序列具有6、5、4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 17的氨基酸序列；

f)与氨基具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 24的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 109的氨基酸序列；

优选地，这些CDR2和CDR3序列与SEQ ID NO: 23、24、120、121、122、123或124的CDR2序列和/或SEQ ID NO: 17、109、110、111或112的CDR3序列具有至少90%氨基酸序列同一性、更优选地至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含CDR2和CDR2（Kabat编号），其氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 311-324的氨基酸序列的ISVD的CDR2和CDR3的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性、优选至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)X₁ISSX₂GRNTNYADX₄VEX₆（SEQ ID NO: 606）的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自G和A，其中该氨基酸残基X₂选自S和T，其中该氨基酸残基X₄选自S和P，并且其中该氨基酸残基X₆选自G、V和A；

b)与X₁ISSX₂GRNTNYADX₄VEX₆（SEQ ID NO: 606）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自G和A，其中该氨基酸残基X₂选自S和T，其中该氨基酸残基X₄选自S和P，并且其中该氨基酸残基X₆选自G、V和A；

c)与X₁ISSX₂GRNTNYADX₄VEX₆（SEQ ID NO: 606）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自G和A，其中该氨基酸残基X₂选自S和T，其中该氨基酸残基X₄选自S和P，并且其中该氨基酸残基X₆选自G、V和A；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SSWAAAAGTIAX₄IYDY（SEQ ID NO: 602）的氨基酸序列；其中氨基酸残基X₄选自I和N；

e)与SSWAAAAGTIAX₄IYDY（SEQ ID NO: 602）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；其中氨基酸残基X₄选自I和N；

f)与SSWAAAAGTIAX₄IYDY（SEQ ID NO: 602）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；其中氨基酸残基X₄选自I和N。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 23的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）以及作为SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 24的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）以及作为SEQ ID NO: 109的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 120的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）以及作为SEQ ID NO: 109的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 120的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）以及作为SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 122的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）以及作为SEQ ID NO: 110的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 123的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）以及作为SEQ ID NO: 111的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 11或98的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 13或14的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 17或109的氨基酸序列；

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域包含四个框架区（分别为FR1至FR4）和三个互补决定区（分别为CDR1至CDR3），其中：

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 11的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 11的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 11的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 13或14的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 17的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO: 17的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO: 17的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 11的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 13的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 13的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 13的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 17的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO: 17的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 11的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 14的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 14的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 14的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 17的氨基酸序列；

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 98的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 98的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO: 98的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 14的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 109的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO: 109的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO: 109的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

优选地，这些CDR序列与SEQ ID NO: 11、13、14或17的CDR序列具有至少90%氨基酸序列同一性、更优选地至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

优选地，CDR序列与SEQ ID NO: 11、98、99、100或101的CDR1序列，SEQ ID NO: 13、14、103或104的CDR2序列和/或SEQ ID NO: 17、109、110、111或112的CDR3序列具有至少90%的氨基酸序列同一性，更优选至少95%的氨基酸序列同一性，例如99%或更高的氨基酸序列同一性，或者甚至基本上100%的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含CDR（AbM编号），其氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性、优选至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

在一些实施例中，ISVD包含CDR（AbM编号），其氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 311-324的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性、优选至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)氨基酸序列GRX₁FSGNTMG（SEQ ID NO: 597），其中氨基酸残基X₁选自T、K和G；

b)与氨基酸序列GRX₁FSGNTMG（SEQ ID NO: 597）具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自T、K和G；

c)与氨基酸序列GRX₁FSGNTMG（SEQ ID NO: 597）具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自T、K和G；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)X₁ISSX₂GRNTN（SEQ ID NO: 599）的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和G，并且该氨基酸残基X₂选自S和T；

e)与X₁ISSX₂GRNTN（SEQ ID NO: 599）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和G，并且该氨基酸残基X₂选自S和T；

f)与X₁ISSX₂GRNTN（SEQ ID NO: 599）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和G，并且该氨基酸残基X₂选自S和T；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)氨基酸序列SSWAAAAGTIAX₄IYDY（SEQ ID NO: 602），其中氨基酸残基X₄选自N和I；

h)与氨基酸序列SSWAAAAGTIAX₄IYDY（SEQ ID NO: 602）具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₄选自N和I；

i)与氨基酸序列SSWAAAAGTIAX₄IYDY（SEQ ID NO: 602）具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₄选自N和I。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的CDR1、作为SEQ IDNO: 13或14的氨基酸序列的CDR2以及作为SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的CDR3。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 98的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 109的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 98的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 103的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 109的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 99的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 103的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 109的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 99的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 109的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 100的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 103的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 110的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 100的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 111的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 101的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 104的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 112的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的具体实例具有如表A-3中针对ISVD10F11（SEQID NO: 4）及其序列优化变体所指示的一个或多个或全部框架区（除如上文所定义的CDR之外）。在一个实施例中，该ISVD包含以下的完整氨基酸序列或由以下的完整氨基酸序列组成：ISVD10F11（SEQ ID NO: 4）、A025503354（SEQ ID NO: 311）、A025503357（SEQ ID NO:312）、A025503359（SEQ ID NO: 313）、A025503386（SEQ ID NO: 314）、A025503388（SEQ IDNO: 315）、A025501587（SEQ ID NO: 316）、A025503391（SEQ ID NO: 317）、A025503381（SEQID NO: 318）、A025501511（SEQ ID NO: 5）、A025502469（SEQ ID NO: 319）、A025502471（SEQ ID NO: 320）、A025500129（SEQ ID NO: 321），（参见表A-2）。在另一个实施例中，该ISVD包含以下的完整氨基酸序列或由以下的完整氨基酸序列组成：6B01（SEQ ID NO:322）、8F05（SEQ ID NO: 323）或53G11（SEQ ID NO: 324）（参见表A-2和表A-3）。

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 22的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 23或24的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 17或109的氨基酸序列；

在一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD是基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成的ISVD，其中：

-CDR1（Kabat编号）具有选自以下的氨基酸序列：

a)SEQ ID NO: 22的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）具有选自以下的氨基酸序列：

d)SEQ ID NO: 23或24的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 23或24的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）具有选自以下的氨基酸序列：

g)SEQ ID NO: 17的氨基酸序列；

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 22的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 23的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 23的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 23的氨基酸序列具有6、5、4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 17的氨基酸序列；

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 22的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 24的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 24的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 24的氨基酸序列具有6、5、4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 17的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO: 17的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 22的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 24的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 109的氨基酸序列；

优选地，这些CDR序列与SEQ ID NO: 22、23、24或17的CDR序列具有至少90%氨基酸序列同一性、更优选地至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

优选地，CDR序列与SEQ ID NO: 22、118或119的CDR1序列、SEQ ID NO: 23、24、120、121、122、123或124的CDR2序列和/或SEQ ID NO: 17、109、110、111或112的CDR3序列具有至少90%的氨基酸序列同一性，更优选至少95%的氨基酸序列同一性，例如99%或更高的氨基酸序列同一性，或者甚至基本上100%的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含CDR（Kabat编号），其氨基酸序列与具有选自SEQ IDNO: 4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性、优选至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含CDR（Kabat编号），其氨基酸序列与具有选自SEQ IDNO: 4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 311-324的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性、优选至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)GNTMG（SEQ ID NO: 22）的氨基酸序列；

b)与GNTMG（SEQ ID NO: 22）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c)与GNTMG（SEQ ID NO: 22）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)X₁ISSX₂GRNTNYADX₄VEX₆（SEQ ID NO: 606）的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自G和A，其中该氨基酸残基X₂选自S和T，其中该氨基酸残基X₄选自S和P，并且其中该氨基酸残基X₆选自G、V和A；

e)与X₁ISSX₂GRNTNYADX₄VEX₆（SEQ ID NO: 606）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自G和A，其中该氨基酸残基X₂选自S和T，其中该氨基酸残基X₄选自S和P，并且其中该氨基酸残基X₆选自G、V和A；

f)与X₁ISSX₂GRNTNYADX₄VEX₆（SEQ ID NO: 606）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自G和A，其中该氨基酸残基X₂选自S和T，其中该氨基酸残基X₄选自S和P，并且其中该氨基酸残基X₆选自G、V和A；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SSWAAAAGTIAX₄IYDY（SEQ ID NO: 602）的氨基酸序列；其中氨基酸残基X₄选自I和N；

h)与SSWAAAAGTIAX₄IYDY（SEQ ID NO: 602）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；其中氨基酸残基X₄选自I和N；

i)与SSWAAAAGTIAX₄IYDY（SEQ ID NO: 602）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；其中氨基酸残基X₄选自I和N。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 22的氨基酸序列的CDR1、作为SEQ IDNO: 23或24的氨基酸序列的CDR2以及作为SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的CDR3

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 22的氨基酸序列的CDR1、作为SEQ IDNO: 24的氨基酸序列的CDR2以及作为SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的CDR3。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 22的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 23的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 22的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 24的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 109的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 22的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 120的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 109的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 22的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 120的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 118的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 122的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 110的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 118的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 123的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 111的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的具体实例具有如表A-4中针对ISVD10F11（SEQID NO: 4）及其序列优化变体所指示的一个或多个或全部框架区（除如上文所定义的CDR之外）。在一个实施例中，该ISVD包含以下的完整氨基酸序列或由以下的完整氨基酸序列组成：ISVD10F11（SEQ ID NO: 4）、A025503354（SEQ ID NO: 311）、A025503357（SEQ ID NO:312）、A025503359（SEQ ID NO: 313）、A025503386（SEQ ID NO: 314）、A025503388（SEQ IDNO: 315）、A025501587（SEQ ID NO: 316）、A025503391（SEQ ID NO: 317）、A025503381（SEQID NO: 318）、A025501511（SEQ ID NO: 5）、A025502469（SEQ ID NO: 319）、A025502471（SEQ ID NO: 320）、A025500129（SEQ ID NO: 321），（参见表A-2）。在另一个实施例中，该ISVD包含以下的完整氨基酸序列或由以下的完整氨基酸序列组成：6B01（SEQ ID NO:322）、8F05（SEQ ID NO: 323）或53G11（SEQ ID NO: 324）（参见表A-2和表A-4）。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域具有与SEQ ID NO: 4、5或7中的一个具有大于80%、大于90%（诸如大于95%或甚至大于99%）的序列同一性的氨基酸序列。在一个实施例中，本技术的多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 4、5或7的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 4具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 4的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 5具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 5的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 311具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 311的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 312具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 312的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 313具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 313的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 314具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 314的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 315具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 315的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 316具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 316的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 317具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 317的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 318具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 318的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 319具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 319的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 320具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 320的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 321具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 321的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 322具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 322的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 323具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 323的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 324具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 324的氨基酸序列。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与具有SEQ IDNO: 4至7的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与具有SEQ IDNO: 4、5、311-324的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与具有SEQ IDNO: 4至7的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与食蟹猴PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 4、5、311-324的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与具有SEQ IDNO: 4至7的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与小鼠PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD仍然以小于10倍亲和力（KD）差异与人PD-L1和食蟹猴PD-L1特异性地结合。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD仍然与人和食蟹猴PD-L1特异性地结合并且不与B7家族的其他成员结合。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD仍然与人和食蟹猴PD-L1特异性地结合并且不与PD-L2结合。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD以与具有SEQ ID NO:4至7的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的效力阻断人PD-L1与人PD-1的相互作用，其中该效力是在用作为竞争物的hPD-1进行的对表达人PD-L1的CHO细胞的FACS竞争测定中测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD以与具有SEQ ID NO:4至7的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的效力阻断食蟹猴PD-L1与食蟹猴PD-1的相互作用，其中该效力是在用作为竞争物的食蟹猴PD-1进行的对表达食蟹猴PD-L1的CHO细胞的FACS竞争测定中测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD以与具有SEQ ID NO:4至7的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的效力阻断hPD-L1与hPD-1的相互作用，其中该效力是在用作为竞争物的hPD-1进行的对ES-2的FACS竞争测定中测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD以与具有SEQ ID NO:4至7的VHH中的一个相比（基本上）相同的%抑制或更高的%抑制阻断hPD-L1与hPD-1的相互作用，其中该%抑制是在AlphaScreen中确定的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD以与具有SEQ ID NO:4至7的VHH中的一个相比（基本上）相同的%抑制或更高的%抑制阻断hPD-L1与CD80的相互作用，其中该%抑制是在AlphaScreen中确定的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与具有SEQ IDNO: 4至7的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的针对T细胞活化的效力，其中该效力是经由自体破伤风类毒素回忆测定（TT测定）（例如如本文所述的TT测定）中的IFN-γ产生来监测的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与具有SEQ IDNO: 4至7的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的针对T细胞活化的功效，其中该效力是经由自体破伤风类毒素回忆测定（TT测定）（例如如本文所述的TT测定）中的IFN-γ产生来监测的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 4至7的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 4、5、311-324的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 4至7的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 4、5、311-324的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 4至7的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与小鼠PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD仍然以小于10倍亲和力（KD）差异与人PD-L1和食蟹猴PD-L1特异性地结合。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD仍然以小于100倍、小于500倍或小于1000倍亲和力（KD）差异与人PD-L1和小鼠PD-L1特异性地结合。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD仍然与人和犬科动物PD-L1特异性结合，而不与B7家族的其他成员结合。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD仍然与人和犬科动物PD-L1特异性结合，而不与PD-L2结合。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD以与具有SEQ ID NO: 4至7的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的效力阻断人PD-L1与人PD-1的相互作用，其中该效力是在用作为竞争物的hPD-1进行的对表达人PD-L1的CHO细胞的FACS竞争测定中测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD以与具有SEQ ID NO: 4至7的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的效力阻断食蟹猴PD-L1与食蟹猴PD-1的相互作用，其中该效力是在用作为竞争物的食蟹猴PD-1进行的对表达食蟹猴PD-L1的CHO细胞的FACS竞争测定中测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD以与具有SEQ ID NO: 4至7的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的效力阻断hPD-L1与hPD-1的相互作用，其中该效力是在用作为竞争物的hPD-1进行的对ES-2的FACS竞争测定中测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD以与具有SEQ ID NO: 4至7的VHH中的一个相比（基本上）相同的%抑制或更高的%抑制阻断hPD-L1与(h)PD-1的相互作用，其中该%抑制是在AlphaScreen中确定的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD以与具有SEQ ID NO: 4至7的VHH中的一个相比（基本上）相同的%抑制或更高的%抑制阻断hPD-L1与(h)CD80的相互作用，其中该%抑制是在AlphaScreen中确定的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 4至7的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的针对T细胞活化的效力，其中该效力是经由自体破伤风类毒素回忆测定（TT测定）（例如如本文所述的TT测定）中的IFN-γ产生来监测的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 4至7的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的针对T细胞活化的功效，其中该效力是经由自体破伤风类毒素回忆测定（TT测定）（例如如本文所述的TT测定）中的IFN-γ产生来监测的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 4至7的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 4至7的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 4至7的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 4至7的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 4、5、311-324的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 4、5、311-324的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 4、5、311-324的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 4、5、311-324的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 4至7的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 4至7的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与小鼠PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 4至7的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD仍然以小于10倍亲和力（KD）差异与人PD-L1和食蟹猴PD-L1特异性地结合。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 4、5、311-324的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD仍然以小于10倍亲和力（KD）差异与人PD-L1和食蟹猴PD-L1特异性地结合。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 4至7的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD仍然以小于100倍、小于500倍或小于1000倍亲和力（KD）差异与人PD-L1和小鼠PD-L1特异性地结合。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 4至7的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD仍然与人和犬科动物PD-L1特异性结合，而不与B7家族的其他成员结合。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 4至7的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD仍然与人和犬科动物PD-L1特异性结合，而不与PD-L2结合。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 4至7的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD以与具有SEQID NO: 4至7的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的效力阻断人PD-L1与人PD-1的相互作用，其中该效力是在用作为竞争物的hPD-1进行的对表达人PD-L1的CHO细胞的FACS竞争测定中测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 4至7的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD以与具有SEQID NO: 4至7的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的效力阻断食蟹猴PD-L1与食蟹猴PD-1的相互作用，其中该效力是在用作为竞争物的食蟹猴PD-1进行的对表达食蟹猴PD-L1的CHO细胞的FACS竞争测定中测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 4至7的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD以与具有SEQID NO: 4至7的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的效力阻断hPD-L1与hPD-1的相互作用，其中该效力是在用作为竞争物的hPD-1进行的对ES-2的FACS竞争测定中测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 4至7的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD以与具有SEQID NO: 4至7的VHH中的一个相比（基本上）相同的%抑制或更高的%抑制阻断hPD-L1与PD-1的相互作用，其中该%抑制是在AlphaScreen中确定的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 4至7的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD以与具有SEQID NO: 4至7的VHH中的一个相比（基本上）相同的%抑制或更高的%抑制阻断hPD-L1与CD80的相互作用，其中该%抑制是在AlphaScreen中确定的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 4至7的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 4至7的VHH中的一个相比至少（基本上）一半的针对T细胞活化的效力、优选地至少（基本上）相同的针对T细胞活化的效力，其中该效力是经由自体破伤风类毒素回忆测定（TT测定）（例如如本文所述的TT测定）中的IFN-γ产生来监测的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 4至7的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 4至7的VHH中的一个相比至少（基本上）至少75%的针对T细胞活化的功效、优选地至少80%或90%的针对T细胞活化的功效、更优选地至少（基本上）相同的针对T细胞活化的功效，其中该功效是经由自体破伤风类毒素回忆测定（TT测定）（例如如本文所述的TT测定）中的IFN-γ产生来监测的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合人PD-L1，解离常数（K_D）为5.10^-9至10^-11摩尔/升或更低，优选为10^-9至5.10^-11摩尔/升或5.10^-10至10^-10摩尔/升，或更优选为10^-10至10^-11摩尔/升，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合人PD-L1，kon速率在10⁵M^-1s^-1至约10⁷M^-1s^-1之间、优选在5.10⁵M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、更优选在10⁶M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、例如在10⁶M^-1s^-1和5.10⁶M^-1s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合人PD-L1，koff速率在10-3 s^-1（t1/2 = 0.69 s）和10^-6s^-1（提供t1/2为多天的接近不可逆的复合物）之间，优选在10^-3s^-1和5.10^-6s^-1之间，更优选在5.10^-4s^-1和5.10^-6s^-1之间，例如在5.10^-4s^-1和10^-5s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合食蟹猴PD-L1，解离常数（K_D）为5.10^-9至10^-11摩尔/升或更低，优选为10^-9至5.10^-11摩尔/升或更低并且更优选5.10^-10至10^-10摩尔/升，例如10^-10至10^-11摩尔/升，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合食蟹猴PD-L1，kon速率在10⁵M^-1s^-1至约10⁷M^-1s^-1之间、优选在5.10⁵M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、更优选在10⁶M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、例如在10⁶M^-1s^-1和5.10⁶M^-1s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合食蟹猴PD-L1，koff速率在10-3 s^-1（t1/2 = 0.69 s）和10^-6s^-1（提供t1/2为多天的接近不可逆的复合物）之间，优选在10^-3s^-1和5.10^-6s^-1之间，更优选在5.10^-4s^-1和5.10^-6s^-1之间，例如在5.10^-4s^-1和10^-5s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合小鼠PD-L1，解离常数（K_D）为5.10^-7至10^-10摩尔/升或更低，优选为10^-7至5.10^-10摩尔/升或更低并且更优选10^-7至10^-9摩尔/升，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合小鼠PD-L1，kon速率在10⁴M^-1s^-1至约10⁷M^-1s^-1之间、优选在5.10⁴M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、更优选在10⁵M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、例如在10⁵M^-1s^-1和10⁶M^-1s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合小鼠PD-L1，koff速率在10^-1s^-1（t1/2 = 0.69 s）和10^-6s^-1（提供t1/2为多天的接近不可逆的复合物）之间，优选在5.10^-2s^-1和10^-5s^-1之间，更优选在5.10^-2s^-1和10^-4s^-1或5.10^-2s^-1和10^-3s^-1之间，例如在5.10^-2s^-1和5.10^-3s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域以小于10倍的亲和力差异（KD）特异性结合人PD-L1和食蟹猴PD-L1。

在一些实施例中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域以亲和力（KD）方面小于100倍的差异、小于500倍的差异或小于1000倍的差异与人PD-L1和小鼠PD-L1特异性地结合。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合人和食蟹猴PD-L1并且不结合B7家族的其他成员。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合人和食蟹猴PD-L1并且不结合PD-L2。

在本技术中，这些ISVD和包含该ISVD的这些多肽与PD-L1的结合也可在其中PD-L1在细胞表面（诸如例如，CHO Flp-In人PD-L1细胞、CHO Flp-In食蟹猴PD-L1细胞、CHO Flp-In小鼠PD-L1细胞或ES-2细胞）上暴露的测定中测量。Invitrogen™ Flp-In™系统允许整合和表达哺乳动物细胞（例如，CHO细胞）中的特定基因组位置处的目的基因（例如，编码人、食蟹猴或小鼠PD-L1）。Flp-In系统涉及将Flp重组靶标（FRT）位点引入所选哺乳动物细胞系的基因组中。然后，经由在该FRT位点处的Flp重组酶介导的DNA重组将含有该目的基因的表达载体整合到该基因组中（O'Gorman等人, 1991, Recombinase-Mediated GeneActivation and Site-Specific Integration in Mammalian Cells [哺乳动物细胞中重组酶介导的基因活化和位点特异性整合], Science [科学]251, 1351-1355）。

ES-2细胞（ATCC；CRL-1978）是从患有透明细胞癌的47岁黑人女性的卵巢中分离出来的表现出成纤维细胞样形态的细胞系。该细胞显示出PD-L1的高表面表达（Grenga等人2014, ImmunoTherapy of Cancer[癌症免疫疗法杂志], 2（增刊3）: P102）。

用于测量该ISVD（或包含该ISVD的多肽）与在细胞表面上暴露的PD-L1的结合的首选测定为FACS测定，诸如例如，如实例中所述的该FACS测定，其中这些ISVD或多肽与CHO或ES-2细胞上表达的PD-L1的结合被确定。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合PD-L1并阻断PD-L1与PD-1的相互作用。在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合hPD-L1并阻断hPD-L1与hPD-1的相互作用。在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合食蟹猴PD-L1并阻断食蟹猴PD-L1与食蟹猴PD-1的相互作用。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域显示出与PD-1竞争结合PD-L1的高效力和/或功效（作为单可变结构域）。在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以功能性阻断PD-L1。更具体地，ISVD可以阻断PD-L1和PD-1之间的相互作用。在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域拮抗PD-L1的活性。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合人PD-L1并阻断人PD-L1与人PD-1的相互作用。例如，在用作为竞争物的hPD-1进行的对表达人PD-L1的CHO细胞的FACS竞争测定中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域可具有10^-8M或更低、更优选地10^-8M或更低、10^-9M或更低、或甚至10^-10M或更低的EC50值。例如，在这样的FACS竞争测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和10^-8M之间，例如10^-10M和5.10^-9M之间、10^-10M和10^-8M之间或10^-11M和10^-9M之间的EC50值。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合食蟹猴PD-L1并阻断食蟹猴PD-L1与食蟹猴PD-1的相互作用。例如，在用作为竞争物的食蟹猴PD-1进行的对表达食蟹猴PD-L1的CHO细胞的FACS竞争测定中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域可具有10^-8M或更低、更优选地10^-9M或更低、5.10^-10M或更低、或甚至10^-10M或更低的EC50值。例如，在这样的FACS竞争测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和10^-8M之间，例如10^-10M和5.10^-9M之间、10^-10M和10^-9M之间、10^-10M和10^-8M之间或10^-11M和10^-9M之间的EC50值。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合内源PD-L1并阻断PD-L1与人PD-1的相互作用。例如，在用作为竞争物的人PD-1进行的对表达人PD-L1的ES-2细胞的FACS竞争测定中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域可具有10^-8M或更低、更优选地10^-9M或更低、或甚至10^-10M或更低的EC50值。例如，在这样的FACS竞争测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和10^-8M之间，例如10^-11M和10^-9M之间、或10^-11M和10^-10M之间的EC50值。

在一些实施例中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域阻断人PD-L1与人PD1的结合至少50%、诸如至少60%、70%、80%、90%、95%或甚至更高，如通过配体竞争、AlphaScreen或竞争性结合测定（诸如竞争ELISA或竞争FACS）所确定的。

在一些实施例中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域阻断食蟹猴PD-L1与食蟹猴PD1的结合至少50%、诸如至少60%、70%、80%、90%、95%或甚至更高，如通过配体竞争、AlphaScreen或竞争性结合测定（诸如竞争ELISA或竞争FACS）所确定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合PD-L1并阻断PD-L1与CD80的相互作用。在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合hPD-L1并阻断hPD-L1与hCD80的相互作用。在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合食蟹猴PD-L1并阻断食蟹猴PD-L1与食蟹猴CD80的相互作用。

在一些实施例中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域阻断hPD-L1与hCD80的结合至少50%、诸如至少60%、70%、80%、90%、95%或甚至更高，如通过配体竞争、AlphaScreen或竞争性结合测定（诸如竞争ELISA或竞争FACS）所确定的。

在一些实施例中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域阻断食蟹猴PD-L1与食蟹猴CD80的结合至少50%、诸如至少60%、70%、80%、90%、95%或甚至更高，如通过配体竞争、AlphaScreen或竞争性结合测定（诸如竞争ELISA或竞争FACS）所确定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域显示出作为单可变结构域的高T细胞活化效力。T细胞活化是指这样的过程，其中成熟T细胞可在它们的表面上表达抗原特异性T细胞受体以识别它们的同源抗原，并且通过进入细胞周期、分泌细胞因子或裂解酶、以及启动免疫系统的这些基于细胞的功能来作出应答。

如本文所用，T细胞活化是指T细胞（例如细胞毒性T细胞）的一种或多种细胞应答，例如选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性、活化标志物的表达以及重定向的靶细胞裂解。本发明的多肽能够诱导一种或多种此类应答。测量T细胞活化的合适测定是本领域已知的，例如描述于WO 99/54440或Schlereth等人2005（CancerImmunol. Immunother.[癌症免疫学与免疫疗法]20: 1-12），或如实例或下文中所举例说明的。例如，T细胞活化可以通过评估 (1) 增殖、(2) 活化标志物（例如IL2RA/CD25）的上调和/或 (3) 效应细胞因子（IFN-γ、TNF-α）的产生来测量。

在一些实施例中，由这些ISVD和包含这些ISVD的多肽进行的T细胞活化可通过以下来监测：CD69、CD25和各种细胞粘附分子的上调、细胞因子（例如，IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-2、IL-4和IL-10）的重新表达和/或释放、颗粒酶和穿孔素表达的上调、和/或细胞增殖、膜出泡、天冬酶原（procaspase）3和/或7的活化、核DNA的片段化和/或半胱天冬酶底物聚（ADP核糖）聚合酶的切割。在一些实施例中，通过测量IFN-γ释放来监测T细胞活化。

在一些实施例中，T细胞活化是通过确定许多分子（即CD25、CD69、CD71和HLA-DR，也被称为“活化抗原”）通过活化的增殖淋巴细胞在它们的表面上的表达来测量的。使用单克隆抗体（mAb）作为特异性试剂的免疫荧光测定和流式细胞术分析很容易证明这种活化抗原。通过二色和三色免疫荧光染色，还可以在大量淋巴细胞培养物中鉴定参与活化过程的T细胞亚群。

在一些实施例中，T细胞活化可以通过DNA合成测定来测量。DNA合成测定使用经放射性标记的3H-胸腺嘧啶来检测细胞内的DNA。新增殖的细胞并入了该标记，提供了极其灵敏和准确的细胞系检测（参见例如Madhavan 2007, J. Stem Cells Regen. Med.[干细胞和再生医学杂志] 3: 12）。

在一些实施例中，可以在破伤风类毒素回忆测定（TT测定）中测量T细胞活化。该测定利用先前已暴露于抗原的淋巴细胞，并且在随后再次暴露时将显示出增强的应答。来自接种破伤风疫苗的个体的原代淋巴细胞用于启动体外回忆抗原应答。用破伤风类毒素刺激此类淋巴细胞提供了一种有用的测定方法来评定候选治疗性分子（诸如检查点抑制剂）的效果，并且作为针对对肿瘤抗原的模拟应答的模型。

用负载的抗原呈递细胞（APC）培养后，淋巴细胞会受到抗原刺激。在存在检查点抑制剂的情况下培养抗原刺激的淋巴细胞以调节活化应答。该测定中评定的终点包括淋巴细胞增殖、活化标志物和细胞因子产生（Ticha等人 2021, A cell-based in vitro assayfor testing of immunological integrity of Tetanus toxoid vaccine antigen [用于测试破伤风类毒素疫苗抗原的免疫完整性的基于细胞的体外测定],NpjVaccines [Npj疫苗]6: 1-11）。在一些实施例中，在T淋巴细胞活化后测量IFN-γ产生。

在一些实施例中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域在经由IFN-γ产生进行监测的TT测定（例如，如实例中所述）中具有10^-8M或更低、更优选地10^-9M或更低、或甚至5.10^-10M或更低的效力（EC50值）。例如，在这样的TT测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和10^-8M之间，例如10^-10M和10^-8M之间、10^-10M和10^-9M之间或10^-11M和10^-9M之间的效力（EC50值）。

在一些实施例中，包含本技术的至少两个免疫球蛋白单可变结构域的多肽在通过IFN-γ产生监测的TT测定（例如如实例中所述）中具有10^-8M或更低，更优选为10^-9M或更低，或甚至为5.10^-10M或更低的效力（EC50值）。例如，在这样的TT测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和10^-8M之间，例如10^-10M和10^-8M之间、10^-10M和10^-9M之间或10^-11M和10^-9M之间的效力（EC50值）。

在一些实施例中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域在经由IFN-γ产生进行监测的TT测定（例如如实例中所述）中具有至少50%、诸如至少60%、70%、80%、90%、95%的功效。

该T细胞活化生物测定（NFAT）是一种基于生物发光细胞的测定，由基因工程化Jurkat T细胞系组成，该细胞系表达由NFAT应答元件（NFAT-RE）驱动的荧光素酶报告基因。当TCR/CD3效应细胞（NFAT）参与时，TCR转导细胞内信号，导致NFAT-RE介导的发光。使用Bio-Glo™荧光素酶测定系统和标准发光计（例如GloMax® Discover系统）检测和定量生物发光信号。在一些实施例中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域在NFAT测定（例如，如实例中所述）中具有10^-7M或更低、10^-8M或更低、更优选地5x10^-8M或更低、或甚至10^-9M或更低、或甚至5x10^-10或更低的效力（EC50值）。例如，在这样的NFAT测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-10M和10^-7M之间，例如10^-10M和10^-8M之间或10^-10M和10^-9M之间的效力（EC50值）。

5.2.2系列42

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 132的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 134或136的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 143或145的氨基酸序列；

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 132的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 134的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 134的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 134的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 143的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO: 143的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO: 143的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 132的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 136的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 136的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 136的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 145的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO: 145的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO: 145的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

优选地，CDR序列与SEQ ID NO: 132的CDR1序列，SEQ ID NO: 134、135、136或137的CDR2序列和/或SEQ ID NO: 143、144、145、146、147、148、149、150、151或152的CDR3序列具有至少90%的氨基酸序列同一性，更优选至少95%的氨基酸序列同一性，例如99%或更高的氨基酸序列同一性，或者甚至基本上100%的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含CDR（AbM编号），其氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO:340-379的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性、优选至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)氨基酸序列GGTFRHYVMG（SEQ ID NO: 132）；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

h)与氨基酸序列DX₁TSX₂VX₃X₄AVEAYDY（SEQ ID NO: 608）具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A、V、R、K和E，该氨基酸残基X₂选自Q和G，该氨基酸残基X₃选自V、K、Q、H和E，并且该氨基酸残基X₄选自L和R；

i)与氨基酸序列DX₁TSX₂VX₃X₄AVEAYDY（SEQ ID NO: 608）具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A、V、R、K和E，该氨基酸残基X₂选自Q和G，该氨基酸残基X₃选自V、K、Q、H和E，并且该氨基酸残基X₄选自L和R。

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)氨基酸序列GGTFRHYVMG（SEQ ID NO: 132）；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)氨基酸序列DX₁TSX₂VVLAVEAYDY（SEQ ID NO: 609），其中该氨基酸残基X₁选自A、V、R、K和E，该氨基酸残基X₂选自Q和G；

h)与氨基酸序列DX₁TSX₂VVLAVEAYDY（SEQ ID NO: 609）具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A、V、R、K和E，该氨基酸残基X₂选自Q和G；

i)与氨基酸序列DX₁TSX₂VVLAVEAYDY（SEQ ID NO: 609）具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A、V、R、K和E，该氨基酸残基X₂选自Q和G。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 132的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 134的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 143的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 132的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 135的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 144的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 132的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 135的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 145的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 132的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 136的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 146的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 132的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 135的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 147的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 132的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 135的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 148的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 132的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 135的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 149的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 132的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 135的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 150的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 132的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 136的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 149的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 132的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 135的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 146的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 132的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 136的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 145的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 132的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 136的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 147的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 132的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 136的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 150的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 132的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 136的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 144的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 132的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 135的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 151的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 132的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 137的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 152的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的具体实例具有如表A-9中针对ISVD36E11（SEQID NO: 340）及其序列优化变体所指示的一个或多个或全部框架区（除如上文所定义的CDR之外）。在一个实施例中，ISVD包含以下或由以下组成：ISVD36E11（SEQ ID NO: 340）、A025501239（SEQ ID NO: 341）、A025503054（SEQ ID NO: 342）、A025503015（SEQ ID NO:343）、A025503025（SEQ ID NO: 344）、A025503114（SEQ ID NO: 345）、A025503029（SEQ IDNO: 346）、A025503124（SEQ ID NO: 347）、A025503034（SEQ ID NO: 348）、A025503049（SEQID NO: 349）、A025503094（SEQ ID NO: 350）、A025503030（SEQ ID NO: 351）、A025503009（SEQ ID NO: 352）、A025503119（SEQ ID NO: 353）、A025503039（SEQ ID NO: 354）、A025503040（SEQ ID NO: 355）、A025503089（SEQ ID NO: 356）、A025503024（SEQ ID NO:357）、A025503005（SEQ ID NO: 358）、A025503104（SEQ ID NO: 359）、A025503109（SEQ IDNO: 360）、A025503130（SEQ ID NO: 361）、A025503004（SEQ ID NO: 362）、A025503014（SEQID NO: 363）、A025503044（SEQ ID NO: 364）、A025503050（SEQ ID NO: 365）、A025503055（SEQ ID NO: 366）、A025503129（SEQ ID NO: 367）、A025503020（SEQ ID NO: 368）、A025503110（SEQ ID NO: 369）、A025503120（SEQ ID NO: 370）、A025503115（SEQ ID NO:371）、A025503100（SEQ ID NO: 372）、A025503099（SEQ ID NO: 373）、A025503000（SEQ IDNO: 374）、A025503090（SEQ ID NO: 375）、A025503064（SEQ ID NO: 376）、A025503095（SEQID NO: 377）、A025500154（SEQ ID NO: 378）的完整氨基酸序列（参见表A-2）。在另一个实施例中，ISVD包含以下或由以下组成：ISVD41C01的完整氨基酸序列（SEQ ID NO: 379）（参见表A-2和表A-9）。

上述CDR序列的SEQ ID NO基于根据AbM定义的CDR定义（参见表A-9）。值得注意的是，同样可以使用根据Kabat定义而定义的CDR序列的SEQ ID NO（参见表A-10）。因此，由本技术提供的、如上所述使用AbM定义与PD-L1特异性结合的ISVD也可以使用Kabat定义来描述。

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 159的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 160或162的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 143或145的氨基酸序列；

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 159的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 160的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 160的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 160的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 143的氨基酸序列；

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 159的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 162的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 162的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 162的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 145的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO: 145的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

优选地，CDR序列与SEQ ID NO: 159的CDR1序列，SEQ ID NO: 160、161、162或163的CDR2序列和/或SEQ ID NO: 143、144、145、146、147、148、149、150、151或152的CDR3序列具有至少90%的氨基酸序列同一性，更优选至少95%的氨基酸序列同一性，例如99%或更高的氨基酸序列同一性，或者甚至基本上100%的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含CDR（Kabat编号），其氨基酸序列与具有选自SEQ IDNO: 340-379的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性、优选至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)HYVMG（SEQ ID NO: 159）的氨基酸序列；

c)与氨基酸序列HYVMG（SEQ ID NO: 159）具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)HYVMG（SEQ ID NO: 159）的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)DX₁TSX₂VVLAVEAYDY（SEQ ID NO: 609）的氨基酸序列；其中氨基酸残基X₁选自A、V、R、K或E，并且其中氨基酸残基X₂选自Q或G；

h)与DX₁TSX₂VVLAVEAYDY（SEQ ID NO: 609）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；其中氨基酸残基X₁选自A、V、R、K或E，并且其中氨基酸残基X₂选自Q或G；

i)与DX₁TSX₂VVLAVEAYDY（SEQ ID NO: 609）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；其中氨基酸残基X₁选自A、V、R、K或E，并且其中氨基酸残基X₂选自Q或G。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 159的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 160的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 143的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 159的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 161的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 144的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 159的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 161的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 145的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 159的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 162的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 146的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 159的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 161的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 147的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 159的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 161的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 148的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 159的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 161的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 149的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 159的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 161的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 150的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 159的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 162的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 148的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 159的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 161的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 146的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 159的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 162的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 144的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 159的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 162的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 145的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 159的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 162的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 147的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 159的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 162的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 149的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 159的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 162的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 150的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 159的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 161的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 151的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 159的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 163的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 152的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的具体实例具有如表A-10中针对ISVD36E11（SEQ ID NO: 340）及其序列优化变体所指示的一个或多个或全部框架区（除如上文所定义的CDR之外）。在一个实施例中，ISVD包含以下或由以下组成：ISVD36E11（SEQ ID NO: 340）、A025501239（SEQ ID NO: 341）、A025503054（SEQ ID NO: 342）、A025503015（SEQ ID NO:343）、A025503025（SEQ ID NO: 344）、A025503114（SEQ ID NO: 345）、A025503029（SEQ IDNO: 346）、A025503124（SEQ ID NO: 347）、A025503034（SEQ ID NO: 348）、A025503049（SEQID NO: 349）、A025503094（SEQ ID NO: 350）、A025503030（SEQ ID NO: 351）、A025503009（SEQ ID NO: 352）、A025503119（SEQ ID NO: 353）、A025503039（SEQ ID NO: 354）、A025503040（SEQ ID NO: 355）、A025503089（SEQ ID NO: 356）、A025503024（SEQ ID NO:357）、A025503005（SEQ ID NO: 358）、A025503104（SEQ ID NO: 359）、A025503109（SEQ IDNO: 360）、A025503130（SEQ ID NO: 361）、A025503004（SEQ ID NO: 362）、A025503014（SEQID NO: 363）、A025503044（SEQ ID NO: 364）、A025503050（SEQ ID NO: 365）、A025503055（SEQ ID NO: 366）、A025503129（SEQ ID NO: 367）、A025503020（SEQ ID NO: 368）、A025503110（SEQ ID NO: 369）、A025503120（SEQ ID NO: 370）、A025503115（SEQ ID NO:371）、A025503100（SEQ ID NO: 372）、A025503099（SEQ ID NO: 373）、A025503000（SEQ IDNO: 374）、A025503090（SEQ ID NO: 375）、A025503064（SEQ ID NO: 376）、A025503095（SEQID NO: 377）、A025500154（SEQ ID NO: 378）、ISVD41C01（SEQ ID NO: 379）的完整氨基酸序列（参见表A-2）。在另一个实施例中，ISVD包含以下或由以下组成：ISVD41C01的完整氨基酸序列（SEQ ID NO: 379）（参见表A-2和表A-10）。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 340具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 340的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 341具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 341的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 342具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 342的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 343具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 343的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 344具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 344的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 345具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 345的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 346具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 346的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 347具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 347的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 348具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 348的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 349具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 349的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 350具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 350的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 351具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 351的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 352具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 352的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 353具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 353的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 354具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 354的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 355具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 355的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 356具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 356的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 357具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 357的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 358具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 358的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 359具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 359的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 360具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 360的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 361具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 361的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 362具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 362的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 363具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 363的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 364具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 364的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 365具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 365的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 366具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 366的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 367具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 367的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 368具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 368的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 369具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 369的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 370具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 370的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 371具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 371的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 372具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 372的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 373具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 373的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 374具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 374的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 375具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 375的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 376具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 376的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 377具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 377的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 378具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 378的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 379具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 379的氨基酸序列。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与具有SEQ IDNO: 340-379的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与食蟹猴PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 340-379的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 340-379的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 340-379的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 340-379的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 340-379的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 340-379的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 340-379的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 340-379的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD仍然以小于10倍亲和力（KD）差异与人PD-L1和食蟹猴PD-L1特异性地结合。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合人PD-L1，kon速率在10⁴M^-1s^-1至约10⁷M^-1s^-1之间、优选在5.10⁵M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、更优选在5.10⁵M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、例如在10⁵M^-1s^-1和5.10⁶M^-1s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合食蟹猴PD-L1，解离常数（K_D）为5.10^-9至10^-11摩尔/升或更低，优选为10^-9至5.10^-11摩尔/升或更低并且更优选5.10^-10至10^-10摩尔/升，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合食蟹猴PD-L1，kon速率在10⁴M^-1s^-1至约10⁷M^-1s^-1之间、优选在10⁵M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、更优选在5.10⁵M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、例如在10⁵M^-1s^-1和5.10⁶M^-1s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域显示出与PD-1竞争结合PD-L1的高效力和/或功效（作为单可变结构域）。在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以功能性阻断PD-L1。更具体地，ISVD可以阻断PD-L1和PD1之间的相互作用。在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域拮抗PD-L1的活性。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合人PD-L1并阻断人PD-L1与人PD-1的相互作用。例如，在用作为竞争物的hPD-1进行的对表达人PD-L1的CHO细胞的FACS竞争测定中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域可具有10^-8M或更低、更优选地10^-9M或更低、或甚至10^-10M或更低的EC50值。例如，在这样的FACS竞争测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和10^-8M之间，例如10^-10M和10^-9M之间、10^-10M和10^- ⁸M之间或10^-11M和10^-9M之间的EC50值。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合食蟹猴PD-L1并阻断食蟹猴PD-L1与食蟹猴PD-1的相互作用。例如，在用作为竞争物的食蟹猴PD-1进行的对表达食蟹猴PD-L1的CHO细胞的FACS竞争测定中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域可具有10^-8M或更低、更优选地10^-9M或更低、或甚至10^-10M或更低的EC50值。例如，在这样的FACS竞争测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和10^-8M之间，例如10^- ¹⁰M和10^-9M之间、10^-10M和10^-8M之间或10^-11M和10^-9M之间的EC50值。

在一些实施例中，包含本技术的至少两个免疫球蛋白单可变结构域的多肽在通过IFN-γ产生监测的TT测定（例如如实例中所述）具有10^-8M或更低，更优选为10^-9M或更低，或甚至为5.10^-10M或更低的效力（EC50值）。例如，在这样的TT测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和10^-8M之间，例如10^-10M和10^-8M之间、10^-10M和10^-9M之间或10^-11M和10^-9M之间的效力（EC50值）。

5.2.3系列18

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 169的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 171或175的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 192或193的氨基酸序列；

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 169的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 171的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 171的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 171的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 192的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO: 192的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO: 192的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 169的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 175的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 175的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 175的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 196的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO: 196的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO: 196的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

优选地，这些CDR序列与SEQ ID NO: 169的CDR1序列、SEQ ID NO: 171、175、173、174、175、176、177、178、179、180或181的CDR2序列和/或SEQ ID NO: 192或193的CDR3序列具有至少90%氨基酸序列同一性、更优选地至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含CDR（AbM编号），其氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO:420-450的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性、优选至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)氨基酸序列GSIFTSAVME（SEQ ID NO: 169）；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 169的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 171的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 192的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 169的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 172的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 193的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 169的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 173的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 193的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 169的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 174的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 193的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 169的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 175的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 193的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 169的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 176的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 193的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 169的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 177的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 193的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 169的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 178的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 193的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 169的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 171的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 193的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 169的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 179的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 193的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 169的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 180的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 193的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 169的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 181的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 193的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的具体实例具有如表A-11中针对ISVD52A01（SEQ ID NO: 420）及其序列优化变体所指示的一个或多个或全部框架区（除如上文所定义的CDR之外）。在一个实施例中，ISVD包含以下或由以下组成：ISVD52A01（SEQ ID NO: 420）、A025503425（SEQ ID NO: 421）、A025503424（SEQ ID NO: 422）、A025503427（SEQ ID NO:423）、A025503426（SEQ ID NO: 424）、A025503428（SEQ ID NO: 425）、A025503431（SEQ IDNO: 426）、A025503432（SEQ ID NO: 427）、A025503421（SEQ ID NO: 428）、A025503434（SEQID NO: 429）、A025503422（SEQ ID NO: 430）、A025503433（SEQ ID NO: 431）、A025503435（SEQ ID NO: 432）、A025500158（SEQ ID NO: 433）、A025503416（SEQ ID NO: 434）、A025503417（SEQ ID NO: 435）、A0255034189（SEQ ID NO: 436）、A025503436（SEQ ID NO:437）、A025503423（SEQ ID NO: 438）、A025503429（SEQ ID NO: 439）、A025503430（SEQ IDNO: 440）、A025503437（SEQ ID NO: 441）、A025503419（SEQ ID NO: 442）、A025503438（SEQID NO: 443）、A025503420（SEQ ID NO: 444）、A025503452（SEQ ID NO: 445）、A025503453（SEQ ID NO: 446）、A025503454（SEQ ID NO: 447）、A025503455（SEQ ID NO: 448）、A025503456（SEQ ID NO: 449）的完整氨基酸序列（参见表A-2）。在另一个实施例中，ISVD包含以下或由以下组成：ISVD8G05的完整氨基酸序列（SEQ ID NO: 450）（参见表A-2和表A-11）。

上述CDR序列的SEQ ID NO基于根据AbM定义的CDR定义（参见表A-11）。值得注意的是，同样可以使用根据Kabat定义而定义的CDR序列的SEQ ID NO（参见表A-12）。因此，由本技术提供的、如上所述使用AbM定义与PD-L1特异性结合的ISVD也可以使用Kabat定义来描述。

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 197的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 198或202的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 192或193的氨基酸序列；

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 197的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO: 497的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 198的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 198的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 198的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 192的氨基酸序列；

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 197的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 202的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO: 202的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 202的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 193的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO: 193的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO: 193的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

优选地，这些CDR序列与SEQ ID NO: 197的CDR1序列、SEQ ID NO: 198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208或209的CDR2序列和/或SEQ ID NO: 192或193的CDR3序列具有至少90%氨基酸序列同一性、更优选地至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含CDR（Kabat编号），其氨基酸序列与具有选自SEQ IDNO: 420-450的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性、优选至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SAVME（SEQ ID NO: 197）的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 197的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 198的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 192的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 197的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 199的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 193的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 197的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 200的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 193的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 197的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 201的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 193的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 197的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 202的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 193的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 197的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 203的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 193的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 197的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 204的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 193的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 197的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 205的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 193的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 197的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 198的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 193的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 197的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 206的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 193的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 197的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 207的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 193的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 197的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 208的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 193的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 197的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 209的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 193的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的具体实例具有如表A-12中针对ISVD52A01（SEQ ID NO: 420）及其序列优化变体所指示的一个或多个或全部框架区（除如上文所定义的CDR之外）。在一个实施例中，ISVD包含以下或由以下组成：ISVD52A01（SEQ ID NO: 420）、A025503425（SEQ ID NO: 421）、A025503424（SEQ ID NO: 422）、A025503427（SEQ ID NO:423）、A025503426（SEQ ID NO: 424）、A025503428（SEQ ID NO: 425）、A025503431（SEQ IDNO: 426）、A025503432（SEQ ID NO: 427）、A025503421（SEQ ID NO: 428）、A025503434（SEQID NO: 429）、A025503422（SEQ ID NO: 430）、A025503433（SEQ ID NO: 431）、A025503435（SEQ ID NO: 432）、A025500158（SEQ ID NO: 433）、A025503416（SEQ ID NO: 434）、A025503417（SEQ ID NO: 435）、A0255034189（SEQ ID NO: 436）、A025503436（SEQ ID NO:437）、A025503423（SEQ ID NO: 438）、A025503429（SEQ ID NO: 439）、A025503430（SEQ IDNO: 440）、A025503437（SEQ ID NO: 441）、A025503419（SEQ ID NO: 442）、A025503438（SEQID NO: 443）、A025503420（SEQ ID NO: 444）、A025503452（SEQ ID NO: 445）、A025503453（SEQ ID NO: 446）、A025503454（SEQ ID NO: 447）、A025503455（SEQ ID NO: 448）、A025503456（SEQ ID NO: 449）的完整氨基酸序列（参见表A-2）。在另一个实施例中，ISVD包含以下或由以下组成：ISVD8G05的完整氨基酸序列（SEQ ID NO: 450）（参见表A-2和表A-12）。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 420具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 420的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 421具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 421的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 422具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 422的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 423具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 423的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 424具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 424的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 425具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 425的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 426具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 426的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 427具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 427的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 428具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 428的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 429具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 429的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 430具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 430的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 431具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 431的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 432具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 432的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 433具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 433的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 434具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 434的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 435具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 435的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 436具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 436的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 437具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 437的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 438具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 438的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 439具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 439的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 440具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 440的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 441具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 441的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 442具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 442的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 443具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 443的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 444具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 444的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 445具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 445的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 446具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 446的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 447具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 447的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 448具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 448的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 449具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 449的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 450具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 450的氨基酸序列。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与具有SEQ IDNO: 420-450的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与食蟹猴PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 420-450的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 420-450的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 420-450的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 420-450的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 420-450的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 420-450的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 420-450的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 420-450的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD仍然以小于10倍亲和力（KD）差异与人PD-L1和食蟹猴PD-L1特异性地结合。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合人PD-L1，解离常数（K_D）为5.10^-9至10^-11摩尔/升或更低，优选为10^-9至5.10^-11摩尔/升或10^-9至10^-10摩尔/升，或更优选为10^-9至10^-11摩尔/升，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合人PD-L1，kon速率在10⁴M^-1s^-1至约10⁷M^-1s^-1之间、优选在5.10⁴M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、更优选在10⁵M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、例如在5.10⁵M^-1s^-1和5.10⁶M^-1s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合人PD-L1，koff速率在10^-3s^-1（t1/2 = 0.69 s）和10^-6s^-1（提供t1/2为多天的接近不可逆的复合物）之间，优选在10^-3s^-1和5.10^-6s^-1之间，更优选在10^-4s^-1和10^-6s^-1之间，例如在10^-4s^-1和10^-5s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合食蟹猴PD-L1，解离常数（K_D）为5.10^-9至10^-11摩尔/升或更低，优选为10^-9至5.10^-11摩尔/升或更低并且更优选10^-9至10^-10摩尔/升，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合食蟹猴PD-L1，kon速率在10⁴M^-1s^-1至约10⁷M^-1s^-1之间、优选在5.10⁴M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、更优选在10⁵M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、例如在5.10⁵M^-1s^-1和5.10⁶M^-1s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合食蟹猴PD-L1，koff速率在10^-3s^-1（t1/2 = 0.69 s）和10^-6s^-1（提供t1/2为多天的接近不可逆的复合物）之间，优选在10^-3s^-1和5.10^-6s^-1之间，更优选在10^-4s^-1和10^-6s^-1之间，例如在10^-4s^-1和10^-5s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合内源PD-L1并阻断PD-L1与人PD-1的相互作用。例如，在用作为竞争物的人PD-1进行的对表达人PD-L1的ES-2细胞的FACS竞争测定中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域可具有10^-8M或更低、更优选地10^-9M或更低、或甚至10^-10M或更低的EC50值。例如，在这样的FACS竞争测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和10^-8M之间，例如10^-10M和10^-9M之间、10^-10M和10^- ⁸M之间或10^-11M和10^-9M之间的EC50值。

在一些实施例中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域在经由IFN-γ产生进行监测的TT测定（例如，如实例中所述）中具有10^-8M或更低、更优选地10^-9M或更低、或甚至5.10^-10M或更低的效力（EC50值）。例如，在这样的TT测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和10^-8M之间，例如10^-10M和10^-8M之间、10^-10M和5.10^-9M之间或10^-11M和5.10^-9M之间的效力（EC50值）。

在一些实施例中，包含本技术的至少两个免疫球蛋白单可变结构域的多肽在通过IFN-γ产生监测的TT测定（例如如实例中所述）具有10^-8M或更低，更优选为10^-9M或更低，或甚至为5.10^-10M或更低的效力（EC50值）。例如，在这样的TT测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和10^-9M之间，例如10^-10M和10^-9M之间、10^-10M和5.10^-9M之间或10^-11M和5.10^-9M之间的效力（EC50值）。

该T细胞活化生物测定（NFAT）是一种基于生物发光细胞的测定，由基因工程化Jurkat T细胞系组成，该细胞系表达由NFAT应答元件（NFAT-RE）驱动的荧光素酶报告基因。当TCR/CD3效应细胞（NFAT）参与时，TCR转导细胞内信号，导致NFAT-RE介导的发光。使用Bio-Glo™荧光素酶测定系统和标准发光计（例如GloMax® Discover系统）检测和定量生物发光信号。在一些实施例中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域在NFAT测定（例如，如实例中所述）中具有10^-7M或更低、10^-8M或更低、更优选地5x10^-8M或更低、或甚至10^-9M或更低、或甚至5x10^-10或更低的效力（EC50值）。例如，在这样的NFAT测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-10M和10^-7M之间，例如10^-10M和5.10^-8M之间或10^-10M和10^-8M之间的效力（EC50值）。

5.2.4系列16

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 218的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 222的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 234的氨基酸序列；

优选地，CDR序列与SEQ ID NO: 218或219的CDR1序列，SEQ ID NO: 222、223或224的CDR2序列和/或SEQ ID NO: 234或235的CDR3序列具有至少90%的氨基酸序列同一性，更优选至少95%的氨基酸序列同一性，例如99%或更高的氨基酸序列同一性，或者甚至基本上100%的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含CDR（AbM编号），其氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO:482-497的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性、优选至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)ERTFX₁SYSMG的氨基酸序列（SEQ ID NO: 617），其中该氨基酸残基X₁选自S和G；

b)与ERTFX₁SYSMG（SEQ ID NO: 617）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自S和G；

c)与ERTFX₁SYSMG（SEQ ID NO: 617）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自S和G；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 218的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 222的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 234的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 218的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 223的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 234的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 218的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 224的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 234的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 219的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 222的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 235的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的具体实例具有如表A-13中针对ISVD9B10（SEQID NO: 482）及其序列优化变体所指示的一个或多个或全部框架区（除如上文所定义的CDR之外）。在一个实施例中，该ISVD包含以下的完整氨基酸序列或由以下的完整氨基酸序列组成：ISVD9B10（SEQ ID NO: 482）、A025500177（SEQ ID NO: 483）、A025503408（SEQ ID NO:484）、A025503409（SEQ ID NO: 485）、A025503410（SEQ ID NO: 486）、A025503411（SEQ IDNO: 487）、A025503412（SEQ ID NO: 488）、A025503413（SEQ ID NO: 489）、A025503414（SEQID NO: 490）、A025503415（SEQ ID NO: 491）、A025503447（SEQ ID NO: 492）、A025503448（SEQ ID NO: 493）、A025503449（SEQ ID NO: 494）、A025503450（SEQ ID NO: 495）、A025503451（SEQ ID NO: 496）（参见表A-2）。在另一个实施例中，ISVD包含以下或由以下组成：ISVD41B12的完整氨基酸序列（SEQ ID NO: 497）（参见表A-2和表A-13）。

上述CDR序列的SEQ ID NO基于根据AbM定义的CDR定义（参见表A-13）。值得注意的是，同样可以使用根据Kabat定义而定义的CDR序列的SEQ ID NO（参见表A-14）。因此，由本技术提供的、如上所述使用AbM定义与PD-L1特异性结合的ISVD也可以使用Kabat定义来描述。

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 241的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 242的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 234的氨基酸序列；

优选地，CDR序列与SEQ ID NO: 241的CDR1序列，SEQ ID NO: 242或243的CDR2序列和/或SEQ ID NO: 234或235的CDR3序列具有至少90%的氨基酸序列同一性，更优选至少95%的氨基酸序列同一性，例如99%或更高的氨基酸序列同一性，或者甚至基本上100%的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含CDR（Kabat编号），其氨基酸序列与具有选自SEQ IDNO: 482-497的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性、优选至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SYSMG（SEQ ID NO: 241）的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 241的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 242的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 234的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 241的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 243的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 234的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 241的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 244的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 234的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

在另一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 241的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 242的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 235的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的具体实例具有如表A-14中针对ISVD9B10（SEQID NO: 482）及其序列优化变体所指示的一个或多个或全部框架区（除如上文所定义的CDR之外）。在一个实施例中，该ISVD包含以下的完整氨基酸序列或由以下的完整氨基酸序列组成：ISVD9B10（SEQ ID NO: 482）、A025500177（SEQ ID NO: 483）、A025503408（SEQ ID NO:484）、A025503409（SEQ ID NO: 485）、A025503410（SEQ ID NO: 486）、A025503411（SEQ IDNO: 487）、A025503412（SEQ ID NO: 488）、A025503413（SEQ ID NO: 489）、A025503414（SEQID NO: 490）、A025503415（SEQ ID NO: 491）、A025503447（SEQ ID NO: 492）、A025503448（SEQ ID NO: 493）、A025503449（SEQ ID NO: 494）、A025503450（SEQ ID NO: 495）、A025503451（SEQ ID NO: 496）（参见表A-2）。在另一个实施例中，ISVD包含以下或由以下组成：ISVD41B12的完整氨基酸序列（SEQ ID NO: 497）（参见表A-2和表A-14）。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 482具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 482的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 483具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 483的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 484具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 484的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 485具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 485的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 486具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 486的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 487具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 487的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 488具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 488的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 489具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 489的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 490具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 490的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 491具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 491的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 492具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 492的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 493具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 493的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 494具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 494的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 495具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 495的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 496具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 496的氨基酸序列。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 497具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 497的氨基酸序列。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与具有SEQ IDNO: 482-497的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与食蟹猴PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 482-497的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 482-497的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 482-497的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 482-497的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 482-497的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 482-497的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 482-497的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 482-497的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD仍然以小于10倍亲和力（KD）差异与人PD-L1和食蟹猴PD-L1特异性地结合。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合人PD-L1，解离常数（K_D）为5.10^-9至10^-11摩尔/升或更低，优选为10^-9至5.10^-11摩尔/升或5.10^-10至10^-10摩尔/升，或更优选为10^-9至10^-10摩尔/升，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合人PD-L1，koff速率在10^-3s^-1（t1/2 = 0.69 s）和10^-6s^-1（提供t1/2为多天的接近不可逆的复合物）之间，优选在10^-3s^-1和5.10^-5s^-1之间，更优选在10^-4s^-1和5.10^-5s^-1之间，例如在10^-4s^-1和10^-5s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合食蟹猴PD-L1，koff速率在10^-3s^-1（t1/2 = 0.69 s）和10^-6s^-1（提供t1/2为多天的接近不可逆的复合物）之间，优选在10^-3s^-1和5.10^-6s^-1之间，更优选在5.10^-4s^-1和5.10^-6s^-1之间，例如在10^-4s^-1和10^- ⁵s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合人PD-L1并阻断人PD-L1与人PD-1的相互作用。例如，在用作为竞争物的hPD-1进行的对表达人PD-L1的CHO细胞的FACS竞争测定中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域可具有10^-8M或更低、更优选地5.10^-9M或更低、10^-9M或更低、或甚至10^-10M或更低的EC50值。例如，在这样的FACS竞争测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和10^-8M之间，例如10^-10M和10^-9M之间、10^-10M和10^-8M之间或10^-11M和10^-9M之间的EC50值。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合内源PD-L1并阻断PD-L1与人PD-1的相互作用。例如，在用作为竞争物的人PD-1进行的对表达人PD-L1的ES-2细胞的FACS竞争测定中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域可具有10^-8M或更低、更优选地10^-9M或更低、或甚至10^-10M或更低的EC50值。例如，在这样的FACS竞争测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和10^-8M之间，例如10^-11M和10^-9M之间、或10^-11M和5.10^-10M之间的EC50值。

该T细胞活化生物测定（NFAT）是一种基于生物发光细胞的测定，由基因工程化Jurkat T细胞系组成，该细胞系表达由NFAT应答元件（NFAT-RE）驱动的荧光素酶报告基因。当TCR/CD3效应细胞（NFAT）参与时，TCR转导细胞内信号，导致NFAT-RE介导的发光。使用Bio-Glo™荧光素酶测定系统和标准发光计（例如GloMax® Discover系统）检测和定量生物发光信号。在一些实施例中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域在NFAT测定（例如，如实例中所述）中具有10^-7M或更低、10^-8M或更低、更优选地5x10^-8M或更低、或甚至10^-9M或更低的效力（EC50值）。例如，在这样的NFAT测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-10M和10^-7M之间，例如10^-10M和10^-8M之间或10^-9M和10^-7M之间的效力（EC50值）。

5.2.5系列17

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 256的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 267的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 279的氨基酸序列；

优选地，CDR序列与SEQ ID NO: 256的CDR1序列，SEQ ID NO: 267的CDR2序列和/或SEQ ID NO: 279的CDR3序列具有至少90%的氨基酸序列同一性，更优选至少95%的氨基酸序列同一性，例如99%或更高的氨基酸序列同一性，或者甚至基本上100%的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含CDR（AbM编号），其氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO:514的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性、优选至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 256的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 267的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 279的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的具体实例具有如表A-15中针对ISVD8E09（SEQID NO: 514）及其序列优化变体所指示的一个或多个或全部框架区（除如上文所定义的CDR之外）（参见表A-2）。

上述CDR序列的SEQ ID NO基于根据AbM定义的CDR定义（参见表A-15）。值得注意的是，同样可以使用根据Kabat定义而定义的CDR序列的SEQ ID NO（参见表A-16）。因此，由本技术提供的、如上所述使用AbM定义与PD-L1特异性结合的ISVD也可以使用Kabat定义来描述。

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 293的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 299的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 279的氨基酸序列；

优选地，CDR序列与SEQ ID NO: 293的CDR1序列，SEQ ID NO: 299的CDR2序列和/或SEQ ID NO: 279的CDR3序列具有至少90%的氨基酸序列同一性，更优选至少95%的氨基酸序列同一性，例如99%或更高的氨基酸序列同一性，或者甚至基本上100%的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含CDR（Kabat编号），其氨基酸序列与具有选自SEQ IDNO: 514的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性、优选至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 293的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 299的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 279的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的具体实例具有如表A-16中针对ISVD8E09（SEQID NO: 515）及其序列优化变体所指示的一个或多个或全部框架区（除如上文所定义的CDR之外）（参见表A-2）。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 514具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 514或520的氨基酸序列。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与具有SEQ IDNO: 514的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与食蟹猴PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 514的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 514的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 514的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 514的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 514的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 514的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 514的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 514的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD仍然以小于10倍亲和力（KD）差异与人PD-L1和食蟹猴PD-L1特异性地结合。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合人PD-L1，解离常数（K_D）为10^-8至10^-11摩尔/升或更低，优选为5.10^-9至5.10^-11摩尔/升或5.10^-9至10^-10摩尔/升，或更优选为10^-8至10^-10摩尔/升，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合人PD-L1，koff速率在10^-2s^-1（t1/2 = 0.69 s）和10^-6s^-1（提供t1/2为多天的接近不可逆的复合物）之间，优选在5.10^-3s^-1和5.10^-6s^-1之间，更优选在5.10^-3s^-1和10^-5s^-1之间，例如在10^-3s^-1和10^-5s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合食蟹猴PD-L1，解离常数（K_D）为10^-8至10^-11摩尔/升或更低，优选为5.10^-9至5.10^-11摩尔/升或更低并且更优选为5.10^-9至10^-10摩尔/升，或更优选为10^-8至10^-10摩尔/升，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合食蟹猴PD-L1，koff速率在10^-2s^-1（t1/2 = 0.69 s）和10^-6s^-1（提供t1/2为多天的接近不可逆的复合物）之间，优选在5.10^-3s^-1和5.10^-6s^-1之间，更优选在5.10^-3s^-1和10^-6s^-1之间，例如在10^-3s^-1和10^- ⁵s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合人PD-L1并阻断人PD-L1与人PD-1的相互作用。例如，在用作为竞争物的hPD-1进行的对表达人PD-L1的CHO细胞的FACS竞争测定中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域可具有10^-8M或更低、更优选地5.10^-9M或更低、10^-9M或更低、或甚至10^-10M或更低的EC50值。例如，在这样的FACS竞争测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和10^-8M之间，例如10^-10M和5.10^-9M之间、5.10^-10M和10^-8M之间或10^-10M和5.10^-9M之间的EC50值。

在一些实施例中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域在经由IFN-γ产生进行监测的TT测定（例如，如实例中所述）中具有10^-7M或更低、更优选地5.10^-8M或更低、或甚至10^-8M或更低的效力（EC50值）。例如，在这样的TT测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和10^-7M之间，例如10^-10M和10^-7M之间、10^-10M和5.10^-8M之间的效力（EC50值）。

5.2.6系列6

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 257的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 268的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 280的氨基酸序列；

优选地，CDR序列与SEQ ID NO: 257的CDR1序列，SEQ ID NO: 268的CDR2序列和/或SEQ ID NO: 280的CDR3序列具有至少90%的氨基酸序列同一性，更优选至少95%的氨基酸序列同一性，例如99%或更高的氨基酸序列同一性，或者甚至基本上100%的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含CDR（AbM编号），其氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO:515的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性、优选至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 257的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 268的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 280的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的具体实例具有如表A-15中针对ISVD9A10（SEQID NO: 515）及其序列优化变体所指示的一个或多个或全部框架区（除如上文所定义的CDR之外）（参见表A-2）。

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 294的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 300的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 280的氨基酸序列；

优选地，CDR序列与SEQ ID NO: 294的CDR1序列，SEQ ID NO: 300的CDR2序列和/或SEQ ID NO: 280的CDR3序列具有至少90%的氨基酸序列同一性，更优选至少95%的氨基酸序列同一性，例如99%或更高的氨基酸序列同一性，或者甚至基本上100%的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含CDR（Kabat编号），其氨基酸序列与具有选自SEQ IDNO: 515的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性、优选至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 294的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 300的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 280的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的具体实例具有如表A-16中针对ISVD9A10（SEQID NO: 515）及其序列优化变体所指示的一个或多个或全部框架区（除如上文所定义的CDR之外）（参见表A-2）。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 515具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 515或521的氨基酸序列。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与具有SEQ IDNO: 515的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与食蟹猴PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 515的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 515的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 515的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 515的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 515的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 515的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 515的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 515的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD仍然以小于10倍亲和力（KD）差异与人PD-L1和食蟹猴PD-L1特异性地结合。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合人PD-L1，解离常数（K_D）为10^-8至10^-11摩尔/升或更低，优选为10^-8至10^-10摩尔/升或5.10^-9至10^-11摩尔/升，或更优选为5.10^-9至10^-10摩尔/升，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合人PD-L1，koff速率在10^-2s^-1（t1/2 = 0.69 s）和10^-6s^-1（提供t1/2为多天的接近不可逆的复合物）之间，优选在10^-2s^-1和5.10^-6s^-1之间，更优选在5.10^-3s^-1和5.10^-6s^-1之间，例如在5.10^-3s^-1和10^-5s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合食蟹猴PD-L1，解离常数（K_D）为10^-8至10^-11摩尔/升或更低，优选为10^-8至10^-10摩尔/升或更低并且更优选为5.10^-9至10^-11摩尔/升，或更优选为5.10^-9至10^-10摩尔/升，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合食蟹猴PD-L1，koff速率在10^-2s^-1（t1/2 = 0.69 s）和10^-6s^-1（提供t1/2为多天的接近不可逆的复合物）之间，优选在10^-2s^-1和5.10^-6s^-1之间，更优选在5.10^-3s^-1和5.10^-6s^-1之间，例如在5.10^-3s^-1和10^-5s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合人PD-L1并阻断人PD-L1与人PD-1的相互作用。例如，在用作为竞争物的hPD-1进行的对表达人PD-L1的CHO细胞的FACS竞争测定中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域可具有10^-8M或更低、更优选地5.10^-9M或更低、10^-9M或更低、或甚至10^-10M或更低的EC50值。例如，在这样的FACS竞争测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和10^-8M之间，例如10^-10M和10^-8M之间、10^-10M和10^-9M之间或10^-11M和10^-9M之间的EC50值。

5.2.7系列44

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 258的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 269的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 281的氨基酸序列；

优选地，CDR序列与SEQ ID NO: 258的CDR1序列，SEQ ID NO: 269的CDR2序列和/或SEQ ID NO: 281的CDR3序列具有至少90%的氨基酸序列同一性，更优选至少95%的氨基酸序列同一性，例如99%或更高的氨基酸序列同一性，或者甚至基本上100%的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含CDR（AbM编号），其氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO:516的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性、优选至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 258的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 269的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 281的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的具体实例具有如表A-15中针对ISVD32C01（SEQ ID NO: 516）及其序列优化变体所指示的一个或多个或全部框架区（除如上文所定义的CDR之外）（参见表A-2）。

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 295的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 301的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 281的氨基酸序列；

优选地，CDR序列与SEQ ID NO: 295的CDR1序列，SEQ ID NO: 301的CDR2序列和/或SEQ ID NO: 281的CDR3序列具有至少90%的氨基酸序列同一性，更优选至少95%的氨基酸序列同一性，例如99%或更高的氨基酸序列同一性，或者甚至基本上100%的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含CDR（Kabat编号），其氨基酸序列与具有选自SEQ IDNO: 516的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性、优选至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 295的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 301的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 281的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的具体实例具有如表A-16中针对ISVD32C01（SEQ ID NO: 516）及其序列优化变体所指示的一个或多个或全部框架区（除如上文所定义的CDR之外）（参见表A-2）。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 516具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 516或522的氨基酸序列。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与具有SEQ IDNO: 516的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与食蟹猴PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 516的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 516的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 516的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 516的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 516的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 516的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 516的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 516的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD仍然以小于10倍亲和力（KD）差异与人PD-L1和食蟹猴PD-L1特异性地结合。

在一些实施例中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域在经由IFN-γ产生进行监测的TT测定（例如，如实例中所述）中具有10^-7M或更低、更优选地5.10^-8M或更低、或甚至10^-8M或更低的效力（EC50值）。例如，在这样的TT测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和5.10^-8M之间，例如10^-10M和5.10^-8M之间、10^-10M和10^-8M之间或10^-11M和10^-8M之间的效力（EC50值）。

5.2.8系列43

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 259的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 270的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 282的氨基酸序列；

优选地，CDR序列与SEQ ID NO: 259的CDR1序列，SEQ ID NO: 270的CDR2序列和/或SEQ ID NO: 282的CDR3序列具有至少90%的氨基酸序列同一性，更优选至少95%的氨基酸序列同一性，例如99%或更高的氨基酸序列同一性，或者甚至基本上100%的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含CDR（AbM编号），其氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO:517的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性、优选至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 259的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 270的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 282的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的具体实例具有如表A-15中针对ISVD32E11（SEQ ID NO: 517）及其序列优化变体所指示的一个或多个或全部框架区（除如上文所定义的CDR之外）（参见表A-2）。

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 296的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 302的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 282的氨基酸序列；

优选地，CDR序列与SEQ ID NO: 296的CDR1序列，SEQ ID NO: 302的CDR2序列和/或SEQ ID NO: 282的CDR3序列具有至少90%的氨基酸序列同一性，更优选至少95%的氨基酸序列同一性，例如99%或更高的氨基酸序列同一性，或者甚至基本上100%的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含CDR（Kabat编号），其氨基酸序列与具有选自SEQ IDNO: 517的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性、优选至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 296的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 302的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 282的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的具体实例具有如表A-16中针对ISVD32E11（SEQ ID NO: 517）及其序列优化变体所指示的一个或多个或全部框架区（除如上文所定义的CDR之外）（参见表A-2）。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 517具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 517或523的氨基酸序列。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与具有SEQ IDNO: 517的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与食蟹猴PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 517的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 517的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 517的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 517的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 517的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 517的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 517的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 517的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD仍然以小于10倍亲和力（KD）差异与人PD-L1和食蟹猴PD-L1特异性地结合。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合人PD-L1，解离常数（K_D）为10^-8至10^-11摩尔/升或更低，优选为10^-9至5.10^-11摩尔/升或10^-8至10^-10摩尔/升，或更优选为10^-9至10^-10摩尔/升，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合食蟹猴PD-L1，解离常数（K_D）为10^-8至10^-11摩尔/升或更低，优选为10^-9至5.10^-11摩尔/升或更低并且更优选为10^-8至10^-10摩尔/升，或更优选为10^-9至10^-10摩尔/升，如通过表面等离子体共振测定的。

5.2.9系列46

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 260的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 271的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 283的氨基酸序列；

优选地，CDR序列与SEQ ID NO: 260的CDR1序列，SEQ ID NO: 271的CDR2序列和/或SEQ ID NO: 283的CDR3序列具有至少90%的氨基酸序列同一性，更优选至少95%的氨基酸序列同一性，例如99%或更高的氨基酸序列同一性，或者甚至基本上100%的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含CDR（AbM编号），其氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO:518的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性、优选至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 260的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 271的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 283的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的具体实例具有如表A-15中针对ISVD36D12（SEQ ID NO: 518）及其序列优化变体所指示的一个或多个或全部框架区（除如上文所定义的CDR之外）（参见表A-2）。

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 297的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 303的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 283的氨基酸序列；

优选地，CDR序列与SEQ ID NO: 297的CDR1序列，SEQ ID NO: 303的CDR2序列和/或SEQ ID NO: 283的CDR3序列具有至少90%的氨基酸序列同一性，更优选至少95%的氨基酸序列同一性，例如99%或更高的氨基酸序列同一性，或者甚至基本上100%的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含CDR（Kabat编号），其氨基酸序列与具有选自SEQ IDNO: 518的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性、优选至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 297的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 303的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 283的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的具体实例具有如表A-16中针对ISVD36D12（SEQ ID NO: 518）及其序列优化变体所指示的一个或多个或全部框架区（除如上文所定义的CDR之外）（参见表A-2）。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 514具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 518或524的氨基酸序列。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与具有SEQ IDNO: 518的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与食蟹猴PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 518的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 518的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 518的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 518的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 518的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 518的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 518的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 518的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD仍然以小于10倍亲和力（KD）差异与人PD-L1和食蟹猴PD-L1特异性地结合。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合人PD-L1，k_off速率在10^-2s^-1（t1/2 = 0.69 s）和10^-6s^-1（提供t1/2为多天的接近不可逆的复合物）之间，优选在10^-2s^-1和5.10^-6s^-1之间，更优选在5.10^-3s^-1和5.10^-6s^-1之间，例如在5.10^-3s^-1和10^-5s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合食蟹猴PD-L1，解离常数（K_D）为10^-8至10^-11摩尔/升或更低，优选为10^-9至5.10^-11摩尔/升或10^-8至10^-10摩尔/升，或更优选为10^-9至10^-10摩尔/升，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域特异性结合食蟹猴PD-L1，k_off速率在10^-2s^-1（t1/2 = 0.69 s）和10^-6s^-1（提供t1/2为多天的接近不可逆的复合物）之间，优选在10^-2s^-1和5.10^-6s^-1之间，更优选在5.10^-3s^-1和5.10^-6s^-1之间，例如在5.10^-3s^-1和10^-5s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

5.2.10系列45

-CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 262的氨基酸序列；

以及

-CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 272的氨基酸序列；

以及

-CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 284的氨基酸序列；

优选地，CDR序列与SEQ ID NO: 262的CDR1序列，SEQ ID NO: 272的CDR2序列和/或SEQ ID NO: 284的CDR3序列具有至少90%的氨基酸序列同一性，更优选至少95%的氨基酸序列同一性，例如99%或更高的氨基酸序列同一性，或者甚至基本上100%的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含CDR（AbM编号），其氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO:519的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性、优选至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 262的氨基酸序列的CDR1（AbM编号）、作为SEQ ID NO: 272的氨基酸序列的CDR2（AbM编号）和作为SEQ ID NO: 284的氨基酸序列的CDR3（AbM编号）。

与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的具体实例具有如表A-15中针对ISVD41A05（SEQ ID NO: 519）及其序列优化变体所指示的一个或多个或全部框架区（除如上文所定义的CDR之外）（参见表A-2）。

-CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO: 298的氨基酸序列；

以及

-CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d)SEQ ID NO: 304的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO: 304的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

-CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g)SEQ ID NO: 284的氨基酸序列；

优选地，CDR序列与SEQ ID NO: 298的CDR1序列，SEQ ID NO: 304的CDR2序列和/或SEQ ID NO: 284的CDR3序列具有至少90%的氨基酸序列同一性，更优选至少95%的氨基酸序列同一性，例如99%或更高的氨基酸序列同一性，或者甚至基本上100%的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含CDR（Kabat编号），其氨基酸序列与具有选自SEQ IDNO: 519的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性、优选至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 298的氨基酸序列的CDR1（Kabat编号）、作为SEQ ID NO: 304的氨基酸序列的CDR2（Kabat编号）和作为SEQ ID NO: 284的氨基酸序列的CDR3（Kabat编号）。

与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的具体实例具有如表A-16中针对ISVD41A05（SEQ ID NO: 519）及其序列优化变体所指示的一个或多个或全部框架区（除如上文所定义的CDR之外）（参见表A-2）。

在另一个实施例中，与PD-L1特异性地结合的ISVD可与SEQ ID NO: 519具有大于90%、诸如大于95%或甚至大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，特异性结合PD-L1的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 519的氨基酸序列。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与具有SEQ IDNO: 519的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与食蟹猴PD-L1特异性地结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（上文）的3个、2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 519的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 519的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与PD-L1特异性地结合的此类ISVD的CDR与对应参考CDR序列（上文）具有至少90%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、诸如99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQ ID NO: 519的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 519的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 519的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与人PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 519的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD具有与具有SEQID NO: 519的VHH中的一个相比至少（基本上）相同的与食蟹猴PD-L1的结合亲和力，其中该结合亲和力是使用相同的方法（诸如例如，SPR）来测量的。

在另一个实施例中，当与人PD-L1特异性地结合的ISVD与具有SEQ ID NO: 519的VHH中的一个具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性时，该ISVD仍然以小于10倍亲和力（KD）差异与人PD-L1和食蟹猴PD-L1特异性地结合。

5.3多肽和构建体

从免疫球蛋白单可变结构域（诸如VHH、人源化VHH、骆驼化VH、结构域抗体或dAb）开始设计/选择和/或制备多肽的过程在本文中也被称为“格式化”所述免疫球蛋白单可变结构域；并且构成多肽一部分的免疫球蛋白单可变结构域被称为“格式化的”所述多肽或“处于”所述多肽的“格式”。基于本文的披露内容，技术人员将清楚免疫球蛋白单可变结构域可格式化的方式的实例以及此类格式的实例；并且这种格式化的免疫球蛋白单可变结构域形成了本技术的另一方面。

例如并且不限于，一个或多个免疫球蛋白单可变结构域可用作用于制备多肽的“结合单元”、“结合结构域”或“构建块”（这些术语可互换使用），其可任选地含有可充当结合单元的一个或多个另外的免疫球蛋白单可变结构域（即，针对PD-L1上的相同或另一表位和/或针对除PD-L1之外的一种或多种其他抗原、蛋白质或靶标）。

本技术还提供了包含以下或基本上由以下组成的多肽或构建体：一个或多个免疫球蛋白单可变结构域。在一个实施例中，多肽还包含任选地通过一个或多个接头连接的一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元。一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元可以是本领域已知的任何基团、残基、部分或结合单元。在一个实施例中，一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元是氨基酸序列，使得所得多肽是融合（蛋白质）或融合（多肽）。

这些另外的基团、残基、部分、结合单元或氨基酸序列可为或可不为该ISVD、多肽或构建体提供另外的功能性，并且可修饰或可不修饰该ISVD、多肽和/或构建体的这些特性。此类基团、残基、部分或结合单元可以例如是化学基团、残基、部分，其本身可以具有或不具有生物和/或药理学活性。例如但不限于，此类基团可以连接至一种或多种ISVD和/或多肽以提供ISVD和/或多肽的“衍生物”。

一个或多个另外的氨基酸序列可以是任何合适的和/或期望的氨基酸序列。这些另外的氨基酸序列可改变、更改或以其他方式影响或可不改变、更改或以其他方式影响该ISVD或多肽的这些（生物学）特性，并且可向或可不向该ISVD或该多肽添加另外的功能性。优选地，另外的氨基酸序列使得其赋予ISVD或多肽一种或多种期望的性质或功能。此类氨基酸序列的实例对于技术人员而言将是清楚的，并且一般可包括用于基于常规抗体以及它们的片段（包括但不限于ScFv和单结构域抗体）的肽融合体中的所有氨基酸序列。例如，参考Holliger和Hudson, Nature Biotechnology[自然生物技术], 23, 9, 1126-1136(2005)的综述。例如，此类氨基酸序列可以是这样的氨基酸序列，其与该ISVD或多肽本身相比增加该ISVD或多肽的该半衰期、该溶解度或该吸收、降低该ISVD或多肽的免疫原性或毒性、消除或减弱该ISVD或多肽的不期望的副作用和/或为该ISVD或多肽赋予其他有利特性和/或减少该ISVD或多肽的不期望的特性。此类氨基酸序列的一些非限制性实例为血清蛋白，诸如人血清白蛋白（参见例如WO 00/27435）或半抗原分子（例如被循环抗体识别的半抗原，参见例如WO 98/22141）。

该另外的氨基酸序列还可提供第二结合位点，该结合位点可针对任何期望的蛋白质、多肽、抗原、抗原决定簇或表位（包括但不限于该ISVD所针对的相同的蛋白质、多肽、抗原、抗原决定簇或表位，或不同的蛋白质、多肽、抗原、抗原决定簇或表位）。

在一个实施例中，一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元是结合单元。在一个实施例中，结合单元是免疫球蛋白序列。在一个实施例中，结合单元是免疫球蛋白单可变结构域，例如VHH、人源化VHH、骆驼化VH、结构域抗体、单结构域抗体或dAb。

单价多肽包含以下或基本上由以下组成：仅一个结合单元（例如免疫球蛋白单可变结构域）。包含两个或更多个结合单元（诸如例如，免疫球蛋白单可变结构域）的多肽在本文中也将被称为“多价”多肽，并且存在于此类多肽中的这些结合单元/免疫球蛋白单可变结构域在本文中也将被称为呈“多价格式”。例如，“二价”多肽可包含两个免疫球蛋白单可变结构域（任选地经由接头序列连接），而“三价”多肽可包含三个免疫球蛋白单可变结构域（任选地经由两个接头序列连接）；而“四价”多肽可以包含任选地通过三个接头序列连接的四个免疫球蛋白单可变结构域；而“五价”多肽可以包含任选地通过四个接头序列连接的五个免疫球蛋白单可变结构域；而“六价”多肽可以包含任选地通过五个接头序列连接的六个免疫球蛋白单可变结构域，等等。单价多肽的实例描述于表A-7和A-19（SEQ ID NO: 72、73、543、546、547、552、560、584、585、586、587和588）中。二价多肽的实例描述于表A-7和A-19中（SEQ ID NO: 70、74、75、526、529、530、531、533、535、536、545、554、556、557、558、559、566、567、568、570、572、578、582和589）。三价多肽的实例描述于表A-7和A-19中（SEQ ID NO:71、76、77、538、539、541、542、548、549、551、561、562、563、565、573、574、575、576、579、580、581、583、590、591和592）。四价多肽的实例描述于表A-7和A-19（SEQ ID NO: 78、593、594和595）中。（对SEQ ID NO 70-78和526、529-531、533、535、536、538、539、541-543、545-549、551、552、556-563、565-568、570、572-576和578-595的多肽的提及涵盖带有FLAG-HI6或HIS6标签的多肽以及没有FLAG-HI6或HIS6标签的多肽）

在多价多肽中，该两个或更多个免疫球蛋白单可变结构域可以是相同或不同的，并且可针对相同的抗原或抗原决定簇（例如针对相同的一个或多个部分或一个或多个表位，或者针对不同的部分或表位）或者可替代性地针对不同的抗原或抗原决定簇；或其任何合适的组合。含有至少两个结合单元（诸如例如，免疫球蛋白单可变结构域）的多肽（其中至少一个结合单元针对第一抗原（即，PD-L1），并且至少一个结合单元针对第二抗原（即，与PD-L1不同））也将被称为“多特异性”多肽，并且存在于此类多肽中的这些结合单元（诸如例如，免疫球蛋白单可变结构域）在本文中也将被称为呈“多特异性形式”。因此，例如，“双特异性”多肽是这样的多肽，其包含针对第一抗原（即，PD-L1）的至少一个免疫球蛋白单可变结构域和针对第二抗原（即，与PD-L1不同）的至少一个另外的免疫球蛋白单可变结构域，而“三特异性”多肽是这样的多肽，其包含针对第一抗原（即，PD-L1）的至少一个免疫球蛋白单可变结构域、针对第二抗原（即，与PD-L1不同）的至少一个另外的免疫球蛋白单可变结构域和针对第三抗原（即，与PD-L1和该第二抗原两者不同）的至少一个另外的免疫球蛋白单可变结构域；等等。双特异性多肽的实例描述于表A-7和A-19中（SEQ ID NO: 70、71、75、76、526、529、530、531、533、535、536、538、539、541、542、545、548、549、551、556、557、558、559、561、562、563、565、566、567、568、570、572、573、574、575、576、578、579、580、581、582和583）。（对SEQ ID NO 70-78和526、529-531、533、535、536、538、539、541-543、545-549、551、552、556-563、565-568、570、572-576和578-595的多肽的提及涵盖带有FLAG-HI6或HIS6标签的多肽以及没有FLAG-HI6或HIS6标签的多肽）

在一个实施例中，该多肽可进一步包含一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元（任选地经由一个或多个肽接头连接），其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元为该多肽提供与没有所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元的对应多肽相比增加的（体内）半衰期。体内半衰期延长是指，例如，多肽在施用后在哺乳动物（例如人受试者）中具有增加的半衰期。半衰期可以表示为例如t1/2β。

基团、残基、部分或结合单元的类型一般是不受限制的，并且可例如选自由以下组成的组：聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段、可与血清蛋白结合的结合单元、Fc部分以及可与血清蛋白结合的小的蛋白质或肽。

更具体地，为该多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元可选自由以下组成的组：可与血清白蛋白（诸如人血清白蛋白）或血清免疫球蛋白（诸如IgG）结合的结合单元。在一个实施例中，为该多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元是可与人血清白蛋白结合的结合单元。在一个实施例中，结合单元是ISVD。

例如，WO 2004/041865和WO 2006/122787描述了与血清白蛋白结合（以及特别地针对人血清白蛋白）的ISVD，其可与其他蛋白质（诸如与期望的靶标结合的一个或多个其他ISVD）连接以便增加所述蛋白质的半衰期。这些ISVD包括称为Alb-1（WO 2006/122787中的SEQ ID NO: 52）的ISVD及其人源化变体，例如Alb-8（WO 2006/122787中的SEQ ID NO:62）。同样，这些可用于延长治疗性蛋白质和多肽以及其他治疗性实体或部分的半衰期。此外，WO 2012/175400描述了Alb-1的进一步改进版本，称为Alb-23。

在一个实施例中，该多肽包含选自Alb-1、Alb-3、Alb-4、Alb-5、Alb-6、Alb-7、Alb-8、Alb-9、Alb-10（WO 2006/122787）和Alb-23的血清白蛋白结合部分。在一个实施例中，血清白蛋白结合部分是Alb-8或Alb-23或其变体，如WO 2012/175400的第7-9页所示。在一个实施例中，血清白蛋白结合部分选自WO 2012/175741、WO2015/173325、WO2017/080850、WO2017/085172、WO2018/104444、WO2018/134235和WO2018/134234中描述的白蛋白结合物。一些血清白蛋白结合物也显示在表A-5中。在一个实施例中，血清白蛋白结合物是AlbX00001（SEQ ID NO: 41）。包含AlbX0001的多肽的实例描述于表A-7（SEQ ID NO: 75和76）中。在一个实施例中，血清白蛋白结合物是Alb23002（SEQ ID NO: 42）。包含ALB23002的多肽的实例描述于表A-7和A-19中（SEQ ID NO: 70、71、526、529、530、531、533、535、536、538、539、541、542、545、548、549、551、556、557、558、559、561、562、563、565、566、567、568、570、572、573、574、575和576）。（对SEQ ID NO 70-78和526、529-531、533、535、536、538、539、541-543、545-549、551、552、556-563、565-568、570、572-576和578-595的多肽的提及涵盖带有FLAG-HI6或HIS6标签的多肽以及没有FLAG-HI6或HIS6标签的多肽）

在一个实施例中，本技术的多肽的另一组分是特异性结合人血清白蛋白的ISVD并且包含

i.CDR1（Abm编号），其是SEQ ID NO: 43的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 43有2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

ii.CDR2（Abm编号），其是SEQ ID NO: 45的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 45有2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列；以及

iii.CDR3（Abm编号），其是SEQ ID NO: 47的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 47有2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

在一个实施例中，特异性结合人血清白蛋白的ISVD包含作为SEQ ID NO: 50的氨基酸序列的CDR1、作为SEQ ID NO: 51的氨基酸序列的CDR2以及作为SEQ ID NO: 47的氨基酸序列的CDR3。

与人血清白蛋白特异性地结合的此类ISVD的实例具有如表A-3中针对ISVDALB23002所指示的一个或多个或全部框架区（除如上文所定义的这些CDR之外）。在一个实施例中，其是包含以下或由以下组成的组的ISVD：ISVD ALB23002的完整氨基酸序列（SEQID NO: 42，参见表A-3和A-5）。

还可以使用CDR区的Kabat定义来描述特异性结合人血清白蛋白的ISVD。因此，在一个实施例中，本技术的多肽的另一组分是特异性结合人血清白蛋白的ISVD并且包含

i.CDR1（Kabat编号），其是SEQ ID NO: 50的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 50有2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

ii.CDR2（Kabat编号），其是SEQ ID NO: 51的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 51有2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列；以及

iii.CDR3（Kabat编号），其是SEQ ID NO: 47的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 47有2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

在一个实施例中，ISVD包含作为SEQ ID NO: 50的氨基酸序列的CDR1、作为SEQ IDNO: 51的氨基酸序列的CDR2以及作为SEQ ID NO: 47的氨基酸序列的CDR3。

与人血清白蛋白特异性地结合的此类ISVD的实例具有如表A-17中针对构建体ALB23002所指示的一个或多个或全部框架区（除如上文所定义的这些CDR之外）。在一个实施例中，其是包含以下或由以下组成的组的ISVD：构建体ALB23002的完整氨基酸序列（SEQID NO: 42，参见表A-17和A-5）。

另外，在另一个实施例中，与人血清白蛋白结合的ISVD的氨基酸序列可与SEQ IDNO: 42具有大于90%、诸如大于95%或大于99%的序列同一性，其中这些CDR如上文所定义。在一个实施例中，与人血清白蛋白结合的ISVD包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 42的氨基酸序列。

当与人血清白蛋白结合的此类ISVD在至少一个CDR中具有相对于对应参考CDR序列（如上文所定义）的2个或1个氨基酸差异时，该ISVD具有与构建体ALB23002（SEQ ID NO:42）相比至少一半的对人血清白蛋白的结合亲和力、或至少相同的对人血清白蛋白的结合亲和力，其中结合亲和力是使用相同的方法（诸如SPR）来测量的。

在一个实施例中，当与人血清白蛋白结合的此类ISVD在多肽或构建体中具有C末端位置时，其表现出C末端延伸，诸如C末端丙氨酸（A）或甘氨酸（G）延伸。在一个实施例中，这样的ISVD选自SEQ ID NO: 29、30、32、34、35、36、37、38、39和40（参见表A-5）。在另一个实施例中，与人血清白蛋白结合的ISVD具有除该多肽中的C末端位置之外的另一个位置（即，不是本技术的多肽的C末端ISVD）。在一个实施例中，这样的ISVD选自SEQ ID NO: 27、28、31、33、41和42（参见表A-5）。

在一个实施例中，本技术的ISVD或多肽可（任选地经由合适的接头或铰链区）与一个或多个恒定结构域（例如，可用作Fc部分的一部分/用于形成Fc部分的2个或3个恒定结构域）、与Fc部分和/或与赋予该ISVD或多肽一种或多种效应子功能和/或可赋予与一种或多种Fc受体结合的能力的一个或多个抗体部分、片段或结构域连接。例如，为此目的并且不限于此，该一个或多个另外的氨基酸序列可包含抗体的一个或多个CH2和/或CH3结构域，诸如来自重链抗体（如本文所述）以及更优选地来自常规人4链抗体；和/或可形成Fc区（的一部分），例如来自IgG（例如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4）、来自IgE或来自另一人Ig（诸如IgA、IgD或IgM）。例如，WO 94/04678描述了包含骆驼科VHH结构域或其人源化衍生物的重链抗体，其中骆驼科CH2和/或CH3结构域已被人CH2和CH3结构域替换，以便提供由2条重链组成的免疫球蛋白，每条重链包含VHH以及人CH2和CH3结构域（但没有CH1结构域），该免疫球蛋白具有由这些CH2和CH3结构域提供的效应子功能，并且该免疫球蛋白可在不存在任何轻链的情况下发挥作用。可与本技术的ISVD或多肽合适地连接以便提供效应子功能的其他氨基酸序列对于技术人员而言将是清楚的，并且可基于期望的一种或多种效应子功能进行选择。参考例如WO 04/058820、WO 99/42077、WO 02/056910和WO 05/017148，以及Holliger和Hudson, 同上的综述；以及WO 09/068628。与相应的ISVD或多肽相比，ISVD或多肽与Fc部分的偶联也可导致半衰期延长。对于一些应用，使用赋予增加的半衰期而没有任何生物学上显著的效应子功能的Fc部分和/或恒定结构域（即CH2和/或CH3结构域）也可以是合适的或甚至是首选的。具有增加的体内半衰期的包含一个或多个ISVD或多肽和一个或多个恒定结构域的其他合适的构建体对于技术人员而言将是清楚的，并且可例如包含（任选地经由接头序列）与CH3结构域连接的ISVD或多肽。一般而言，任何具有增加的半衰期的融合蛋白或衍生物优选具有大于50 kD的分子量，即肾吸收的截止值。

多肽的组分例如ISVD可以通过一种或多种合适的接头例如肽接头彼此连接。使用接头来连接两个或更多个（多）肽是本领域众所周知的。示例性肽接头示于表A-6中。一类常用的肽接头被称为“Gly-Ser”或“GS”接头。这些是基本上由甘氨酸（G）和丝氨酸（S）残基组成的接头，并且通常包含肽基序的一个或多个重复，例如GGGGS（SEQ ID NO: 54）基序（例如，具有式(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n可以是1、2、3、4、5、6、7或更大）。此类GS接头的一些常用实例是9GS接头（GGGGSGGGS，SEQ ID NO: 57）、15GS接头（n = 3；SEQ ID NO: 59）和35GS接头（n = 7；SEQ ID NO: 64）。例如参考Chen等人2013（Adv. Drug Deliv. Rev.[先进药物递送综述] 65(10): 1357-1369）和Klein等人2014（Protein Eng. Des. Sel.[蛋白工程化设计与筛选] 27 (10): 325-330）。在一个实施例中，使用9GS接头将多肽的组分彼此连接。具有9GS接头的ISVD格式的实例描述于表A-7（SEQ ID NO: 74、77和78）中。在一个实施例中，使用35GS接头将多肽的组分彼此连接。具有35GS连接子的ISVD格式的实例描述于表A-7（SEQ ID NO: 70、71、75和76）中。

本技术还提供了序列优化的ISVD和多肽，其在稳定性研究期间在储存后表现出增加的稳定性。在一个实施例中，序列优化的ISVD和多肽显示N末端的焦谷氨酸翻译后修饰减少，因此具有增加的产物稳定性。焦谷氨酸修饰会导致最终产物的异质性并且需要避免。通过将N末端谷氨酸（E）更改为天冬氨酸（D），消除了N末端pGlu翻译后修饰的可能性，从而提高了产物稳定性。因此，本发明还涉及如上所述的ISVD和多肽，其中在位置1（所述位置根据Kabat编号来确定）处的谷氨酸被改变成天冬氨酸（E1D）。在位置1（根据Kabat编号）具有天冬氨酸的ISVD和多肽的实例描述于表A-2（SEQ ID NO: 7、325-339、380-419、451-481、498-513、520-525）、表A-7（SEQ ID NO: 71、74、75、76、77和78）和表A-19（536、538、539、541、542、548、549、551、573、574、575、576、578、579、580、581、582、583、590、591、592、593、594和595）。（对SEQ ID NO 70-78和526、529-531、533、535、536、538、539、541-543、545-549、551、552、556-563、565-568、570、572-576和578-595的多肽的提及涵盖带有FLAG-HI6或HIS6标签的多肽以及没有FLAG-HI6或HIS6标签的多肽）

本技术还提供了“人源化的”序列优化的ISVD和多肽，即其中所述天然存在的VHH序列（以及特别地这些框架序列中）的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基被存在于来自人类的常规4链抗体中的VH结构域中的一个或多个对应位置处的氨基酸残基中的一个或多个替换（例如上文所指示的）。因此，本发明还涉及如上所述的人源化的ISVD和多肽。此类人源化ISVD的实例描述于表A-3（SEQ ID NO: 5、7、311-321和326-336）、表A-9（SEQ ID NO:341-378和381-418）、表A-11（SEQ ID NO: 421-449和452-480）和表A-13（SEQ ID NO: 527、483-496、528、499-512）。

本技术还提供了序列优化的ISVD和多肽，其表现出与人血清中存在的预先存在的抗体的结合减少。为此，在一个实施例中，该多肽在至少一个ISVD中包含在氨基酸位置11处的缬氨酸（V）以及在氨基酸位置89处的亮氨酸（L）（根据Kabat编号）。在一个实施例中，多肽在每个ISVD中包含氨基酸位置11处的缬氨酸（V）和氨基酸位置89处的亮氨酸（L）（根据Kabat编号）。因此，本发明还涉及如上所述的ISVD和多肽，其在至少一个ISVD中（诸如在所有ISVD中）已用在氨基酸位置11处的缬氨酸（V）以及在氨基酸位置89处的亮氨酸（L）（根据Kabat编号方式）进行了序列优化。在至少一个ISVD中包含在氨基酸位置11处的缬氨酸（V）以及在氨基酸位置89处的亮氨酸（L）（根据Kabat编号）的ISVD和多肽的实例描绘于表A-2（SEQ ID NO: 5、7、311-321、326-336、341-378、381至418、421-449、452至480、527、483-496、528、599至512）和表A-7（SEQ ID NO: 70、71、75和76）以及表A-19（526、529、530、531、533、535、545、556、557、558、559、566、567、568、570和572）中。（对SEQ ID NO 70-78和526、529-531、533、535、536、538、539、541-543、545-549、551、552、556-563、565-568、570、572-576和578-595的多肽的提及涵盖带有FLAG-HI6或HIS6标签的多肽以及没有FLAG-HI6或HIS6标签的多肽）

在一个实施例中，该ISVD或多肽具有序列VTVSS(X)n（SEQ ID NO: 79）的C末端，其中n为1至10、优选地1至5、诸如1、2、3、4或5，并且其中每个X为独立地选择的氨基酸残基。在一个实施例中，多肽在其C末端包含这样的ISVD。在一个实施例中，n是1或2，例如1。在一个实施例中，X是天然存在的氨基酸。在一个实施例中，X选自由丙氨酸（A）、甘氨酸（G）、缬氨酸（V）、亮氨酸（L）或异亮氨酸（I）组成的组。

在另一个实施例中，多肽在至少一个ISVD中的位置110（根据Kabat编号）处包含赖氨酸（K）或谷氨酰胺（Q）。在另一个实施例中，ISVD在至少一个ISVD中的位置112（根据Kabat编号）处包含赖氨酸（K）或谷氨酰胺（Q）。在这些实施方案中，ISVD的C末端是VKVSS（SEQ IDNO: 80）、VQVSS（SEQ ID NO: 81）、VTVKS（SEQ ID NO: 82）、VTVQS（SEQ ID NO: 83）、VKVKS（SEQ ID NO: 84）、VKVQS（SEQ ID NO: 85）、VQVKS（SEQ ID NO: 86）或VQVQS（SEQ ID NO:87），使得在添加单个丙氨酸后，多肽的C末端例如包含序列VTVSSA（SEQ ID NO: 88）、VKVSSA（SEQ ID NO: 89）、VQVSSA（SEQ ID NO: 90）、VTVKSA（SEQ ID NO: 91）、VTVQSA（SEQID NO: 92）、VKVKSA（SEQ ID NO: 93）、VKVQSA（SEQ ID NO: 94）、VQVKSA（SEQ ID NO: 95）或VQVQSA（SEQ ID NO: 96）。在一个实施例中，该多肽在每个ISVD中包含在氨基酸位置11处的缬氨酸（V）以及在氨基酸位置89处的亮氨酸（L）（根据Kabat编号），任选地在至少一个ISVD中包含在氨基酸位置110处的赖氨酸（K）或谷氨酰胺（Q）（根据Kabat编号），并且包含在C末端ISVD的C末端处的1至5个（天然存在的）氨基酸（如上文所定义）的延伸，诸如单一丙氨酸（A）延伸，使得该多肽的C末端例如包含序列VTVSSA（SEQ ID NO: 88）、VKVSSA（SEQ IDNO: 89）或VQVSSA（SEQ ID NO: 90）。参见例如WO 2012/175741和WO 2015/173325了解这方面的进一步信息。

在一个实施例中，本技术的多肽包含选自由以下组成的组的ISVD中的一个或多个或基本上由选自由以下组成的组的ISVD中的一个或多个组成：SEQ ID NO: 4-7、311-525和527-528的氨基酸序列。在一个实施例中，多肽还包含任选地通过一个或多个接头连接的一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元（如本文所述）。在一个实施例中，多肽选自由SEQID NO: 70-78、526、529-531、533、535、536、538、539、541-543、545-549、551、552、554、556-563、565-568、570、572-576和578-595的氨基酸序列组成的组。（对SEQ ID NO 70-78和526、529-531、533、535、536、538、539、541-543、545-549、551、552、556-563、565-568、570、572-576和578-595的多肽的提及涵盖带有FLAG-HI6或HIS6标签的多肽以及没有FLAG-HI6或HIS6标签的多肽）

在另一个实施例中，该多肽可以与SEQ ID NO: 70-78、526、529-531、533、535、536、538、539、541-543、545-549、551、552、554、556-563、565-568、570、572-576和578-595之一具有超过90%（例如超过95%或超过99%）的序列同一性。在另一个实施例中，多肽可以与SEQ ID NO: 70-78、70-78、526、529-531、533、535、536、538、539、541-543、545-549、551、552、554、556-563、565-568、570、572-576和578-595之一具有超过90%（例如超过95%或超过99%）的序列同一性，其中序列如上所定义。在一个实施例中，多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO: 70-78、526、529-531、533、535、536、538、539、541-543、545-549、551、552、554、556-563、565-568、570、572-576和578-595的氨基酸序列中的任一个。（对SEQ ID NO 70-78和526、529-531、533、535、536、538、539、541-543、545-549、551、552、556-563、565-568、570、572-576和578-595的多肽的提及涵盖带有FLAG-HI6或HIS6标签的多肽以及没有FLAG-HI6或HIS6标签的多肽）

在一些实施例中，本技术的多肽或构建体特异性结合人PD-L1，解离常数（K_D）为5.10^-9至10^-11摩尔/升或更低，优选为10^-9至5.10^-11摩尔/升或更低并且更优选5.10^-10至10^-10摩尔/升，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的多肽或构建体特异性结合人PD-L1，kon速率在10⁵M^-1s^-1至约10⁷M^-1s^-1之间、优选在5.10⁵M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、更优选在10⁶M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、例如在10⁶M^-1s^-1和5.10⁶M^-1s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的多肽或构建体特异性结合人PD-L1，koff速率在5.10^- ³s^-1（t1/2 = 0.69 s）和10^-6s^-1（提供t1/2为多天的接近不可逆的复合物）之间，优选在10^- ³s^-1和10^-6s^-1之间，更优选在5.10^-4s^-1和10^-6s^-1之间，例如在5.10^-4s^-1和10^-5s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的多肽或构建体特异性结合食蟹猴PD-L1，解离常数（K_D）为5.10^-9至10^-11摩尔/升或更低，优选为10^-9至5.10^-11摩尔/升或更低并且更优选5.10^-10至10^-10摩尔/升，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的多肽或构建体特异性结合食蟹猴PD-L1，kon速率在10⁵M^-1s^-1至约10⁷M^-1s^-1之间、优选在5.10⁵M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、更优选在10⁶M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、例如在10⁶M^-1s^-1和5.10⁶M^-1s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的多肽或构建体特异性结合食蟹猴PD-L1，koff速率在5.10^-3s^-1（t1/2 = 0.69 s）和10^-6s^-1（提供t1/2为多天的接近不可逆的复合物）之间，优选在10^-3s^-1和10^-6s^-1之间，更优选在5.10^-4s^-1和10^-6s^-1之间，例如在5.10^-4s^-1和10^-5s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的多肽或构建体特异性结合小鼠PD-L1，解离常数（K_D）为5.10^-7至10^-10摩尔/升或更低，优选为10^-7至5.10^-10摩尔/升或更低并且更优选5.10^-8至10^-9摩尔/升，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的多肽或构建体特异性结合小鼠PD-L1，kon速率在10⁴M^- ¹s^-1至约10⁷M^-1s^-1之间、优选在5.10⁴M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、更优选在10⁵M^-1s^-1和10⁷M^-1s^-1之间、例如在10⁵M^-1s^-1和10⁶M^-1s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的多肽或构建体特异性结合小鼠PD-L1，koff速率在10^- ²s^-1（t1/2 = 0.69 s）和10^-6s^-1（提供t1/2为多天的接近不可逆的复合物）之间，优选在10^- ²s^-1和10^-5s^-1之间，更优选在10^-2s^-1和10^-3s^-1之间，例如在5.10^-2s^-1和5.10^-2s^-1之间，如通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施例中，本技术的多肽或构建体以小于10倍的亲和力差异（KD）特异性结合人PD-L1和食蟹猴PD-L1。在一些实施例中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域以亲和力（KD）方面小于100倍的差异、小于500倍的差异或小于1000倍的差异与人PD-L1和小鼠PD-L1特异性地结合。

在一些实施例中，本技术的多肽或构建体与人和食蟹猴PD-L1特异性地结合并且不与PD-L2或B7家族的其他成员结合。

在一些实施例中，本技术的多肽或构建体可以功能性阻断PD-L1。更具体地，ISVD可以阻断PD-L1和PD1之间的相互作用。在一些实施例中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域拮抗PD-L1的活性。

在一些实施例中，本技术的多肽或构建体特异性结合人PD-L1并阻断人PD-L1与人PD-1的相互作用。例如，在用作为竞争物的hPD-1进行的对表达人PD-L1的CHO细胞的FACS竞争测定中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域可具有10^-8M或更低、更优选地10^-9M或更低、或甚至10^-10M或更低的EC50值。例如，在这样的FACS竞争测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和10^-8M之间，例如10^-10M和10^-9M之间、10^-10M和10^-8M之间或10^-11M和10^-9M之间的EC50值。

在一些实施例中，本技术的多肽或构建体特异性结合食蟹猴PD-L1并阻断食蟹猴PD-L1与食蟹猴PD-1的相互作用。例如，在用作为竞争物的食蟹猴PD-1进行的对表达食蟹猴PD-L1的CHO细胞的FACS竞争测定中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域可具有10^-8M或更低、更优选地10^-9M或更低、或甚至10^-10M或更低的EC50值。例如，在这样的FACS竞争测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和10^-8M之间，例如10^-10M和10^-9M之间、10^-10M和10^-8M之间或10^-11M和10^-9M之间的EC50值。

在一些实施例中，本技术的多肽或构建体特异性结合内源PD-L1并阻断PD-L1与人PD-1的相互作用。例如，在用作为竞争物的人PD-1进行的对表达人PD-L1的ES-2细胞的FACS竞争测定中，本技术的这些免疫球蛋白单可变结构域可具有10^-8M或更低、更优选地10^-9M或更低、或甚至10^-10M或更低的EC50值。例如，在这样的FACS竞争测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以具有10^-11M和10^-8M之间，例如10^-11M和10^-9M之间、或10^-11M和10^-10M之间的EC50值。

在一些实施例中，本技术的多肽或构建体阻断人PD-L1与人PD1的结合至少20%，诸如至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或甚至更高，如通过配体竞争、AlphaScreen或竞争性结合测定（诸如竞争ELISA或竞争FACS）所确定的。

在一些实施例中，本技术的多肽或构建体阻断食蟹猴PD-L1与食蟹猴PD1的结合至少20%，诸如至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或甚至更高，如通过配体竞争、AlphaScreen或竞争性结合测定（诸如竞争ELISA或竞争FACS）所确定的。

在一些实施例中，本技术的多肽或构建体特异性结合人和食蟹猴PD-L1并阻断PD-L1与CD80的相互作用。

在一些实施例中，本技术的多肽或构建体阻断PD-L1与CD80的结合至少20%，诸如至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或甚至更高，如通过配体竞争、AlphaScreen或竞争性结合测定（诸如竞争ELISA或竞争FACS）所确定的。

在一些实施例中，本技术的多肽或构建体在经由IFN-γ产生进行监测的TT测定（例如，如实例中所述）中具有10^-8M或更低、更优选地10^-9M或更低、或甚至5.10^-10M或更低的效力（EC50值）。例如，在这样的TT测定中，本技术的免疫球蛋白单可变结构域可以可介导诱导IFN-γ，EC50值在10^-11M和10^-8M之间，例如10^-10M和10^-8M之间、10^-10M和10^-9M之间或10^-11M和10^-9M之间。

在一些实施例中，本技术的多肽或构建体在经由IFN-γ产生进行监测的TT测定（例如如实例中所述）中具有至少50%、诸如至少60%、70%、80%、90%、95%的功效。

5.4核酸分子

还提供了编码本技术的ISVD和/或多肽的核酸分子。

“核酸分子”（与“核酸”互换使用）是通过磷酸主链彼此连接以形成核苷酸序列的核苷酸单体链。核酸可用于转化/转染宿主细胞或宿主生物体，例如用于表达和/或产生多肽。用于制备目的的合适的宿主或宿主细胞对于技术人员而言将是清楚的，并且可以例如为任何合适的真菌、原核或真核细胞或细胞系或任何合适的真菌、原核或真核生物体。本技术还涵盖包含编码本技术的多肽的核酸的宿主或宿主细胞。

核酸可以是例如DNA、RNA或其杂合体，并且还可以包含（例如化学地）经修饰的核苷酸，如PNA。它可以是单链或双链的。在一个实施例中，它是双链DNA的形式。例如，本技术的核苷酸序列可以是基因组DNA、cDNA。

本技术的核酸可以以本身已知的方式制备或获得，和/或可以从合适的天然来源分离。编码天然存在的（多）肽的核苷酸序列可以例如进行定点诱变，以提供编码具有序列变异的多肽的核酸分子。此外，如对于技术人员将清楚的，为了制备核酸以及若干核苷酸序列，可将诸如带有编码靶向部分的核苷酸序列的至少一种核酸以及例如带有编码一个或多个接头的核苷酸序列的核酸以合适的方式连接在一起。

用于产生核酸的技术对于技术人员来说是清楚的，并且可以例如包括但不限于自动化DNA合成；定点诱变；组合两个或更多个天然存在的和/或合成的序列（或其两个或更多个部分），引入导致截短的表达产物表达的突变；通过使用一种或多种“错配”引物进行的PCR反应来引入一个或多个限制位点（例如以形成可使用合适的限制酶容易地消化和/或连接的盒和/或区）和/或引入突变。

5.5载体

还提供了包含编码本技术的ISVD和/或多肽的核酸分子的载体。本文使用的载体是适合于将遗传材料携带到细胞中的媒剂。载体包括裸核酸，例如质粒或mRNA，或嵌入更大结构中的核酸，例如脂质体或病毒载体。

在一些实施例中，载体包含至少一种核酸，该至少一种核酸任选地与一种或多种调节元件（诸如例如一种或多种合适的启动子、增强子、终止子等）连接。在一个实施例中，该载体为表达载体，即，适用于在合适的条件下（例如，当该载体被引入到（例如人）细胞中时）表达所编码的多肽或构建体的载体。基于DNA的载体包含转录元件（例如启动子和聚A信号）和翻译元件（例如科扎克序列）的存在。

在一个实施例中，在该载体中，所述至少一种核酸和所述调节元件彼此“可操作地连接”，这一般意味着它们彼此处于功能关系。例如，如果启动子能够启动或以其他方式控制/调节编码序列的转录和/或表达（其中所述编码序列应理解为处于所述启动子“的控制下”），则认为所述启动子与编码序列“可操作地连接”。一般而言，当两个核苷酸序列可操作地连接时，它们将处于相同的取向并且通常也在相同的阅读框中。它们通常也基本上是连续的，尽管这也可能不是必需的。

在一个实施例中，载体的任何调节元件使得它们能够在预期的宿主细胞或宿主生物体中提供其预期的生物学功能。例如，启动子、增强子或终止子应在预期的宿主细胞或宿主生物体中是“可操作的”，这意味着例如所述启动子应能够启动或以其他方式控制/调节所述启动子与其可操作地连接的核苷酸序列（例如编码序列）的转录和/或表达。

5.6组合物

本技术还提供了一种组合物，其包含本技术的至少一种ISVD、本技术的至少一种多肽或构建体、本技术的编码多肽的至少一种核酸分子或包含此类核酸分子的至少一种载体。组合物可以是药物组合物。组合物还可包含至少一种药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，并且任选地包含一种或多种另外的药学活性多肽和/或化合物。

5.7宿主生物体

本技术还涉及（非人）宿主细胞或（非人）宿主生物体，其能够表达本技术的ISVD和/或多肽或者包含：编码本技术的ISVD和/或多肽的核酸和/或包含编码本技术的ISVD和/或多肽的核酸分子的载体。

合适的宿主细胞或宿主生物体对于本领域技术人员来说是清楚的，并且例如是任何合适的真菌、原核或真核细胞或细胞系或任何合适的真菌、原核或真核生物体。具体实例包括HEK293细胞、CHO细胞、大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母。在一个实施例中，宿主是巴斯德毕赤酵母。

5.8多肽的方法和用途

本技术还提供了用于产生本技术的ISVD和/或多肽的方法。该方法可包括：用编码该ISVD和/或多肽的核酸转化/转染（非人）宿主细胞或宿主生物体，在该宿主中表达该ISVD和/或多肽，任选地之后进行一个或多个分离和/或纯化步骤。在实施例中，该方法可以包括：

a)在合适的（非人）宿主细胞或宿主生物体中或在另一合适的表达系统中表达编码ISVD和/或多肽的核酸序列或遗传构建体；任选地接着：

b)分离和/或纯化该ISVD和/或多肽。

在另一个实施例中，该方法可以包括：

a)培养和/或保持（非人）宿主或宿主细胞，其能够在使得所述（非人）宿主或宿主细胞表达本技术的ISVD和/或多肽的合适的情况下表达本技术的ISVD和/或多肽和/或包含编码本技术的ISVD和/或多肽的核酸或遗传构建体；

任选地接着：

b)分离和/或纯化所产生的ISVD和/或多肽。

适合于生产目的的（非人）宿主细胞或宿主生物体对于本领域技术人员来说是清楚的，并且可以例如为任何合适的真菌、原核或真核细胞或细胞系或任何合适的真菌、原核或真核生物体。具体实例包括HEK293细胞、CHO细胞、大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母。在一个实施例中，宿主是巴斯德毕赤酵母。

本技术的ISVD、本技术的多肽或构建体、如所描述的核酸分子或载体、或包含本技术的ISVD、多肽、构建体、核酸分子或载体的组合物可用作药物。因此，本技术提供了本技术的ISVD、本技术的多肽或构建体、如所描述的核酸分子或载体、或包含本技术的ISVD、多肽、构建体、核酸分子或载体的组合物，用作药物。

还提供了本技术的ISVD、本技术的多肽或构建体、如所描述的核酸分子或载体、或包含本技术的ISVD、多肽、构建体、核酸分子或载体的组合物，用于诊断、预防和/或治疗。

还提供了本技术的ISVD、本技术的多肽或构建体、如所描述的核酸分子或载体、或包含本技术的ISVD、多肽、构建体、核酸分子或载体的组合物，用于诊断、预防和/或治疗至少一种疾病和/或障碍。

还提供了本技术的ISVD、本技术的多肽或构建体、如所描述的核酸分子或载体、或包含本技术的ISVD、多肽、构建体、核酸分子或载体的组合物，其用于诊断、预防和/或治疗与PD-L1、与该PD-L1的生物学或药理学活性、和/或与其中涉及PD-L1的生物学途径或信号传导相关联的至少一种疾病和/或障碍。

已知PD-L1在某些增生性疾病中发挥作用。增生性疾病是一组以某些细胞过度增殖和细胞基质过度更新为特征的病症。如此，还提供了本技术的ISVD、本技术的多肽或构建体、如所描述的核酸分子或载体、或包含本技术的ISVD、多肽、构建体、核酸分子或载体的组合物，用于诊断、预防和/或治疗增生性疾病。增生性疾病的实例是癌症。因此，还提供了本技术的ISVD、本技术的多肽或构建体、如所描述的核酸分子或载体、或包含本技术的ISVD、多肽、构建体、核酸分子或载体的组合物，用于诊断、预防和/或治疗癌症。

进一步提供了一种用于诊断、预防和/或治疗至少一种疾病和/或障碍的方法，该方法包括：向对其有需要的受试者施用药学上活性的量的本技术的至少一种ISVD、本技术的至少一种多肽或构建体、如所描述的核酸分子或载体、或包含本技术的ISVD、多肽、构建体、核酸分子或载体的组合物。

进一步提供了一种用于诊断、预防和/或治疗与PD-L1、与该PD-L1的生物学或药理学活性、和/或与其中涉及PD-L1的生物学途径或信号传导相关联的至少一种疾病或障碍的方法，所述方法包括：向对其有需要的受试者施用药学上活性的量的本技术的至少一种ISVD、本技术的至少一种多肽或构建体、如所描述的核酸分子或载体、或包含本技术的ISVD、多肽、构建体、核酸分子或载体的组合物。

进一步提供了一种用于诊断、预防和/或治疗至少一种增生性疾病的方法，所述方法包括：向对其有需要的受试者施用药学上活性的量的本技术的至少一种ISVD、本技术的至少一种多肽或构建体、如所描述的核酸分子或载体、或包含本技术的ISVD、多肽、构建体、核酸分子或载体的组合物。

进一步提供了一种用于诊断、预防和/或治疗癌症的方法，所述方法包括：向对其有需要的受试者施用药学上活性的量的本技术的至少一种ISVD、本技术的至少一种多肽或构建体、如所描述的核酸分子或载体、或包含本技术的ISVD、多肽、构建体、核酸分子或载体的组合物。

进一步提供了本技术的ISVD、本技术的多肽、如所描述的核酸分子或载体、或包含该ISVD、多肽、构建体、核酸分子或载体的组合物在制备药物组合物中的用途，该药物组合物用于诊断、预防和/或治疗与PD-L1、与该PD-L1的生物学或药理学活性、和/或与其中涉及PD-L1的生物学途径或信号传导相关联的至少一种疾病或障碍。

进一步提供了本技术的ISVD、本技术的多肽、如所描述的核酸分子或载体、或包含该ISVD、多肽、构建体、核酸分子或载体的组合物在制备用于诊断、预防和/或治疗至少一种增生性疾病的药物组合物中的用途。

进一步提供了本技术的ISVD、本技术的多肽、如所描述的核酸分子或载体、或包含该ISVD、多肽、构建体、核酸分子或载体的组合物在制备用于诊断、预防和/或治疗癌症的药物组合物中的用途。

本技术上下文中所指的“受试者”可以是任何动物。在一个实施例中，受试者是哺乳动物。在哺乳动物中，可以区分人和非人哺乳动物。非人动物可以为例如伴侣动物（例如狗、猫）、家畜（例如牛、马、羊、山羊或猪动物）或一般用于研究目的和/或用于产生抗体的动物（例如小鼠、大鼠、兔子、猫、狗、山羊、绵羊、马、猪、非人灵长类动物诸如食蟹猴、或骆驼科动物诸如美洲驼或羊驼）。在一个实施例中，受试者是人受试者。

物质（包括本技术的ISVD、多肽、构建体、核酸分子和载体、或包含其的组合物）可通过任何合适的施用途径施用于受试者，例如通过肠胃外施用，诸如肌肉内、皮下或皮内施用。在一个实施例中，使用皮下施用。

可将有效量的如本文所述的ISVD、多肽、构建体、核酸分子或载体、或包含该ISVD、多肽、构建体、核酸分子或载体的组合物施用于受试者，以便提供预期的诊断、预防和/或治疗结果。

可以施用一个剂量或多个剂量。如果施用多于一个剂量，则可以合适的间隔施用这些剂量，以便使该ISVD、多肽、构建体、组合物、核酸分子或载体的效果最大化。

5.9表

表A-1：人、食蟹猴和小鼠PDL1的氨基酸序列（“ID”是指本文使用的SEQ ID NO）

表A-2：结合PDL1的ISVD的氨基酸序列（“ID”指本文使用的SEQ ID NO）

表A-5：血清白蛋白结合ISVD序列（“ID”是指本文使用的SEQ ID NO）

表A-6：接头序列（“ID”是指如本文所用的SEQ ID NO）

表A-8：ISVD C末端

表A-19：格式化的ISVD构建体的序列

6实例

6.1实例1：改进的抗PDL1 ISVD的生成

6.1.1免疫接种

为了诱导重链抗体（HcAb）依赖性体液免疫应答，用重组人PD-L1 Fc嵌合体（R&D系统公司（R&D Systems））对一只美洲驼和一只羊驼进行免疫。使用重组小鼠PD-L1（R&D系统公司）对美洲驼进行加强免疫。

6.1.2文库构建和噬菌体展示选择

定期采集免疫血液样品，测定血清应答，并从分离的PBL中制备总RNA。根据制造商的说明（阿默沙姆生物科学公司（Amersham Biosciences），皮斯卡塔韦，新泽西州，美国），使用Ficoll-Hypaque从这些血液样品中制备外周血单个核的细胞（PBMC）。从PBMC中提取总RNA并用作RT-PCR的起始材料以扩增编码VHH的DNA片段，基本上如WO 2005/044858中所述。随后，根据标准方案制备噬菌体（参见例如本文引用的由阿博利恩公众有限公司（AblynxN.V.）提交的现有技术和申请），并且在过滤灭菌之后在4°C储存以供进一步使用。

对于一般噬菌体展示选择技术，请参考Antibody Phage Display: Methods andProtocols[抗体噬菌体展示：方法和方案]（第一版，2002，O’Brian和Aitken编辑，HumanaPress[哈马纳出版社]，托托瓦，新泽西州）。使用美洲驼和羊驼VHH免疫文库以交替选择轮对人、食蟹猴和小鼠PD-L1蛋白执行两轮或三轮淘选噬菌体展示选择。将来自选择的输出铺板在LB/amp/2%glu板上。挑取集落并在96深孔板（1 ml体积）中生长，并通过添加IPTG进行诱导以进行VHH表达。根据标准方法制备周质提取物（体积：约80 μl）（参见例如本文引用的现有技术和申请人提交的申请）。

6.1.3初步筛选和测序

通过表达人、食蟹猴或小鼠PD-L1（内部制造）的CHO细胞系上的FACS结合，以及通过使用作为表达人、食蟹猴或小鼠PD-L1的CHO细胞的竞争物的hPD-1-Fc（R&D系统公司）进行的FACS竞争测定，对4067周质提取物（PE）执行了初步筛选。

简而言之，在流式细胞术中以荧光细胞条形码设置评估了含有抗PD-L1 VHH的PE与CHO Flp-In细胞系上过表达的人、食蟹猴和小鼠PD-L1的结合。将1/10的PE最终稀释液施用至细胞。允许VHH在4°C在FACS缓冲液（补充有10% FBS和0.05%叠氮化物的PBS）中在摇床上于黑暗中缔合过夜。通过离心洗涤细胞两次，并用别藻蓝蛋白（APC）标记的抗FLAG抗体（博奇公司（Biolegend）；目录号：637308）在4°C下探测30分钟，以检测与PD-L1结合的VHH。洗涤细胞，然后通过iQue Screener（赛多利斯公司（Sartorius））进行分析。使用正确的门控策略，通过各自的荧光条形码分离多重化细胞系。

在流式细胞术中以荧光细胞条形码设置评估了含有抗PD-L1 VHH的PE与人PD-1-Fc（R&D系统公司）对与CHO Flp-In细胞系上过表达的人、食蟹猴和小鼠PD-L1的结合的竞争。将1/4的PE最终稀释液施用至细胞，并与等于10nM的固定浓度人PD-1-Fc竞争。允许VHH和人PD-1-Fc在4°C在FACS缓冲液（补充有10% FBS和0.05%叠氮化物的PBS）中在摇床上于黑暗中缔合过夜。通过离心洗涤细胞两次，并且用经别藻蓝蛋白（APC）标记的山羊抗人IgG抗体（杰克逊免疫研究公司（Jackson ImmunoResearch）；目录号：109-136-088）在4°C探测30分钟，以检测与PD-L1结合的人PD-1-Fc。洗涤细胞，然后通过iQue Screener（赛多利斯公司（Sartorius））进行分析。使用正确的门控策略，通过各自的荧光条形码分离多重化细胞系。

对971个在任何细胞系上表现出与huPD-1-Fc结合并超过50%竞争的克隆进行了测序。根据众所周知的程序对来自噬菌体展示选择输出的VHH进行序列分析（Pardon等人.2014, Nat. Protoc.[自然方案] 9: 674）。由此获得195个独特序列，分为47个不同的家族。

6.2实例2：独特序列的初步表征

6.2.1独特克隆的解离速率分析

在ProteOn XPR36仪器（伯乐实验室（Bio-Rad Laboratories））上通过表面等离子共振（SPR）对来自该序列分析的所有独特克隆进行针对人、食蟹猴和小鼠PD-L1和人PD-L2的解离速率分析。实验在25°C下进行。使用含有0.005% Tween 20（伯乐实验室（Bio-RadLaboratories））的PBS pH7.4作为测定缓冲液。根据制造商的说明，使用ProteOn胺偶联试剂盒（伯乐实验室）将抗hu IgG抗体（思拓凡公司（Cytiva））固定在GLC传感器芯片（伯乐实验室）的5个不同配体泳道上。人PD-L1 Fc（R&D系统公司）、食蟹猴PD-L1 Fc（义翘神州公司）、小鼠PD-L1 Fc（R&D系统）或人PD-L2 Fc（R&D系统公司）被捕获在抗人IgG抗体固定化配体泳道上。一个配体泳道用作参考表面，并且抗人IgG抗体表面上没有捕获任何靶标。将在运行缓冲液中按1 : 10稀释的样品（含有独特VHH的周质提取物）流过2分钟，然后恒定流过测定缓冲液10分钟。在样品注射之间，用3 M MgCl2（思拓凡公司）再生表面。注入几个缓冲液空白以进行双重参考。

使用ProteOn Manager 3.1.0软件（伯乐实验室）分析数据，解离速率根据1 : 1相互作用模型（Langmuir结合模型）确定。图1a和1b以点状图显示了不同克隆对人、食蟹猴和小鼠PD-L1的解离速率。

所测试的克隆均未与PD-L2结合。大多数克隆对于PD-L1有人和食蟹猴交叉反应。九个家族也表现出与小鼠PD-L1的交叉反应。低于约1 x 10^-3s^-1的解离速率被认为是可接受的。这些克隆以及具有较低解离速率但在流式细胞术中显示出强食蟹猴结合或强竞争的若干目的克隆随后在α筛选中进行筛选以完全阻断CD80。

6.2.2Alphascreen中PD-L1/CD80相互作用的抑制

使用Alphascreen评估VHH（在周质提取物中产生）抑制PDL1和CD80之间相互作用的能力。将5 µL的35 nM生物素化hCD80/His6（R&D系统公司，目录号9050-B1，内部生物素化）和5 µL的在周质提取物中的经12倍稀释的VHH（在测定缓冲液：PBS、0.1% BSA、0.03%Tween中稀释）添加到384孔OptiPlates（珀金埃尔默公司，目录号6007290）的每个孔。混合物由100 µg/mL抗人IgG1 Fc VHH偶联受体alphascreen珠（未缀合的受体珠（珀金埃尔默公司，目录号6762002），内部与抗人IgG1 Fc VHH缀合）和3.75 nM经Fc标记的hPDL-1（R&D系统公司，目录号156-B7）制备而成。将10 µL该混合物添加到每个孔中。将板在室温下孵育1小时。最后，在黑暗中将5 µL 100 µg/mL链霉亲和素供体珠（珀金埃尔默公司（PerkinElmer），货号6760002）添加到每个孔中。将板密封（珀金埃尔默公司（Perkin Elmer），目录号6050185）并在黑暗中在室温下孵育1小时。使用EnVision（珀金埃尔默公司）使用串扰校正来测量荧光发射。可以抑制PD-L1/CD80相互作用的单个克隆应表现出荧光信号减弱。根据每个样品的荧光信号计算每个样品的抑制百分比，如下所示：100(%) × (顶部-样品)/(顶部-底部)，其中顶部为板阴性对照中的至少6个的平均信号，并且底部为板阳性对照中的至少3个的平均信号。

170个克隆在Alphascreen中显示出超过50%的抑制。表B-0中给出了26个选定克隆的结果。

表B-0：Alphascreen中周质提取物的筛选结果

6.2.3初始先导组的选择

基于FACS中的结合和竞争、Alphascreen结果、序列分析和进一步的生物物理表征，选择20个克隆进行表达、纯化和表征。

6.3实例3：VHH表达构建体的生成

对于所选择的克隆，将用各自携带独特限制位点的正向FR1和反向FR4引物的特定组合通过PCR获得的含有VHH的DNA片段用适当的限制酶消化并连接到VHH表达载体的匹配克隆盒中（下文所述）。然后将连接混合物转化到电转化感受态大肠杆菌TG1（60502，鲁西基公司（Lucigen），米德尔顿，威斯康星州）或TOP10（C404052，赛默飞世尔科技公司（ThermoFisher Scientific），沃尔瑟姆，马萨诸塞州）细胞，然后使其在适当的抗生素选择压力（卡那霉素或吉欧霉素）下生长。通过质粒DNA的桑格测序（LGC基因组公司（LGCGenomics），柏林，德国）验证抗性克隆。

VHH在大肠杆菌TG1中从含有lac启动子、针对卡那霉素的抗性基因、大肠杆菌复制起点和前面带有针对OmpA信号肽的编码序列的VHH克隆位点的质粒表达载体被表达。在具有VHH编码序列的框架中，质粒编码C末端FLAG3和HIS6标签。信号肽将表达的VHH引导至细菌宿主的周质区室。

HIS6标记的VHH通过固定金属亲和色谱（IMAC）纯化，然后进行脱盐步骤，如有必要，在PBS中进行凝胶过滤色谱（Superdex柱，通用医疗集团（GE Healthcare））。另外，VHH在蛋白A上纯化，然后进行脱盐步骤，如有必要，在PBS中进行凝胶过滤色谱（Superdex柱，通用医疗集团）。VHH的纯度和完整性通过SDS-PAGE和质谱法进行验证。

6.4实例4：基于细胞的测定中ISVD的表征

在结合性FACS、竞争FACS和破伤风类毒素抗原特异性共培养测定（TT测定）中对单价先导组VHH进行表征。

6.4.1使用hPD1-Fc作为竞争物的对表达人、食蟹猴或小鼠PD-L1的CHO细胞的结合性FACS和竞争FACS

通过流式细胞术评估纯化的抗PD-L1 VHH与CHO Flp-In细胞系上过表达的人、食蟹猴和小鼠PD-L1的结合。将以200nM开始的系列稀释的VHH施用至细胞。允许VHH在4°C在FACS缓冲液（补充有10% FBS和0.05%叠氮化物的PBS）中缔合30分钟。通过离心洗涤细胞并用小鼠抗FLAG抗体（西格玛公司（Sigma）；目录号：F1804）在4°C下探测30分钟，以检测与PD-L1结合的VHH。通过离心洗涤细胞，随后用藻红蛋白标记的山羊抗小鼠IgG抗体进行探测，以检测小鼠抗FLAG抗体。洗涤细胞并用5nM TOPRO-3孵育以染色死细胞，随后在门控过程中将死细胞去除。然后通过BD FACS Canto II分析细胞。

在流式细胞术中评估了纯化的抗PD-L1 VHH与人PD-1-Fc（R&D系统公司）对CHOFlp-In细胞系上过表达的人、食蟹猴和小鼠PD-L1的竞争。将以600nM开始的系列稀释的VHH施用至细胞，并与等于15nM的固定浓度人PD-1-Fc竞争。允许VHH和人PD-1-Fc在4°C在FACS缓冲液（补充有10% FBS和0.05%叠氮化物的PBS）中在摇床上缔合2小时。通过离心清洗细胞两次，并在4°C下用藻红蛋白（PE）标记的山羊抗人IgG F(ab)片段（南方生物技术公司（Southern Biotech）；目录号：2043-09）探测30分钟，以检测与PD-L1结合的人PD-1-Fc。洗涤细胞并用5nM TOPRO-3孵育以染色死细胞，随后在门控过程中将死细胞去除。然后通过BDFACS Canto II分析细胞。

20个VHH中的16个在竞争FACS中表现出与人PD-1-Fc非常有效的竞争（表B-1和图2）。

表B-1：以hPD-1 Fc作为竞争物，纯化的VHH在CHO细胞上的竞争FACS结果

6.4.2使用hPD1-Fc作为竞争物在ES-2细胞上的竞争FACS

在不同的内源表达PD-L1的细胞系ES-2上测试了一些VHH的FACS竞争。表达水平低。进行与hPD-1的竞争。

在流式细胞术中评估了纯化的抗PD-L1 VHH与人PD-1-Fc（R&D系统公司）对ES-2细胞上表达的PD-L1的竞争。将以600nM开始的系列稀释的VHH施用至细胞，并与等于15nM的固定浓度人PD-1-Fc竞争。允许VHH和人PD-1-Fc在4°C在FACS缓冲液（补充有10% FBS和0.05%叠氮化物的PBS）中在摇床上缔合2小时。通过离心清洗细胞两次，并在4°C下用藻红蛋白（PE）标记的山羊抗人IgG F(ab)片段（南方生物技术公司（Southern Biotech）；目录号：2043-09）探测30分钟，以检测与PD-L1结合的人PD-1-Fc。洗涤细胞并用5nM TOPRO-3孵育以染色死细胞，随后在门控过程中将死细胞去除。然后通过BD FACS Canto II分析细胞。

竞争FACS中与人PD-1-Fc的竞争结果如表B-2和图3所示。

表B-2：以hPD-1 Fc作为竞争物，纯化的VHH在ES-2细胞上的竞争FACS结果

6.4.3TT特异性共培养测定中单价VHH的功能测试

在自体破伤风类毒素回忆测定（TT测定）中测试了20个VHH的T细胞活化情况（通过IFN-γ的产生进行监测）。简而言之，从低温储存中取回从健康供体（血沉棕黄层）分离的PBMC，并且在补充有10%热灭活FBS（西格玛公司（Sigma），F7254）和1x青霉素/链霉素（吉布科公司（Gibco），15140）的DC培养基（RPMI 1640培养基、GlutaMAX™补充剂、HEPES（吉布科公司，目录号72400））中解冻。根据人单核细胞分离试剂盒（干细胞公司（Stemcell），19359）供应商的说明，通过负磁细胞分离来分离单核细胞，并且在补充有20 µg/ml的IL-4（博奇公司，574006）和100 µg/mL的GM-CSF（博奇公司，572904）的DC培养基中培养7天。7天后，单核细胞分化为未成熟的树突状细胞（iDC）。收获iDC并冷冻在液氮中以供以后使用。将来自相同供体的PBMC在补充有10%热灭活人AB血清（BioIVT，SM-612-Hsi）和1x青霉素/链霉素的共培养培养基（RPMI 1640培养基、GlutaMAX™补充剂、HEPES（吉布科公司，目录号72400））中解冻，并且在补充有0.5 µg/mL破伤风类毒素（TT）（卡尔生物化学公（Calbiochem），582231）的共培养培养基中培养7天。7天后，TT特异性T细胞被富集。收获细胞并冷冻在液氮中以供以后使用。对于VHH表征测定，将iDC在共培养培养基中解冻，以5000个细胞/孔接种在96孔圆底板（Falcon，353077）中的补充有0.5 µg/ml TT的共培养培养基中，并且在37°C在5%CO2气氛中孵育4小时。将富集自体TT的T细胞在共培养培养基中解冻，并且将100,000个细胞/孔与稀释系列的VHH一起添加到该iDC。共培养3天后，收获细胞上清液并通过ELISA测定IFN-γ分泌。破伤风类毒素回忆测定（TT测定）中单价ISVD的分析结果如表B-3所示。

表B-3：TT测定中纯化（单价）的VHH的EC50值

6.4.4结论

功能测定可以对初始先导组进行清晰的排名。选择在TT测定和FACS中具有合理效力的来自不同家族的克隆。这导致了具有9个VHH的过滤先导组。

6.5实例5：过滤先导组的单价VHH的亲和力确定

其余有意义的克隆对人、食蟹猴和小鼠PD-L1的亲和力（KD）通过ProteOn XPR36仪器（伯乐实验室）上的SPR确定。实验在25°C下进行。使用含有0.005% Tween 20（伯乐实验室）的PBS pH7.4作为测定缓冲液。根据制造商的说明，使用ProteOn胺偶联试剂盒（伯乐实验室）将抗hu IgG抗体（思拓凡公司）固定在GLC传感器芯片（伯乐实验室）的4个不同配体泳道上。人PD-L1 Fc（R&D系统公司）、食蟹猴PD-L1 Fc（义翘神州公司（Sino biological））或小鼠PD-L1 Fc（R&D系统公司）被捕获在抗人IgG抗体固定化配体泳道上。一个配体泳道用作参考表面，并且抗人IgG抗体表面上没有捕获任何靶标。使以运行缓冲液稀释的六种不同的浓度（范围为300 nM至1.2 nM（ISVD36E11、ISVD39（ISVD6B01）和ISVD40（ISVD10F11））或100nM至0.4 nM（ISVD9B10、ISVD32E11、ISVD36（ISVD8E09）、ISVD3P、ISVD9A10和ISVD52A01））以多循环动力学流过相应的靶标和参考表面2分钟，之后是测定缓冲液的恒定流持续15分钟。在不同的注射之间，用3 M MgCl₂（思拓凡公司）再生表面。注入几个缓冲液空白以进行双重参考。

使用ProteOn Manager 3.1.0软件（伯乐实验室）分析数据。通过Langmuir 1:1相互作用配体结合模型拟合传感图来计算动力学速率常数（ka和kd）。平衡解离常数KD计算为kd/ka比率。结果示于表B-4中。

表B-4：人、食蟹猴和小鼠PD-L1（Proteon）上先导组VHH的动力学分析

由于异质谱的指示性参数

根据亲和力测定和所有其他表征数据，选择16个ISVD进行进一步优化和/或格式化。这些ISVD的序列如表A-2所示。

6.6实例6：格式化

6.6.1VHH格式的制备

将单价ISVD格式化为具有和不具有抗白蛋白结合性VHH的多价构建体（表B-5；表A-19）。

表B-5 格式化的抗hPDL1 VHH构建体

6.6.2格式化对解离速率的影响

通过解离速率分析（Proteon；参见实例6.2.1）针对与hPD-L1的结合将抗PD-L1ISVD的具有在N末端格式化的抗白蛋白VHH的二价构建体与单价抗PD-L1 ISVD进行比较。

表B-6：单价VHH和用N末端Alb23002格式化的VHH的解离速率值。

如果PD-L1 ISVD被格式化，则在SPR中与hPD-L1的结合将得以维持。

6.6.3竞争FACS中格式化对功能性的影响

基于使用内源性表达ES-2的细胞系和表达cyPD-L1的CHO细胞系进行的竞争FACS来评估N或C末端位置中的这些ISVD的格式化的影响。进行与hPD-1的竞争。该FACS是在不存在人血清白蛋白的情况下进行的。

在流式细胞术中评估了纯化的格式化ISVD与人PD-1-Fc（R&D系统公司）对CHOFlp-In细胞系上过表达的食蟹猴PD-L1以及对ES-2细胞的结合的竞争。以400 nM开始的系列稀释的ISVD构建体被施加至细胞，并且针对等于30 nM的固定浓度人PD-1-Fc和等于15nM的固定浓度食蟹猴PD-L1-Fc进行竞争。允许ISVD构建体和PD-1-Fc在4°C在FACS缓冲液（补充有10% FBS和0.05%叠氮化物的PBS）中在摇床上缔合1.5小时。通过离心清洗细胞两次，并在4°C下用藻红蛋白（PE）标记的山羊抗人IgG F(ab)片段（杰克逊免疫研究公司（Jackson ImmunoResearch）；目录号：109-116-170）探测30分钟，以检测与PD-L1结合的PD-1-Fc。洗涤细胞并用5nM TOPRO-3孵育以染色死细胞，随后在门控过程中将死细胞去除。然后通过MACS QuantX（美天旎生物技术公司（Milteny Biotec））分析细胞。结果示于表B-7中。

表B-7：在没有人白蛋白的情况下使用格式化的ISVD构建体的竞争FACS IC50（nM）

在竞争FACS中检测到抗PD-L1 VHH位置的影响最小（<2倍效力差异）。

6.6.4TT特异性共培养测定中格式化的构建体的分析

在TT测定中评估用抗白蛋白VHH格式化的构建体（如6.4.3中所述）。将单价ISVD和另外用抗白蛋白VHH格式化的二价ISVD的效力与基准分子进行比较。结果在表B-8中给出。

表B-8：TT测定中的单价ISVD和用抗白蛋白VHH格式化的二价ISVD的EC50值

6.6.5竞争FACS中ES-2细胞上格式化的ISVD10F11的分析

用抗白蛋白VHH格式化的构建体在内源表达PD-L1的细胞系ES-2上进行FACS竞争测试。竞争物是hPD-1。将单价ISVD及其带有抗白蛋白VHH的二价格式与4个基准分子进行了比较。

在流式细胞术中评估了纯化的格式化ISVD与人PD-1-Fc（R&D系统公司）对ES-2细胞结合的竞争。将以100nM开始的系列稀释的ISVD构建体施用至细胞，并与等于50nM的固定浓度生物素化人PD-1-Fc竞争。允许ISVD构建体和PD-1-Fc在4°C在FACS缓冲液（补充有10%FBS和0.05%叠氮化物的PBS）中在摇床上缔合2小时。将细胞离心洗涤两次，然后在4°C下用藻红蛋白（PE）标记的山羊抗人IgG F(ab)片段（南方生物技术公司（Southern Biotech）；目录号：2043-09，以检测PD-1-Fc与PD-L1的结合）；或用藻红蛋白（PE）标记的链霉亲和素（伊生物技术公司（eBiosciences），目录号12-4317-87）探测30分钟。洗涤细胞并用5nM TOPRO-3孵育以染色死细胞，随后在门控过程中将死细胞去除。然后通过FACS Canto II（BD）分析细胞。

结果显示在表B-9和图4中。

表B-9：竞争FACS中ES-2细胞上单价和格式化ISVD以及基准分子的EC50（nM）。

二价ISVD构建体在竞争FACS中ES-2细胞上显示出增强的效力。

6.6.6在竞争FACS中评估四价ISVD构建体

由ISVD10F11和ISVD36E11制成四价构建体和带有9GS接头变异的构建体，并且在基于ES-2细胞以及基于表达cyPD-L1的CHO细胞的竞争FACS中进行评估。竞争物是hPD-1。

在流式细胞术中评估了ISVD构建体与人PD-1-Fc（R&D系统公司）对CHO Flp-In细胞系上过表达的食蟹猴PD-L1以及对ES-2细胞的结合的竞争。以50nM开始的系列稀释的ISVD构建体被施加至细胞，并且针对等于40nM的固定浓度人PD-1-Fc和等于4nM的固定浓度食蟹猴PD-L1-Fc进行竞争。允许ISVD构建体和PD-1-Fc在4°C在FACS缓冲液（补充有10% FBS和0.05%叠氮化物的PBS）中在摇床上缔合1.5小时。通过离心清洗细胞两次，并在4°C下用藻红蛋白（PE）标记的山羊抗人IgG F(ab)片段（杰克逊免疫研究公司；目录号：109-116-170）探测30分钟，以检测与PD-L1结合的PD-1-Fc。洗涤细胞并用5nM TOPRO-3孵育以染色死细胞，随后在门控过程中将死细胞去除。然后通过MACS QuantX（美天旎生物技术公司（Milteny Biotec））分析细胞。结果在表B-10中给出。

表B-10：不同多价构建体的竞争FACS的EC50值

可以得出结论，单价和二价ISVD构建体已经非常有效。通过将ISVD设置为四价，只能看到轻微的改进。

6.6.7与人血清白蛋白和小鼠血清白蛋白结合

通过SPR评估用抗白蛋白VHH格式化的构建体对人或小鼠血清白蛋白（HSA和MSA）的亲和力。

表B-11：格式化的ISVD与人或小鼠MSA结合的亲和力

6.6.8TT测定中多价ISVD构建体的功能测试

二价半衰期延长的ISVD在TT测定中进行了表征，并与单价ISVD和基准进行了比较。结果在表B-12以及图5和图6中给出。

表B-12：TT测定中单一和格式化ISVD以及基准分子的EC50（nM）。

值得关注的是，基准1和2以及某些二价ISVD在EC50值上重叠。这表明两者都非常有效，以至于达到了测定墙。只能得出结论，这些二价ISVD在此测定中“与基准1和2一样有效”。基准1的顶部始终低于ISVD曲线的顶部（图5），这表明ISVD构建体的功效增加。

6.7实例7：ISVD10F11、ISVD36E11、ISVD52A01和ISVD9B10的序列优化

6.7.1ISVD10F11、ISVD36E11、ISVD52A01和ISVD9B10的序列优化

序列优化（SO）是亲本ISVD序列发生突变的过程。该过程涵盖该ISVD的人源化、针对翻译后修饰的位点以及针对潜在的预先存在的抗体和ADA的表位的敲除、以及ISVD的进一步成熟。对ISVD10F11、ISVD36E11、ISVD52A01和ISVD9B10进行了进一步的序列优化。优化的序列如表A-2所示。

6.7.2竞争FACS中序列优化ISVD的表征

在饱和浓度的人PD-1-Fc（R&D系统公司）的存在下，在流式细胞术中评估经纯化的SO变体与在CHO Flp-In细胞系和ES-2细胞上过表达的食蟹猴PD-L1的结合。将以50nM开始的系列稀释的ISVD施用至细胞，并与等于1.5µM的固定饱和浓度人PD-1-Fc竞争。允许ISVD和PD-1-Fc在4°C在FACS缓冲液（补充有10% FBS和0.05%叠氮化物的PBS）中在摇床上缔合2小时。通过离心清洗细胞两次，并在4°C下用藻红蛋白（PE）标记的山羊抗人IgG F(ab)片段（杰克逊免疫研究公司（Jackson ImmunoResearch）；目录号：109-116-170）探测30分钟，以检测与PD-L1结合的PD-1-Fc。洗涤细胞并用5nM TOPRO-3孵育以染色死细胞，随后在门控过程中将死细胞去除。然后通过MACS QuantX（美天旎生物技术公司（Milteny Biotec））分析细胞。与PD-1竞争的IC50值显示在表B-13中。

表B-13：在存在饱和浓度的PD-1的情况下，竞争FACS中序列优化的ISVD的IC50值

6.7.3序列优化的ISVD变体的亲和力确定

ISVD 9B10和52A01的序列优化变体对人和食蟹猴的亲和力（表示为K_D）通过ProteOn XPR36仪器（伯乐实验室）上的SPR测定。实验在25°C下进行，使用测定缓冲液HBS-EP+（思拓凡公司）。根据制造商的说明，经由胺偶联试剂盒（思拓凡公司）将抗人IgG Fc捕获蛋白固定到来自HC200 M传感器芯片（XanTec生物分析有限公司（XanTec bioanalyticsGmbH））的3个不同配体泳道上。人PD-L1 Fc（赛诺菲公司（Sanofi））或食蟹猴PD-L1 Fc（义翘神州公司）被捕获在抗人IgG蛋白固定配体泳道上。一个配体泳道用作参考表面，并且抗人IgG表面上没有捕获任何靶标。使以运行缓冲液稀释的六种不同的浓度（范围为100 nM至0.1 nM（ISVD 9B10变体）或250 nM至0.24 nM（ISVD 52A01变体）以多循环动力学模式流过相应的靶标和参考表面2分钟，之后是测定缓冲液的恒定流持续15分钟。在不同的注射之间，用0.85% H3PO4再生表面。注入几个缓冲液空白以进行双重参考。使用ProteOn Manager3.1.0软件（伯乐实验室）分析数据。通过Langmuir 1 : 1相互作用配体结合模型拟合传感图来计算动力学速率常数（ka和kd）。平衡解离常数KD计算为kd/ka比率。

ISVD 10F11和36E11的序列优化变体对人和食蟹猴PD-L1的亲和力（表达为K_D值）是在Biacore 8K仪器（思拓凡公司）上通过SPR来确定的。实验在37°C下进行，使用测定缓冲液HBS-EP+（思拓凡公司）。根据制造商的说明，使用思拓凡公司的胺偶联试剂盒将抗人FcNANOBODY®蛋白固定在CM5芯片（思拓凡（Cytiva））的通道1和2的活性流动池和参考流动池两者的表面上。人PD-L1 Fc（赛诺菲公司）或食蟹猴PD-L1 Fc（义翘神州公司）被捕获在抗人IgG蛋白固定化活性流动细胞上。使以运行缓冲液稀释的六种不同的浓度（范围为33 nM至0.13 nM（ISVD 10F11变体）或300 nM至1.2 nM（ISVD 36E11变体）以多循环动力学流过相应的靶标和参考表面2分钟，之后是测定缓冲液的恒定流持续30分钟。在不同的注射之间，用0.85% H3PO4再生表面。注入几个缓冲液空白以进行双重参考。通过使用具有质量传输限制的1:1 Langmuir结合模型，通过Biacore 8K评估软件拟合传感图来计算动力学速率常数（ka和kd）。通过软件作为kd/ka比率计算平衡解离常数KD。

序列优化的ISVD对于结合人PD-L1和食蟹猴PD-L1的K_D值显示在表B-14中。

表B-14：ISVD10F11、ISVD36E11、ISVD52A01和ISVD9B10的序列优化变体对于结合人PD-L1和食蟹猴PD-L1的K_D值

6.7.4NFAT报告基因测定中序列优化的ISVD的功能测试

ISVD在NFAT报告基因测定（普洛麦格公司（Promega），目录号J1252）中进行了PD-L1阻断测试。简而言之，在测定之前2天，从低温储存中取回Gloresponse^TMNFAT-RE/PD-1Jurkat细胞，并且在补充有10%热灭活FBS（西格玛公司，F7254）的Jurkat培养基（RPMI 1640培养基、 GlutaMAX™补充剂、HEPES（吉布科公司，目录号72400））中培养。在测定当天，将PD-L1 aAPC CHO K1细胞在补充有10%热灭活FBS（西格玛公司，F7254）的培养基（Ham's F-12营养混合物、GlutaMAX^TM补充剂（吉布科公司，目录号31765-068））中解冻，并且以10,000个细胞/孔接种在经组织培养处理的384孔板（瑞孚迪公司（Revvity），目录号6007688）中。将在补充有1%热灭活FBS的Jurkat培养基中的ISVD连续稀释液添加到CHO K1细胞中，并在室温下孵育10分钟。在10分钟孵育之后，使Gloresponse^TMNFAT-RE/PD-1 Jurkat细胞以15,000个细胞/孔包含在含有1%热灭活FBS的Jurkat培养基中，并且在5% CO2气氛中在37°C孵育24小时。在孵育之后，添加Bio-Glo™荧光素酶底物（普洛麦格公司，目录号G7941），并且使用Clariostar读板器读取发光信号。序列优化的ISVD的效力和功效（与基准1相比）如表B-15所示。

表B-15：ISVD10F11、ISVD36E11、ISVD52A01和ISVD9B10的序列优化变体在NFAT报告基因测定中的效力和功效

6.7.5TT共培养测定中序列优化的ISVD的功能测试

如6.4.3中所述，在自体破伤风类毒素回忆测定（TT测定）中测试序列优化的ISVD的T细胞活化情况（通过IFN-γ产生进行监测）。将具有序列优化的CDR序列的ISVD（作为单价）与具有亲本CDR序列的ISVD以及与二价基准1分子进行比较。结果显示在表B-16和图7中。

表B-16：TT测定中包含亲本CDR序列并包含优化的CDR序列的单价ISVD的EC50（M）值。

6.8实例8：通过低温电子显微镜（cryo-EM）确定ISVD10F11/PD-L1相互作用位点的结构

将4874.48 pmol的三价ISVD A025500035与9748.96 pmol的经avi标记的PD-L1胞外结构域（ECF）和14623.45 pmol的抗VHH Fab（TPP-37996）在总体积为500 uL的PBS中孵育。最终的化学计量比率为1:2:3（ISVD:PD-L1:Fab）。将复合物在环境温度孵育30分钟，并且在Superdex200 10/300 GL增量柱（思拓凡公司）上用1.2柱体积PBS经由尺寸排阻色谱法纯化，并且收集0.25 mL级分。合并峰级分并使用3kDa MWCO Centricon（密理博西格玛公司（Millipore Sigma））浓缩至50 uL。通过SDS-PAGE证实了合并的峰级分中所有三种组分的存在。使用Stunner分光光度计（无缚实验室（Unchained Labs））通过在280 nm处的吸收确定样品浓度为6.2 mg/mL。使用PBS将样品稀释至2.5 mg/mL。

CryoEM样品在1.2/1.3 UltraFoil网格（昆蒂福尔公司（Quantifoil））上制备，每个网格使用4 uL，并使用赛默飞世尔公司（Thermo Fisher）Vitrobot进行玻璃化。在环境温度和湿度100%下，孵育时间为10秒，印迹力为0，印迹时间为1秒。在配备Falcon4i直接电子探测器的赛默飞世尔公司Glacios 200 keV透射电子显微镜上收集了两个网格的三个数据集。在0度倾斜从第一网格收集了8000个动态影像。在30度倾斜从第二网格收集了900和3500个动态影像。所有三个数据集的总电子剂量为每平方埃60个电子，每个动态影像有55个帧。

每个数据集均在CryoSPARC中使用斑块运动校正、斑块对比度传递函数校正和使用70-200埃粒径的“斑点粒子拾取”进行独立分析。对每个数据集使用三轮2D分类来分析粒子。2D分类后，数据集被合并并进行几轮初始模型生成和3D分类，其中在每轮之间手动选择良好的类别。最终图是在CryoSPARC中使用约600,000个粒子进行非均匀细化生成的。合并的数据集细化至紧密掩模情况下3.54埃的分辨率（未掩模为4.1埃）。

为了将结构建模到cryoEM图中，使用分子操作环境（化学计算组）程序为ISVDA025500035和TPP-37996 Fab生成预测结构。为了将PD-L1建模到图中，使用了已发布的PD-L1结构（PDB 3BIS）。使用ChimeraX（USFC）将所有三个组分手动拟合到cryoEM图中。ISVD10F11的CDR2和CDR3相互作用的结构图如图8所示。

对获得的A025500035和PD-L1之间相互作用的结构进行分析表明以下氨基酸参与结合：

•PD-L1表位：Y56、E58、E60、D61、N63、Q66、H78和R113

•ISVD10F11互补位：CDR2中的S52、S53和N56以及CDR3中的A98、A99、A100、A100a、I100d和I100g；CDR1中没有残基参与结合。

7工业实用性

本文所述的ISVD、多肽、构建体、编码其的核酸分子、包含核酸的载体和组合物可用于例如治疗，诸如治疗患有癌症的受试者。

Claims

1.一种与人PD-L1特异性地结合的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，与PD-L1蛋白的选自Y56、E58、E60、D62、N63、Q66、H78和R113的一个或多个氨基酸相互作用。

2.如实施例1所述的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），其中CDR2中的S51、S53和N56（Kabat编号）和/或CDR3中的A98、A99、A100、A100a、I100d和I100g（Kabat编号）中的一个或多个形成与PD-L1蛋白上的表位的相互作用位点。

3.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR2（AbM编号）由氨基酸序列X₁X₂SX₃SX₄X₅NX₆X₇（SEQ ID NO: 600）组成，其中X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆和X₇是独立选择的任何氨基酸，

以及

- CDR3（AbM编号）由氨基酸序列X₁X₂X₃AAAAX₄X₅IX₆X₇IX₈X₉X₁₀（SEQ ID NO: 603）组成，其中X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉和X₁₀为独立地选择的任何氨基酸。

4.如权利要求3所述的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），其中

- CDR2（AbM编号）由氨基酸序列X₁X₂SX₃SX₄X₅NX₆X₇（SEQ ID NO: 600）组成，其中X₁选自A、S、T、P和G，X₂选自M、L、I、V和C，X₃选自A、S、T、P和G，X₄选自A、S、T、P和G，X₅选自R、H和K，X₆选自A、S、T、P和G，并且X₇选自N和Q；

以及

- CDR3（AbM编号）由氨基酸序列X₁X₂X₃AAAAX₄X₅IX₆X₇IX₈X₉X₁₀（SEQ ID NO: 603）组成，其中X₁选自A、S、T、P和G，X₂选自A、S、T、P和G，X₃选自F、Y和W，X₄选自A、S、T、P和G，X₅选自A、S、T、P和G，X₆选自A、S、T、P和G，X₇选自N、Q、I、L、M、V和C，X₈选自F、Y和W，X₉选自D和E，并且X₁₀选自F、Y和W。

5.如权利要求3或4中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) SEQ ID NO: 13或14的氨基酸序列；

b) 与SEQ ID NO: 13或14的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与SEQ ID NO: 13或14的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) SEQ ID NO: 17或109的氨基酸序列；

e) 与SEQ ID NO: 17或109的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f) 与SEQ ID NO: 17或109的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

6.如权利要求3至5中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) X₁ISSX₂GRX₃TN（SEQ ID NO: 598）的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和G，该氨基酸残基X₂选自S和T，并且该氨基酸残基X₃选自N、T和F；

b) 与X₁ISSX₂GRX₃TN（SEQ ID NO: 598）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和G，该氨基酸残基X₂选自S和T，并且该氨基酸残基X₃选自N、T和F；

c) 与X₁ISSX₂GRX₃TN（SEQ ID NO: 598）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和G，该氨基酸残基X₂选自S和T，并且该氨基酸残基X₃选自N、T和F；

以及

- CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) 氨基酸序列SSWAAAX₁GTX₂X₃X₄IYDY（SEQ ID NO: 601），其中该氨基酸残基X₁选自A和P，该氨基酸残基X₂选自I、L和T，该氨基酸残基X₃选自A、P和S，并且该氨基酸残基X₄选自N和I；

e) 与氨基酸序列SSWAAAX₁GTX₂X₃X₄IYDY（SEQ ID NO: 601）具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和P，该氨基酸残基X₂选自I、L和T，并且该氨基酸残基X₃选自N和I；

a) 与氨基酸序列SSWAAAX₁GTX₂X₃X₄IYDY（SEQ ID NO: 601）具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和P，该氨基酸残基X₂选自I、L和T，并且该氨基酸残基X₃选自N和I。

7.如权利要求3至6中任一项所述的ISVD，其中该CDR1和CDR2（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 311-324的氨基酸序列的ISVD的CDR1和CDR2的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

8.如权利要求3至17中任一项所述的ISVD，其中

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 13的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 14的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 109的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 103的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 109的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 14的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 103的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 110的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 13的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 111的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 104的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 112的氨基酸序列组成。

9.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) SEQ ID NO: 23或24的氨基酸序列；

b) 与SEQ ID NO: 23或24的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与SEQ ID NO: 23或24的氨基酸序列具有6、5、4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) SEQ ID NO: 17或109的氨基酸序列；

f) 与SEQ ID NO: 17或39的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

10.如权利要求9所述的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) X₁ISSX₂GRX₃TNYADX₄VX₅X₆（SEQ ID NO: 605）的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自G和A，其中该氨基酸残基X₂选自S和T，其中该氨基酸残基X₃选自T、N和F，其中该氨基酸残基X₄选自S和P，其中该氨基酸残基X₅选自E和K，并且其中该氨基酸残基X₆选自G、V和A；

b) 与X₁ISSX₂GRX₃TNYADX₄VX₅X₆（SEQ ID NO: 605）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自G和A，其中该氨基酸残基X₂选自S和T，其中该氨基酸残基X₃选自T、N和F，其中该氨基酸残基X₄选自S和P，其中该氨基酸残基X₅选自E和K，并且其中该氨基酸残基X₆选自G、V和A；

c) 与X₁ISSX₂GRX₃TNYADX₄VX₅X₆（SEQ ID NO: 605）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自G和A，其中该氨基酸残基X₂选自S和T，其中该氨基酸残基X₃选自T、N和F，其中该氨基酸残基X₄选自S和P，其中该氨基酸残基X₅选自E和K，并且其中该氨基酸残基X₆选自G、V和A；

以及

- CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) SSWAAAX₁GTX₂X₃X₄IYDY（SEQ ID NO: 601）的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自A和P，其中该氨基酸残基X₂选自I、L和T，其中该氨基酸残基X₃选自A、P和S，并且其中该氨基酸残基X₄选自I和N；

e) 与SSWAAAX₁GTX₂X₃X₄IYDY（SEQ ID NO: 601）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自A和P，其中该氨基酸残基X₂选自I、L和T，其中该氨基酸残基X₃选自A、P和S，并且其中该氨基酸残基X₄选自I和N；

f) 与SSWAAAX₁GTX₂X₃X₄IYDY（SEQ ID NO: 601）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自A和P，其中该氨基酸残基X₂选自I、L和T，其中该氨基酸残基X₃选自A、P和S，并且其中该氨基酸残基X₄选自I和N。

11.如权利要求9或10中任一项所述的ISVD，其中该CDR2和CDR3（Kabat编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 311-324的氨基酸序列的ISVD的CDR2和CD3的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

12.如权利要求9至11中任一项所述的ISVD，其中

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 23的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 24的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 109的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 120的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 109的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 24的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 120的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 122的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 110的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 123的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 111的氨基酸序列组成。

13.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) SEQ ID NO: 11或98的氨基酸序列；

b) 与SEQ ID NO: 11或98的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与SEQ ID NO: 11或98的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) SEQ ID NO: 13或14的氨基酸序列；

e) 与SEQ ID NO: 13或14的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f) 与SEQ ID NO: 13或14的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) SEQ ID NO: 17或109的氨基酸序列；

h) 与SEQ ID NO: 17或109的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i) 与SEQ ID NO: 17或109的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

14.如权利要求13所述的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) 氨基酸序列GRX₁FSX₂NX₃MG（SEQ ID NO: 596），其中该氨基酸残基X₁选自T、K和G，该氨基酸残基X₂选自G和R，并且该氨基酸残基X₃选自T和A；

b) 与氨基酸序列GRX₁FSX₂NX₃MG（SEQ ID NO: 596）具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自T、K和G，该氨基酸残基X₂选自G和R，并且该氨基酸残基X₃选自T和A；

c) 与氨基酸序列GRX₁FSX₂NX₃MG（SEQ ID NO: 596）具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自T、K和G，该氨基酸残基X₂选自G和R，并且该氨基酸残基X₃选自T和A；

以及

- CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) X₁ISSX₂GRX₃TN（SEQ ID NO: 598）的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和G，该氨基酸残基X₂选自S和T，并且该氨基酸残基X₃选自N、T和F；

e) 与X₁ISSX₂GRX₃TN（SEQ ID NO: 598）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和G，该氨基酸残基X₂选自S和T，并且该氨基酸残基X₃选自N、T和F；

f) 与X₁ISSX₂GRX₃TN（SEQ ID NO: 598）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和G，该氨基酸残基X₂选自S和T，并且该氨基酸残基X₃选自N、T和F；

以及

- CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) 氨基酸序列SSWAAAX₁GTX₂X₃X₄IYDY（SEQ ID NO: 601），其中该氨基酸残基X₁选自A和P，该氨基酸残基X₂选自I、L和T，该氨基酸残基X₃选自A、P和S，并且该氨基酸残基X₄选自N和I；

h) 与氨基酸序列SSWAAAX₁GTX₂X₃X₄IYDY（SEQ ID NO: 601）具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和P，该氨基酸残基X₂选自I、L和T，并且该氨基酸残基X₃选自N和I；

i) 与氨基酸序列SSWAAAX₁GTX₂X₃X₄IYDY（SEQ ID NO: 601）具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和P，该氨基酸残基X₂选自I、L和T，并且该氨基酸残基X₃选自N和I。

15.如权利要求13或14中任一项所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 311-324的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

16.如权利要求13至15中任一项所述的ISVD，其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 11的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 13的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1由SEQ ID NO: 11的氨基酸序列组成；

- CDR2由SEQ ID NO: 13和14的氨基酸序列之一组成；以及

- CDR3由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 98的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 14的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 109的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 98的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 103的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 109的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 99的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 103的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 109的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 99的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 14的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 109的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 11的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 14的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 100的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 103的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 110的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 100的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 13的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 111的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 101的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 104的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 112的氨基酸序列组成。

17.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) SEQ ID NO: 22的氨基酸序列；

b) 与SEQ ID NO: 22的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与SEQ ID NO: 22的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) SEQ ID NO: 23或24的氨基酸序列；

e) 与SEQ ID NO: 23或24的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f) 与SEQ ID NO: 23或24的氨基酸序列具有6、5、4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) SEQ ID NO: 17或109的氨基酸序列；

18.如权利要求17所述的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) X₁NX₂MG（SEQ ID NO: 604）的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自G和R并且其中该氨基酸残基X₂选自T和A；

b) 与X₁NX₂MG（SEQ ID NO: 604）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自G和R并且其中该氨基酸残基X₂选自T和A；

c) 与氨基酸序列X₁NX₂MG（SEQ ID NO: 604）具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自G和R并且其中该氨基酸残基X₂选自T和A；

以及

- CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) X₁ISSX₂GRX₃TNYADX₄VX₅X₆（SEQ ID NO: 605）的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自G和A，其中该氨基酸残基X₂选自S和T，其中该氨基酸残基X₃选自T、N和F，其中该氨基酸残基X₄选自S和P，其中该氨基酸残基X₅选自E和K，并且其中该氨基酸残基X₆选自G、V和A；

e) 与X₁ISSX₂GRX₃TNYADX₄VX₅X₆（SEQ ID NO: 605）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自G和A，其中该氨基酸残基X₂选自S和T，其中该氨基酸残基X₃选自T、N和F，其中该氨基酸残基X₄选自S和P，其中该氨基酸残基X₅选自E和K，并且其中该氨基酸残基X₆选自G、V和A；

f) 与X₁ISSX₂GRX₃TNYADX₄VX₅X₆（SEQ ID NO: 605）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自G和A，其中该氨基酸残基X₂选自S和T，其中该氨基酸残基X₃选自T、N和F，其中该氨基酸残基X₄选自S和P，其中该氨基酸残基X₅选自E和K，并且其中该氨基酸残基X₆选自G、V和A；

以及

- CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) SSWAAAX₁GTX₂X₃X₄IYDY（SEQ ID NO: 601）的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自A和P，其中该氨基酸残基X₂选自I、L和T，其中该氨基酸残基X₃选自A、P和S，并且其中该氨基酸残基X₄选自I和N；

h) 与SSWAAAX₁GTX₂X₃X₄IYDY（SEQ ID NO: 601）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自A和P，其中该氨基酸残基X₂选自I、L和T，其中该氨基酸残基X₃选自A、P和S，并且其中该氨基酸残基X₄选自I和N；

i) 与SSWAAAX₁GTX₂X₃X₄IYDY（SEQ ID NO: 601）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自A和P，其中该氨基酸残基X₂选自I、L和T，其中该氨基酸残基X₃选自A、P和S，并且其中该氨基酸残基X₄选自I和N。

19.如权利要求17或18中任一项所述的ISVD，其中这些CDR（Kabat编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 311-324的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

20.如权利要求17至19中任一项所述的ISVD，其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 22的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 23和24的氨基酸序列之一组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 22的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 23的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 22的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 24的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 109的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 22的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 120的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 109的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 22的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 24的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 109的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 22的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 120的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 118的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 122的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 110的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 118的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 123的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 111的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 118的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 123的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 111的氨基酸序列组成。

21.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) SEQ ID NO: 132的氨基酸序列；

b) 与SEQ ID NO: 132的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与SEQ ID NO: 132的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) SEQ ID NO: 134或136的氨基酸序列；

e) 与SEQ ID NO: 134或136的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f) 与SEQ ID NO: 134或136的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) SEQ ID NO: 143或145的氨基酸序列；

h) 与SEQ ID NO: 143或145的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i) 与SEQ ID NO: 143或145的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

22.如权利要求21所述的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) 氨基酸序列GGTFRHYVMG（SEQ ID NO: 132）；

b) 与氨基酸序列GGTFRHYVMG（SEQ ID NO: 132）具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与氨基酸序列GGTFRHYVMG（SEQ ID NO: 132）具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) X₁X₂SWSGSGX₃Y（SEQ ID NO: 607）的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A或G，该氨基酸残基X₂选自I、S和V，并且该氨基酸残基X₃选自T和Q；

e) 与X₁X₂SWSGSGX₃Y（SEQ ID NO: 607）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A或G，该氨基酸残基X₂选自I、S和V，并且该氨基酸残基X₃选自T和Q；

f) 与X₁X₂SWSGSGX₃Y（SEQ ID NO: 607）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A或G，该氨基酸残基X₂选自I、S和V，并且该氨基酸残基X₃选自T和Q；

以及

- CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) DX₁TSX₂VX₃X₄AVEAYDY（SEQ ID NO: 608）的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A、V、R、K和E，该氨基酸残基X₂选自Q和G，该氨基酸残基X₃选自V、K、Q、H和E，并且该氨基酸残基X₄选自L和R；

h) 与DX₁TSX₂VX₃X₄AVEAYDY（SEQ ID NO: 608）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A、V、R、K和E，该氨基酸残基X₂选自Q和G，该氨基酸残基X₃选自V、K、Q、H和E，并且该氨基酸残基X₄选自L和R；；

i) 与DX₁TSX₂VX₃X₄AVEAYDY（SEQ ID NO: 608）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A、V、R、K和E，该氨基酸残基X₂选自Q和G，该氨基酸残基X₃选自V、K、Q、H和E，并且该氨基酸残基X₄选自L和R。

23.如权利要求21或22中任一项所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 340-379的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

24.如权利要求21至23中任一项所述的ISVD，其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 134的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 143的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 135的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 144的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 135的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 145的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 136的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 146的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 135的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 147的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 135的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 148的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 135的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 149的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 135的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 150的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 136的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 149的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 135的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 146的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 136的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 145的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 136的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 147的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 136的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 149的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 136的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 150的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 136的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 144的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 135的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 151的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 132的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 137的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 152的氨基酸序列组成。

25.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) SEQ ID NO: 159的氨基酸序列；

b) 与SEQ ID NO: 159的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与SEQ ID NO: 159的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) SEQ ID NO: 160或162的氨基酸序列；

e) 与SEQ ID NO: 160或162的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f) 与SEQ ID NO: 160或162的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) SEQ ID NO: 143或145的氨基酸序列；

26.如权利要求25所述的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) HYVMG（SEQ ID NO: 159）的氨基酸序列；

b) 与HYVMG（SEQ ID NO: 159）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与HYVMG（SEQ ID NO: 159）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) X₁X₂SWSGSGX₃YYADSVKG（SEQ ID NO: 610）的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自G和A，其中该氨基酸残基X₂选自I、S和V，并且其中该氨基酸残基X₃选自T和Q；

e) 与X₁X₂SWSGSGX₃YYADSVKG（SEQ ID NO: 610）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自G和A，其中该氨基酸残基X₂选自I、S和V，并且其中该氨基酸残基X₃选自T和Q；

f) 与X₁X₂SWSGSGX₃YYADSVKG（SEQ ID NO: 610）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自G和A，其中该氨基酸残基X₂选自I、S和V，并且其中该氨基酸残基X₃选自T和Q；

以及

- CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) DX₁TSX₂VX₃X₄AVEAYDY（SEQ ID NO: 608）的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自A、V、R、K或E，其中该氨基酸残基X₂选自Q或G，其中该氨基酸残基X₃选自V、K、Q、H或E，并且其中该氨基酸残基X₄选自R或L；

h) 与DX₁TSX₂VX₃X₄AVEAYDY（SEQ ID NO: 608）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自A、V、R、K或E，其中该氨基酸残基X₂选自Q或G，其中该氨基酸残基X₃选自V、K、Q、H或E，并且其中该氨基酸残基X₄选自R或L；

i) 与DX₁TSX₂VX₃X₄AVEAYDY（SEQ ID NO: 608）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自A、V、R、K或E，其中该氨基酸残基X₂选自Q或G，其中该氨基酸残基X₃选自V、K、Q、H或E，并且其中该氨基酸残基X₄选自R或L。

27.如权利要求25或26所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 340-379的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

28.如权利要求25至27中任一项所述的ISVD，其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 160的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 143的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 161的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 144的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 161的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 145的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 162的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 146的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 161的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 147的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 161的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 148的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 161的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 149的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 161的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 150的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 162的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 148的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 161的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 146的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 162的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 144的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 161的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 146的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 166的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 145的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 162的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 147的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 162的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 149的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 162的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 147的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 162的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 150的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 161的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 151的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 159的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 163的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 152的氨基酸序列组成。

29.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) SEQ ID NO: 169的氨基酸序列；

b) 与SEQ ID NO: 169的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与SEQ ID NO: 169的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) SEQ ID NO: 171或175的氨基酸序列；

e) 与SEQ ID NO: 171或175的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f) 与SEQ ID NO: 171或175的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) SEQ ID NO: 192或193的氨基酸序列；

h) 与SEQ ID NO: 192或193的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i) 与SEQ ID NO: 192或193的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

30.如权利要求29所述的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) 氨基酸序列GSIFTSAVME（SEQ ID NO: 169）；

b) 与氨基酸序列GSIFTSAVME（SEQ ID NO: 169）具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与氨基酸序列GSIFTSAVME（SEQ ID NO: 169）具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) RIGSGGRX₁A（SEQ ID NO: 611）的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自I、R、H、E、K、T、Q、A、S、P和G；

e) 与RIGSGGRX₁A（SEQ ID NO: 611）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自I、R、H、E、K、T、Q、A、S、P和G；

f) 与RIGSGGRX₁A（SEQ ID NO: 611）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自I、R、H、E、K、T、Q、A、S、P和G；

以及

- CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) VX₁GGYIY（SEQ ID NO: 612）的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自M和I；

h) 与VX₁GGYIY（SEQ ID NO: 612）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自M和I；

i) 与VX₁GGYIY（SEQ ID NO: 612）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自M和I。

31.如权利要求29或30中任一项所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 420-450的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

32.如权利要求29至30中任一项所述的ISVD，其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 169的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 171的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 192的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 169的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 172的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 169的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 173的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 169的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 174的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 169的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 175的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 169的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 176的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 169的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 177的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 169的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 178的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 169的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 171的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 169的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 179的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 169的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 180的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 169的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 181的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成。

33.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) SEQ ID NO: 197的氨基酸序列；

b) 与SEQ ID NO: 197的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与SEQ ID NO: 197的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) SEQ ID NO: 198或202的氨基酸序列；

e) 与SEQ ID NO: 198或202的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f) 与SEQ ID NO: 198或202的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) SEQ ID NO: 192或193的氨基酸序列；

34.如权利要求33所述的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) SAVME（SEQ ID NO: 197）的氨基酸序列；

b) 与SAVME（SEQ ID NO: 197）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与SAVME（SEQ ID NO: 197）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) RIGSGGRX₁AYX₂DSVKG（SEQ ID NO: 613）的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自I、R、H、E、K、T、Q；A、S、P和G，并且其中该氨基酸残基X₂选自P和V；

e) 与RIGSGGRX₁AYX₂DSVKG（SEQ ID NO: 613）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自I、R、H、E、K、T、Q；A、S、P和G，并且其中该氨基酸残基X₂选自P和V；

f) 与RIGSGGRX₁AYX₂DSVKG（SEQ ID NO: 613）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自I、R、H、E、K、T、Q；A、S、P和G，并且其中该氨基酸残基X₂选自P和V；

以及

- CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) VX₁GGYIY（SEQ ID NO: 612）的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自M和I；

h) 与VX₁GGYIY（SEQ ID NO: 612）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自M和I；

i) 与VX₁GGYIY（SEQ ID NO: 612）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自M和I。

35.如权利要求33或34中任一项所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 420-450的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

36.如权利要求33至35中任一项所述的ISVD，其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 198的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 192的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 199的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 200的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 201的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 202的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 203的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 204的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 205的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 198的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 206的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 207的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 208的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 197的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 209的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 193的氨基酸序列组成。

37.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) SEQ ID NO: 218的氨基酸序列；

b) 与SEQ ID NO: 218的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与SEQ ID NO: 218的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) SEQ ID NO: 222的氨基酸序列；

e) 与SEQ ID NO: 222的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f) 与SEQ ID NO: 222的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) SEQ ID NO: 234的氨基酸序列；

h) 与SEQ ID NO: 234的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i) 与SEQ ID NO: 234的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

38.如权利要求37所述的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) 氨基酸序列ERTFX₁SYSMG（SEQ ID NO: 617），其中该氨基酸残基X₁选自S和G；

b) 与氨基酸序列ERTFX₁SYSMG（SEQ ID NO: 617）具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自S和G；

c) 与氨基酸序列ERTFX₁SYSMG（SEQ ID NO: 617）具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自S和G；

以及

- CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) X₁IX₂YRGAGPY（SEQ ID NO: 614）的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自V和P，并且其中该氨基酸残基X₂选自G和F；

e) 与X₁IX₂YRGAGPY（SEQ ID NO: 614）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自V和P，并且其中该氨基酸残基X₂选自G和F；

f) 与X₁IX₂YRGAGPY（SEQ ID NO: 614）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自V和P，并且其中该氨基酸残基X₂选自G和F；

以及

- CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) RDGAVASIPQAFX₁S（SEQ ID NO: 615）的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和T；

h) 与RDGAVASIPQAFX₁S（SEQ ID NO: 615）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和T；

i) 与RDGAVASIPQAFX₁S（SEQ ID NO: 615）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中该氨基酸残基X₁选自A和T。

39.如权利要求37或38中任一项所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 482-497的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

40.如权利要求37至40中任一项所述的ISVD，其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 218的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 222的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 234的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 218的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 223的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 234的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 218的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 224的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 234的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 219的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 222的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 235的氨基酸序列组成。

41.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) SEQ ID NO: 241的氨基酸序列；

b) 与SEQ ID NO: 241的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与SEQ ID NO: 241的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) SEQ ID NO: 242的氨基酸序列；

e) 与SEQ ID NO: 242的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f) 与SEQ ID NO: 242的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) SEQ ID NO: 234的氨基酸序列；

42.如权利要求41所述的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) SYSMG（SEQ ID NO: 241）的氨基酸序列；

b) 与SYSMG（SEQ ID NO: 241）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与SYSMG（SEQ ID NO: 241）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) X₁IX₂YRGAGPYYEDSVKG（SEQ ID NO: 616）的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自V和P，并且其中该氨基酸残基X₂选自G和F；

e) 与X₁IX₂YRGAGPYYEDSVKG（SEQ ID NO: 616）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自V和P，并且其中该氨基酸残基X₂选自G和F；

f) 与X₁IX₂YRGAGPYYEDSVKG（SEQ ID NO: 616）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自V和P，并且其中该氨基酸残基X₂选自G和F；

以及

- CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) RDGAVASIPQAFX₁S（SEQ ID NO: 615）的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自A和T；

h) 与RDGAVASIPQAFX₁S（SEQ ID NO: 615）的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自A和T；

i) 与RDGAVASIPQAFX₁S（SEQ ID NO: 615）的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；其中该氨基酸残基X₁选自A和T。

43.如权利要求41或42中任一项所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQ ID NO: 482-497的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

44.如权利要求41至43中任一项所述的ISVD，其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 241的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 242的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 234的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 241的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 243的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 234的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 241的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 244的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 234的氨基酸序列组成，

或其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 241的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 242的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 235的氨基酸序列组成。

45.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) SEQ ID NO: 256的氨基酸序列；

b) 与SEQ ID NO: 256的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与SEQ ID NO: 256的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) SEQ ID NO: 267的氨基酸序列；

e) 与SEQ ID NO: 267的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f) 与SEQ ID NO: 267的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) SEQ ID NO: 279的氨基酸序列；

h) 与SEQ ID NO: 279的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i) 与SEQ ID NO: 279的氨基酸序列具有43、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

46.如权利要求45所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQID NO: 514的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

47.如权利要求45或46中任一项所述的ISVD，其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 256的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 267的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 279的氨基酸序列组成。

48.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) SEQ ID NO: 293的氨基酸序列；

b) 与SEQ ID NO: 293的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与SEQ ID NO: 293的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) SEQ ID NO: 299的氨基酸序列；

e) 与SEQ ID NO: 299的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f) 与SEQ ID NO: 299的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) SEQ ID NO: 279的氨基酸序列；

i) 与SEQ ID NO: 279的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

49.如权利要求48所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQID NO: 514的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

50.如权利要求48或49中任一项所述的ISVD，其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 293的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 299的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 279的氨基酸序列组成。

51.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) SEQ ID NO: 257的氨基酸序列；

b) 与SEQ ID NO: 257的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与SEQ ID NO: 257的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) SEQ ID NO: 268的氨基酸序列；

e) 与SEQ ID NO: 268的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f) 与SEQ ID NO: 268的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) SEQ ID NO: 280的氨基酸序列；

h) 与SEQ ID NO: 280的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i) 与SEQ ID NO: 280的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

52.如权利要求51所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQID NO: 515的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

53.如权利要求51或52中任一项所述的ISVD，其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 257的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 268的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 280的氨基酸序列组成。

54.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) SEQ ID NO: 294的氨基酸序列；

b) 与SEQ ID NO: 294的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与SEQ ID NO: 294的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) SEQ ID NO: 300的氨基酸序列；

e) 与SEQ ID NO: 300的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f) 与SEQ ID NO: 300的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) SEQ ID NO: 280的氨基酸序列；

55.如权利要求54所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQID NO: 515的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

56.如权利要求54或55中任一项所述的ISVD，其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 294的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 300的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 280的氨基酸序列组成。

57.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) SEQ ID NO: 258的氨基酸序列；

b) 与SEQ ID NO: 258的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与SEQ ID NO: 258的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) SEQ ID NO: 269的氨基酸序列；

e) 与SEQ ID NO: 269的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f) 与SEQ ID NO: 269的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) SEQ ID NO: 281的氨基酸序列；

h) 与SEQ ID NO: 281的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i) 与SEQ ID NO: 281的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

58.如权利要求57所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQID NO: 516的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

59.如权利要求57至58中任一项所述的ISVD，其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 258的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 269的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 281的氨基酸序列组成。

60.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) SEQ ID NO: 295的氨基酸序列；

b) 与SEQ ID NO: 295的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与SEQ ID NO: 295的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) SEQ ID NO: 301的氨基酸序列；

e) 与SEQ ID NO: 301的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f) 与SEQ ID NO: 301的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) SEQ ID NO: 281的氨基酸序列；

61.如权利要求60所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQID NO: 516的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

62.如权利要求60或61中任一项所述的ISVD，其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 295的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 301的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 281的氨基酸序列组成。

63.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) SEQ ID NO: 259的氨基酸序列；

b) 与SEQ ID NO: 259的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与SEQ ID NO: 259的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) SEQ ID NO: 270的氨基酸序列；

e) 与SEQ ID NO: 270的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f) 与SEQ ID NO: 270的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) SEQ ID NO: 282的氨基酸序列；

h) 与SEQ ID NO: 282的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i) 与SEQ ID NO: 282的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

64.如权利要求63所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQID NO: 517的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

65.如权利要求63或64中任一项所述的ISVD，其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 259的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 270的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 282的氨基酸序列组成。

66.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) SEQ ID NO: 296的氨基酸序列；

b) 与SEQ ID NO: 296的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与SEQ ID NO: 296的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) SEQ ID NO: 302的氨基酸序列；

e) 与SEQ ID NO: 302的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f) 与SEQ ID NO: 302的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) SEQ ID NO: 282的氨基酸序列；

67.如权利要求66所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQID NO: 517的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

68.如权利要求66或67中任一项所述的ISVD，其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 296的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 302的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 282的氨基酸序列组成。

69.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) SEQ ID NO: 260的氨基酸序列；

b) 与SEQ ID NO: 260的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与SEQ ID NO: 260的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) SEQ ID NO: 271的氨基酸序列；

e) 与SEQ ID NO: 271的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f) 与SEQ ID NO: 271的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) SEQ ID NO: 283的氨基酸序列；

h) 与SEQ ID NO: 283的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i) 与SEQ ID NO: 283的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

70.如权利要求69所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQID NO: 518的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

71.如权利要求69或70中任一项所述的ISVD，其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 260的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 271的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 283的氨基酸序列组成。

72.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) SEQ ID NO: 297的氨基酸序列；

b) 与SEQ ID NO: 297的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与SEQ ID NO: 297的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) SEQ ID NO: 303的氨基酸序列；

e) 与SEQ ID NO: 303的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f) 与SEQ ID NO: 303的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) SEQ ID NO: 283的氨基酸序列；

73.如权利要求72所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQID NO: 518的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

74.如权利要求72或73中任一项所述的ISVD，其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 297的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 303的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 283的氨基酸序列组成。

75.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) SEQ ID NO: 262的氨基酸序列；

b) 与SEQ ID NO: 262的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与SEQ ID NO: 262的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) SEQ ID NO: 272的氨基酸序列；

e) 与SEQ ID NO: 272的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f) 与SEQ ID NO: 272的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR3（AbM编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) SEQ ID NO: 284的氨基酸序列；

h) 与SEQ ID NO: 284的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i) 与SEQ ID NO: 284的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

76.如权利要求75所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQID NO: 519的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

77.如权利要求75或76中任一项所述的ISVD，其中

- CDR1（AbM编号）由SEQ ID NO: 262的氨基酸序列组成；

- CDR2（AbM编号）由SEQ ID NO: 272的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（AbM编号）由SEQ ID NO: 284的氨基酸序列组成。

78.一种特异性地结合人PD-L1的免疫球蛋白单可变结构域（ISVD），该免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

a) SEQ ID NO: 298的氨基酸序列；

b) 与SEQ ID NO: 298的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

c) 与SEQ ID NO: 298的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

d) SEQ ID NO: 304的氨基酸序列；

e) 与SEQ ID NO: 304的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f) 与SEQ ID NO: 304的氨基酸序列具有6、5、4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR3（Kabat编号）由选自以下的氨基酸序列组成：

g) SEQ ID NO: 284的氨基酸序列；

i) 与SEQ ID NO: 284的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

79.如权利要求78所述的ISVD，其中这些CDR（AbM编号）的氨基酸序列与具有选自SEQID NO: 519的氨基酸序列的ISVD的CDR的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、诸如95%氨基酸序列同一性、或99%氨基酸序列同一性或更高氨基酸序列同一性、或甚至基本上100%氨基酸序列同一性。

80.如权利要求78或79中任一项所述的ISVD，其中

- CDR1（Kabat编号）由SEQ ID NO: 298的氨基酸序列组成；

- CDR2（Kabat编号）由SEQ ID NO: 304的氨基酸序列组成；以及

- CDR3（Kabat编号）由SEQ ID NO: 284的氨基酸序列组成。

81.如权利要求1至80中任一项所述的ISVD，其氨基酸序列

i) 与SEQ ID NO: 4、5、7、311-525或527-528的氨基酸序列中的一个具有80%氨基酸序列同一性，其中出于确定氨基酸同一性的程度的目的，形成这些CDR序列的氨基酸残基被忽略；

并且其中：

ii) 优选地，根据Kabat编号，位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108处的一个或多个氨基酸残基选自表1中提到的标志残基。

82.如权利要求1至81中任一项所述的ISVD，其基本上由衍生自常规四链抗体的重链可变结构域序列组成，或者基本上由衍生自重链抗体的重链可变结构域序列组成。

83.如权利要求1至82中任一项所述的ISVD，其基本上由VHH、人源化VHH、骆驼化VH、结构域抗体、单结构域抗体或dAb组成。

84.如权利要求1至83中任一项所述的ISVD，其是人源化ISVD，该人源化ISVD选自由以下组成的组：SEQ ID NO: 5、7、311-321、326-336、341-378、380-418、421-449、451-481、483-496、498-512和527-528，或者选自由以下组成的组：与SEQ ID NO: 5、7、311-321、326-336、341-378、380-418、421-449、451-481、483-496、498-512和527-528的氨基酸序列中的至少一个具有大于80%、优选地大于90%、更优选地大于95%、诸如99%或更高氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

85.如权利要求1至84中任一项所述的ISVD，其中该氨基酸序列选自由SEQ ID NO: 4、5、7、311-525和527-528组成的组。

86.一种多肽或构建体，其包含一种或多种如权利要求1至85中任一项所述的ISVD或基本上由该一种或多种ISVD组成，并且任选地进一步包含任选地经由一个或多个接头连接的一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元。

87.如权利要求86所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元是氨基酸序列。

88.如权利要求86至87中任一项所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个接头是一个或多个氨基酸序列。

89.如权利要求86至88中任一项所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元是免疫球蛋白序列。

90.如权利要求86至89中任一项所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元是ISVD。

91.如权利要求86至90中任一项所述的多肽或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自由以下组成的组：VHH、人源化VHH、骆驼化VH、结构域抗体、单结构域抗体和dAb。

92.如权利要求86至91中任一项所述的多肽或构建体，其是多价构建体。

93.如权利要求86至92中任一项所述的多肽或构建体，其是多特异性构建体。

94.如权利要求86至93中任一项所述的多肽或构建体，其中与没有所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元的ISVD相比，所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元为该多肽或构建体提供增加的半衰期。

95.如权利要求94所述的多肽或构建体，其中为该多肽或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自由以下组成的组：聚乙二醇分子（PEG）、血清蛋白或其片段、与血清蛋白特异性地结合的结合单元、Fc部分以及与血清蛋白特异性地结合的小的蛋白质或肽。

96.如权利要求95所述的多肽或构建体，其中为该多肽或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自由以下组成的组：人血清白蛋白或其片段。

97.如权利要求95所述的多肽或构建体，其中为该多肽或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自由以下组成的组：与血清白蛋白（诸如人血清白蛋白）或血清免疫球蛋白（诸如IgG）特异性地结合的结合单元。

98.如权利要求97所述的多肽或构建体，其中为该多肽或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自由以下组成的组：与血清白蛋白（诸如人血清白蛋白）或血清免疫球蛋白（诸如IgG）特异性地结合的VHH、人源化VHH、骆驼化VH、结构域抗体、单结构域抗体或dAb。

99.如权利要求98所述的多肽或构建体，其中为该多肽或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元是特异性结合人血清白蛋白的ISVD。

100.如权利要求99所述的多肽或构建体，其中特异性地结合人血清白蛋白的所述ISVD基本上由4个框架区（分别为FR1至FR4）和3个互补性决定区（分别为CDR1至CDR3）组成，其中：

- CDR1（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

a) SEQ ID NO: 43的氨基酸序列；

b) 与SEQ ID NO: 43的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；以及

c) 与SEQ ID NO: 43的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR2（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

d) SEQ ID NO: 45的氨基酸序列；

e) 与SEQ ID NO: 45的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

f) 与SEQ ID NO: 45的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

- CDR3（AbM编号）具有选自以下的氨基酸序列：

g) SEQ ID NO: 47的氨基酸序列；

h) 与SEQ ID NO: 47的氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；

i) 与SEQ ID NO: 47的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

101.如权利要求100所述的多肽或构建体，其中CDR1由SEQ ID NO: 43的氨基酸序列组成，CDR2由SEQ ID NO: 45的氨基酸序列组成，并且CDR3由SEQ ID NO: 47的氨基酸序列组成。

102.如权利要求101所述的多肽或构建体，其中特异性地结合人血清白蛋白的所述ISVD选自由以下组成的组：ALB8（SEQ ID NO: 27）、ALB23（SEQ ID NO: 28）、ALBX00001（SEQID NO: 41）和ALB23002（SEQ ID NO: 42）。

103.如权利要求86至102中任一项所述的多肽或构建体，其中所述接头选自由SEQ IDNO: 53至69组成的组。

104.如权利要求86至103中任一项所述的多肽或构建体，其进一步包含C末端延伸。

105.如权利要求104所述的多肽或构建体，其中所述C末端延伸为C末端延伸(X)_n，其中n为1至10，优选地1至5，诸如1、2、3、4或5（以及优选地1或2，诸如1）；并且每个X为独立地选择的、并且优选地独立地选自由以下组成的组的（优选地天然存在的）氨基酸残基：丙氨酸（A）、甘氨酸（G）、缬氨酸（V）、亮氨酸（L）或异亮氨酸（I）。

106.一种核酸，其编码如权利要求1至85中任一项所述的ISVD或如权利要求86至105中任一项所述的多肽。

107.如权利要求106所述的核酸，其呈遗传构建体的形式。

108.一种非人宿主或宿主细胞，其表达或在合适的情况下能够表达如权利要求1至85中任一项所述的ISVD或如权利要求86至105中任一项所述的多肽；和/或包含如权利要求106或107中任一项所述的核酸。

109.一种用于产生如权利要求1至85中任一项所述的ISVD或如权利要求86至105中任一项所述的多肽的方法，该方法至少包括以下步骤：

a) 在合适的非人宿主细胞或宿主生物体中或在另一合适的表达系统中表达如权利要求106或107中任一项所述的核酸；

任选地接着：

b) 分离和/或纯化如权利要求1至85中任一项所述的ISVD，或如权利要求86至105中任一项所述的多肽。

110.一种用于产生如权利要求1至85中任一项所述的ISVD或如权利要求86至105中任一项所述的多肽的方法，所述方法至少包括以下步骤：

a) 在使得如权利要求108所述的非人宿主或宿主细胞表达和/或产生至少一种如权利要求1至85中任一项所述的ISVD或至少一种如权利要求86至105中任一项所述的多肽的条件下培养和/或维持所述非人宿主或宿主细胞；

任选地接着：

111.一种组合物，其包含至少一种如权利要求1至85中任一项所述的ISVD、至少一种如权利要求86至105中任一项所述的多肽或构建体、或至少一种如权利要求106或107中任一项所述的核酸。

112.如权利要求111所述的组合物，其是药物组合物。

113.如权利要求111或112中任一项所述的组合物，其为药物组合物，该药物组合物进一步包含至少一种药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，并且任选地包含一种或多种另外的药学上活性的多肽和/或化合物。

114.如权利要求1至85中任一项所述的ISVD、如权利要求86至105中任一项所述的多肽或构建体、或如权利要求111至113中任一项所述的组合物，其用作药物。

115.如权利要求1至85中任一项所述的ISVD、如权利要求86至105中任一项所述的多肽或构建体、或如权利要求111至113中任一项所述的组合物，其用于诊断、预防和/或治疗至少一种疾病和/或障碍。

116.如权利要求1至85中任一项所述的ISVD、如权利要求86至105中任一项所述的多肽或构建体、或如权利要求111至113中任一项所述的组合物，其用于诊断、预防和/或治疗与PD-L1、与该PD-L1的生物学或药理学活性、和/或与其中涉及PD-L1的生物学途径或信号传导相关联的至少一种疾病和/或障碍。

117.如权利要求1至85中任一项所述的ISVD、如权利要求86至105中任一项所述的多肽或构建体、或如权利要求111至113中任一项所述的组合物，其用于诊断、预防和/或治疗癌症。

118.一种用于诊断、预防和/或治疗至少一种疾病和/或障碍的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用药学上活性的量的如权利要求1至85中任一项所述的ISVD、如权利要求86至105中任一项所述的多肽或构建体、或如权利要求111至113中任一项所述的组合物。

119.如权利要求118所述的方法，其用于诊断、预防和/或治疗与PD-L1、与该PD-L1的生物学或药理学活性、和/或与其中涉及PD-L1的生物学途径或信号传导相关联的至少一种疾病或障碍，所述方法包括向对其有需要的受试者施用药学上活性的量的至少一种如权利要求1至85中任一项所述的ISVD、如权利要求86至105中任一项所述的多肽或构建体、或如权利要求111至113中任一项所述的组合物。

120.如权利要求118或119中任一项所述的方法，其用于诊断、预防和/或治疗癌症，所述方法包括向对其有需要的受试者施用药学上活性的量的至少一种如权利要求1至85中任一项所述的ISVD、如权利要求86至105中任一项所述的多肽或构建体、或如权利要求111至113中任一项所述的组合物。