CN121574434A - 一种新型的苯硼酸修饰的壳聚糖微载体、制备方法及应用 - Google Patents

一种新型的苯硼酸修饰的壳聚糖微载体、制备方法及应用

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CN121574434A CN202511674589.8A CN202511674589A CN121574434A CN 121574434 A CN121574434 A CN 121574434A CN 202511674589 A CN202511674589 A CN 202511674589A CN 121574434 A CN121574434 A CN 121574434A
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新型的苯硼酸修饰的壳聚糖微载体、制备方法及应用,所述苯硼酸修饰的壳聚糖微载体由4‑甲酰基苯硼酸和中粘度壳聚糖，与明胶混合，交联得到。所述的微载体的粒径尺寸约为100 μm，扫描电镜分析显示，微载体表现出明确的球形多孔形态，具有均一的孔形，孔径大小均匀，可以提供细胞生长的三维环境。其硬度、弹性和孔壁较适中，更有利于较多的细胞生长和营养物质传输，稳定性更高，更适合细胞培养，表现出优异的生物安全性和生物相容性，更适用于3D细胞培养体系。

Description

一种新型的苯硼酸修饰的壳聚糖微载体、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新型的苯硼酸修饰的壳聚糖微载体、制备方法及应用。
背景技术
人类干细胞衍生的类球体和类器官的产生是解决众多医学、药理学和生物学挑战的重要一步。传统的培养方法是在二维平面培养皿上进行，细胞粘附在人造塑料或玻璃基板上，仅在其外围与其他细胞接触。由于没有氧气、营养物或废物梯度，环境在生理上是非均匀的。细胞不允许堆叠在一起，而是被迫形成单层形态，这并不是所有细胞类型的自然形态。在平皿中建立共培养物可以增加细胞间的自然接触和交流，但二维表面仍然抑制细胞形成多维结构的能力。因此，2D培养的平面层细胞不能准确地模拟体内细胞的生长环境。随着技术的发展，3D悬浮细胞培养成为了构建类器官的关键步骤。3D悬浮细胞培养是基于生物支架材料，通过细胞自主的自组装或微环境的调控从而形成三维的类器官结构，更好的模拟细胞的形态学和生理学。
微载体作为一种悬浮细胞培养的生物支架，其多孔的结构和材料本身的特性，为细胞提供了稳定的基质微环境，在细胞增殖、药物递送和类器官构建过程中发挥着重要的作用。基于微载体的三维细胞培养模式与二维的细胞培养模式相比，其可以模拟体内微环境，实现细胞的快速增殖，同时可以增强干细胞的干性及定向分化能力，同时其还可以实现细胞的时序性再生，从而指导干细胞发生时序性的功能变化。目前市场现有细胞微载体能够一定程度上实现细胞大规模扩增，但是再最终获取细胞时则需要添加各类酶降解微载体，从而获得单个细胞。同时再细胞体内应用递送场景中，微载体在体内的降解以及细胞的缓释则遇到较大瓶颈。因此，研发一种新型的能够响应组织器官以及机体环境从而自发降解的微载体在干细胞扩增，提升干细胞性能以及干细胞递送方面具有深切的社会和医学意义。
针对上述问题，本发明研发了一种基于乳化法合成苯硼酸修饰的壳聚糖（CS-FPBA）微载体，其不仅能够实现细胞的大规模扩增，同时具有葡萄糖以及PH敏感的特性，能够在机体内以及特定疾病（糖尿病）个体中实现自我降解并实现干细胞的递送及缓释。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种新型的苯硼酸修饰的壳聚糖微载体，所述苯硼酸修饰的壳聚糖微载体由4-甲酰基苯硼酸和中粘度壳聚糖，与明胶混合，交联得到。
优选的，所述苯硼酸修饰的壳聚糖微载体的粒径＞100 μm。
本发明的第二目的是提供所述的苯硼酸修饰的壳聚糖微载体制备方法，包括如下步骤：
（1）中粘度壳聚糖分散于醋酸溶液中，充分溶解，活化；
（2）将4-甲酰基苯硼酸缓慢加入步骤（1）得到的溶液中，室温搅拌；
（3）透析，调pH至5.0，去除多余的4-甲酰基苯硼酸，冻干，得到产物CS-FPBA；
（4）步骤（3）得到的产物CS-FPBA充分溶解，搅拌加入明胶和交联剂，为反应体系；
（5）液体石蜡和Span 80搅拌至混合均匀，为溶剂体系；
（6）将步骤（4）所述的反应体系在搅拌情况下缓慢加入步骤（5）所述的溶剂体系中，反应，静置，收集沉淀；
（7）清洗步骤（6）收集得到的沉淀，超纯水溶胀后，冷冻，干燥，得终产物CS-FPBA微载体。
优选的，步骤（2）所述的4-甲酰基苯硼酸的浓度为0.02 mmol。
优选的，步骤（4）所述的交联剂为 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺。
优选的，步骤（4）所述的明胶浓度为5%。
优选的，步骤（5）所述的液体石蜡和Span 80的体积质量比为250：5。
优选的，步骤（6）所述的反应温度为30℃，反应时间为48h。
优选的，步骤（7）所述的清洗使用异丙醇和无水乙醇。
本发明的第三目的是提供所述的苯硼酸修饰的壳聚糖微载体或所述的制备方法制备得到的苯硼酸修饰的壳聚糖微载体在细胞三维培养中的应用。
本发明的有益效果是：（1）本发明提供了一种新型的苯硼酸修饰的壳聚糖微载体，所述苯硼酸修饰的壳聚糖微载体由4-甲酰基苯硼酸和中粘度壳聚糖，与明胶混合，交联得到。所述的微载体的粒径尺寸约为100 μm，扫描电镜分析显示，微载体表现出明确的球形多孔形态，具有均一的孔形，孔径大小均匀，可以提供细胞生长的三维环境。其硬度、弹性和孔壁较适中，更有利于较多的细胞生长和营养物质传输。
（2）在pH为5.5时，CS和CS-FPBA两种材料降解率偏高；在pH为6.5时，CS的降解率低于CS-FPBA；在pH为7.4时，CS-FPBA的降解率低于CS，综上，CS-FPBA的稳定性更高。动物细胞培养的最佳pH范围在7 - 7.5之间， CS-FPBA更适合细胞培养的应用。在相同的培养模式下，CS-FPBA微载体环境下的细胞增殖显著好于CS。
（3）光学显微镜证实细胞在微载体的多孔结构上粘附良好。微载体上的细胞在 1-9 d 内表现出显着的增殖并形成紧密的连接，与二维培养的 SHED 相比，3D 培养的 SHED(SHED-CD) 中的表达率显著升高。将SHED培养到CS-FPBA微载体上，在搅拌式生物反应器中共培养后，得到组装SHED微载体，SHED保持了良好的生物活性和分化潜能。因此，CS-FPBA微载体表现出优异的生物安全性和生物相容性，更适用于3D细胞培养体系。
附图说明
图1合成苯硼酸修饰的壳聚糖CS-FPBA微载体的流程示意图
图2 CS-FPBA大体图及显微结构图
图3 CS与CS-FPBA体外降解率
图4 CS与CS-FPBA在不同pH值下的稳定性
图5 CS与CS-FPBA在不同溶液下的状态
图6 CS与CS-FPBA 细胞增殖检测
图7 CS-FPBA微载体培养细胞应用
图8 CS-FPBA细胞培养扫描电子显微镜
图9 CS-FPBA细胞增殖检测
图10 CS-FPBA微载体培养的SHED细胞仍维持间充质干细胞的干性特征
图11 CS-FPBA微载体培养的SHED细胞具有优良的成骨能力
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的保护范围进行详细的阐述，应当说明的是，本发明的保护范围并不受以下实施例的限制。
应当说明的是，以下实施例中，若无特殊说明，所述的方法均是常规方法，所述的试剂均可从商业途径购买得到。
实施例一、一种壳聚糖载体的制备方法
包括以下步骤：
（1）中粘度壳聚糖（CS）分散于1%的醋酸溶液中，充分溶解，得到稳定的壳聚糖交替悬浮液；
（2）冷冻干燥，得产物CS；
（3）将CS放入烘箱中干燥40 min，放入70%的乙醇中浸泡24 h，用去离子水反复清洗3次；
（4）将步骤（3）得到的1%合成产物CS充分溶解后搅拌下加入0.5%的明胶，加入交联剂（EDC+NHS）为反应体系；
（5）液体石蜡250 mL+5 g Span 80，330转匀速搅拌，直至混合均匀，为溶剂体系；
（6）将步骤（4）所述的反应体系在搅拌情况下缓慢加入步骤（5）所述的溶剂体系中；
（7）30℃，反应48 h后，静置，收沉淀；
（8）异丙醇，无水乙醇依次清洗，超纯水溶胀后，冷冻，干燥，得终产物CS微载体，将其干燥保存。
实施例二、一种苯硼酸-壳聚糖载体的制备方法
包括以下步骤：
（1）中粘度壳聚糖（CS）分散于醋酸溶液中，充分溶解，活化4小时；
（2）将0.02 mmol 4-甲酰基苯硼酸（FPBA）缓慢加入步骤（1）所述的混和溶液中，室温搅拌12小时；
（3）透析袋蒸馏水透析3天，调pH至5.0，去除多余的FPBA；冻干，得产物CS-FPBA，备用；
（4）步骤（4）得到的1%合成产物CS-FPBA充分溶解后搅拌下加入0.5%的明胶，加入交联剂（EDC+NHS）为反应体系；
（5）液体石蜡250 mL+5 g Span 80，330转匀速搅拌，直至混合均匀，为溶剂体系；
（6）将步骤（4）所述的反应体系在搅拌情况下缓慢加入步骤（5）所述的溶剂体系中；
（7）30℃，反应48 h后，静置，收沉淀；
（8）异丙醇，无水乙醇依次清洗，超纯水溶胀后，冷冻，干燥，得终产物CS-FPBA微载体，筛选得粒径＞100 um微载体干燥保存。
壳聚糖是一种发展较快的医用高分子材料，具有低免疫原性，降解可控性和多孔性等特点，为制造支持干细胞增殖分化的多功能壳聚糖基支架，我们添加了4-甲酰基苯硼酸，制得可用于细胞培养，增强细胞分化的微载体材料。
制备过程如图1所示，透析后，经过冷冻冻干得到CS-FPBA作为干粉（图2A），并在干燥器中保存在环境条件下，以备后续应用。可以看到，制备了粒径尺寸约为100 μm的CS-FPBA微载体（图2B）。 扫描电镜分析显示，微载体表现出明确的球形多孔形态，具有均一的孔形，孔径大小均匀，可以提供细胞生长的三维环境。其硬度、弹性和孔壁较适中，更有利于较多的细胞生长和营养物质传输。
实施例三、微载体的体外降解率的测定
在室温下使用PBS缓冲液对微载体进行降解性能研究。首先对干燥状态下的载体材料进行称重（此时质量记为m1），然后将样品材料浸入PBS缓冲液中，在37℃下孵育40 d。在指定的时间间隔内，取出样品并用去离子水洗涤。最后将冲洗后的样品进行二次冻干再称重(此时质量记为m2)。
支架的降解率由以下公式计算：
DR = (m1 m2)/m1×100%
CS和CS-FPBA支架在PBS中浸泡40天的体外降解率如图3所示。CS-FPBA的体外降解率低于CS，说明由本实验制得的壳聚糖-苯硼酸微载体降解缓慢，表明壳聚糖-苯硼酸微载体能够维持细胞在微载体表面的黏附、铺展以及生长代谢。
优质的微载体要求适应于多种培养体系，有一定的稳定性。根据图4可知，在pH为5.5时，CS和CS-FPBA两种材料降解率偏高；在pH为6.5时，CS的降解率低于CS-FPBA；在pH为7.4时，CS-FPBA的降解率低于CS，综上，CS-FPBA的稳定性更高。在不同pH的溶液中浸泡材料，分别观察其完好程度（图5）。动物细胞培养的最佳pH范围在7 - 7.5之间，根据观察，CS-FPBA更适合细胞培养的应用。
实施例四、细胞增殖实验
得到两种微载体材料之后，将其应用于细胞培养检测，观察细胞增殖情况。利用生物反应器构建三维培养模式，按100 mg微载体，2.5×106cell细胞量接种，首日接种培养基50 mL，变速模式（40转）24 H后，第二日，培养基加至75 mL，恒定模式旋转培养。对细胞进行染色后使用荧光荧光显微镜进行观察，染色过程中注意避光。根据图6可知，在相同的培养模式下，CS-FPBA微载体环境下的细胞增殖显著好于CS。
实施例五、
2D细胞培养方法：
在细胞超净工作台中，将组织置于培养皿，使用PBS反复冲洗，至其表面无明显血液；弃PBS，向培养皿中加入1.5 ml胶原酶，将其剪成组织块，5%CO2细胞孵箱中进行消化；加入等体积培养液，800转离心5 min；接种至25 cm2培养瓶，混匀后置于细胞孵箱中培养；弃原培养基，无菌PBS洗涤3次；加入胰酶消化3 min；加入适量培养液，吹打后转移至15 ml离心管离心；弃上清，重悬牙髓干细胞（SHED）后按1×106/瓶的密度接种于75 cm2培养瓶中，待用。
3D细胞培养方法：
将上述合成的微载体在无菌生物安全柜中进行紫外线消毒6 h。 将灭菌后的微载体转移至125 mL透气内置叶轮培养瓶中，并补充培养基。 然后将培养瓶置于3Dmini生物反应器上，匀速旋转，以确保微载体完全溶胀（图7）。将牙髓干细胞（SHED）以2.5×106细胞/mL的浓度接种到含有微载体的培养瓶中，加入培养基至50mL，周期24h。第二日，将培养基添加至 75 mL，恒定模式旋转培养。然后获得SHED-微载体组装体用于后续实验。用0.25%胰蛋白酶在37℃下消化5min，获得3D培养的SHED。
蛋白质样品制备检测方法：
将2D 培养的 SHED 和 3D 培养的 SHED 的蛋白质样品进行制备，通过用 RIPA裂解缓冲液在 4 °C 下处理 20 分钟来制备。将样品以离心 15 min，收集上清液，使用BCA 蛋白测定试剂盒进行蛋白浓度定量。将等量的蛋白质样品与上样缓冲液和PBS混合，加载到蛋白电泳预制胶中进行蛋白验证。
光学显微镜证实细胞在微载体的多孔结构上粘附良好。采用扫描电镜观察3D培养细胞球体在不同时间点的形态结构。观察显示，微载体上的细胞在 1-9 d 内表现出显着的增殖并形成紧密的连接（图8）。 通过使用以二维方式培养的细胞作为对照组，在整个培养期间观察到细胞计数显著增加（图9A）。染色结果表明，与二维培养的 SHED 相比，3D 培养的 SHED (SHED-CD) 中的表达率显著升高（图9B）。将SHED培养到CS-FPBA微载体上，在搅拌式生物反应器中共培养后，得到组装SHED微载体，SHED保持了良好的生物活性和分化潜能（图10）。 我们的研究进一步证实，通过微载体和SHED悬浮培养建立三维培养体系后，SHED高表达RUNX2等成骨发育相关蛋白（图11），使其能够更好地保持其发育潜能，具有优良的成骨能力。因此这些结果表明CS-FPBA微载体表现出优异的生物安全性和生物相容性，更适用于3D细胞培养体系。
综上所述，本发明提供了一种新型的苯硼酸修饰的壳聚糖微载体，所述苯硼酸修饰的壳聚糖微载体由4-甲酰基苯硼酸和中粘度壳聚糖，与明胶混合，交联得到。所述的微载体的粒径尺寸约为100 μm，扫描电镜分析显示，微载体表现出明确的球形多孔形态，具有均一的孔形，孔径大小均匀，可以提供细胞生长的三维环境。其硬度、弹性和孔壁较适中，更有利于较多的细胞生长和营养物质传输。在pH为5.5时，CS和CS-FPBA两种材料降解率偏高；在pH为6.5时，CS的降解率低于CS-FPBA；在pH为7.4时，CS-FPBA的降解率低于CS，综上，CS-FPBA的稳定性更高。动物细胞培养的最佳pH范围在7 - 7.5之间， CS-FPBA更适合细胞培养的应用。在相同的培养模式下，CS-FPBA微载体环境下的细胞增殖显著好于CS。光学显微镜证实细胞在微载体的多孔结构上粘附良好。微载体上的细胞在 1-9 d 内表现出显着的增殖并形成紧密的连接，与二维培养的 SHED 相比，3D 培养的 SHED (SHED-CD) 中的表达率显著升高。将SHED培养到CS-FPBA微载体上，在搅拌式生物反应器中共培养后，得到组装SHED微载体，SHED保持了良好的生物活性和分化潜能。因此，CS-FPBA微载体表现出优异的生物安全性和生物相容性，更适用于3D细胞培养体系。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种新型的苯硼酸修饰的壳聚糖微载体，其特征在于，所述苯硼酸修饰的壳聚糖微载体由4-甲酰基苯硼酸和中粘度壳聚糖，与明胶混合，交联得到。
2.如权利要求1所述的苯硼酸修饰的壳聚糖微载体，其特征在于，所述苯硼酸修饰的壳聚糖微载体的粒径＞100 μm。
3.如权利要求1所述的苯硼酸修饰的壳聚糖微载体制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）中粘度壳聚糖分散于醋酸溶液中，充分溶解，活化；
（2）将4-甲酰基苯硼酸缓慢加入步骤（1）得到的溶液中，室温搅拌；
（3）透析，调pH至5.0，去除多余的4-甲酰基苯硼酸，冻干，得到产物CS-FPBA；
（4）步骤（3）得到的产物CS-FPBA充分溶解，搅拌加入明胶和交联剂，为反应体系；
（5）液体石蜡和Span 80搅拌至混合均匀，为溶剂体系；
（6）将步骤（4）所述的反应体系在搅拌情况下缓慢加入步骤（5）所述的溶剂体系中，反应，静置，收集沉淀；
（7）清洗步骤（6）收集得到的沉淀，超纯水溶胀后，冷冻，干燥，得终产物CS-FPBA微载体。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述的4-甲酰基苯硼酸的浓度为0.02 mmol。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述的交联剂为 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述的明胶浓度为5%。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）所述的液体石蜡和Span 80的体积质量比为250：5。
8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（6）所述的反应温度为30℃，反应时间为48h。
9.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（7）所述的清洗使用异丙醇和无水乙醇。
10.如权利要求1所述的苯硼酸修饰的壳聚糖微载体或如权利要求3-9任一项所述的制备方法制备得到的苯硼酸修饰的壳聚糖微载体在细胞三维培养中的应用。
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