CN121591908A - 一种三特异性抗体、抗体偶联药物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及同时靶向EpCAM、cMet和Trop2的三特异性抗体、抗体偶联药物及其制备方法和用途。具体地，本发明提供了包括抗EpCAM的纳米抗体、抗cMet的纳米抗体和抗Trop2的纳米抗体的三特异性抗体。本发明还提供了基于纳米抗体和三特异性纳米抗体构建的药物偶联物。

Description

一种三特异性抗体、抗体偶联药物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术药物领域，具体涉及靶向于EpCAM、cMet和Trop2的三特异性抗体偶联药物及其制备方法与应用。

背景技术

抗体药物偶联物(Antibody-Drug Conjugates，ADC)是一类由单克隆抗体(Antibody)和小分子细胞毒性药物(Drug)通过连接子(Linker)偶联而成的新型靶向化疗药物，兼具传统小分子化疗的强大杀伤效应及抗体药物的肿瘤靶向性，是近些年抗癌药物研发热点之一。

EpCAM全称为Epithelial cell adhesion molecule(上皮细胞粘附分子)，亦称CD326，隶属GA733蛋白家族，是一种I型跨膜糖蛋白，在癌细胞膜上广泛表达，尤其是鳞癌和腺癌。参与了肿瘤干细胞、细胞增殖、代谢、血管生成、上皮向间充质转化(EMT)、转移、化疗/放射抵抗和免疫调节等过程。在肿瘤发展过程中，EPCAM会与许多关键信号通路如Wnt/β-catenin、转化生长因子-β/SMAD、Epex/EGFR、PI3K/Akt/mTor和P53等发生串扰，诱导肿瘤细胞产生生物学变化。由Sesen Bio开发的Oportuzumab monatox是进展最快的EpCAM ADC，处于临床Ⅲ期，由重组人源化抗EpCAM抗体scFv与假单胞菌外毒素A偶联而成。2021年8月，FDA拒绝批准Oportuzumab monatox用于治疗对卡介苗(BCG)无应答的高风险非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)。目前Sesen Bio已自愿暂停Oportuzumab monatox在美国的非肌肉浸润性膀胱癌(NMIBC)适应症的进一步开发。

cMet全称为cellular-mesenchymal epithelial transition factor(细胞间质上皮转换因子)，为受体酪氨酸激酶家族成员。cMet信号的异常激活在各种类型的癌症中都有报道，其原因包括蛋白质过表达、基因扩增或重排、转录调控以及自分泌或旁分泌配体刺激。研究表明，CMet信号通路可以增强肿瘤细胞的增殖、存活、运动和迁移、散射、上皮-间质转化(EMT)、血管生成、侵袭和转移扩散。目前全球范围内没有靶向cMet的ADC上市。进展最快的为艾伯维的Telisotuzumab Vedotin，目前处于临床Ⅲ期，通过可切割连接子将抗cMet单克隆抗体ABT-700与微管蛋白抑制剂MMAE连接，DAR＝3.1。2022年1月4日，FDA授予Telisotuzumab Vedotin突破性疗法认定(BTD)，用于非小细胞肺癌(NSCLC)。其余cMet ADC开发还处于较早临床阶段，布局企业包括恒瑞、荣昌生物、再生元、礼来等。

Trop2全称为Trophoblast Cell-Surface Antigen 2(人滋养细胞表面糖蛋白抗原2)，是一种跨膜蛋白，高表达于乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌等多种肿瘤，可促进肿瘤细胞增殖、侵袭、转移、扩散等过程，其高表达与肿瘤患者生存期缩短及不良预后密切相关。以Trop2为靶点的抗体治疗策略，如单抗药物、抗体偶联药物、双特异性抗体等多种形式的药物正处于研发中。2020年4月，FDA批准了首个靶向Trop2的抗体偶联药物SacituzumabGovitecan(Trodelvy)，其是由Trop2的人源化IgG1的单克隆抗体与化疗药物伊利替康的活性代谢物SN-38连接构成的抗体偶联药物。它能够通过与肿瘤细胞表面Trop2蛋白相结合，将化疗药物递送到肿瘤细胞内部。

虽然ADC疗效得到了广泛的验证，但仍需解决单克隆抗体体积大、实体瘤穿透率较低等阻碍因素。纳米抗体是从驼科动物血清中分离筛选得到的一种相对分子质量仅约15kDa的小尺寸抗体，仅含重链可变区(Variabledomain of heavy chain of heavy chainantibody，VHH)，为传统抗体的1/10左右，晶体结构为直径约2.5nm、长约4.2nm的橄榄球形。独特的分子结构使其具有良好的组织穿透性，有望为ADC带来更优异的疗效和安全性。

三特异性抗体药物偶联物是一个前沿性概念。目前布局的企业很少，均处于临床前研究阶段，理论上而言，三特异性抗体可更加特异性地靶向肿瘤细胞，增强细胞杀伤毒性，克服耐药性，并减少副作用。此外，三特异性抗体还可以促进靶点间的交联作用，促进抗体偶联药物的内吞，从而达到更好的治疗效果。目前暂无公开报道的靶向EpCAM、cMet和Trop2的三特异性抗体偶联药物。

发明内容

本申请公开了靶向EpCAM的抗体、靶向cMet的抗体与靶向Trop2的抗体联用，特别公开了同时靶向EpCAM、cMet和Trop2的三特异性抗体，其中，抗体部分可以为EpCAM、cMet和Trop2纳米抗体改造抗体，来源于羊驼。本申请还公开了同时靶向EpCAM、cMet和Trop2的定点偶联的三特异性抗体偶联药物，由靶向部分、细胞毒性药物和连接子组成。在一些实施方案中，本申请以抗有丝分裂剂单甲基奥利他汀E(MMAE，一种微管蛋白抑制剂)作为有毒载荷，通过溶酶体可裂解的二肽缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)将它连接到抗体的定点突变位点，从而获得抗体偶联药物。在一些实施方案中，本申请公开的三特异性抗体偶联药物Anti-EpCAM/cMet/Trop2-VC-MMAE(DAR≈4)可有效抑制EpCAM阳性、cMet阳性和Trop2弱阳性的HT-29结直肠癌细胞系荷瘤小鼠肿瘤的生长，表现出高效的抗肿瘤活性，且安全性良好。

在上述基础上，本申请的技术方案涉及以下几个方面。

1.三特异性抗体

在一个方面，本发明提供了特异性结合EpCAM、cMet和Trop2的三特异性抗体，其包含对EpCAM特异性的第一抗原结合结构域、对cMet特异性的第二抗原结合结构域和对Trop2特异性的第三抗原结合结构域。

EpCAM结合结构域

本发明的三特异性抗体所包含的对EpCAM特异性的第一抗原结合结构域可以为任何抗体形式。

在某些实施方案中，所述第一抗原结合结构域选自纳米抗体、全长抗体(例如IgG抗体)或其抗原结合片段(例如scFv、Fab、scFab)。

在某些实施方案中，所述第一抗原结合结构域为VHH，所述第二抗原结合结构域是VHH；其包含下述CDR1(互补决定区1)、CDR2(互补决定区2)和CDR3(互补决定区3)序列：

(a)CDR1，其具有：如SEQ ID NO:4所示序列，或与SEQ ID NO:4所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(b)CDR2，其具有：如SEQ ID NO:5所示的序列，或与SEQ ID NO:5所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；以及

(c)CDR3，其具有：如SEQ ID NO:6所示的序列，或与SEQ ID NO:6所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。

在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域包含：如SEQ ID NO:4所示的CDR1、如SEQ ID NO:5所示的CDR2、以及如SEQ ID NO:6所示的CDR3。

在一些实施方案中，所述的置换是保守置换。

在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:1或其变体所示的VHH序列；所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的)的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述置换是保守置换。

在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:1所示的VHH序列。

c-Met结合结构域

本发明的三特异性抗体所包含的对c-Met特异性的第二抗原结合结构域可以为任何抗体形式。

在某些实施方案中，所述第二抗原结合结构域选自纳米抗体、全长抗体(例如IgG抗体)或其抗原结合片段(例如scFv、Fab、scFab)。

在某些实施方案中，所述第二抗原结合结构域为VHH，所述第二抗原结合结构域是VHH；其包含下述CDR1(互补决定区1)、CDR2(互补决定区2)和CDR3(互补决定区3)序列：

(a)CDR1，其具有：如SEQ ID NO:7所示序列，或与SEQ ID NO:7所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(b)CDR2，其具有：如SEQ ID NO:8所示的序列，或与SEQ ID NO:8所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；以及

(c)CDR3，其具有：如SEQ ID NO:9所示的序列，或与SEQ ID NO:9所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。

在一些实施方案中，所述第二抗原结合结构域包含：如SEQ ID NO:7所示的CDR1、如SEQ ID NO:8所示的CDR2、以及如SEQ ID NO:9所示的CDR3。

在一些实施方案中，所述第二抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:2或其变体所示的VHH序列；所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的)的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述置换是保守置换。

在一些实施方案中，所述第二抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:2所示的VHH序列。

Trop2结合结构域

本发明的三特异性抗体所包含的对Trop2特异性的第三抗原结合结构域可以为任何抗体形式。

在某些实施方案中，所述第三抗原结合结构域选自纳米抗体、全长抗体(例如IgG抗体)或其抗原结合片段(例如scFv、Fab、scFab)。

在某些实施方案中，所述第三抗原结合结构域为VHH，其包含下述CDR1(互补决定区1)、CDR2(互补决定区2)和CDR3(互补决定区3)序列：

(a)CDR1，其具有：如SEQ ID NO:10所示序列，或与SEQ ID NO:10所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(b)CDR2，其具有：如SEQ ID NO:11所示的序列，或与SEQ ID NO:11所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；以及

(c)CDR3，其具有：如SEQ ID NO:12所示的序列，或与SEQ ID NO:12所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

在一些实施方案中，所述第三抗原结合结构域包含：如SEQ ID NO:10所示的CDR1、如SEQ ID NO:11所示的CDR2、以及如SEQ ID NO:12所示的CDR3。

在一些实施方案中，所述第三抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:3或其变体所示的VHH序列；所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的)的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述置换是保守置换。

在一些实施方案中，所述三抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:3所示的VHH序列。

本申请所述氨基酸序列可以使用Kabat、IMGT、Chothia或Abm编号系统定义。

三特异性抗体的结构

本领域技术人员应理解，本领域已知的三特异性抗体结构形式均可以用于本发明。作为示例，提供了以下三特异性纳米抗体，其中，所述第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域均为VHH。

在某些实施方案中，三特异性纳米抗体依次包含第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域。

在某些实施方案中，所述三特异性纳米抗体还包含免疫球蛋白Fc结构域。

在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域位于所述第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域之间，或者位于所述第一抗原结合结构域之后，或者位于所述第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域之间。

在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域任选地通过肽接头与所述第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域或第三抗原结合结构域的N端相连。

在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域任选地通过肽接头与所述第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域或第三抗原结合结构域的C端相连。

在某些实施方案中，所述三特异性纳米抗体从N端到C端依次包含：第二抗原结合结构域、第三抗原结合结构域、第一抗原结合结构域和免疫球蛋白Fc结构域。示例性的结构参见图1中的T1。

在某些实施方案中，所述三特异性纳米抗体从N端到C端依次包含：第一抗原结合结构域、第三抗原结合结构域、免疫球蛋白Fc结构域和第二抗原结合结构域。示例性的结构参见图1中的T3。

在某些实施方案中，所述三特异性纳米抗体从N端到C端依次包含：第一抗原结合结构域、免疫球蛋白Fc结构域、第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域。示例性的结构参见图1中的T6。

在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域是IgG的Fc结构域(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc结构域)。

在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域包含如SEQ ID NO:13所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个、4个或5个氨基酸置换、缺失或添加)的序列。

在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域发生突变。所述突变可以提供与治疗剂(例如，细胞毒性药物)结合的位点。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域包含S239和/或K290位置处的突变，所述突变例如包括S239C和/或K290C。

在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域按照Kabat EU索引编号。

本发明的三特异性抗体中，所述肽接头可以是刚性肽接头或柔性肽接头。

在某些实施方案中，所述肽接头由10至20个(例如，10-19个、10-18个、10至17个、10至16个、10至15个)氨基酸残基组成。

在某些实施方案中，所述接头为包含一个或多个甘氨酸和/或一个或多个丝氨酸的肽接头。

在某些实施方案中，所述肽接头为(G4S)n，n为不小于0的整数，例如为1、2、3或4。在某些实施方案中，所述肽接头为(GGGGS)₃。

在某些实施方案中，所述三特异性纳米抗体包含如SEQ ID NO:17、18或19所示的序列。此处所示序列在其N端不包含起始密码子(如ATG)编码的氨基酸(如甲硫氨酸(Met))。本领域技术人员理解，在通过基因工程制备蛋白的过程中，由于起始密码子的作用，所产生的多肽链第一位经常为起始密码子编码的氨基酸(如Met)。本发明的三特异性抗体不仅囊括在其N末端不包含起始密码子编码的氨基酸(如Met)的氨基酸序列，也囊括在其N末端包含起始密码子编码的氨基酸(如Met)的氨基酸序列。因此，在上述氨基酸序列的N端进一步包含起始密码子编码的氨基酸(如Met)的序列也在本发明的保护范围内。

在某些实施方案中，所述双特异性纳米抗体包含SEQ ID NO:17、18或19所示序列的变体，所述变体与SEQ ID NO:17、18或19相比差异仅在于一个或多个(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换)氨基酸残基的保守置换，或者与其所源自的抗体或其抗原结合片段具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且基本保留了其所源自的三特异性纳米抗体的生物学功能(例如特异性结合EpCAM、cMet和Trop2，中和EpCAM、cMet和Trop2的生物活性)。例如，在一些实施方案中，所述变体与其所源自的三特异性纳米抗体相比，可在第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域和/或第三抗原结合结构域的N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。

在一些实施方案中，所述三特异性抗体为二聚体，例如均二聚体或杂二聚体。

在一些实施方案中，所述三特异性抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^{- 7}M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的K_D与EpCAM结合。

在一些实施方案中，所述三特异性抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^{- 7}M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的K_D与c-Met结合。

在一些实施方案中，所述三特异性抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^{- 7}M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的K_D与Trop2结合。

本发明的三特异性抗体可以为具有任何抗体结构的单价或双价抗体。

2.多特异性抗体

另一方面，本申请提供了一种多特异性抗体，其包含本发明的三特异性抗体。为产生所述多特异性抗体，可以将本发明的三特异性抗体连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他方式)至一个或多个其他结合分子(例如另外的抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)。

在某些实施方案中，所述多特异性抗体特异性结合EpCAM、cMet和Trop2，并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标。

3.核酸、载体、宿主细胞和表达方法

在另一个方面，本申请提供一种分离的核酸分子，其包含编码所述三特异性抗体或多特异性抗体的多核苷酸序列。可以利用本领域已知的方法获得所述核酸，例如，分离自噬菌体展示文库、酵母展示文库、免疫动物、永生化的细胞(例如，小鼠B细胞杂交瘤细胞、EBV介导的永生化B细胞)或者化学合成。所述核酸分子可以针对用于表达的宿主细胞进行密码子优化。

在另一个方面，本申请提供包含所述核酸分子的载体。

在一些实施方案中，所述核酸分子被制备为重组核酸。在一些实施方案中，将所述核酸分子克隆入表达载体中。表达载体可以进一步包含额外的多核苷酸序列，例如调控序列和抗生素抗性基因。可使用本领域众所周知的技术制备包含所述核酸的所述重组核酸，例如化学合成、DNA重组技术(例如聚合酶链式反应(PCR)技术)等(参见Sambrook,J.,E.F.Fritsch,and T.Maniatis.(1989).Molecular cloning:a laboratory manual,2nded.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)。表达载体还可以包含编码多肽或蛋白的多核苷酸序列，所述多肽或蛋白可促进所表达抗体或抗原结合片段的检测和/或分离。这类多肽或蛋白可以包括但不限于亲和标签(例如生物素、聚组氨酸标签(His₆)或谷胱甘肽S-转移酶(GSH)标签)、包含蛋白酶切割位点的多肽和报告蛋白(例如荧光蛋白)。所述核酸分子可以存在于一种或多种载体中。在一些实施方案中，所述表达载体为DNA质粒，例如用于在细菌、酵母或哺乳动物细胞中表达的DNA质粒。在另一些实施方案中，所述表达载体为病毒载体。在其它实施方案中，表达载体为噬菌体载体或噬菌粒载体。

在另一个方面，本申请提供一种宿主细胞，其包含至少一个如上所述的核酸或载体。在一些实施方案中，所述宿主细胞用于表达所述三特异性抗体或多特异性抗体。宿主细胞的实例包括但不限于原核细胞(例如细菌，例如大肠杆菌)、真核细胞(例如酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞)。细菌(例如，大肠杆菌BL21(DE3))对于表达较小的抗原结合片段特别有利。适合于抗体表达的哺乳动物宿主细胞包括但不限于骨髓瘤细胞、HeLa细胞、HEK细胞(例如HEK 293细胞)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和其他适于表达抗体的哺乳动物细胞。

4.抗体的制备

本发明的抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过噬菌体表面展示技术、基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明抗体的DNA分子，将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得。

在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：

(1)用至少一种本文所述的核酸或表达载体转化宿主细胞；

(2)在合适的条件下培养转化的宿主细胞以允许所述核酸或表达载体表达，和

(3)从宿主细胞或培养基中分离和纯化所述三特异性抗体或多特异性抗体。

在一些实施方案中，宿主细胞还包含伴侣质粒，其可以帮助提高抗体或抗体片段的溶解性、稳定性和/或折叠。从宿主细胞中分离和纯化抗体的技术是本领域技术人员所熟知的。

5.缀合物

另一方面，本申请还提供了缀合物，其包含本发明的三特异性抗体或多特异性抗体以及偶联部分。

在某些实施方案中，所述靶向部分任选地通过接头与所述偶联部分缀合。

在某些实施方案中，所述偶联部分选自蛋白标签(protein tag)。这类蛋白标签是本领域熟知的，其实例包括但不限于His、Flag、GST、MBP、HA、Myc、GFP或生物素，并且本领域技术人员已知如何根据期望目的选择合适的蛋白标签(例如，纯化标签、检测标签或示踪标签)。在某些示例性实施方案中，本发明的三特异性抗体的C端连接有纯化标签。

在某些实施方案中，所述偶联部分选自可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物)、磁珠(例如，)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。在某些实施方案中，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。在某些实施方案中，可通过不同长度的接头(linker)将如上所述的可检测的标记连接至本发明的三特异性抗体，以降低潜在的位阻。

在某些实施方案中，所述偶联部分选自治疗剂，例如细胞毒性药物。

在某些实施方案中，所述偶联部分选自另外的生物活性多肽。

6.抗体偶联药物(ADC)

本申请进一步提供一种抗体偶联药物(ADC)，其包含：

靶向部分，选自前文任一项所述的三特异性抗体或多特异性抗体；

细胞毒性药物部分；以及

连接子，用于连接所述靶向部分和所述细胞毒性药物部分。

将细胞毒性药物与抗体上的二硫键进行偶联，或通过工程化突变半胱氨酸偶联技术与抗体进行位点特异性和稳定偶联。将抗体特定位点的氨基酸突变为半胱氨酸，与药物-连接体进行反应，可以实现定点偶联，获得均一程度高的偶联物，改善ADC药物的治疗指数。

在一些实施方案中，所述靶向部分通过半胱氨酸残基上的巯基与所述连接子连接。

在一些实施方案中，所述靶向部分通过VHH上半胱氨酸残基上的巯基与所述连接子连接。

在一些实施方案中，所述靶向部分通过铰链区中还原后的二硫键上半胱氨酸残基上的巯基与所述连接子连接。

在一些实施方案中，所述靶向部分通过Fc结构域半胱氨酸残基上的巯基与所述连接子连接。

在一些实施方案中，所述靶向部分通过Fc结构域239和/或290位的半胱氨酸残基上的巯基与所述连接子连接。

在一些实施方案中，所述细胞毒性药物选自微管蛋白抑制剂和DNA损伤药物。

在一些实施方案中，所述微管蛋白抑制剂选自奥瑞他汀类化合物(例如，MMAE、MMAF)、美登素类化合物(例如，美登素、美登醇、DM1、DM4)、紫杉烷类(例如，紫杉醇Taxol、多西紫杉醇Docetaxel、卡巴他赛Carbazitaxel)、长春花碱类(例如，长春花碱、长春新碱)、艾日布林和秋水仙碱。

在一些实施方案中，所述DNA损伤剂选自DNA烷化剂(卡奇霉素γ1l、N-乙酰-γ1I卡奇霉素、安曲霉素、PBD、杜卡霉素)、DNA拓扑异构酶抑制剂(例如，喜树碱类化合物(具体如，喜树碱、SN-38、Dxd、伊立替康、贝洛替康、拓扑替康、PNU-159682)、阿霉素、柔红霉素、依托泊苷、米托蒽醌)和鹅膏蕈碱。

在一些实施方案中，所述细胞毒性药物为MMAE。

在一些实施方案中，所述连接子为可切割或不可切割的连接子。

在一些实施方案中，所述可切割的连接子选自蛋白酶敏感性、pH敏感性和谷胱甘肽敏感性连接子。

在一些实施方案中，所述连接子选自MC(6-马来酰亚胺基己酰基)、MCC(马来酰亚胺基甲基环己烷-1-甲酸酯)、MP(马来酰亚胺基丙酰基)、Val-Cit(缬氨酸-瓜氨酸)、Val-Ala(缬氨酸-丙氨酸)、Ala-Phe(丙氨酸-苯丙氨酸)、PAB(对氨基苄氧羰基)、SPP(5-(琥珀酰亚胺基)-4-(吡啶-2-基硫基)戊酸酯)、6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-4-(吡啶-2-基硫基)己酸酯、6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-5-甲基-4-(吡啶-2-基硫基)己酸酯、SMCC(N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯)或SIAB(N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯)及其任意组合。

在一些实施方案中，所述连接子为MC-Val-Cit-PAB。

在一些实施方案中，所述多肽构建体每条肽链通过VHH、铰链区还原后二硫键中半胱氨酸残基或Fc结构域的半胱氨酸残基与0、1、2、3、4或5个下述结构连接：

在一些实施方案中，所述的抗体偶联药物选自：

其中，x＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

Ab为前文任一项所述的三特异性抗体。

在一些实施方案中，所述的抗体偶联药物为：

其中，x＝1、2、3、4、5或6；

Ab含有如SEQ ID NO:17、18或19所示的氨基酸序列或由其组成。

7.组合物

在另一个方面，本申请提供一种组合物，其包括一个或多个前文任一项所述的抗体偶联药物或由其组成。

在一些实施方案中，所述组合物的DAR值为1-10，例如1-1.5、1-2、1-2.5、1-3、1-3.5、1-4、1-4.5、1-5、1-5.5、1-6、1-6.5、1-7、1-7.5、1-8、1-8.5、1-9、1-9.5、1-10、1.5-2、1.5-2.5、1.5-3、1.5-3.5、1.5-4、1.5-4.5、1.5-5、1.5-5.5、1.5-6、1.5-6.5、1.5-7、1.5-7.5、1.5-8、1.5-8.5、1.5-9、1.5-9.5、1.5-10、2-2.5、2-3、2-3.5、2-4、2-4.5、2-5、2-5.5、2-6、2-6.5、2-7、2-7.5、2-8、2-8.5、2-9、2-9.5、2-10、2.5-3、2.5-3.5、2.5-4、2.5-4.5、2.5-5、2.5-5.5、2.5-6、2.5-6.5、2.5-7、2.5-7.5、2.5-8、2.5-8.5、2.5-9、2.5-9.5、2.5-10、3-3.5、3-4、3-4.5、3-5、3-5.5、3-6、3-6.5、3-7、3-7.5、3-8、3-8.5、3-9、3-9.5、3-10、3.5-4、3.5-4.5、3.5-5、3.5-5.5、3.5-6、3.5-6.5、3.5-7、3.5-7.5、3.5-8、3.5-8.5、3.5-9、3.5-9.5、3.5-10、4-4.5、4-5、4-5.5、4-6、4.5-5、4.5-5.5、4.5-6、4.5-6.5、4.5-7、4.5-7.5、4.5-8、4.5-8.5、4.5-9、4.5-9.5、4.5-10、5-5.5、5-6、5-6.5、5-7、5-7.5、5-8、5-8.5、5-9、5-9.5、5-10、5.5-6、5.5-6.5、5.5-7、5.5-7.5、5.5-8、5.5-8.5、5.5-9、5.5-9.5、5.5-10、6-6.5、6-7、6-7.5、6-8、6-8.5、6-9、6-9.5、6-10、6.5-7、6.5-7.5、6.5-8、6.5-8.5、6.5-9、6.5-9.5、6.5-10、7-7.5、7-8、7-8.5、7-9、7-9.5、7-10、7.5-8、7.5-8.5、7.5-9、7.5-9.5、7.5-10、8-8.5、8-9、8-9.5、8-10、8.5-9、8.5-9.5、8.5-10、9-9.5、9-10、9.5-10。

在另一个方面，本申请提供一种组合物，其包括一个或多个下述的抗体偶联药物或由其组成：

其中，x＝1、2、3、4、5、6、7或8；

Ab含有如SEQ ID NO:17、18或19所示的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，所述组合物的DAR值为1-8，例如1-1.5、1-2、1-2.5、1-3、1-3.5、1-4、1-4.5、1-5、1-5.5、1-6、1-6.5、1-7、1-7.5、1-8、1.5-2、1.5-2.5、1.5-3、1.5-3.5、1.5-4、1.5-4.5、1.5-5、1.5-5.5、1.5-6、1.5-6.5、1.5-7、1.5-7.5、1.5-8、2-2.5、2-3、2-3.5、2-4、2-4.5、2-5、2-5.5、2-6、2-6.5、2-7、2-7.5、2-8、2.5-3、2.5-3.5、2.5-4、2.5-4.5、2.5-5、2.5-5.5、2.5-6、2.5-6.5、2.5-7、2.5-7.5、2.5-8、3-3.5、3-4、3-4.5、3-5、3-5.5、3-6、3-6.5、3-7、3-7.5、3-8、3.5-4、3.5-4.5、3.5-5、3.5-5.5、3.5-6、3.5-6.5、3.5-7、3.5-7.5、3.5-8、4-4.5、4-5、4-5.5、4-6、4-6.5、4-7、4-7.5、4-8、4.5-5、4.5-5.5、4.5-6、4.5-6.5、4.5-7、4.5-7.5、4.5-8、5-5.5、5-6、5-6.5、5-7、5-7.5、5-8、5.5-6、5.5-6.5、5.5-7、5.5-7.5、5.5-8、6-6.5、6-7、6-7.5、6-8、6.5-7、6.5-7.5、6.5-8、7-7.5、7-8或7.5-8。

在一些实施方案中，所述组合物的DAR值为1-5，例如3.5-4.5，再例如3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4或4.5。

8.抗体组合物

本申请还提供了一种抗体组合物，其包含特异性结合EpCAM的第一抗体、特异性结合c-Met的第二抗体和特异性结合Trop2的第三抗体。

特异性结合EpCAM的抗体

本发明的抗体组合物所包含的特异性结合EpCAM的第一抗体可以为任何抗体形式，包括但不限于单域抗体、单链抗体、抗体Fab、抗体全长蛋白、抗原结合片段、双特异性抗体、多特异性抗体、双/多价单域抗体、双/多价单链抗体和双/多价抗体Fab中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述第一抗体为特异性结合EpCAM的纳米抗体或其抗原结合片段，或包含所述的纳米抗体或其抗原结合片段的多肽构建体。

在某些实施方案中，所述特异性结合EpCAM的纳米抗体或其抗原结合片段包含下述CDR1(互补决定区1)、CDR2(互补决定区2)和CDR3(互补决定区3)序列：

(a)CDR1，其具有：如SEQ ID NO:4所示序列，或与SEQ ID NO:4所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(b)CDR2，其具有：如SEQ ID NO:5所示的序列，或与SEQ ID NO:5所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；以及

(c)CDR3，其具有：如SEQ ID NO:6所示的序列，或与SEQ ID NO:6所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。

在一些实施方案中，所述特异性结合EpCAM的纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:4所示的CDR1、如SEQ ID NO:5所示的CDR2、以及如SEQ ID NO:6所示的CDR3。

在一些实施方案中，所述特异性结合EpCAM的纳米抗体或其抗原结合片段包含包含如SEQ ID NO:1或其变体所示的VHH序列；所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的)的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述置换是保守置换。

在一些实施方案中，所述第一抗体包含如SEQ ID NO:1所示的VHH序列。

特异性结合c-Met的抗体

本发明的抗体组合物所包含的特异性结合c-Met的第二抗体可以为任何抗体形式，包括但不限于单域抗体、单链抗体、抗体Fab、抗体全长蛋白、抗原结合片段、双特异性抗体、多特异性抗体、双/多价单域抗体、双/多价单链抗体和双/多价抗体Fab中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述第二抗体为特异性结合c-Met的纳米抗体或其抗原结合片段，或包含所述的纳米抗体或其抗原结合片段的多肽构建体。

在某些实施方案中，所述特异性结合c-Met的纳米抗体或其抗原结合片段包含下述CDR1(互补决定区1)、CDR2(互补决定区2)和CDR3(互补决定区3)序列：

(a)CDR1，其具有：如SEQ ID NO:7所示序列，或与SEQ ID NO:7所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(b)CDR2，其具有：如SEQ ID NO:8所示的序列，或与SEQ ID NO:8所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；以及

(c)CDR3，其具有：如SEQ ID NO:9所示的序列，或与SEQ ID NO:9所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。

在一些实施方案中，所述特异性结合c-Met的纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:7所示的CDR1、如SEQ ID NO:8所示的CDR2、以及如SEQ ID NO:9所示的CDR3。

在一些实施方案中，所述特异性结合c-Met的纳米抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:2或其变体所示的VHH序列；所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的)的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述置换是保守置换。

在一些实施方案中，所述特异性结合c-Met的纳米抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:2所示的VHH序列。

特异性结合Trop2的抗体

本发明的抗体组合物所包含的特异性结合Trop2的第三抗体可以为任何抗体形式，包括但不限于单域抗体、单链抗体、抗体Fab、抗体全长蛋白、抗原结合片段、双特异性抗体、多特异性抗体、双/多价单域抗体、双/多价单链抗体和双/多价抗体Fab中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述第三抗体为特异性结合Trop2的纳米抗体或其抗原结合片段，或包含所述的纳米抗体或其抗原结合片段的多肽构建体。

在一些实施方案中，所述特异性结合Trop2的纳米抗体或其抗原结合片段包含下述CDR1(互补决定区1)、CDR2(互补决定区2)和CDR3(互补决定区3)序列：

(a)CDR1，其具有：如SEQ ID NO:10所示序列，或与SEQ ID NO:10所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(b)CDR2，其具有：如SEQ ID NO:11所示的序列，或与SEQ ID NO:11所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；以及

(c)CDR3，其具有：如SEQ ID NO:12所示的序列，或与SEQ ID NO:12所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。

在一些实施方案中，所述特异性结合Trop2的纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:10所示的CDR1、如SEQ ID NO:11所示的CDR2、以及如SEQ ID NO:12所示的CDR3。

在一些实施方案中，所述特异性结合Trop2的纳米抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:3或其变体所示的VHH序列；所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的)的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加；优选地，所述置换是保守置换。

在一些实施方案中，所述第一抗体包含如SEQ ID NO:3所示的VHH序列。

多肽构建体

在一些实施方案中，所述第一抗体为包含特异性结合EpCAM的纳米抗体或其抗原结合片段的多肽构建体。在一些实施方案中，所述第二抗体为包含特异性结合-Met的纳米抗体或其抗原结合片段的多肽构建体。在一些实施方案中，所述第三抗体为包含特异性结合Trop2的纳米抗体或其抗原结合片段的多肽构建体。

在一些实施方案中，所述多肽构建体包含免疫球蛋白Fc结构域。

在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域直接或通过肽接头连接至所述纳米抗体或其抗原结合片段的N端或C端。

在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域直接或通过肽接头连接至所述纳米抗体或其抗原结合片段的C端。

在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域包含SEQ ID NO：13所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个、4个或5个氨基酸置换、缺失或添加)的序列。

在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域包含或不包含S239和/或K290位置处的突变，所述突变例如包括S239C和/或K290C。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域按照Kabat EU索引编号。

在一些实施方案中，所述多肽构建体含有如SEQ ID NO:14、15或16所示的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，所述多肽构建体为二聚体。

在一些实施方案中，所述多肽构建体包含但不局限于单域抗体、单链抗体、抗体Fab、抗体全长蛋白、抗原结合片段、双特异性抗体、多特异性抗体、双/多价单域抗体、双/多价单链抗体和双/多价抗体Fab中的一种或多种。

9.药物组合物

在另一个方面，本申请提供一种药物组合物，其包括前文任一项所述的三特异性抗体、多特异性抗体、核酸分子、载体、宿主细胞、缀合物、抗体偶联药物、组合物或抗体组合物，以及任选的载体或赋型剂。

所述赋型剂可以是Handbook of Pharmaceutical Excipients，AmericanPharmaceutical Association(1986)中描述的赋形剂。适宜的赋形剂的非限制性实例包括缓冲剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、螯合剂、表面活性剂、调味剂、甜味剂、着色剂。

在一些实施方案中，合适的缓冲剂包括碳酸氢钙、碳酸钙碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化镁、乳酸镁、葡萄糖酸镁、氢氧化铝、柠檬酸钠、酒石酸钠、乙酸钠、碳酸钠、多磷酸钠、多磷酸钾、焦磷酸钠、焦磷酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸三钠、磷酸三钾、偏磷酸钾、氧化镁、氢氧化镁、碳酸镁、硅酸镁、乙酸钙、甘油磷酸钙、氯化钙、氢氧化钙和其它钙盐等或其组合。

在一些实施方案中，合适的防腐剂包括抗氧化剂，如α-生育酚和抗坏血酸盐，以及抗微生物剂，如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇和苯酚。抗氧化剂可进一步包括EDTA、柠檬酸、抗坏血酸、丁羟甲苯(BHT)、丁羟茴醚(BHA)、亚硫酸钠、对氨基苯甲酸、谷胱甘肽、没食子酸丙酯、半胱氨酸、甲硫氨酸、乙醇和N-乙酰基半胱氨酸等。

在一些实施方案中，合适的粘合剂包括淀粉，如马铃薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉；糖，如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖、麦芽糊精；天然和合成树胶；明胶；纤维素衍生物，如微晶纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)；聚乙二醇(PEG)；蜡；碳酸钙；磷酸钙；醇，如山梨糖醇、木糖醇、甘露糖醇和水，或它们的组合。

在一些实施方案中，合适的润滑剂包括硬脂酸金属盐(如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸铝)、脂肪酸酯(如硬脂酰富马酸钠)、脂肪酸(如硬脂酸)、脂肪醇、山萮酸甘油酯、矿物油、石蜡、氢化植物油、亮氨酸、聚乙二醇(PEG)、十二烷基硫酸金属盐(如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁)、氯化钠、苯甲酸钠、乙酸钠和滑石粉，或它们的组合。

在一些实施方案中，崩解剂可以是非泡腾崩解剂。合适的非泡腾崩解剂包括淀粉，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、预胶化和改性淀粉，甜味剂，粘土，如膨润土，微晶纤维素，藻酸盐，羟基乙酸淀粉钠，树胶，如琼脂、瓜尔脂、刺槐豆脂、刺梧桐胶、果胶(pecitin)和黄蓍胶。在一些实施方案中，崩解剂可以是泡腾崩解剂。合适的泡腾崩解剂包括与柠檬酸组合的碳酸氢钠和与酒石酸组合的碳酸氢钠。

在一些实施方案中，合适的调味剂可以选自肉桂油；冬青油；薄荷油；三叶草油；干草油；茴香油；桉树油；香草；柑橘油，如柠檬油、橙油、葡萄和葡萄柚油；和水果香精，包括苹果、桃、梨、草莓、覆盆子、樱桃、李子、菠萝和杏香精。

在一些实施方案中，合适的甜味剂包括葡萄糖(玉米糖浆)、右旋糖、转化糖、果糖及其混合物(当不用作载体时)；糖精及其各种盐，如钠盐；二肽甜味剂，如阿斯巴甜；二氢查耳酮化合物，甘草甜素；甜叶菊(Stevia Rebaudiana)(甜菊苷)；蔗糖的氯代衍生物，如三氯蔗糖；和糖醇，如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇(sylitol)等。

在一些实施方案中，合适的着色剂包括食品、药物和化妆品颜料(FD&C)，药物和化妆品颜料(D&C)，以及外部药物和化妆品颜料(Ext.D&C)。

在一些实施方案中，合适的螯合剂包括乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸(EDTA)；EDTA的二钠盐、三钠盐、四钠盐、二钾盐、三钾盐、二锂盐和二铵盐；EDTA的钡、钙、钴、铜、镝、铕、铁、铟、镧、镁、锰、镍、钐、锶或锌螯合物；反式-1，2-二氨基环己烷-N，N，N′，N′-四乙酸一水合物；N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸；1，3-二氨基-2-羟基丙烷-N，N，N′，N′-四乙酸；1，3-二氨基丙烷-N，N，N′，N′-四乙酸；乙二胺-N，N′-二乙酸；乙二胺-N，N′-二丙酸二盐酸盐；乙二胺-N，N′-双(亚甲基膦酸)半水合物；N-(2-羟乙基)乙二胺-N，N′，N′-三乙酸；乙二胺-N，N，N′，N′-四(亚甲基膦酸)；O，O′-双(2-氨乙基)乙二醇-N，N，N′，N′-四乙酸；N，N-双(2-羟基苄基)乙二胺-N，N-二乙酸；1，6-己二胺-N，N，N′，N′-四乙酸；N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸；亚氨基二乙酸；1，2-二氨基丙烷-N，N，N′，N′-四乙酸；次氮基三乙酸；次氮基三丙酸；次氮基三(亚甲基磷酸)的三钠盐；7，19，30-三氧杂-1，4，10，13，16，22，27，33-八氮杂双环[11，11，11]三十五烷六氢溴化物；或三亚乙基四胺-N，N，N′，N″，N″′，N″′-六乙酸等。

在一些实施方案中，合适的稀释剂包括水、甘油、甲醇、乙醇和其它生物相容性稀释剂。

在一些实施方案中，合适的表面活性剂包括聚山梨醇酯、月桂基硫酸钠、硬脂酰富马酸钠、聚氧乙烯烷基醚、失水山梨醇脂肪酸酯、聚乙二醇(PEG)、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、脂肪酸的糖酯、脂肪酸的甘油酯或其组合等。

本文所述药物组合物可以被配制成多种制剂形式，并通过多种不同方式施用，例如口服、直肠或肠胃外施用。本文所用的术语“肠胃外”可以包括动脉内、心内、脑室内、真皮内、十二指肠内、髓内、肌肉内、骨内、腹膜内、鞘内、静脉内、玻璃体内、硬膜外、皮下、吸入、透皮、经粘膜、舌下、颊部和局部(包括表皮、真皮、灌肠剂、滴眼液、滴耳液、鼻内、阴道)施用。在一些示例性实施方案中，给药途径可以是通过注射，如肌肉内、静脉内、皮下或腹膜内注射。用于口服的制剂可以包括胶囊、片剂、囊片、丸剂、糖锭剂、锭剂、粉末和颗粒剂等。

10.制药用途

在一个方面，本申请提供本文所述的三特异性抗体、多特异性抗体、核酸分子、载体、宿主细胞、缀合物、抗体偶联药物、组合物、抗体组合物或药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于在受试者中预防和/或治疗与EpCAM、c-Met和/或Trop2有关的疾病。

在另一个方面，本申请提供预防和/或治疗与EpCAM、c-Met和/或Trop2有关的疾病，包括给有此需要的受试者施用有效量的本文所述的三特异性抗体、多特异性抗体、核酸分子、载体、宿主细胞、缀合物、抗体偶联药物、组合物、抗体组合物或药物组合物。

在一些实施方案中，所述与EpCAM、c-Met和/或Trop2有关的疾病为肿瘤，例如与EpCAM、c-Met和/或Trop2有关阳性的肿瘤。在一些实施方案中，所述肿瘤选自结直肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌(例如，三阴乳腺癌)、肺癌、口腔鳞癌、卵巢癌(例如卵巢上皮癌)、宫颈癌和膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌和视网膜母细胞瘤。

在一些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人；

在一些实施方案中，所述三特异性抗体、多特异性抗体、核酸分子、载体、宿主细胞、缀合物、抗体偶联药物、组合物、抗体组合物或药物组合物单独使用，或与另外的药学活性剂联合使用。

11.检测用途

另一方面，提供了本发明的三特异性抗体、缀合物或抗体组合物在制备检测试剂中的用途，所述检测试剂用于检测EpCAM、c-Met和/或Trop2在样品中的存在或其水平或者用于诊断受试者是否患有与EpCAM、c-Met和/或Trop2有关的疾病。

在某些实施方案中，用于制备检测试剂的缀合物包含本发明的三特异性抗体以及可检测的标记。

在某些实施方案中，用于制备检测试剂的三特异性抗体带有可检测的标记。

在某些实施方案中，用于制备检测试剂的三特异性抗体不带有可检测的标记。在此类实施方案中，所述检测试剂可以进一步包含能够检测本发明的三特异性抗体的其他试剂(如第二抗体)。

另一方面，本申请提供了检测EpCAM、c-Met和/或Trop2在样品中的存在或其含量的方法，其包括使用本发明的三特异性抗体、缀合物或抗体组合物。

在某些实施方案中，所述方法是免疫学检测，例如免疫印迹法、酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。

在某些实施方案中，用于所述方法的缀合物包含本发明的三特异性抗体以及可检测的标记。

在某些实施方案中，用于所述方法的三特异性抗体带有可检测的标记。

在某些实施方案中，用于所述方法的三特异性抗体不带有可检测的标记。因此，所述方法还可以包括使用带有可检测的标记的其他试剂(如第二抗体)来检测本发明的三特异性抗体。

在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：

(1)将所述样品与本发明的三特异性抗体、缀合物或抗体组合物接触；

(2)检测所述三特异性抗体、缀合物或抗体组合物与抗原之间复合物的形成或检测所述复合物的量。

所述复合物的形成表明存在抗原或表达抗原的细胞；

其中，所述抗原选自EpCAM、c-Met和Trop2。

所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。

在某些实施方案中，所述方法用于诊断受试者是否患有与EpCAM、c-Met和/或Trop2有关的疾病。在此类实施方案中，所述方法还可以包括：将所述EpCAM、c-Met和/或Trop2在来自所述受试者的样品中的量与参考值进行比较的步骤。所述参考值可以是EpCAM、c-Met和/或Trop2在来自已知不具有与EpCAM、与c-Met和/或与Trop2有关的疾病的受试者(例如健康对照)的样品中的水平(也称作“阴性参考值”)。例如，如果EpCAM、c-Met和/或Trop2在来自所述受试者的样品中的量相对于阴性参考值升高时，则指示所述受试者患有与EpCAM、c-Met和/或Trop2有关的疾病。

在某些实施方案中，所述与EpCAM有关的疾病以EpCAM表达升高和/或过度的EpCAM活性为特征。在某些实施方案中，所述与EpCAM有关的疾病为肿瘤，包括但不限于结直肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌(例如，三阴乳腺癌)、肺癌、口腔鳞癌、卵巢癌(例如卵巢上皮癌)、宫颈癌和膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌和视网膜母细胞瘤。

在某些实施方案中，所述与c-MET有关的疾病以c-MET表达升高和/或过度的c-MET活性为特征。在某些实施方案中，所述与c-MET有关的疾病为肿瘤，包括但不限于结直肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌(例如，三阴乳腺癌)、肺癌、口腔鳞癌、卵巢癌(例如卵巢上皮癌)、宫颈癌和膀胱癌。

在某些实施方案中，所述与Trop2有关的疾病以Trop2表达升高和/或过度的Trop2活性为特征。在某些实施方案中，所述与Trop2有关的疾病为肿瘤，包括但不限于结直肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌(例如，三阴乳腺癌)、肺癌、口腔鳞癌、卵巢癌(例如卵巢上皮癌)、宫颈癌和膀胱癌。

在某些实施方案中，所述样品可以选自尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的肿瘤组织、活体组织切片或细针抽吸组织)、组织学制备物等。

术语定义

在本文中，除非另有说明，否则所使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、细胞培养、生物化学、细胞生物学等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所述使用的，单数形式的“一种”、“一个”也意欲包括复数形式，除非上下文另有明确指明。此外，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或其变体是开放性的，不是排他性或穷举性。

如本文中所使用的，术语“EpCAM”全称为Epithelial cell adhesion molecule(上皮细胞粘附分子)，也叫CD326，TACSTD1，GA733-2，KSA，CO17-1A等，是一种保守的I型跨膜糖蛋白，大小为35kDa。编码人EpCAM的基因位于2号染色体上，人EpCAM是一种由314个氨基酸组成的多肽，由一个疏水性前导肽，242个氨基酸的大细胞外结构域(N端)、23个氨基酸的单跨跨膜结构域和26个氨基酸的短细胞质结构域(C端)组成。EpCAM的氨基酸序列可参见NCBI Gene ID:NP_002345.2。如本文中所述使用的，术语“抗体”和“单克隆抗体”是指通常由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。每条链都有可变区(variable region)，分别称为重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。VH和VL一起负责结合抗体识别的抗原。哺乳动物免疫球蛋白有五种主要的重链类别(或同种型)，它们决定了抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在哺乳动物中未发现的抗体同种型包括IgX、IgY、IgW和IgNAR。IgY是鸟类和爬行动物产生的一级抗体，在功能上与哺乳动物IgG和IgE相似。IgW和IgNAR抗体由软骨鱼类产生，而IgX抗体存在于两栖动物中。

如本文中所使用的，术语“c-Met”全称为cellular-mesenchymal epithelialtransition factor(细胞间质上皮转换因子)，为受体酪氨酸激酶家族成员。c-Met是位于7号染色体带7q21eq31上的原癌基因，最初在体内翻译成一条单链前体蛋白，经翻译后修饰而成为由二硫键连接的三维结构。成熟的c-MET分子由一条分子量为50kDa的胞外α链及140kDa的跨膜β链组成。其中，氨基酸序列可参见例如NCBI Gene ID：NP_000236.2。

如本文中所使用的，术语“Trop2”全称为Trophoblast Cell-Surface Antigen 2(人滋养细胞表面糖蛋白抗原2)，是一种跨膜蛋白。Trop-2由位于1号染色体上的TACSTD2基因编码，由323个氨基酸构成。Trop-2蛋白结构包括一个疏水性前导肽，一个细胞外结构域，一个跨膜结构域和一个胞质尾区。Trop2的序列是本领域技术人员公知的，其中，氨基酸序列可参见例如NCBI Gene ID:NP_002344.2。

抗体可变区包含框架区(framework region,FR)和高变区(hypervariableregions,HVR)，称为“互补决定区(complementaritydeterminingregion，CDR)”。所述CDR主要负责与抗原的表位结合。VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。

如本文中所使用的，术语“纳米抗体(nanobody)”、“单域抗体(single-domainantibody)”“VHH抗体”或“骆驼抗体”是指不存在另外抗体结构域，并且具有能够特异性结合抗原或抗原表位的单域(可变区)的抗体。术语“纳米抗体(nanobody)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，通常来源于重链抗体(例如骆驼科动物抗体或鲨鱼抗体)的可变区。典型地，纳米抗体由4个构架区和3个互补性决定区组成，具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的结构。纳米抗体可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。纳米抗体也称为单域抗体(single-domain antibody,sdAb)，两者可互换使用。

如本文中所使用的，术语“三特异性抗体”是指对三种不同抗原(或表位)具有结合特异性的抗体。三特异性抗体包含对不同抗原(或表位)具有结合特异性的三种抗原结合结构域，从而能够结合三个不同的结合位点和/或靶分子。在一些情况下，不同抗原结合结构域通过肽接头连接。术语“三特异性纳米抗体”是指由三个纳米抗体形成的三特异性抗体。

术语“多特异性抗体”是指对至少两种(例如两种、三种或四种)不同抗原(或表位)具有结合特异性的抗体。多特异性抗体包含对不同抗原(或表位)具有结合特异性的多个抗原结合结构域，从而能够结合至少两个不同的结合位点和/或靶分子。在一些情况下，各个抗原结合结构域通过肽接头连接。

如本文中所使用的，术语“Fc区”或“Fc结构域”是指包含CH2及CH3的重链恒定区的部分。在一些实施方案中，Fc区包含铰链、CH2及CH3。在一些实施方案中，当Fc区包含铰链时铰链介导两个含Fc的多肽间的二聚。Fc区可为本文所论述的任何抗体重链恒定区同型。在一些实施方案中，Fc区为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”是指由淋巴细胞单个克隆或由单个抗体的编码序列转染的细胞产生的抗体。可以通过本领域技术人员已知的方法产生单克隆抗体。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。

如本文中所使用的，术语“保守变体”是指一种含有保守氨基酸取代的蛋白质，该取代基本上不会影响或降低蛋白质的亲和力。例如，特异性结合EpCAM的纳米抗体或多肽构建体可包括至多1个、至多2个、至多5个、至多10个，或至多15个保守置换并且特异性结合EpCAM的多肽。功能相似氨基酸的保守氨基酸置换是本领域普通技术人员熟知的。以下六组被认为是彼此互为保守置换的氨基酸的实例：

1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；和

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

如本文中所使用的，氨基酸残基缩写如下:丙氨酸(Ala；A)，天冬酰胺(Asn；N)，天冬氨酸(Asp；D)，精氨酸(Arg；R)，半胱氨酸(Cys；C)，谷氨酸(Glu；E)，谷氨酰胺(Gln；Q)，甘氨酸(Gly；G)，组氨酸(His；H)，异亮氨酸(Ile；I)，亮氨酸(Leu；L)，赖氨酸(Lys；K)，甲硫氨酸(Met；M)，苯丙氨酸(Phe；F)，脯氨酸(Pro；P)，丝氨酸(Ser；S)，苏氨酸(Thr；T)，色氨酸(Trp；W)，酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。

如本文中所使用的，术语“同一性”指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子(即结合分子与靶分子)之间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。两分子之间的结合亲和力可用K_D值描述。K_D值是指由kd(特定的结合分子-靶分子相互作用的解离速率；亦称为koff)与ka(特定结合分子-靶分子相互作用的缔合速率；亦称为kon)之比得到的解离常数，或者指表示为摩尔浓度(M)的kd/ka。K_D值越小，两分子结合越紧密，亲和力越高。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的K_D结合该抗原。K_D值可通过本领域熟知的方法确定，例如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定。

如本文中所使用的，术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”指包含至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物的寡聚体或聚合物，通常可以包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。

如本文中所使用的，术语“分离的”是指物质(例如核酸分子或多肽)与其存在的来源或环境是分离的，即基本上不包含其他任何成分。

如本文中所使用的，术语“载体”是用于将外源核酸导入宿主细胞的媒介，当载体转化入适当的宿主细胞时，外源核酸得以扩增或表达。载体通常保持游离，但是可以设计为使基因或其部分整合入基因组的染色体。在本文中，载体的定义涵盖质粒、线性化质粒、病毒载体、粘粒、噬菌体载体、噬菌粒、人工染色体(例如，酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体)等。

如本文中所使用的，术语“表达载体”指能够表达DNA的载体，所述DNA与能够影响DNA表达的调控序列(如启动子、核糖体结合位点)可操作地连接。调控序列可以包含启动子和终止子序列，并且任选地可以包含复制起点、选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体可以是质粒、噬菌体载体、重组病毒或其他载体，当引入适当的宿主细胞时，导致克隆DNA的表达。适当的表达载体是本领域技术人员公知的，并且包含在真核细胞和/或原核细胞中可复制的表达载体以及保持游离的表达载体或者整合入宿主细胞基因组的表达载体。

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是用于接受、维持、复制或扩增载体的细胞。宿主细胞还可以用来表达核酸或载体所编码的多肽。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。

如本文中所使用的，术语“接触”是指直接进行物理缔合；包括固体和液体两种形式。

如本文中所使用的，术语“细胞毒性药物”是指能够杀死细胞的任何药物或化合物。“细胞毒性”是指分子对预期靶向细胞的毒性，而不是对生物体其余部分的细胞。相比之下，术语“毒性”是指分子对除该预期靶向细胞以外的其它细胞的毒性。

如本文中所使用的，术语“受试者”、“患者”或“个体”包括哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物可以是哺乳纲的任何成员，包括但不限于人；非人灵长类动物，如黑猩猩、猿或其它猴科动物；农畜，如牛、马、绵羊、山羊、猪；家养动物，如兔、狗(或犬)、猫；实验动物，包括啮齿动物，如大鼠、小鼠和豚鼠；等等。非哺乳动物可以包括鸟、鱼等。在一些实施方案中，受试者可以是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者可以是人。在一些情况下，人可以是成年人。在一些情况下，人可以是儿童。在一些情况下，人可以是0-17岁。在一些情况下，人可以是18-130岁。在一些情况下，受试者可以是男性。在一些情况下，受试者可以是女性。在一些情况下，受试者被诊断为或者被怀疑患有某种疾病。在一些情况下，所述疾病是癌症。所述受试者可以是患者，也可以是个体。在一些情况下，受试者、患者或个体可以互换使用。

如本文中所使用的，术语“治疗”、“处理”、“改善”或“减轻”包括缓解或减轻疾病的症状，抑制疾病，例如阻止疾病的发展，缓解疾病，使疾病消退，缓解由疾病引起的症状，或者停止疾病的症状。术语“治疗”、“处理”、“改善”或“减轻”可以进一步包括获得治疗益处。治疗益处可指所治疗的疾病的根除。另外，治疗性益处也可如下实现：根除与所治疗疾病相关的一种或多种生理学症状，使受试者获得可以观察到的改善，尽管在一些实施方案中，该受试者可能仍受到该潜在疾病的折磨。

如本文中所使用的，术语“有效量”、“治疗有效量”指所施用的药物的足够量，该量将至少部分地缓解所治疗的疾病的症状。可调整给药方案以提供最佳所需响应。例如，可单次推注，也可随时间给药数个分剂量，或根据治疗情况按比例减少或增加剂量。要注意，剂量值可随要减轻的疾病的类型及严重性而变化，且可包括单次或多次剂量。要进一步理解，对于任何特定个体，具体的给药方案应根据个体需要及药物说明书或临床医师专业判断来随时间调整。一般而言，有效剂量在每日每kg体重约0.0001至约50mg，例如约0.01至约10mg/kg/日(单次或分次给药)。对70kg的人而言，这会合计为约0.007mg/日至约3500mg/日，例如约0.7mg/日至约700mg/日。在一些情况下，不高于前述范围的下限的剂量水平可以是足够的，而在其它情况下，仍可在不引起任何有害副作用的情况下采用较大剂量，条件是首先将所述较大剂量分成数个较小剂量以在一整天中给药。

发明的有益效果

本申请提供了靶向EpCAM的抗体、靶向cMet的抗体与靶向Trop2的抗体联用的方案，特别提供了同时靶向EpCAM、cMet和Trop2的三特异性抗体以及抗体偶联药物，以及含有它们的组合物及用途。所述抗体偶联药物可以对EpCAM、cMet和Trop2蛋白具有较好的结合活性，对于EpCAM阳性、cMet阳性和/或Trop2阳性的肿瘤表现出较好的靶向性以及抑制活性，且安全性良好。

附图说明

图1示例性地显示了三抗的三种代表性结构。

图2显示了用SDS-PAGE鉴定Anti-cMet/Trop2/EpCAM TsAb(T1)、Anti-EpCAM/Trop2/cMet TsAb(T3)、Anti-EpCAM/cMet/Trop2 TsAb(T6)的条带大小(1为非还原，2为还原)。

图3示例性地显示了一个ADC(Anti-EpCAM/cMet/Trop2(T6)-VC-MMAE)的结构。

图4显示了用疏水相互作用色谱法(HIC)检测Anti-EpCAM/cMet/Trop2(T6)-VC-MMAE的DAR值。

图5显示了用ELISA法检测Anti-cMet/Trop2/EpCAM TsAb(T1)、Anti-EpCAM/Trop2/cMet TsAb(T3)、Anti-EpCAM/cMet/Trop2 TsAb(T6)与抗原EpCAM的结合活性的检测结果。

图6显示了用ELISA法检测Anti-cMet/Trop2/EpCAM TsAb(T1)、Anti-EpCAM/Trop2/cMet TsAb(T3)、Anti-EpCAM/cMet/Trop2 TsAb(T6)与抗原cMet的结合活性的检测结果。

图7显示了用ELISA法检测Anti-cMet/Trop2/EpCAM TsAb(T1)、Anti-EpCAM/Trop2/cMet TsAb(T3)、Anti-EpCAM/cMet/Trop2 TsAb(T6)与抗原Trop2的结合活性的检测结果。

图8显示了用流式细胞术检测Anti-EpCAM/cMet/Trop2 TsAb(T6)及亲本抗体在胰腺癌细胞系BxPC3中的结合能力。

图9显示了用流式细胞术检测Anti-EpCAM/cMet/Trop2 TsAb(T6)及亲本抗体在胰腺癌细胞系BxPC3中的内化能力。

图10显示了用流式细胞术检测Anti-EpCAM/cMet/Trop2 TsAb(T6)及亲本抗体在结直肠癌细胞系HT-29中的结合能力。

图11显示了用流式细胞术检测Anti-EpCAM/cMet/Trop2 TsAb(T6)及亲本抗体在结直肠癌细胞系HT-29中的内化能力。

图12显示了用免疫荧光法检测Anti-cMet/Trop2/EpCAM TsAb(T1)、Anti-EpCAM/Trop2/cMet TsAb(T3)、Anti-EpCAM/cMet/Trop2 TsAb(T6)在胰腺癌细胞系BxPC3中的内化能力。

图13显示了用免疫荧光法检测Anti-cMet/Trop2/EpCAM TsAb(T1)、Anti-EpCAM/Trop2/cMet TsAb(T3)、Anti-EpCAM/cMet/Trop2 TsAb(T6)及亲本抗体在结直肠癌细胞系HT-29细胞中的内化能力。

图14显示了用免疫荧光法检测Anti-cMet/Trop2/EpCAM TsAb(T1)、Anti-EpCAM/Trop2/cMet TsAb(T3)、Anti-EpCAM/cMet/Trop2 TsAb(T6)及亲本抗体在卵巢癌SKOV3细胞中的内化能力。

图15显示了Anti-EpCAM/cMet/Trop2(T6)-VC-MMAE单针给药对EpCAM高表达/cMet高表达/Trop2高表达胰腺癌细胞系BxPC3荷瘤小鼠的抑瘤效果。

图16显示了Anti-EpCAM/cMet/Trop2(T6)-VC-MMAE单针给药对EpCAM高表达/cMet高表达/Trop2高表达胰腺癌细胞系BxPC3荷瘤小鼠体重变化结果。

图17显示了Anti-EpCAM/cMet/Trop2(T6)-VC-MMAE单针给药对EpCAM高表达/cMet高表达/Trop2低表达结直肠癌细胞系HT-29荷瘤小鼠的抑瘤效果。

图18显示了Anti-EpCAM/cMet/Trop2(T6)-VC-MMAE单针给药对EpCAM高表达/cMet高表达/Trop2低表达结直肠癌细胞系HT-29荷瘤小鼠的体重变化结果。

图19显示了Anti-EpCAM/Trop2/cMet/(T3)-VC-MMAE单针给药对EpCAM高表达/cMet高表达/Trop2低表达结直肠癌细胞系HT-29荷瘤小鼠的抑瘤效果。

图20显示了Anti-EpCAM/Trop2/cMet/(T3)-VC-MMAE单针给药对EpCAM高表达/cMet高表达/Trop2低表达结直肠癌细胞系HT-29荷瘤小鼠的体重变化结果。

序列信息

本发明涉及的序列的信息描述于下面的表中：

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：EpCAM、cMet和Trop2亲本多肽构建体的定点改造与设计1.1实验室前期基于噬菌体展示技术和筛选技术从羊驼抗体库中筛选得到靶向EpCAM、cMet和Trop2特异性的纳米抗体，氨基酸序列如表1所示。

表1.亲本VHH的氨基酸序列

1.2将筛选得到的Anti-EpCAM、Anti-cMet和Anti-Trop2纳米抗体与传统抗体Fc段CH2、CH3(SEQ ID NO:13)串联表达，延长半衰期，表达载体使用PTT5-H，将239位丝氨酸突变为半胱氨酸，再将290位赖氨酸突变为半胱氨酸，分别命名为“Anti-EpCAM Ab”、“Anti-cMetAb”和“Anti-Trop2 Ab”。如表2所示。

表2.“Anti-EpCAM Ab”、“Anti-cMet Ab”和“Anti-Trop2 Ab”的氨基酸序列(带Fc标签)

1.3：“3+0”结构的三特异性抗体的构建

将Anti-cMet VHH、Anti-Trop2 VHH、Anti-EpCAM VHH和传统抗体Fc段CH2、CH3(SEQ ID NO:13)进行串联表达，表达载体使用PTT5-H，将239位丝氨酸突变为半胱氨酸，再将290位赖氨酸突变为半胱氨酸，得到“3+0”结构的Anti-cMet/Trop2/EpCAM多肽构建体，命名为“Anti-cMet/Trop2/EpCAM TsAb(T1)”，如表3所示。

表3.“Anti-cMet/Trop2/EpCAM TsAb(T1)”的氨基酸序列(带Fc标签)

1.4：“2+1”结构的三特异性抗体的构建

将Anti-EpCAM VHH、Anti-Trop2 VHH、传统抗体Fc段CH2、CH3(SEQ ID NO:13)和Anti-cMet VHH进行串联表达，表达载体使用PTT5-H，将239位丝氨酸突变为半胱氨酸，再将290位赖氨酸突变为半胱氨酸，得到“2+1”结构的Anti-EpCAM/Trop2/cMet多肽构建体，命名为“Anti-EpCAM/Trop2/cMet TsAb(T3)”，如表4所示。

表4.“Anti-EpCAM/Trop2/cMet TsAb(T3)”的氨基酸序列(带Fc标签)

1.5将Anti-EpCAM VHH、传统抗体Fc段CH2、CH3(SEQ ID NO:13)、Anti-cMet VHH和Anti-Trop2 VHH进行串联表达，表达载体使用PTT5-H，将239位丝氨酸突变为半胱氨酸，再将290位赖氨酸突变为半胱氨酸，得到“1+2”结构的Anti-EpCAM/cMet/Trop2多肽构建体，命名为“Anti-EpCAM/cMet/Trop2 TsAb(T6)”，如表5所示。

表5.“Anti-EpCAM/cMet/Trop2 TsAb(T6)”的氨基酸序列(带Fc标签)

实施例2：Anti-EpCAMAb、Anti-cMetAb、Anti-Trop2Ab，Anti-cMet/Trop2/EpCAM TsAb(T1)、Anti-EpCAM/Trop2/cMetTsAb(T3)、Anti-EpCAM/cMet/Trop2TsAb(T6)的瞬时表 达与亲和层析纯化

2.1获取质粒由通用生物系统(安徽)有限公司合成Anti-EpCAM Ab、Anti-cMetAb、Anti-Trop2 Ab，Anti-cMet/Trop2/EpCAM TsAb(T1)、Anti-EpCAM/Trop2/cMet TsAb(T3)、Anti-EpCAM/cMet/Trop2 TsAb(T6)质粒。经快转将质粒导入DH-5α大肠杆菌感受态细胞(深圳康体)，热激90s后在氨苄抗性的LB培养板的环境下37℃培养过夜。挑取单克隆菌落在氨苄抗性LB培养基中扩增培养，37℃，220rpm，15h，再用无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒。

2.2抗体表达利用单质粒瞬时转染Expi-293F细胞表达Anti-EpCAM Ab、Anti-cMetAb、Anti-Trop2 Ab，Anti-cMet/Trop2/EpCAM TsAb(T1)、Anti-EpCAM/Trop2/cMet TsAb(T3)、Anti-EpCAM/cMet/Trop2 TsAb(T6)。准备密度为4×10⁶/mL、活率为95％、体积为200mL的Expi-293F细胞。将抗体单质粒各0.5mg经0.22μm过滤并加入5mL CD05培养基中。同时将2mgPEI加入5mL CD05培养基中，立即涡旋振荡8s，静置2min。再将7mlPEI混合物加入质粒混合物内，立即涡旋振荡8s，静置8min。最后用移液器将前者混合物滴加入200mL细胞液内，边加边轻微混匀。在5％ CO₂、37℃恒温摇床内培养，4h后取出补充200mLfreestyle培养液，再在恒温摇床内培养表达7-8天。

2.3纯化抗体收集Anti-EpCAM Ab、Anti-cMet Ab、Anti-Trop2 Ab，Anti-cMet/Trop2/EpCAM TsAb(T1)、Anti-EpCAM/Trop2/cMet TsAb(T3)、Anti-EpCAM/cMet/Trop2TsAb(T6)的细胞表达上清，10000rpm离心25min。0.22μm过滤该细胞上清备用。

AKTA纯化仪器上机操作：软件设置流速8mL/min、最大压力0.3MPa；首先用B液(100mM一水柠檬酸)充分冲洗仪器管道，降低流速至2mL/min装上proteinA中压层析柱，用95％A液(200mM十二水合磷酸氢二钠)以8ml/min流速平衡proteinA介质至基线水平稳定，该过程约15min；以8mL/min流速上样，可见UV值上升并保持至一定水平，该峰为穿透峰；上样结束后再以95％A液平衡，峰值降至基线水平稳定；70％B液进行洗脱，该过程可见峰值先攀升再降至基线，洗脱峰形成过程即洗脱目的蛋白过程，收集该过程洗脱液；100％B液冲洗管道杂蛋白，再用20％乙醇充满管道和protein A柱子，拆下柱子，4℃保存。洗脱蛋白经由透析袋透析于20mM PBS内，4℃透析24h。酶标仪或BCA检测抗体浓度，若抗体浓度＜0.5mg/mL，则需通过10Kd浓缩管(Millipore)以3000rpm 10min进行浓缩。抗体分装后保存于-20℃备用。

图2显示了用SDS-PAGE鉴定抗体的条带大小。如图所示，非还原条件下，EpCAM、cMet和Trop2纳米抗体的条带大小在80～90KDa左右，Anti-cMet/Trop2/EpCAM TsAb(T1)、Anti-EpCAM/Trop2/cMet TsAb(T3)、Anti-EpCAM/cMet/Trop2 TsAb(T6)的条带大小在140～160KDa左右，还原条件下，T1、T3和T6抗体的条带大小在80KDa左右，与理论值吻合，且条带干净单一，说明抗体纯度高。

实施例3：抗体偶联药物Anti-EpCAM/cMet/Trop2(T6)-VC-MMAE的制备

以抗有丝分裂剂单甲基奥利他汀E(MMAE，一种微管蛋白抑制剂)作为有毒载荷，通过溶酶体可裂解的MC-Val-Cit-PAB(马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲酰氧基羧基)连接子将它连接到T6抗体的定点突变位点，从而获得抗体偶联药物(如图3所示)。实验细节步骤如下：

(1)向抗体反应体系中加入0.5M的EDTA，使其工作浓度达到5mM；

(2)还原：向反应体系中加入10eq的Tris(2-carboxyethyl)phosphinehydrochloride(TCEP；BEYOTIME)，37℃孵育2h，工程化抗体上的二硫键以及突变位点上的半胱氨酸活化的巯基基团被暴露出来，通过超滤浓缩管(10Kd；Millipore)置换缓冲液；

(3)氧化：加入过量Dehydroascorbic acid(DHAA)(50eq)，室温孵育3h，将还原的二硫键重新氧化连接，仅暴露工程化半胱氨酸位点，利用超滤浓缩管进行缓冲液置换，去除氧化剂DHAA；

(4)偶联：MC-vc-PAB-MMAE(MCE，CAS No.:646502-53-6)溶于DMSO中，储存浓度为10mM，加入的DMSO占总反应体系的10％，涡旋混匀，4℃孵育，Anti-EpCAM/cMet/Trop2 TsAb(T6)工程化抗体的反应体系加入6eq MC-vc-PAB-MMAE，4℃孵育4h；用超滤浓缩管去除过量小分子、半胱氨酸、以及DMSO等杂质。得到抗体偶联药物Anti-EpCAM/cMet/Trop2(T6)-VC-MMAE。

亲本抗体偶联药物Anti-EpCAM-VC-MMAE、Anti-cMet-VC-MMAE、Anti-Trop2-VC-MMAE通过同样的反应体系获得。

实施例4：疏水相互作用色谱法(HIC)鉴定Anti-EpCAM/cMet/Trop2(T6)-VC-MMAE 的平均DAR值

(1)采用的是一种硅胶基HPLC色谱柱(4.6×100mm,3.5μm，Agilent)进行HIC-UPLC(waters)分析，确定药物-抗体比值(DAR)；

(2)抗体及其偶联物通过40min线性梯度洗脱从缓冲液A(1.5M硫酸铵，50mM磷酸钠)，到缓冲液B(80％磷酸钠,20％异丙醇)，pH＝7.5，0.5mL/min，25℃。如图8所示：Anti-EpCAM/cMet/Trop2(T6)-VC-MMAE在pH＝7.5的情况下，DAR≈4，与理论值符合。

实施例5：ELISA法检测Anti-cMet/Trop2/EpCAMTsAb(T1)、Anti-EpCAM/Trop2/ cMet TsAb(T3)、Anti-EpCAM/cMet/Trop2TsAb(T6)与抗原EpCAM、cMet和Trop2的结合活性

将抗原EpCAM、cMet和Trop2((购于Sino Biological)用PBS稀释至1μg/mL，铺于96孔板，每孔100μL，4℃过夜孵育后PBST洗涤5次，用2％BSA封闭过夜，吸除封闭液，用PBST洗5次，干燥24h。将Anti-EpCAM Ab，Anti-cMet Ab，Anti-Trop2 Ab，Anti-cMet/Trop2/EpCAMTsAb(T1)、Anti-EpCAM/Trop2/cMet TsAb(T3)、Anti-EpCAM/cMet/Trop2 TsAb(T6)、Negative control稀释成一系列不同浓度，加入已经包被好EpCAM/cMet/Trop2抗原的96孔板，每孔100μL，37℃孵育1h，PBST洗5次。随后加入Goat Anti-Human IgG(HRP)二抗(1:2000稀释)，37℃孵育30min，PBST洗涤5次，加入底物显色A液/B液1:1混合，100μL/孔，显色约10min，呈现出蓝色梯度变化，然后加入50μL/孔终止液，颜色转为黄色，于450nm/630nm波长测吸光度值。

结果表明，Anti-EpCAM Ab、Anti-cMet/Trop2/EpCAM TsAb(T1)、Anti-EpCAM/Trop2/cMet TsAb(T3)、Anti-EpCAM/cMet/Trop2 TsAb(T6)与抗原EpCAM呈浓度依赖性结合；Anti-cMet Ab、T1、T3、T6与抗原cMet呈浓度依赖性结合；Anti-Trop2 Ab、T1、T3、T6与抗原Trop2呈浓度依赖性结合，EC₅₀均处于nM/L级别(如表6所示)，不过T3、T6两种形式的三特异性抗体结合活性明显低于亲本抗体，综合来看T1的结合活性最优，Negative control未呈现出特异性结合趋势(如图5、图6、图7所示)。

表6：三特异性抗体及亲本抗体的EC₅₀值

实施例6：Anti-EpCAM/cMet/Trop2TsAb(T6)的结合和内化效果鉴定6.1流式细胞术检测Anti-EpCAM/cMet/Trop2 TsAb(T6)在BxPC3、HT-29细胞中的结合和内化能力

选择EpCAM高表达/cMet高表达/Trop2高表达的胰腺癌细胞系BxPC3，EpCAM高表达/cMet高表达/Trop2低表达的结直肠癌细胞系HT-29。将BxPC3、HT-29(2×10⁵/well)与抗体(10μg/mL)用预冷的PBS重悬，做三份平行样，4℃孵育1h，1200rpm，3min离心洗涤，取两份平行样，用2％FBS1640重悬，37℃分别孵育30min和3h，1200rpm，3min离心洗涤，二抗(Goatanti-Human IgG Fc Cross-Adsorbed Secondary Antibody，DyLight^TM650；Invitrogen)1：400稀释，4℃孵育30min，通过分析型流式细胞仪(LSRFortessaX-20；BD)上样分析，如图8、图9、图10、图11所示：Anti-EpCAM/cMet/Trop2 TsAb(T6)在BxPC3细胞系中的结合率显著高于亲本抗体、在HT-29细胞系中的结合率也优于亲本抗体；孵育3h后，Anti-EpCAM/cMet/Trop2 TsAb(T6)在BxPC3细胞系中的内化值为亲本抗体的300％以上，在HT-29细胞系中的内化值也优于亲本抗体。

6.2免疫荧光法检测Anti-cMet/Trop2/EpCAM TsAb(T1)、Anti-EpCAM/Trop2/cMetTsAb(T3)、Anti-EpCAM/cMet/Trop2 TsAb(T6)在BxPC3、HT-29、SKOV3细胞中内化能力

第一天，铺结直肠癌细胞系HT-29、胰腺癌细胞系BxPC3和卵巢癌细胞系SKOV3，10000/孔，培养过夜。第二天，按3小时和1小时两个时间段孵育一抗，即Anti-EpCAM Ab、Anti-cMet Ab、Anti-Trop2 Ab，Anti-cMet/Trop2/EpCAM TsAb(T1)、Anti-EpCAM/Trop2/cMet TsAb(T3)、Anti-EpCAM/cMet/Trop2 TsAb(T6)和阴性对照，稀释液为2％FBSDMEM，抗体终浓度为100nM/L。固定：PBS清洗三次，加入4％甲醛溶液100ul，静置20min。通透：PBS清洗3次，加入100ul免疫荧光通透液，静置5min。封闭：PBS清洗2次，加入2％BSA 100μL，放置30min。加二抗：二抗(Goat anti-Human IgG Fc Cross-Adsorbed Secondary Antibody)，1：2000稀释，4℃孵育30min。染细胞核：PBS清洗3次，将DAPI 1：2000稀释，上下颠倒混匀，加入100μL，常温静置10min。通过高内涵细胞筛选成像分析系统(Opera Phenix)上样拍摄。

如图12、图13、图14所示：在统一荧光强度的条件下，在BxPC3细胞系中，T1、T3、T6均内化效果显著。在HT-29、SKOV3细胞系中，Anti-cMet/Trop2/EpCAM TsAb(T1)、Anti-EpCAM/Trop2/cMet TsAb(T3)、Anti-EpCAM/cMet/Trop2 TsAb(T6)的内化效果均显著优于Anti-Trop2 Ab，Anti-EpCAM Ab和Anti-cMet Ab。

实施例7：Anti-EpCAM/cMet/Trop2(T6)-VC-MMAE在胰腺癌细胞系BxPC3荷瘤小鼠 中的单针抑瘤效果

选择裸鼠(5-6周龄，雌性)，BxPC3按照2×10⁶细胞数量进行皮下接种，待肿瘤体积为100mm³左右，按肿瘤大小均一分组，组别为Anti-EpCAM-VC-MMAE 2.5μM、Anti-cMet-VC-MMAE 2.5μM、Anti-Trop2-VC-MMAE 2.5μM、Anti-EpCAM/cMet/Trop2(T6)-VC-MMAE 2.5μM、PBS。单针尾静脉注射，每隔3～4天监测瘤体积、体重。

使用卡尺测定肿瘤尺寸，并使用以下公式计算体积：V＝(W²×L)/2，其中V＝肿瘤体积，W＝较小的垂直直径，L＝较大的垂直直径。当肿瘤大小达到1500mm³，对小鼠实施安乐死。如图15、图16所示：在2.5μM的剂量下，Anti-Trop2-VC-MMAE 2.5μM和Anti-EpCAM/cMet/Trop2(T6)-VC-MMAE 2.5μM可以完全清除100mm³ BxPC3肿瘤的生长，而Anti-EpCAM-VC-MMAE 2.5μM、Anti-cMet-VC-MMAE 2.5μM只能抑制肿瘤生长，与Anti-EpCAM/cMet/Trop2(T6)-VC-MMAE具有显著性差异。同时各组动物体重没有出现下降或其他异常。

实施例8：Anti-EpCAM/cMet/Trop2(T6)-VC-MMAE在结直肠癌HT-29荷瘤小鼠中的 单针抑瘤效果

选择裸鼠(5-6周龄，雌性)，HT-29按照2×10⁶细胞数量进行皮下接种，待肿瘤体积为100mm³左右，按肿瘤大小均一分组，组别为Anti-Trop2-VC-MMAE 5μM、Anti-EpCAM/cMet/Trop2(T6)-VC-MMAE 5μM、PBS。单针尾静脉注射，每隔3～4天监测瘤体积、体重。

使用卡尺测定肿瘤尺寸，并使用以下公式计算体积：V＝(W²×L)/2，其中V＝肿瘤体积，W＝较小的垂直直径，L＝较大的垂直直径。当肿瘤大小达到1500mm³，对小鼠实施安乐死。如图17、图18所示：在5μM的剂量下，Anti-EpCAM/cMet/Trop2(T6)-VC-MMAE可以完全清除100mm³ HT-29肿瘤的生长，而Anti-Trop2-VC-MMAE 5μM只能抑制肿瘤生长，与Anti-EpCAM/cMet/Trop2(T6)-VC-MMAE具有显著性差异。同时体重没有出现下降或其他异常。

实施例9：Anti-EpCAM/Trop2/cMet(T3)-VC-MMAE在动物体内的抑瘤效果

选择裸鼠(5-6周龄，雌性)，HT-29按照2×10⁶细胞数量进行皮下接种，待肿瘤体积为100mm³左右，按肿瘤大小均一分组，组别为Anti-EpCAM/Trop2/cMet(T3)-VC-MMAE 5μM、PBS。单针尾静脉注射，每隔3～4天监测瘤体积、体重。

使用卡尺测定肿瘤尺寸，并使用以下公式计算体积：V＝(W²×L)/2，其中V＝肿瘤体积，W＝较小的垂直直径，L＝较大的垂直直径。当肿瘤大小达到1500mm³，对小鼠实施安乐死。如图19、图20所示：在5μM的剂量下，Anti-EpCAM/Trop2/cMet(T3)-VC-MMAE 5μM可以完全清除100mm³HT-29肿瘤的生长，同时动物体重没有出现下降或其他异常。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (29)

1.一种特异性结合EpCAM、cMet和Trop2的三特异性抗体，其包含对EpCAM特异性的第一抗原结合结构域、对cMet特异性的第二抗原结合结构域和对Trop2特异性的第三抗原结合结构域。

2.权利要求1的三特异性抗体，所述第一抗原结合结构域为VHH，其包含下述CDR1(互补决定区1)、CDR2(互补决定区2)和CDR3(互补决定区3)序列：

(a)CDR1，其具有：如SEQ ID NO:4所示序列，或与SEQ ID NO:4所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(b)CDR2，其具有：如SEQ ID NO:5所示的序列，或与SEQ ID NO:5所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；以及

(c)CDR3，其具有：如SEQ ID NO:6所示的序列，或与SEQ ID NO:6所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

优选地，所述第一抗原结合结构域包含：如SEQ ID NO:4所示的CDR1、如SEQ ID NO:5所示的CDR2、以及如SEQ ID NO:6所示的CDR3；

优选地，所述第一抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:1或其变体所示的VHH序列；所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加；优选地，所述置换是保守置换。

3.权利要求1或2的三特异性抗体，所述第二抗原结合结构域是VHH，其包含下述CDR1(互补决定区1)、CDR2(互补决定区2)和CDR3(互补决定区3)序列：

(a)CDR1，其具有：如SEQ ID NO:7所示序列，或与SEQ ID NO:7所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(b)CDR2，其具有：如SEQ ID NO:8所示的序列，或与SEQ ID NO:8所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；以及

(c)CDR3，其具有：如SEQ ID NO:9所示的序列，或与SEQ ID NO:9所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

优选地，所述第二抗原结合结构域包含：如SEQ ID NO:3所示的CDR1、如SEQ ID NO:5所示的CDR2、以及如SEQ ID NO:7所示的CDR3；

优选地，所述第二抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:2或其变体所示的VHH序列；所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加；优选地，所述置换是保守置换。

4.权利要求1-3任一项的三特异性抗体，所述第三抗原结合结构域是VHH，其包含下述CDR1(互补决定区1)、CDR2(互补决定区2)和CDR3(互补决定区3)序列：

(a)CDR1，其具有：如SEQ ID NO:10所示序列，或与SEQ ID NO:10所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(b)CDR2，其具有：如SEQ ID NO:11所示的序列，或与SEQ ID NO:11所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；以及

(c)CDR3，其具有：如SEQ ID NO:12所示的序列，或与SEQ ID NO:12所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

优选地，所述第二抗原结合结构域包含：如SEQ ID NO:10所示的CDR1、如SEQ ID NO:11所示的CDR2、以及如SEQ ID NO:12所示的CDR3；

优选地，所述第二抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:3或其变体所示的VHH序列；所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加；优选地，所述置换是保守置换。

5.权利要求1-4任一项所述的三特异性抗体，其中，所述三特异性抗体为三特异性纳米抗体，其依次包含第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域；

优选地，所述三特异性纳米抗体还包含免疫球蛋白Fc结构域；

优选地，所述免疫球蛋白Fc结构域位于所述第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域之间，或者位于所述第一抗原结合结构域之后，或者位于所述第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域之间；

优选地，所述免疫球蛋白Fc结构域任选地通过肽接头与所述第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域或第三抗原结合结构域的N端相连；

优选地，所述免疫球蛋白Fc结构域任选地通过肽接头与所述第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域或第三抗原结合结构域的C端相连；

优选地，所述三特异性纳米抗体从N端到C端依次包含：第二抗原结合结构域、第三抗原结合结构域、第一抗原结合结构域和免疫球蛋白Fc结构域；

优选地，所述三特异性纳米抗体从N端到C端依次包含：第一抗原结合结构域、第三抗原结合结构域、免疫球蛋白Fc结构域和第二抗原结合结构域；

优选地，所述三特异性纳米抗体从N端到C端依次包含：第一抗原结合结构域、免疫球蛋白Fc结构域、第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域。

6.权利要求1-5任一项所述的三特异性抗体，所述免疫球蛋白Fc结构域是IgG的Fc结构域；

优选地，所述免疫球蛋白Fc结构域包含如SEQ ID NO:13所示的序列，或与其相比具有至少80％序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加的序列；

优选地，所述免疫球蛋白Fc结构域发生突变；

优选地，所述免疫球蛋白Fc结构域包含S239和/或K290位置处的突变，所述突变例如包括S239C和/或K290C；

优选地，所述接头为肽接头(例如，刚性肽接头或柔性肽接头)；

优选地，所述接头为包含一个或多个甘氨酸和/或一个或多个丝氨酸的肽接头；

优选地，所述肽接头为(G4S)n，n为不小于0的整数，例如为1、2、3或4。

7.权利要求1-6任一项所述的三特异性抗体，所述三特异性抗体具有以下特征中的一个或多个：

(1)所述三特异性抗体包含如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19所示的序列，或包含如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19所示的序列的变体，所述变体与SEQ ID NO:17、18或19相比差异仅在于一个或多个氨基酸残基的保守置换，或者与其所源自的抗体或其抗原结合片段具有至少85％的序列同一性，且基本保留了其所源自的三特异性纳米抗体的生物学功能；

(2)所述三特异性抗体为二聚体；

(3)所述三特异性抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的K_D与EpCAM结合；

(4)所述三特异性抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的K_D与c-Met结合；

(5)所述三特异性抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的K_D与Trop2结合；

(5)所述三特异性抗体为具有任何抗体结构的单价或双价抗体。

8.多特异性抗体，其包含权利要求1-7任一项所述的三特异性抗体；

优选地，所述多特异性抗体特异性结合EpCAM、cMet和Trop2，并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标。

9.分离的核酸分子，其编码权利要求1-7任一项所述的三特异性抗体或权利要求8所述的多特异性抗体。

10.载体，其包含权利要求9所述的核酸分子；优选地，所述载体为克隆载体或表达载体。

11.宿主细胞，其包含权利要求9所述的核酸分子或权利要求10所述的载体。

12.制备权利要求1-7任一项所述的三特异性抗体或权利要求8所述的多特异性抗体的方法，其包括，在允许蛋白表达的条件下，培养权利要求11所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述纳米抗体或其抗原结合片段、三特异性抗体或多特异性抗体。

13.缀合物，其包含权利要求1-7任一项所述的三特异性抗体或权利要求8所述的多特异性抗体，以及偶联部分；

优选地，所述偶联部分选自蛋白标签(protein tag)，例如纯化标签；可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素；治疗剂，例如细胞毒性药物；或，另外的生物活性多肽。

14.抗体偶联药物(ADC)，其包含：靶向部分，选自权利要求1-7任一项所述的三特异性抗体或权利要求8所述的多特异性抗体；

细胞毒性药物部分；以及

连接子，用于连接所述靶向部分和所述细胞毒性药物部分。

15.权利要求14所述的抗体偶联药物，其中所述靶向部分通过半胱氨酸残基上的巯基与所述连接子连接；

优选地，所述靶向部分通过VHH、Fc结构域半胱氨酸残基上的巯基或铰链区中还原后的二硫键中半胱氨酸残基暴露出的巯基与所述连接子连接；

优选地，所述靶向部分通过VHH、铰链区还原后二硫键中半胱氨酸残基或Fc结构域239和/或290位的半胱氨酸残基上的巯基与所述连接子连接。

16.权利要求14或15所述的抗体偶联药物，其中所述细胞毒性药物选自微管蛋白抑制剂和DNA损伤药物；

优选地，所述微管蛋白抑制剂选自奥瑞他汀类化合物(例如，MMAE、MMAF)、美登素类化合物(例如，美登素、美登醇、DM1、DM4)、紫杉烷类(例如，紫杉醇Taxol、多西紫杉醇Docetaxel、卡巴他赛Carbazitaxel)、长春花碱类(例如，长春花碱、长春新碱)、艾日布林和秋水仙碱；

优选地，所述DNA损伤剂选自DNA烷化剂(卡奇霉素γ1l、N-乙酰-γ1I卡奇霉素、安曲霉素、PBD、杜卡霉素)、DNA拓扑异构酶抑制剂(例如，喜树碱类化合物(具体如，喜树碱、SN-38、Dxd、伊立替康、贝洛替康、拓扑替康、PNU-159682)、阿霉素、柔红霉素、依托泊苷、米托蒽醌)和鹅膏蕈碱；

优选地，所述细胞毒性药物为MMAE。

17.权利要求16-18任一项所述的抗体偶联药物，其中所述连接子为可切割或不可切割的连接子；

优选地，所述可切割的连接子选自蛋白酶敏感性、pH敏感性和谷胱甘肽敏感性连接子；

优选地，所述连接子选自MC(6-马来酰亚胺基己酰基)、MCC(马来酰亚胺基甲基环己烷-1-甲酸酯)、MP(马来酰亚胺基丙酰基)、Val-Cit(缬氨酸-瓜氨酸)、Val-Ala(缬氨酸-丙氨酸)、Ala-Phe(丙氨酸-苯丙氨酸)、PAB(对氨基苄氧羰基)、SPP(5-(琥珀酰亚胺基)-4-(吡啶-2-基硫基)戊酸酯)、6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-4-(吡啶-2-基硫基)己酸酯、6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-5-甲基-4-(吡啶-2-基硫基)己酸酯、SMCC(N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯)或SIAB(N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯)及其任意组合；

优选地，所述连接子为MC-Val-Cit-PAB。

18.权利要求14-17任一项所述的抗体偶联药物，所述靶向部分每条肽链通过VHH、铰链区还原后二硫键中半胱氨酸残基或Fc结构域的半胱氨酸残基与0、1、2、3、4或5个下述结构连接：

19.权利要求14-18任一项所述的抗体偶联药物，其选自：

其中，x＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

Ab为权利要求1-7任一项所述的三特异性抗体。

20.权利要求14-19任一项所述的抗体偶联药物，其为：

其中，x＝1、2、3、4、5或6；

Ab含有如SEQ ID NO:17、18或19所示的氨基酸序列或由其组成。

21.组合物，其包括一个或多个权利要求14-20任一项所述的抗体偶联药物或由其组成；

优选地，所述组合物的DAR值为1-10。

22.组合物，其包括一个或多个权利要求19所述的抗体偶联药物或由其组成；

优选地，所述组合物的DAR值为1-8；

更优选地，所述组合物的DAR值为1-5，例如3.5-4.5，再例如3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4或4.5。

23.抗体组合物，其包含特异性结合EpCAM的第一抗体、特异性结合c-Met的第二抗体和特异性结合Trop2的第三抗体。

24.权利要求23的抗体组合物，所述第一抗体为特异性结合EpCAM的纳米抗体或其抗原结合片段，或包含所述的纳米抗体或其抗原结合片段的多肽构建体；

优选地，所述特异性结合EpCAM的纳米抗体或其抗原结合片段包含下述CDR1(互补决定区1)、CDR2(互补决定区2)和CDR3(互补决定区3)序列：

(a)CDR1，其具有：如SEQ ID NO:4所示序列，或与SEQ ID NO:4所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(b)CDR2，其具有：如SEQ ID NO:5所示的序列，或与SEQ ID NO:5所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；以及

(c)CDR3，其具有：如SEQ ID NO:6所示的序列，或与SEQ ID NO:6所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

优选地，所述特异性结合EpCAM的纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:4所示的CDR1、如SEQ ID NO:5所示的CDR2、以及如SEQ ID NO:6所示的CDR3；

优选地，所述特异性结合EpCAM的纳米抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:1或其变体所示的VHH序列；所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加；优选地，所述置换是保守置换。

25.权利要求23或24的抗体组合物，所述第二抗体为特异性结合c-Met的纳米抗体或其抗原结合片段，或包含所述的纳米抗体或其抗原结合片段的多肽构建体；

优选地，所述特异性结合c-Met的纳米抗体或其抗原结合片段包含下述CDR1(互补决定区1)、CDR2(互补决定区2)和CDR3(互补决定区3)序列：

(a)CDR1，其具有：如SEQ ID NO:7所示序列，或与SEQ ID NO:7所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(b)CDR2，其具有：如SEQ ID NO:8所示的序列，或与SEQ ID NO:8所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；以及

(c)CDR3，其具有：如SEQ ID NO:9所示的序列，或与SEQ ID NO:9所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

优选地，所述特异性结合c-Met的纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:7所示的CDR1、如SEQ ID NO:8所示的CDR2、以及如SEQ ID NO:9所示的CDR3；

优选地，所述特异性结合c-Met的纳米抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:2或其变体所示的VHH序列；所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加；优选地，所述置换是保守置换。

26.权利要求23-25任一项的抗体组合物，所述第三抗体为特异性结合Trop2的纳米抗体或其抗原结合片段，或包含所述的纳米抗体或其抗原结合片段的多肽构建体；

优选地，所述特异性结合Trop2的纳米抗体或其抗原结合片段包含下述CDR1(互补决定区1)、CDR2(互补决定区2)和CDR3(互补决定区3)序列：

(a)CDR1，其具有：如SEQ ID NO:10所示序列，或与SEQ ID NO:10所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(b)CDR2，其具有：如SEQ ID NO:11所示的序列，或与SEQ ID NO:11所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；以及

(c)CDR3，其具有：如SEQ ID NO:12所示的序列，或与SEQ ID NO:12所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

优选地，所述特异性结合Trop2的纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:10所示的CDR1、如SEQ ID NO:11所示的CDR2、以及如SEQ ID NO:12所示的CDR3；

优选地，所述特异性结合Trop2的纳米抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:3或其变体所示的VHH序列；所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加；优选地，所述置换是保守置换。

27.权利要求23-26任一项所述的抗体组合物，所述多肽构建体包含免疫球蛋白Fc结构域；

优选地，所述免疫球蛋白Fc结构域直接或通过肽接头连接至所述纳米抗体或其抗原结合片段的N端或C端；优选地，所述免疫球蛋白Fc结构域直接或通过肽接头连接至所述纳米抗体或其抗原结合片段的C端；

优选地，所述免疫球蛋白Fc结构域包含SEQ ID NO：13所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个、4个或5个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；

优选地，所述免疫球蛋白Fc结构域包含或不包含S239和/或K290位置处的突变，所述突变例如包括S239C和/或K290C；优选地，所述免疫球蛋白Fc结构域按照Kabat EU索引编号；

优选地，所述多肽构建体含有如SEQ ID NO:14、15或16所示的氨基酸序列或由其组成；

优选地，所述多肽构建体为二聚体；

优选地，所述多肽构建体包含但不局限于单域抗体、单链抗体、抗体Fab、抗体全长蛋白、抗原结合片段、三特异性抗体、多特异性抗体、双/多价单域抗体、双/多价单链抗体和双/多价抗体Fab中的一种或多种。

28.药物组合物，其包含权利要求1-7任一项所述的三特异性抗体、权利要求8所述的多特异性抗体、权利要求9所述的核酸分子、权利要求10所述的载体、权利要求11所述的宿主细胞、权利要求13所述的缀合物、权利要求14-20任一项所述的抗体偶联药物、权利要求21-22任一项所述的组合物或权利要求23-27任一项的抗体组合物，以及任选的载体或赋型剂。

29.权利要求1-7任一项所述的三特异性抗体、权利要求8所述的多特异性抗体、权利要求9所述的核酸分子、权利要求10所述的载体、权利要求11所述的宿主细胞、权利要求13所述的缀合物、权利要求14-20任一项所述的抗体偶联药物、权利要求21-22任一项所述的组合物或权利要求23-27任一项的抗体组合物或权利要求28的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于在受试者中预防和/或治疗与EpCAM、c-Met和/或Trop2有关的疾病；

优选地，所述与EpCAM、c-Met和/或Trop2有关的疾病为肿瘤，例如EpCAM、c-Met和/或Trop2阳性的肿瘤；

优选地，所述肿瘤结直肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌(例如，三阴乳腺癌)、肺癌、口腔鳞癌、卵巢癌(例如卵巢上皮癌)、宫颈癌和膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌和视网膜母细胞瘤；

优选地，所述受试者为哺乳动物，例如人；

优选地，所述三特异性抗体、多特异性抗体、核酸分子、载体、宿主细胞、缀合物、抗体偶联药物、组合物、抗体组合物或药物组合物单独使用，或与另外的药学活性剂联合使用。