CN121752257A - pH诱导的结构转换脂质纳米载体、半合成细胞外囊泡、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本公开提供了一种pH诱导的结构转换非层状脂质纳米载体（LNV），其包含：(a)至少一种可电离阳离子脂质；(b)至少一种临界堆积参数值（CPP）大于1的磷脂；以及(c)至少一种CPP小于1的非离子型表面活性剂，其摩尔浓度为20%至50%，一种制备所述LNV的方法、一种通过在高于6且最高约10的pH值下将所述脂质纳米载体与细胞外囊泡融合而产生的半合成细胞外囊泡（ssEV）、一种试剂盒以及所述ssEV作为药物或诊断剂的用途。

Description

pH诱导的结构转换脂质纳米载体、半合成细胞外囊泡、其制备 方法及应用

技术领域

本公开涉及pH诱导的结构转换脂质纳米载体、半合成细胞外囊泡、其制备方法及应用。更具体地，本公开涉及具有与细胞外囊泡自发融合能力的脂质纳米载体。

背景技术

细胞外囊泡（EVs）是源自细胞的囊泡结构，也是重要的细胞间通讯介质，可通过细胞外空间转运信使核糖核酸(mRNA)或蛋白质等大分子(O'Brien et al., 2020)。将大量治疗性核酸（如小干扰RNA（siRNA）和mRNA）封装至细胞外囊泡中仍是一项具有挑战性的任务，目前尚缺乏实现这一目标的通用方法(De Jong et al., 2019)。主动装载策略通常涉及扰动囊泡双层以实现药物封装(De Jong et al., 2019)。该方法对于装载相对高分子量药物的细胞外囊泡尤为重要。例如，在基于核酸的治疗中，电穿孔已成为一种常用方法(Alvarez-Erviti, et al., 2011)。然而，该方法对囊泡的破坏程度以及生物载荷在装载过程中是否发生损失尚不完全清楚。类似地，超声处理已被用作暂时破坏膜稳定性、将生物制剂装载入细胞外囊泡的手段(Lamichhane et al., 2016)。

目前仍需要更简单、被动的装载方法，能在不损害细胞外囊泡功能的前提下将大分子（例如治疗性大分子）装载至细胞外囊泡中。

本说明书提及了若干文献，这些文献的内容通过引用整体并入本文。

发明概述

本公开提供了一种能够与EV自发杂合/融合的脂质纳米结构（即脂质纳米载体(LNV)）。该被动过程无需额外外部刺激（如超声处理、电穿孔、特定缓冲液组分），可在极温和条件（例如pH 7.4、37°C的生理条件）下数分钟内完成。所述LNV可促进EV中融合柄的形成，进而生成半合成EV颗粒(ssEV)，且不损害EV的生物活性。这些通用型颗粒可装载多种分子和/或大分子治疗剂。

本公开还提供了制备所述LNV及ssEV的方法。

不受限于此，但据推测，本公开LNV的固有的融合特性基于其非层状溶致液晶结构（例如海绵状结构）。

更具体地，根据本公开，提供以下项目：

项目1. 一种pH诱导的结构转换非层状脂质纳米载体（LNV），包含：

(a) 至少一种可电离阳离子脂质；

(b) 至少一种临界堆积参数值（CPP）大于1的磷脂；以及

(c) 至少一种CPP小于1的非离子型表面活性剂，其摩尔浓度为20%至50%。

项目2. 如项目1所述的LNV，其中：

(a) 所述至少一种可电离阳离子脂质在掺入LNV前的表观酸解离常数(pKa)为5至7.5；

(b) 所述至少一种磷脂为磷脂酰乙醇胺（PE）类脂质；

(c) 所述至少一种表面活性剂为脂肪酸聚乙二醇酯或聚山梨酯；或

(d) (a)至(c)中至少两项的组合。

项目3. 如项目1或2所述的LNV，其中：

(a') 所述至少一种可电离阳离子脂质为D-Lin-MC3-DMA（MC3）；

(b') 所述至少一种磷脂为二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）；

(c') 所述至少一种非离子型表面活性剂为脂肪酸聚乙二醇酯，例如聚乙二醇12-羟基硬脂酸酯，优选Kolliphor^® HS15（KLP）；或

(d') (a')至(c')中至少两项的组合。

项目4. 如项目1-3任一项所述的LNV，其负载有药物或诊断剂，优选地，其中所述药物或诊断剂为核酸分子。

项目5. 组合物，包含如项目1至4中任一项所定义的LNV以及至少一种药学上可接受的赋形剂。

项目6. 制备如项目1至3中任一项所定义的LNV的方法，包括混合：(a)一种有机相，其包含至少一种可电离阳离子脂质、至少一种磷脂和至少一种表面活性剂，且溶于有机溶剂中；以及(b)水性介质。

项目7. 如项目6所述的方法，其中，满足以下至少一种条件：

(i) 所述有机相还包含亲脂性药物或诊断剂；以及

(ii) 所述水相还包含亲水性药物或诊断剂，优选地，其中所述亲水性药物或诊断剂为核酸分子。

项目8. 如项目7所述的方法，其中(ii)所述水相还包含亲水性药物或诊断剂，且所述水性介质的pH值为约4至约6。

项目9. 如项目6-8任一项所述的方法，其中，所述混合使用微流控装置进行。

项目10. 制备半合成细胞外囊泡（ssEV）的方法，其包括将如项目1-4任一项所定义的LNV或如项目5所定义的组合物，在高于6且最高约10的pH值下与细胞外囊泡（EV）混合，从而生成所述ssEV。

项目11. 半合成细胞外囊泡（ssEV），其通过如项目10所定义的方法制备。

项目12. 半合成细胞外囊泡（ssEV），其基本上包含以下组分的全部或部分混合成分：

(a) 如项目1-4任一项所定义的脂质纳米载体；以及

(b) 细胞外囊泡（EV）。

项目13. 组合物，包含如项目11或12所定义的ssEV以及至少一种药学上可接受的赋形剂。

项目14. 试剂盒，包含：

(A) (a) 如项目1-4任一项所定义的LNP或如项目5所定义的组合物；以及

(b) (i) 用于水化(a)的溶液；

(ii) 细胞外囊泡（EVs）或包含所述EVs及至少一种药学上可接受赋形剂的组合物；

(iii) 使用(a)以及(i)和/或(ii)的说明书；或，

(iv) (i)至(iii)中至少两项的组合；

或，

(B) (a') 如项目11或12所定义的ssEV，或如项目13所定义的组合物；以及

(b') (i') 用于水化(a')的溶液；

(ii') 使用(a')和(i')的说明书；或，

(iii') (i')和(ii')的组合。

项目15. 如项目11或12所定义的ssEV或如项目13所定义的组合物，其用作药物或诊断剂。

本公开的其他目的、优点及特征将在结合附图阅读以下对具体实施例的非限制性描述后变得更加明显，该描述仅作为示例给出。

附图说明

在附图中：

图1A-1R： 使用微流控装置制备的未负载与siRNA负载LNVs的组成、制备工艺及理化表征，其中LNVs具有不同摩尔浓度的可电离阳离子脂质（40、50和60 mol % MC3）及N/P比（带正电荷的脂质胺(N)基团与带负电荷的核酸磷酸(P)基团之比）。（图1A）展示了本文实施例中使用的siRNA负载LNVs的制备材料与流程。使用BioRender.com创建。（图1B）和（图1C）分别展示了未负载LNV在pH 7.4和5条件下的流体力学直径(d_h)与多分散系数(PDI)；而（图1D）和（图1E）则分别展示了siRNA负载LNVs在不同脂质配比（40、50和60 mol % MC3，N/P=25）下相应的d_h与PDI。（图1F）展示了LNVs与siRNA负载LNVs在pH 7.4和5条件下的ζ电位值（60 mol % MC3；N/P=25）。（图1G）和（图1H）分别展示了LNVs及siRNA负载LNVs（60% MC3）在pH 7.4条件下的冷冻透射电子显微镜图像，而（图1I）和（图1J）则展示了相应样品在pH 5条件下对应的图像。（图1K）和（图1L）分别展示了LNVs与siRNA负载LNVs（N/P=25，60 mol %MC3）在pH 5和pH 7.4条件下的小角X射线散射分析结果。（图1M）和（图1N）分别展示了60mol % MC3、不同N/P比（即6、12、25和50）的siRNA负载LNVs在pH 7.4条件下的粒径与PDI。（图1O）展示了使用不同N/P比（即6、12、25和50）、60 mol % MC3的siRNA负载LNVs，在添加或不添加Triton™ X-100条件下的电泳迁移率变动分析（EMSA）。（图1P）和（图1Q）通过RiboGreen™检测展示了LNVs中siRNA在不同N/P比（即6、12、25和50）及60 mol % MC3条件下的装载效率，以及不同物料配比（40、50和60 mol % MC3）下的装载效率。（图1R）通过EMSA展示了负载于LNVs（N/P=25，60 mol % MC3）中的siRNA在37℃ RNase处理后的完整性。统计学显著性通过双因素方差分析、Tukey多重比较检验评估（** P ≤ 0.01，* P ≤ 0.05）。所有实验均进行三次重复（n=3）。

图2A-2N：siRNA负载LNVs（60 mol % MC3，N/P 25）（图2A）、MSC源性EVs（图2B）以及在37°C、pH 7.4条件下孵育5分钟（图2C）、30分钟（图2D）和4小时（图2E）后形成的ssEVs的冷冻透射电子显微镜图像。（图2F）展示了siRNA负载LNVs（60 mol % MC3，N/P 25）与MSC源性EVs混合物在pH 5、30分钟条件下的冷冻透射电镜图像。该数据表明，pH 6或更低pH不会导致ssEVs形成；相反，观察到大量聚集，产生大型杂合体(Hyb)。（图2G-H）展示了在pH 7.4和5条件下，LNV中使用Exo-Fect™转染试剂（图2G）以及使用Atto 488标记的DOPE（Atto 488为DOPE标记物）（图2H）时，CellTrace™ Far Red（EV标记物）与FAM-siRNA（FAM为siRNA标记物）的双变量点图。（图2I）通过使用LNV（N/P 25，60 mol % MC3）或市售Exo-Fect™外泌体转染试剂盒，分别在pH 7.4和5条件下，将FAM-siRNA装载入ssEV或杂合体(Hyb)中的效率（以CellTrace™ Far Red与FAM-siRNA双阳性群体百分比表示）。（图2J）展示了Atto 488DOPE从LNV转移至ssEV的效率（以CellTrace™ Far Red与Atto 488 DOPE双阳性群体百分比表示）。（图2K）通过NanoFCM检测了ssEV与杂合体(Hyb)分别在pH 7.4和5条件下的d₅₀值（nm）。（图2L-N）通过动态光散射/静态光散射（DLS/SLS）酶标仪分析，展示了1小时内不同LNV/EV数量比（图2L）、温度（图2M）及pH值（图2N）条件下ssEV的形成过程。统计学显著性通过单因素方差分析、Tukey事后检验评估（****P ≤ 0.0001，***P ≤ 0.001，**P ≤0.01，*P ≤ 0.05）。所有实验均进行三次重复（n=3）。

图3A-3G：（图3A）通过DLS测定的LNVs与mRNA负载LNVs在pH 7.4、N/P 0（未负载LNV）和25、60 mol % MC3条件下的流体力学直径(d_h)及（图3B）多分散系数(PDI)。（图3C）LNVs与mRNA负载LNVs在pH 5和7.4、N/P 0（未负载LNVs）和25、60 mol % MC3条件下的ζ电位(ζ-pot)。（图3D）通过RiboGreen检测分析的LNVs中mRNA的装载效率(LE%)（N/P 25，60 mol% MC3）。（图3E-F）展示了mRNA负载LNVs的冷冻透射电子显微镜图像（图3E），以及mRNA负载LNVs在pH 7.4、37°C、孵育时间5分钟、N/P 25和60 mol % MC3条件下与EVs融合形成ssEVs的能力（图3F）。（图3G）展示了单独的CFSE标记的EVs(“CFSE-labeled EVs”)、单独的Cy5-mRNA负载LNV(“LNV (w cy5-mRNA)”)、CFSE标记的EV与裸Cy5-mRNA(“CFSE-labeled EVs &naked cy5-mRNA”)、CFSE标记的EV与Cy5-mRNA负载LNV(“CFSE-labeled EVs & LNVs (wcy5-mRNA)”)在pH 7.4条件下的双变量点图。将CFSE标记的EV与Cy5-mRNA负载LNV混合后出现双阳性群体（右上角方框内双阳性群体），证实了ssEVs的形成。CFSE：羧基荧光素琥珀酰亚胺酯。平均值±标准差（n=3）。所有实验均进行三次重复（n=3）。

图4A-4B： 通过MTS检测（用于灵敏定量活细胞的比色法）测定的HeLa细胞与LNV及siRNA负载LNV孵育4小时（图4A）和24小时（图4B）后的细胞活力（60 mol % MC3；N/P 25），脂质浓度范围为12.5至200 μg/mL。平均值 ± 标准差（n=3）。所有样品均与阴性对照（培养基）进行比较。统计学显著性通过单因素方差分析、Tukey事后检验评估（*P ≤ 0.05，**P≤ 0.01，****P ≤ 0.0001）。所有实验均进行三次重复（n=3）。

图5A-5B：从骨髓间充质干细胞（MSC）系HS-5中分离的两种EV特异性膜蛋白CD73（图5A）和CD26（图5B）的酶活性。CD73和CD26的活性分别在ssEV形成后（在HEPES缓冲盐水（HEBS）中孵育30分钟，4°C和37°C，pH 7.4）或杂合体形成后（仅在CD73检测中，在HEPES缓冲盐水（HEBS）中孵育30分钟，37°C，pH 5）通过基于吸光度和基于发光的检测方法测定，并与使用Exo-Fect™（在HEBS缓冲液pH 7.4中37°C孵育10分钟）获得的结果进行比较。CD73检测中使用腺苷5'-(α,β-亚甲基)二磷酸（APCP, 40 μM），CD26检测中使用利格列汀（1 μM）作为抑制剂对照。结果以未添加LNV但经受相同融合条件的EV的酶活性进行归一化。平均值±标准差（n=4-6）。统计学显著性通过非配对双尾Student t检验（Welch校正）评估（***P ≤0.001，**P ≤ 0.01，*P ≤ 0.05）（n=4-6）。所有实验均进行至少四次重复（n=4-6）。

图6：在表达绿色荧光蛋白的HeLa细胞中进行siRNA转染效果的比较。将负载GFP-siRNA的LNVs（N/P 25，60 mol % MC3）（LNVs（w siGFP））和负载乱序对照siRNA的LNVs（LNVs（w siCTRL））（60 mol % MC3；N/P 25）与负载GFP-siRNA的ssEVs（ssEVs（w siGFP））、负载对照siRNA的ssEVs（ssEVs（w siCTRL））、负载GFP-siRNA的Lipofectamine™ RNAiMAX（RNAiMAX（w siGFP））、PBS以及裸GFP-siRNA（裸siGFP）进行比较。在10%血清中培养48小时后，通过流式细胞术测量荧光信号评估转染效率。每个孔加入5 pmol每种制剂中的GFP-siRNA（对应浓度为10 nM）。平均值±标准差（n=3）。统计学显著性通过单因素方差分析、Tukey事后检验评估（****P ≤ 0.0001，***P ≤ 0.001，**P ≤ 0.01，*P ≤ 0.05）（n=3）。所有实验均进行三次重复（n=3）。？请确认或删除。

图7：在HeLa细胞中进行萤火虫荧光素酶（FLuc）-mRNA转染效果的比较。将负载FLuc-mRNA的LNVs（LNVs）（N/P 25与60 mol % MC3）和负载FLuc-mRNA的ssEVs（ssEVs）与PBS、裸FLuc-mRNA以及负载FLuc-mRNA（w FLuc-mRNA）的Lipofectamine™ MessengerMAX™（MessengerMAX™）进行比较。在约90%血清中孵育24小时后，通过测量细胞裂解物中荧光素酶的表达来分析转染效率。HeLa细胞用4种不同mRNA剂量处理（每孔100 ng、10 ng、1 ng和0.1 ng）。平均值 ± 标准差。统计学显著性通过非配对双尾Student t检验（Welch校正）评估（**P ≤ 0.01，*P ≤ 0.05）。所有实验均进行三次重复（n=3）。

图8：使用微流控装置制备的颗粒的冷冻透射电子显微镜代表性图像，所述颗粒由CPP > 1的磷脂和CPP值 < 1的非离子型表面活性剂（分别为DOPE和KLP，摩尔比48:52）制备，但不含可电离阳离子脂质。

图9A-9H：（图9A）使用微流控装置制备的颗粒及siRNA负载颗粒的粒径(d_h)和（图9B）PDI，所述颗粒由可电离阳离子脂质、CPP ~ 1的磷脂和CPP值 < 1的非离子型表面活性剂（MC3：DOPC：KLP，摩尔比60:18:22，N/P 0（未负载LNV）和25）制备。（图9C和9E）DOPC-NPs、（图9D和9F）siRNA负载的DOPC-NPs（60% DOPC，N/P 25）分别在pH 5和pH 7.4条件下的冷冻透射电子显微镜代表性图像，以及它们在pH 7.4条件下与EV混合后的图像（图9G）。（图9H）DOPC-NPs在pH 5和7.4条件下，不含或含siRNA（N/P 25）的小角X射线散射分析。所有实验均进行三次重复（n=3）。

图10A-10I：（图10A）使用微流控装置制备的未负载纳米颗粒及siRNA负载纳米颗粒的粒径(d_h)和（图10B）PDI，所述颗粒在pH 5和7.4条件下，由CPP > 1的磷脂和CPP值 < 1的非离子型表面活性剂制备，但使用固定阳离子脂质替代可电离阳离子脂质（固定阳离子脂质（DOTMA）: DOPE: KLP，摩尔比60:18:22，与N/P 0和25）。（图10C和E）DOTMA-NPs、（图10D和10F）siRNA负载的DOTMA-NPs（60% DOTMA，N/P 25）分别在pH 5和pH 7.4条件下的冷冻透射电子显微镜代表性图像，以及它们在pH 7.4条件下与EV混合后的图像（图10G）。（图10H）DOTMA-NPs在pH 5和7.4条件下，不含或含siRNA（N/P 25）的小角X射线散射分析。所有实验均进行三次重复（n=3）。

图11：使用微流控装置制备的纳米颗粒的粒径分布，所述纳米颗粒由可电离阳离子脂质、CPP > 1的磷脂以及（替代CPP值 < 1的非离子型表面活性剂）CPP < 1的溶血磷脂（MC3、DOPE和1-棕榈酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（MPPC），摩尔比60:18:22）制备。所有实验均进行三次重复（n=3）。

图12：显示CPP值 < 1的非离子型表面活性剂浓度对所形成纳米颗粒的影响。(1)用5 mol%表面活性剂形成的纳米颗粒（MC3:DOPE:HS15摩尔比60:35:5；N/P = 25）；(2) 10mol%表面活性剂（MC3:DOPE:HS15摩尔比60:30:10；N/P = 25）；以及(3) 15 mol%表面活性剂（MC3:DOPE:HS15摩尔比60:25:15；N/P = 25）。所有实验均进行两次重复（n=2）。

具体实施方式

定义

LNV组分

本公开提供了pH诱导的结构转换非层状LNV。本公开的LNV具有pH诱导的结构转换特性，即它们能够在酸性pH（例如低于约6）下从六角相转变为中性pH（例如约6.5或更高）下的海绵相，反之亦然。本公开的LNV包含至少一种可电离阳离子脂质、至少一种CPP > 1的磷脂以及至少一种CPP值< 1的非离子型表面活性剂，这些组分赋予LNV非层状结构及其pH诱导的结构转换特性。LNV基于海绵的结构使其能够与EV成功融合，形成保留生物活性的ssEV。本公开的LNV并非囊泡。

LNV的平均粒径(dh)在约20 nm至约200 nm之间。

可电离阳离子脂质

本发明LNV中可电离阳离子脂质（即电荷随pH变化的脂质）的功能是：1) 在酸性pH下与带负电荷的药物（例如核酸如RNA）复合；2) 与具有CPP > 1的磷脂（例如二油酰磷脂酰乙醇胺）和具有CPP值< 1的非离子型表面活性剂（例如KLP）共同产生pH诱导的结构转换非层状LNV；以及3) 支持与EV的融合柄过程。在具体实施方案中，本公开的可电离阳离子脂质（在掺入LNV前）的表观酸解离常数(pKa)介于5至7.5之间（或介于5.3至7.4；5.4至7.4；5.5至7.4；或5.6至7.4，或5.7至7.4，或5.8至7.4，或5.9至7.4，或6至7.4；或介于5.3至7.3；5.4至7.3；5.5至7.3；或5.6至7.3，或5.3至7.3，或5.8至7.3，或5.9至7.3，或6至7.3；或介于5.3至7.2；5.4至7.2；5.5至7.2；或5.6至7.2，或5.3至7.2，或5.8至7.2，或5.9至7.2，或6至7.2；或介于5.3至7.1；5.4至7.1；5.5至7.1；或5.6至7.1，或5.3至7.1，或5.8至7.1，或5.9至7.1，或6至7.1；或介于5.3至7；5.4至7；5.5至7；或5.6至7，或5.3至7，或5.8至7，或5.9至7，或6至7）；和/或为二甲基氨基可电离阳离子脂质衍生物；和/或是锥形可电离阳离子脂质。在具体实施方案中，本公开的可电离脂质是(二甲基氨基)丁酸酯可电离阳离子脂质衍生物。不受限于此，但在具体实施方案中，本公开的可电离阳离子脂质为4-(二甲基氨基)-丁酸，(10Z,13Z)-1-(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯-1-基-10,13-十九碳二烯-1-基酯（也称为DLin-MC3-DMA，pKa = 6.44）、N,N-二甲基-2-(2-((10Z,13Z)-十八碳-10,13-二烯-1-基)-2-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)-1,3-二氧戊环-4-基)乙-1-胺（也称为DLin-KC2-DMA，pKa6.68）、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷（也称为DLin-DMA，pKa = 6.8）、3-(二甲基氨基)丙烷-1,2-二基 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)（也称为DLin-DAP，pKa = 6.2）、N,N-二甲基-1-(2-((10Z,13Z)-十八碳-10,13-二烯-1-基)-2-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)-1,3-二氧戊环-4-基)甲胺（也称为D-Lin-K-DMA，pKa =5.9）、N,N-二甲基-3-(2-((10Z,13Z)-十八碳-10,13-二烯-1-基)-2-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)-1,3-二氧戊环-4-基)丙-1-胺（也称为DLin-KC3-DMA，pKa = 7.2）、N,N-二甲基-4-(2-((10Z,13Z)-十八碳-10,13-二烯-1-基)-2-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)-1,3-二氧戊环-4-基)丁-1-胺（也称为DLin-KC4-DMA，pKa = 7.3）、SM-102 (pKa =6.68)、ALC-0315 (pKa = 6.09)（参见例如US2017151333A1）、L319 (pKa = 6.38) 以及YSK13-C3 (pKa = 6.45)。

可电离阳离子脂质的pKa值可通过商业软件（例如ACD/Labs提供的软件）进行测量。

CPP > 1的磷脂

本发明LNV中CPP > 1的磷脂（例如DOPE）的功能是促进LNV形成非层状结构，并提升纳米颗粒的稳定性和递送效率。本公开的磷脂是那些临界堆积参数值 > 1（即固有曲率< 0，呈倒锥形的脂质）的磷脂，它们通常在LNV中促进形成非层状相（即取决于pH的六角相（HII）和/或海绵（L3）相），并进而促进与EV间的融合柄的形成。不受限于此，但根据本公开，可使用以下CPP > 1的磷脂： CPP > 1的磷脂酰乙醇胺（PE）类脂质、CPP > 1的单半乳糖基二酰基甘油（MGDG）类脂质、CPP > 1的单葡萄糖基二酰基甘油（MGIcDG）类脂质、CPP > 1的二磷脂酰甘油（DPG）类脂质、CPP > 1的磷脂酰丝氨酸（PS）类和磷脂酸（PA）类脂质。

在具体实施方案中，用于本公开LNV的所述至少一种CPP > 1的磷脂为CPP值 > 1的磷脂酰乙醇胺（PE）类脂质，在更具体的实施方案中，其为DOPE。

非离子型表面活性剂

本发明LNV中CPP值< 1的非离子型表面活性剂（例如KLP）的功能是稳定/促进形成LNV的非层状结构。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂充当膜渗透增强剂。具有固有曲率> 0且CPP值< 1的非离子型表面活性剂可用于本公开的LNV。不受限于此，但根据本公开，可使用以下表面活性剂：脂肪酸聚乙二醇酯（例如聚乙二醇12-羟基硬脂酸酯，如聚乙二醇单酯和12-羟基硬脂酸双酯的混合物，例如Kolliphor® HS15（KLP））、聚山梨酯（例如Tween^® 20和80）、聚乙二醇脂肪族醚（通常称为Brij 35和58的那些）、聚乙二醇脂肪族酯（例如PEG硬脂酸酯）以及脱水山梨醇酯（例如Span 60）。

在具体实施方案中，使用脂肪酸聚乙二醇酯，例如非离子型表面活性剂KLP。

自发脂质曲率（CPP值）

脂质几何形状可用CPP表示。CPP与脂质的烃链体积(v)和链长(l)以及极性头基所占的界面面积(a)相关。具体地，CPP通过以下方程计算：

头部基团与尾部链段之间的体积差异可视为脂质自发曲率的一种量度。单层的自发曲率由膜中脂质的堆积方式决定，即脂质与其周围分子的相互作用。因此，单层在双层膜中和在油-水界面处的自发曲率可能略有不同，因为油链穿透进入单层疏水部分的方式可能与双层情况下的穿透方式不同。具有大头部基团和小尾部链段的脂质（锥形，正曲率，CPP< 1）倾向于自组装成凸面结构，例如胶束；而头部基团和尾部链段体积相当的脂质（圆柱形脂质，CPP ~ 1）则形成平面双层或大囊泡；头部基团小、尾部链段大的脂质（倒锥形，负曲率，CPP > 1）会产生倒置聚集体，例如反六角相。可采用不同方法（即X射线衍射和渗透压法）测量脂质及其膜的自发曲率。这些方法和技术公开于例如Sodt等人，2013；BarraganVidal等人，2017；Rand等人，1990；以及Hamai等人，2006的文献中。

LNV组分比例

本公开的LNV包含以下组分的摩尔浓度：所述至少一种可电离阳离子脂质：约30%至约70%（例如约35%至约70%、约35%至约65%、约35%至约60%、约40%至约60%、约40%至约65%、约40%至约70%）；所述至少一种CPP > 1的磷脂：约10%至约50%（例如约10%至约45%、约10%至约40%、约10%至约38%、约10%至约35%、约10%至约30%、约10%至约25%、约10%至约20%；约15%至约45%、约15%至约40%、约15%至约38%、约15%至约35%、约15%至约30%、约15%至约25%、约15%至约20%；约18%至约45%、约18%至约40%、约18%至约38%、约18%至约35%、约18%至约30%、约18%至约25%、约18%至约20%）；所述至少一种CPP值< 1的非离子型表面活性剂：约20%至约50%（例如约20%至约49%；约20%至约48%；约20%至约47%；约20%至约46%；约20%至约45%；约20%至约44%；优选约20%至约43%；约20%至约42%；约21%至约50%；约21%至约49%；约21%至约48%；约21%至约47%；约21%至约46%；约21%至约45%；约21%至约44%；优选约21%至约43%；约21%至约42%；约22%至约50%；约22%至约49%；约22%至约48%；约22%至约47%；约22%至约46%；约22%至约45%；约22%至约44%；约22%至约43%；约22%至约42%；约20%至约35%；约20%至约30%；约20%至约25%；约21%至约35%；约21%至约30%；约21%至约25%；约22%至约35%；约22%至约30%；约22%至约25%）。选择上述摩尔浓度旨在使LNV中获得有用的药物或诊断剂（例如核酸）装载效率。当本公开的LNV仅由所述至少一种可电离阳离子脂质、所述至少一种CPP > 1的磷脂以及所述至少一种CPP值< 1的非离子型表面活性剂组成时，这些组分各自的摩尔浓度之和为100%。

药物

本文所用的“药物”一词是指任何具有药理活性的分子或分子混合物（包括未经批准的活性药物成分）。如本文所用，分子混合物具有药理活性。不受限于此，生物提取物（例如植物或动物提取物）包含在术语“分子混合物”中，因此也包含在术语“药物”中。可掺入本公开载体中的药物可以是低分子量活性药物成分（< 1000 Da）或大分子（> 1000 Da），例如多糖、肽、蛋白质、核酸（例如RNA（如siRNA、mRNA等）、DNA）、靶向蛋白水解的嵌合体（PROTACs）、抗体-药物偶联物以及疫苗抗原。

诊断剂

本文所用的“诊断剂”是指用作诊断测试组成部分的任何医药产品，例如放射性药物、用于成像技术（包括X射线、磁共振成像和超声）的造影剂、用于不涉及放射性同位素或成像技术的诊断测试的化合物、各种染色剂/标记物（即用于检测恶性细胞的染色剂）、抗体（即单克隆抗体）以及基于核酸的探针。在具体实施方案中，诊断剂是带负电荷的分子（例如含核酸的诊断剂）或疏水性分子。

药物与诊断剂的浓度

本公开的LNV可用于包封药物或诊断剂。当药物或诊断剂是核酸时，本公开负载核酸的LNV中，可电离阳离子脂质与核酸药物或诊断剂的比例（即N/P比）≥ 约1（例如≥ 2、≥3、≥ 4、≥ 5，介于6至300之间，或介于6至200之间，或介于6至150之间，或介于6至100之间，或介于6至50之间）。

药物或诊断的制剂

LNV通过在酸性pH下混合水相（例如盐水、纯水）和有机介质（例如乙醇）来制备。亲水性药物在包封入LNV前溶解于水相，而疏水性药物则在装载入LNV前溶解于有机相。

受试者

本文所用术语“受试者”是指任何动物，例如哺乳动物，包括人、狗、猫、猪、牛、猴、牛、马等。在一个特定实施方案中，它指人，在具体实施方案中指成年受试者。

制备负载药物或诊断剂的LNV的方法

本公开的LNV通过混合以下组分制备：(i) 有机相，包含溶解于溶剂中的至少一种可电离阳离子脂质、至少一种CPP > 1的磷脂、至少一种CPP值< 1的非离子型表面活性剂；以及 (ii) 水相。在混合过程中，水相与有机溶剂的体积流量比为0.5:1至5:1。在一个更具体的实施方案中，该比例为1.5:1。当制备负载疏水性药物（或诊断剂）的LNV时，将疏水性药物（或诊断剂）加入有机相；当制备负载亲水性药物（或诊断剂）的LNV（例如核酸）时，将亲水性药物（或诊断剂）加入水相。

用于制备本公开LNV的混合方法包括任何微流控装置。不受限于此，它包括任何微流控芯片设计，包括微混合器、流体动力学聚焦芯片、T型接头芯片、混沌微混合器、分叉混合器和挡板混合器。在一个特定实施方案中，采用由Y型入口设计形成的芯片。在具体实施方案中，所用混合装置是采用高精度注射泵的微流控装置。在具体实施方案中，微流控装置的总流速介于0.001 mL/min至100 mL/min之间，优选流速约为0.05 mL/min；和/或微流控装置的体积流量比为0.5:1至5:1；和/或微流控装置的微通道深度介于1 µm至500 µm之间，优选约100 µm，通道入口宽度介于1 µm至500 µm之间，优选约100/200 µm，通道混合器宽度介于1 µm至500 µm之间，优选约200 µm，通道出口宽度介于1 µm至500 µm之间，优选约200µm。

混合方法还包括乙醇注射法、薄膜蒸发法、反相蒸发法、高压均质化（HPH）、高剪切均质化、超声处理、微乳液形成法，以及任何其他能产生脂质基颗粒的方法。

由此制备出具有pH诱导结构转换特性的非层状LNV，其粒径为20至200 nm，在具体实施方案中约为100 nm，该LNV在酸性pH下形成六角相结构（HII），在中性pH下形成海绵（L3）相结构。（图1A, 1G-1H, 2A）

有机相溶剂

本公开使用的有机溶剂是任何可生物相容的溶剂，其中可电离阳离子脂质和具有CPP > 1的磷脂可溶。不受限于此，它包括醇类（例如乙醇）、油类（例如氟化油）和氯仿。在具体实施方案中，有机相溶剂为乙醇。所用有机溶剂的量足以溶解脂质。在具体实施方案中，脂质在溶剂中的浓度介于每毫升溶剂10微克脂质至每毫升溶剂1克脂质之间。在具体实施方案中，脂质在溶剂中的浓度介于每毫升溶剂1毫克脂质至每毫升溶剂20毫克脂质之间，或介于每毫升溶剂5毫克脂质至每毫升溶剂15毫克脂质之间，或介于每毫升溶剂10毫克脂质至每毫升溶剂15毫克脂质之间。

水性介质

水性介质用于LNV的生产（水相）以及LNV与EV的杂合步骤。本公开使用的水性介质是任何水性介质，包括纯水或盐水。水性介质可具有不同的组成、pH和渗透压。

当待装载到LNV中的药物或诊断剂带负电荷（例如核酸如RNA）时，用于生产LNV（例如负载核酸的LNV）的水性介质的pH范围可为约4至约6，例如4、4.5、5、5.5、6，优选介于约4至6之间。在具体实施方案中，使用乙酸钠缓冲液(pH 4)。可通过添加缓冲液组分（例如乙酸盐缓冲液、乙酸钠、柠檬酸盐缓冲液、柠檬酸钠或柠檬酸磷酸盐缓冲液）和/或酸或碱（例如盐酸和/或氢氧化钠）来调节pH以达到所需pH值。当待装载到LNV中的药物或诊断剂为中性时，水性介质的pH也可高于6并最高达10。LNV形成后，可用例如磷酸盐缓冲液（如PBS）或HEPES缓冲盐水（HEBS）或Tris缓冲液将水溶液中和至pH 7.4。

含有LNV的水溶液可通过将pH提高至约7或更高，最高至约10，来配制储存以备将来使用，或调整用于与EV的杂合步骤。如果含有LNV的水溶液已被中和（例如用PBS），则可用酸或碱（例如盐酸和/或氢氧化钠）进行更精确的调节。

用于杂合步骤的水性介质可进一步包含渗透剂，以实现与EV等渗的溶液。EV的渗透压通常为200-500 mOsm/kg。可使用渗透剂，例如氯化钠、葡萄糖、明胶、木糖醇、山梨醇、甘露醇、葡萄糖聚合物（例如艾考糊精）或氨基酸。

杂合步骤中使用的水性介质的pH高于6且最高至约10，高于7，高于7.1，高于7.2，高于7.3，或介于约7.4至约10之间。

EVs

通用术语“EVs”在本文中描述了天然EVs以及为模拟天然EVs而制备的合成或生物工程化EVs（参见例如exoIL-12™、exoSTING™、exoASO™-STAT6、AGLE-102™、ExoAAV、OmniSome、ILB-202）。“天然EVs”可定义为源自任何真核或原核细胞或组织的异质性膜性囊泡结构群体。它们可根据其特性（如大小、密度和组成）或生物发生途径进行分类，例如，来自哺乳动物细胞的小EVs（≤ 200 nm）主要源于内体，通常被称为外泌体。中型或大型EVs（>200 nm）通常通过质膜出芽形成，被称为外泌体/微囊泡，或在细胞死亡时通过凋亡小体脱落形成（Théry等人，2018）。

术语EVs还指如上所述的EVs的一部分和/或天然EVs的挤出/均质化形式，以及全细胞的挤出形式。挤出/均质化通过任何已知方法进行，例如使用高压挤出器或离心设备通过纳米/微米级滤膜孔挤出，以及通过超声处理、氮气空化、冻融循环或Dounce匀浆器等方式对细胞/EVs进行机械均质化/破碎。

本公开的ssEVs保留了EV表面/膜蛋白功能的至少一部分，以及EV固有的生物活性（例如再生活性、抗炎活性、血管生成、心脏保护和归巢/靶向特性，即识别特定组织/细胞的能力）。

分离EVs的方法

EVs可使用已知方法从生物样品中分离，例如基于离心的方法（如超速离心和密度梯度离心）、基于亲和的方法（如基于蛋白的亲和捕获（例如抗体捕获或MagCapture™试剂盒）或基于膜的亲和捕获（如ExoEasy™试剂盒））、基于沉淀的方法（如ExoQuick™试剂盒）、基于微流控的方法、基于过滤的方法（如切向流过滤和超滤）以及如Wu等人，2023中所述的尺寸排阻色谱法。在一个具体实施方案中，使用差速离心、微滤和超速离心相结合的方法分离EVs。

本文所用术语“生物样品”（可从中分离用于本公开的EVs）包括源自真核生物和原核生物的任何细胞和组织。它包括培养的动物（哺乳动物，如人）细胞系或属于任何组织/器官（例如肺、脑、胰腺、肿瘤/癌、肝、骨髓、血液等）的原代细胞；任何人类/哺乳动物生物流体（例如血液、脑脊液、血清、尿液、（母乳）乳汁、唾液、滑液、胆汁、腹水、羊水、精液、排泄物）；任何培养的细菌菌株（革兰氏阳性和革兰氏阴性）；任何来自真菌和植物的EV。

制备半合成EV颗粒（ssEVs）的方法

将LNVs（例如，负载药物的如核酸、负载诊断剂的）与EVs在水性介质（参见上文，例如PBS）中混合（例如孵育），温度介于4至60°C之间，pH值介于大于6至10之间，例如6.1至10、6.2至10、6.3至10、6.4至10、6.5至10、6.6至10、6.7至10、6.8至10、6.9至10、7至10、7.1至10、7.2至10、7.3至10、7.4至10、7.5至10、6.1至9、6.2至9、6.3至9、6.4至9、6.5至9、6.6至9、6.7至9、6.8至9、6.9至9、7至9、7.1至9、7.2至9、7.3至9、7.4至9、7.5至9。混合持续时间为1秒至48小时（例如5、10、15、20、30、40、50、55秒；1、2、3、4、5、6、10、15、20、25、30、55分钟；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、24、30、36或42小时，以及其间的任何范围）。

ssEVs

ssEVs是LNV与EV融合的结果（参见例如图2C-E、2G-I、图3E和3G）。在具体实施方案中，它们通过本公开的方法制备。在其他具体实施方案中，它们基本上包含本公开LNV和本文所述EV的全部组分（部分或完全混合）。在此上下文中使用的术语“基本上全部组分”意指虽然LNV和EV各自的大部分（至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%）组分存在于ssEVs中，但它们不一定包含所有组分（例如，由于制备方法的原因）。在此上下文中使用的术语“部分或完全混合”旨在涵盖融合所有阶段存在的ssEVs（参见例如图2C-2E和3F）。

根据本公开的ssEVs的平均粒径介于约20 nm至2000 nm之间（取决于例如EV来源、挤出等）。在具体实施方案中，平均粒径约为20 nm ~ 500 nm、20 nm ~ 450 nm、20 nm ~400 nm、20 nm ~ 350 nm、20 nm ~ 300 nm、20 nm ~ 250 nm、约50 nm ~ 250 nm、约75 nm~ 250 nm、约100 nm ~ 250 nm、约125 nm ~ 250 nm、约130 nm ~ 250 nm、约140 nm ~ 250nm、约150 nm ~ 250 nm、约160 nm ~ 250 nm、约20 nm ~ 225 nm、约50 nm ~ 225 nm、约75nm ~ 225 nm、约100 nm ~ 225 nm、约125 nm ~ 225 nm、约130 nm ~ 225 nm、约140 nm ~225 nm、约150 nm ~ 225 nm、约160 nm ~ 225 nm、约20 nm ~ 215 nm、约50 nm ~ 225 nm、约75 nm ~ 215 nm、约100 nm ~ 215 nm、约125 nm ~ 215 nm、约130 nm ~ 215 nm、约140nm ~ 215 nm、约150 nm ~ 215 nm、约160 nm ~ 215 nm、约20 nm ~ 200 nm、约50 nm ~200 nm、约75 nm ~ 200 nm、约100 nm ~ 200 nm、约125 nm ~ 200 nm、约130 nm ~ 200nm、约140 nm ~ 200 nm、约150 nm ~ 200 nm、约160 nm ~ 200 nm。

本方法允许在施用给有需要的受试者之前，在现场（即治疗点）原位生产ssEVs。

组合物/制剂

药学上可接受的赋形剂包括以下一种或多种：冷冻保护剂（例如蔗糖、葡萄糖、海藻糖，或合成聚合物如泊洛沙姆和聚乙烯吡咯烷酮等）、渗透剂（例如葡萄糖、乳果糖、山梨醇、氢氧化镁、柠檬酸镁、氯化钠、氯化钾、聚乙二醇等）、盐类（例如磷酸钠、磷酸钾、三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸钠等）。

LNV组合物/制剂

LNVs可与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合形成组合物（液体或固体），并例如储存以备将来使用。例如，它们可以在以下物质存在下进行冷冻干燥：(i) 一种或多种冷冻保护剂（例如蔗糖、葡萄糖、海藻糖，或合成聚合物如泊洛沙姆和PVP），(ii) 一种或多种渗透剂（例如葡萄糖、PEG、乳果糖、山梨醇、氢氧化镁、柠檬酸镁、氯化钠和氯化钾），以及(iii) 一种或多种盐类（例如磷酸钠、磷酸钾、Tris、柠檬酸钠），然后用水性介质重悬，或作为水性悬浮液在-80至8°C的温度范围内储存。

在具体实施方案中，至少一种胆固醇和PEG脂质（聚乙二醇化）可添加至LNV中（例如DSPE-PEG，分子量=2 kDa；DMG-PEG，分子量=2 kDa）。

ssEV组合物/制剂

ssEVs可与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合形成组合物（液体或固体），并例如储存以备将来使用。例如，它们可以在冷冻保护剂（例如蔗糖、葡萄糖、海藻糖，或合成聚合物如泊洛沙姆和PVP）和盐类组合物（例如磷酸钠、磷酸钾、Tris、柠檬酸钠、氯化钠和氯化钾）存在下进行冷冻干燥，然后用水性介质重悬，或作为水性悬浮液在-80至+8°C的温度范围内储存。

它们也可以包埋于聚合物基质中（例如作为凝胶、植入物或装置）或制成经典药物制剂（例如软膏、胶囊、预填充注射器等）。

在具体实施方案中，可向ssEV中添加胆固醇和/或PEG脂质（聚乙二醇化），例如以提高其稳定性（例如DSPE-PEG，分子量=2 kDa；DMG-PEG，分子量=2 kDa）。

或者，ssEVs可在注射给有需要的受试者之前，在现场（即治疗现场）原位生成。

试剂盒

本发明范围内还包括试剂盒，其包含 (a)至少一种本公开的LNV或包含至少一种LNV和至少一种药学上可接受赋形剂的组合物（液体或固体，例如LNV粉末（如冻干粉））；以及 (b) (i) 用于水化所述至少一种LNV或其组合物（例如在其使用前）的溶液，任选地包含至少一种药学上可接受的赋形剂；(ii) 药物或诊断剂（例如用于装载入LNV或用作对照）；(iii) 包含EVs和至少一种药学上可接受赋形剂的组合物（液体或固体）；(iv) 使用所述至少一种LNV或其组合物的说明书（例如用于从LNV生产ssEVs的说明和/或用于施用ssEV的说明）；或 (v) (i) 至 (iv) 中至少两项的组合。在一个具体实施方案中，试剂盒包含 (a)固体形式（例如冻干）的至少一种LNV（未装载或装载有药物或诊断剂）或固体形式（例如冻干）的包含所述至少一种LNV和至少一种药学上可接受赋形剂（例如至少一种冷冻保护剂）的组合物；以及 (b) (i) 用于水化所述至少一种LNV或组合物的溶液，该溶液含有至少一种药学上可接受的赋形剂（例如至少一种渗透剂和盐，以为LNVs提供等渗环境）。在另一个具体实施方案中，试剂盒还包含 (b) (ii) 药物或诊断剂（例如用于装载入LNV或用作对照）。

本发明范围内还包括试剂盒，其包含 (a) 至少一种本公开的ssEV，或包含所述至少一种ssEV和至少一种药学上可接受赋形剂的组合物（液体或固体）；以及 (b) (i) 用于水化所述至少一种ssEV或其组合物（在其使用前）的溶液；(ii) 使用这些成分的说明书（例如施用至少一种ssEV或其组合物的说明书）；或 (iii) (i) 和 (ii) 的组合。

试剂盒通常包含标示其内容物预期用途的标签。术语“标签”包括随试剂盒提供或附于试剂盒上的任何书面或记录材料，或以其他方式伴随试剂盒的材料。试剂盒可进一步包含一种或多种容器、试剂、施用装置。此类试剂盒的一个示例包含 (i) 包含LNV的第一组合物（液体或固体），其装于第一容器中或第一容器的第一隔室中；以及 (ii) 包含EV和至少一种药学上可接受赋形剂的第二组合物（液体或固体），其装于第二容器中或第一容器的第二隔室中。使用前，可通过例如打破分隔这些隔室的壁，使第一和第二隔室的内容物合并，从而混合第一和第二组合物。在混合物中形成ssEVs后，可将所得溶液施用于有需要的受试者。

用途

本公开的LNVs（例如负载药物或诊断剂的）可包含在用于生产ssEVs的商业试剂盒中。此类ssEVs可用于体外和体内研究，或用于临床（例如治疗或诊断）目的。

施用途径

本公开的ssEV可通过肠胃外、局部或口服途径施用。

受试者

本文所用术语“受试者”或“有需要的受试者”指将从接受有效量的本发明ssEVs或其组合物中受益的受试者。在具体实施方案中，它指动物、哺乳动物和人。本发明的ssEVs和组合物也可用于兽医应用，并用于宠物或其他动物（例如猫、狗、马等宠物；以及牛、鱼、猪、家禽等）。

在本发明描述中（尤其是在下述权利要求的上下文中），术语“一个/种”和“一个/种”以及“所述”以及类似指称的使用应解释为涵盖单数和复数两者，除非本文另有说明或上下文明显矛盾。

术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放式术语（即意为“包括但不限于”），除非另有说明。

本文中数值范围的叙述仅旨在用作分别指代落入该范围内的每个单独数值的简写方法，除非本文另有说明，并且每个单独数值均如同在本文中单独记载一样并入说明书。范围内的所有值子集也如同在本文中单独记载一样并入说明书。

本文描述的所有方法可以任何合适的顺序进行，除非本文另有说明或上下文明显矛盾。

术语“约”具有其普通含义。在实施方案中，它可以指所限定数值的±10%。本文中，术语“大约”具有其普通含义。在实施方案中，它可以指所限定数值的±10%。

本文提供的任何及所有示例或示例性语言（例如“诸如”）的使用仅旨在更好地说明本发明，并不对本发明的范围构成限制，除非另有要求。

说明书中的任何语言均不应解释为指示任何未要求保护的元素对本发明的实践是必需的。

以下非限制性实施例进一步详细说明本公开。

实施例1：材料与方法

LNV的制备

未负载LNV

通过混合有机相与水相制备LNVs及纳米颗粒。有机相包含下表I所列组分（摩尔浓度如下表I所示），溶于乙醇溶剂中；水相包含pH 4的乙酸盐缓冲液（实施例2-9的LNVs制备参见图1A）。实施例10-13所用纳米颗粒的制备方法如图1A所示，区别仅在于有机相包含表I相应各列所列组分。

表I：本文示例所用LNV及纳米颗粒的组分

通过用单独的注射器将每一相分别引入微流控装置进行混合（见图1A）。使用了一种基于Y型入口设计、可实现扩散混合的芯片，其通道深度为100 µm，入口通道宽度为100/200 µm，混合器通道宽度为200 µm，出口通道宽度为200 µm（Fluidic™ 186微混合器，购自德国Microfluidic ChipShop）。混合过程中，水相与有机相的体积流量比设定为1.5:1，并使用高精度注射泵，总流速为0.05 mL/min。

随后通过透析从有机溶剂中纯化制备的LNVs，使用Slide-A-Lyzer™ Mini透析装置（MWCO = 20 kDa），在pH 7.4的PBS或pH 7.4的HEBS（20 mM HEPES，150 mM NaCl）中透析，透析液体积过量1000倍。此过程得到pH 7.4条件下的LNVs。向样品中加入盐酸，以制备pH 5条件下的LNVs。所有制剂的pH值均使用pH计仔细检查。

负载siRNA的LNVs

负载siRNA的LNVs的制备方法与未负载LNVs相同，区别在于在调节水相的pH后加入siRNA。

针对绿色荧光蛋白的siRNA(GFP-siRNA)的核苷酸序列为5'-GAACUUCAGGGUCAGCUUGGG-3'（SEQ ID NO: 1）（3'突出端：正义链(5'-3') dGdG；反义链(5'-3') dTdT）；分子量 = 13365.1 g/mol）。使用的siRNA浓度分别为5.7、11.4、22.8、45.6 µM，以获得分别为50、25、12和6的N/P比。所述GFP-siRNA由Microsynth AG（瑞士）定制合成。

纳米颗粒流式细胞术实验所使用的siRNA为FAM标记的siRNA（MISSION® siRNA荧光通用阴性对照，6-FAM，Sigma-Aldrich，美国）；分子量 = 13854 g/mol），N/P比为25；或者，通过用Atto 488标记的DOPE替换1 mol%的DOPE来标记负载GFP-siRNA的LNVs。

体外敲低实验中，还在LNVs中额外装载了乱序对照siRNA序列作为阴性对照（CTRL-siRNA，核苷酸序列为5'-UAAGGCUAUGAAGAGAUACTT-3' (SEQ ID NO: 2)，3'突出端：正义链(5'-3') dTdT；反义链(5'-3') dTdT；分子量=13270.0)，N/P比为25。该对照siRNA由Microsynth AG（瑞士）定制合成。

负载mRNA的LNV

LNV的制备方法如前所述，区别在于在调节水相的pH后加入mRNA。

mRNA为萤火虫荧光素酶mRNA（FLuc-mRNA，TriLink BioTechnologies，美国；分子量~637715.0 g/mol）或Cy-5标记的萤火虫荧光素酶mRNA（Cy5-FLuc-mRNA，CellernaBioscience，德国；分子量~785980.0 g/mol），浓度为0.25 µM，N/P比为25。

不含MC3的纳米颗粒

纳米颗粒的制备使用与LNV相同的方案，如前所述，区别在于有机相包含DOPE和KLP，摩尔浓度分别为48%和52%。

凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)

对于EMSA实验，将0.1 µg负载于LNVs中的GFP-siRNA或游离GFP-siRNA，与1% (v/v) Triton™ X-100混合或不混合，上样至0.5% (w/v)琼脂糖凝胶。凝胶在0.5 x TAE缓冲液（Tris-base 20 mM，10 mM乙酸，0.5 mM EDTA）中于70 V电泳30分钟，然后用SYBR™ Gold核酸凝胶染料（Thermo Fischer Scientific，美国）染色45分钟，并使用ChemiDoc™ MP成像系统（Bio-Rad，美国）成像。类似地，在37℃下与5 µg/mL RNase A预孵育1小时（有/无Triton™ X-100）后进行EMSA实验，以评估siRNA货物对核酸酶介导降解的抗性。

细胞培养

将骨髓来源的间充质干细胞(MSC)系HS-5在三维培养体系中培养于微载体上来制备EV。具体而言，将118 x10⁶个HS-5细胞接种于4.5 g Corning™ Enhanced Attachment微载体（Corning，美国）上，置于含总体积为300 mL含血清的DEMEM培养基的500 mL Corning™可重复使用的玻璃搅拌瓶（Corning，美国）中。先采用间歇搅拌程序（30 rpm搅拌5分钟，停60分钟），随后将搅拌桨速度设置为连续模式35 rpm。48小时后，用PBS洗涤微载体两次，并向搅拌瓶中加入400 mL新鲜的无血清无酚红培养基。在无血清培养基中培养48小时后收集细胞培养上清。

从细胞培养上清中分离EVs

采用离心、微滤和超速离心相结合的方法从细胞培养上清中分离EVs。首先，使用配备Fiberlite™ F12-6 x 500 LEX固定角转子的Sorvall™ LYNX 6000离心机（均为Thermo Fisher Scientific，美国），将上清依次在500 x g、2,000 x g各离心5分钟，再在10,000 x g离心20分钟。然后将澄清的细胞培养上清通过0.2-µm滤膜过滤，之后使用Optima™ XE-90超速离心机（UC）（Beckman Coulter，美国）和Type 45 Ti固定角钛转子进行超速离心（4℃，100,000 x g，70分钟）。首次超速离心后，用PBS或HEBS洗涤EV沉淀并合并。在相同条件下再次离心，将EV沉淀重悬于冰浴的PBS/HEBS中，并于-20℃储存。

负载核酸（NA）的LNVs与EVs杂合——ssEVs的形成

将不同的RNA负载LNVs（即上述siRNA和mRNA）与MSC源性EVs在水性介质（pH 5、6、7.4或9的PBS或HEBS）中混合，采用不同的EV:LNV颗粒数比（4:1、1:1和1:4）、时间点（5分钟、30分钟、1小时和4小时）、温度（4℃、25℃和37℃）和pH值（5、6、7.4和9）。为达到所用的特定pH值，必要时通过添加盐酸和/或氢氧化钠仔细调节LNV的pH，并用pH计确认。更具体地，使用62.5 mM盐酸或氢氧化钠溶液分别降低或升高pH。每次均使用InLab Micro™ pH电极（Mettler Toledo，美国）仔细检查样品的pH。

HeLa细胞活力

使用CellTiter 96^® AQueous One Solution细胞增殖检测试剂盒（MTS）（Promega，瑞士）测定细胞活力。简言之，将HeLa细胞（每孔2500个细胞，总体积200 µL完全DMEM培养基）接种于96孔板中，在37℃下孵育24小时。然后向孔中加入2 µL LNVs或负载GFP-siRNA的LNVs，使其达到特定的最终脂质浓度（范围从12.5到200 µg mL^-1，稀释倍数1:2），并与细胞共孵育4和24小时。阴性对照组细胞加入2 µL PBS。阳性对照组细胞加入0.5%(v/v) Triton™ X-100。随后，去除培养基，用PBS轻轻洗涤细胞，加入100 µL完全DMEM培养基。加入20 µL MTS试剂，将HeLa细胞在37℃下孵育1小时。使用Tecan Spark^®和Infinite™M200酶标仪（均为Tecan，瑞士）在490 nm处记录吸光度。结果使用i-control™ 2.0软件处理。所有制剂均测试了三个独立批次（n=3）。

冷冻透射电子显微镜

将3 µL ssEV、LNV或EV的PBS悬浮液加到经辉光放电处理（在英国QuorumTechnologies Ltd.的Emitech™ K100X辉光放电系统中处理30秒，）的300目lacey碳支持膜铜网上。使用Vitrobot™ Mark II（Thermo Fisher Scientific，美国）将样品在液乙烷和丙烷混合物中快速冷冻。通过受控吸滤去除多余样品，然后将网格转移到Gatan™冷冻样品杆上，并使用Tecnai™ F20冷冻电镜（Field Electron and Ion Company，美国）在明场模式下以200 kV加速电压成像，观察期间样品保持在-180℃。使用Falcon II™ 4K直接电子探测器（Field Electron and Ion Company，美国）在低剂量条件（<500电子 nm^-2）下记录显微照片。

小角X射线散射（SAXS）

将20 µL样品小心地加入硼硅酸盐玻璃毛细管中。毛细管长度为80 mm，壁厚为0.01 mm，使用皮下注射不锈钢针头上样。为确保密封性，每根毛细管的上部均使用超高真空2-K环氧树脂胶（1份树脂比1份固化剂，v/v，UHU plus，德国）进行精密封闭，分两次连续进行，每次一小时。随后，将毛细管插入专用样品架，然后装入仪器进行进一步分析。SAXS测量使用自建SAXS系统（Xeuss™ 3.0，Xenocs，格勒诺布尔，法国）进行，该系统配备Genix™3D光源（Xenocs）。X射线能量为50 kV（λ = 1.54 Å，Cu K_α），样品位置的光子通量 > 10^-7 计数/秒。样品上的光束尺寸约为0.5 x 0.5 mm²（半高宽）。使用山嵛酸银标准品校准的样品到探测器距离为500 mm，散射信号由Dectris Eiger 1 M探测器（1028 x 1062像素，像素尺寸75 x 75 µm²，Dectris Ltd.，巴登，瑞士）收集。总信号记录时间 > 8400秒。SAXS数据显示在q范围0.016至0.69 Å^-1内，对应的实际长度尺度为1.0466至39.25 nm。使用XSACT（Xenocs）2.6软件包对探测器数据进行掩模、方位角积分、归一化为绝对强度（cm^-1）并扣除背景。

积分强度I(q)相对于散射矢量q的幅值作图，散射矢量q的计算公式为：

动态光散射和静态光散射（DLS/SLS）实验

在25℃、179°散射角下，通过DLS测量LNVs的流体力学尺寸（d_h，单位nm）和zeta电位（ζ-pot，单位mV）使用Malvern Zetasizer™ Advance Pro仪器（Malvern Panalytical，英国）。在控温条件（4℃、25℃和37℃）下，使用DynaPro™ Plate Reader III（WyattTechnology，美国）在密封的384孔微孔板（Aurora Microplates，美国）中进行DLS和SLS时程实验。将微孔板与30 µL LNV悬浮液（~8 x 10⁸颗粒/mL）预孵育约30分钟，直至达到稳定的颗粒浓度读数。然后加入等颗粒数（比例实验除外）的EV，并继续测量（颗粒浓度和d_h）1小时。

评估CD73和CD26酶活性

在测量酶活性之前，EVs要么用LNVs处理形成本公开的ssEVs，要么用Exo-Fect™外泌体转染试剂盒（System Biosciences，美国）进行转染。为测量EV膜蛋白CD73的活性，采用了基于吸光度的孔雀石绿检测法。具体而言，将来自不同测试条件（在HEBS中，pH 7.4）的0.1 μg EV蛋白重悬于60 µL 10 mM Tris缓冲液（pH 7.4）中，然后加入30 µL 800 µM AMP储备液（溶于10 mM Tris缓冲液），使最终浓度达到240 µM。然后将混合物在25℃下孵育10分钟，通过向孔中加入40 µL显色试剂（0.034% (w/v) 孔雀石绿，1.55% (w/v) 四水合钼酸铵，0.0625% (v/v) 聚山梨酯20）来终止酶促反应。板在25℃下孵育1小时，使用Infinite™M200酶标仪在620 nm处测量吸光度。扣除背景后的吸光度值以经受相同杂合条件的EVs所获得的值进行归一化。

杂合使用市售的DPPIV-Glo™蛋白酶检测试剂盒（Promega，瑞士），并按照制造商说明评估杂合后的CD26酶活性。简言之，将25 µL HEBS（pH 7.4）中的0.08 μg EV蛋白与等量的DPPIV-Glo™试剂混合，并在25℃下孵育30分钟。使用Infinite™ M200 Pro酶标仪（Tecan，瑞士）测量发光值，并以经受相同杂合条件的EV所获得的值进行归一化。

纳米颗粒流式细胞术(NanoFCM)分析

按照制造商说明并稍作修改，用CellTrace™ Far Red（Thermo FisherScientific，美国）或5(6)-羧基荧光素二乙酸N-琥珀酰亚胺酯（CFDA-SE）（Chemodex AG，瑞士）标记EVs。简而言之，将EVs与5 μM相应染料混合，并在4℃下孵育过夜。随后，将混合物在37℃下孵育15分钟，使染料进行乙酸酯水解。之后使用Pur-A-Lyzer™ Mini 6000透析试剂盒（Sigma-Aldrich，美国）在4℃下对1000倍体积的PBS透析过夜，以去除未结合的染料。然后将荧光标记的LNV（FAM-siRNA、Cy5-FLuc-mRNA和Atto 488 DOPE）和标记的EV以1:1的颗粒比在4℃或37℃下混合30分钟，并使用Flow NanoAnalyzer™ N30（NanoFCM Co., Ltd,UK）仪器评估ssEV的形成。

对于使用Exo-Fect™外泌体转染试剂盒的对照实验，根据制造商说明，将等量的FAM-siRNA（~ 12 μM）与Exo-Fect™试剂混合。在三个不同通道488/10（侧向散射）、525/40和670/30（带通滤光片）上记录事件1分钟，并使用单光子计数雪崩光电二极管检测器（SPCMAPD）收集。

对于FAM-siRNA和Atto 488 DOPE实验，蓝色488 nm激光设置为10/50 mW，红色638nm激光设置为40/100 mW，SS衰减为0.2%。对于Cy5-FLuc-mRNA实验，488 nm激光更改为20/50 mW，638 nm激光更改为20/100 mW。除Exo-Fect™转染的样品用PBS稀释1:80 (v/v)外，大多数样品在测量前用PBS稀释1:50 (v/v)。使用NanoFCM™ Professional Suite软件（1.8版，NanoFCM Co., Ltd, UK）处理样品，并使用FlowJo™ v10软件（BD Biosciences，美国）分析数据。

GFP敲低实验

对于GFP敲低实验，在24孔板中每孔接种30,000个HeLa-GFP细胞（Cell Biolabs,Inc.，美国）。在37℃和5% CO₂下孵育24小时后，用负载GFP-siRNA（siGFP）或乱序对照siRNA（siCTRL）的LNVs或ssEVs处理细胞。使用负载GFP-siRNA的Lipofectamine™ RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific，美国）和裸GFP-siRNA分别作为阳性和阴性对照。所有样品在100 µL OptiMEM™中制备，并加入到400 µL含10% (v/v)血清的DMEM中，使每种条件下siRNA的最终浓度为10 nM。再孵育48小时后，使用CytoFLEX™流式细胞仪（BeckmanCoulter，美国）分析GFP表达。然后用PBS洗涤细胞两次并进行胰蛋白酶消化。将细胞收集于含血清的DMEM中，并在300 g下离心5分钟。细胞沉淀用PBS洗涤一次，并根据制造商说明用Zombie NIR™可固定活力试剂盒（Biolegend，美国）处理。孵育15分钟后，通过300 g离心10分钟沉淀细胞，并重悬于120 µL冰冷的流式细胞术缓冲液（含0.5% (w/v) BSA和2 mM EDTA的PBS）中进行分析。使用FlowJo™ v10软件处理数据。

荧光素酶表达

对于荧光素酶实验，转染前一天在96孔板中每孔接种5,000个HeLa细胞。在37℃和5% CO₂下孵育24小时后，将培养基替换为90 µL FBS。然后用不同浓度的负载FLuc-mRNA的LNVs和ssEVs处理细胞。使用负载FLuc-mRNA的Lipofectamine™ MessengerMAX™（ThermoFisher Scientific，美国）和裸FLuc-mRNA分别作为阳性和阴性对照。对于每种条件，向孔中加入12 µL PBS中的样品，使得每孔加入细胞的最终mRNA剂量为100、10、1和0.1 ng，最终血清浓度约为90% (v/v)。孵育24小时后，用DPBS洗涤细胞两次，然后裂解细胞，并使用Pierce™萤火虫荧光素酶发光检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国）测定荧光素酶表达。使用Tecan Spark^®微孔板读取仪进行发光测量，并根据Micro BCATM蛋白检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国）确定的蛋白上样量进行归一化。

实施例2：脂质比例、pH和N/P比对未负载与负载siRNA的LNV理化特性的影响

按照实施例1所述，在pH 5和7.4条件下，使用不同摩尔浓度的MC3（40%、50%和60%）制备未负载LNVs和负载siRNA的LNVs。

未负载LNVs和负载siRNA的LNVs的流体力学直径(d_h)随着MC3摩尔浓度的升高或制备时更碱性的pH而增大（图1B（未负载LNVs），图1D（负载siRNA的LNVs））。未负载LNVs和负载siRNA的LNVs的ζ电位随着制备时更碱性的pH而降低（图1F）。在未负载LNV（图1C）或负载siRNA的LNVs（图1E）中，多分散系数随MC3百分比或pH的变化不显著。不同N/P比对负载siRNA的LNVs的粒径和PDI无显著影响（图1M-N）。通过EMSA在存在或不存在Triton™ X-100的情况下，证实LNVs中包封有siRNA（图1O）。仅当用Triton™ X-100溶解LNVs时才能检测到siRNA。

siRNA的装载效率不受所测试的不同N/P比和MC3摩尔浓度的影响（图1P-Q）。负载于LNV中的siRNA（N/P 25，60% MC3，pH 7.4）的完整性得到确认（图1R）。

冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）图像显示，LNVs和负载siRNA的LNVs在pH 7.4和5条件下均具有约100 nm的粒径和非层状结构（图1G-J）。

在pH 5和7.4条件下，对LNVs和负载siRNA的LNVs（N/P 25，60 mol % MC3）进行小角X射线散射（SAXS）分析，揭示关于颗粒结构的更详细信息（图1K-L，分别为pH 5和pH7.4）。

更具体地，pH 5条件下未负载LNVs的SAXS扫描图（图1K）显示明确的六角相（HII相）的形成，其q值位置比为1:√3:2。估计其特征重复距离(d)和中心到中心距离(α)分别为6.93 nm和8.01 nm。加入N/P比为25的siRNA后，在q值为1.2 nm^-1处出现了一个额外的峰，表明形成了具有较小特征间距的第二相。这可能是由于存在含有复合siRNA的颗粒群体。在pH7.4条件下，高级峰消失，但第一个结构峰仍然存在，尽管宽得多（图1L）。在有无siRNA（即LNVs和负载siRNA的LNVs）的情况下均观察到这一点，表明HII相转变为更无序的非层状相，更具体地说是海绵状结构（L3）相。一旦加入siRNA，基于HII相的结构变得更加无序，并出现第四个峰（图1K，深色线）。中性pH下的L3相有助于LNV获得适当的融合能力。

实施例3：使用负载siRNA的LNVs制备的ssEVs的理化特性表征

在两个不同的实验设置中，根据实施例1所述方法，将CellTrace™ Far Red（CT）标记的EVs分别与FAM-siRNA负载的LNVs（图2G）或Atto 488 DOPE标记的LNVs（图2H）混合，使用LNVs（60% MC3；N/P 25），在37℃、pH 5和pH 7.4条件下孵育30分钟。（图2G）在pH 7.4条件下，将LNVs与EVs混合后出现双阳性群体（方框内），证实了ssEVs的形成（第5列，第1行）。例如，当仅将裸FAM-siRNA加入EVs时（图2G，第4列，第1行和第2行），或使用Exo-Fect™外泌体转染试剂盒时（图2G，第4列和第5列，第3行），或在所有其他测试的对照样品中，均未出现该群体。在pH 5条件下，产生大型杂合体（图2G，第5列，第2行）。（图2I）显示，在pH 7.4条件下使用LNVs将FAM-siRNA装载入ssEVs，或在pH 5条件下装载入Hyb，其效率显著高于使用商业Exo-Fect™试剂盒所达到的效率。（图2H）显示，当Atto 488 DOPE标记的LNVs与CellTrace™标记的EVs混合时，在pH 7.4条件下也出现双阳性群体（方框内），证实了ssEVs的形成（图2H，第3列，第1行）。在pH 5条件下形成大型杂合体（Hyb）（图2H，第3列，第2行）。（图2J）展示双阳性ssEVs（pH 7.4）或Hyb（pH 5）群体占总颗粒群体的百分比，即Atto 488DOPE从LNVs转移至EVs的比例，证实杂合过程的发生。图2K显示，ssEV在pH 7.4条件下生成（d50 < 200 nm），而大型杂合体在pH 5条件下形成，证实pH 5条件下获得的双阳性群体为聚集体，而pH 7.4条件下获得ssEVs。

在pH 7.4条件下，当LNV以海绵相存在时（图1H和1L），LNV在杂合合步骤中自发且瞬时地在EV中产生融合柄，生成杂合系统，本文称之为半合成细胞外囊泡（ssEVs），如图2A-E所示（负载siRNA的LNVs与EVs的数量比为4:1，LNV以N/P比25和60 mol% MC3制备）。纳米颗粒流式细胞术（NanoFCM）测量也证实了这种相互作用（图2G-J）。相反，在pH 5条件下，LNVs与EVs之间发生大量聚集（图2F、2G和2H），未能形成ssEVs。

使用DLS/SLS酶标仪在384微孔板中测定了LNV:EV数量比、反应温度（4℃、25℃和37℃）和pH值（5、6、7.4和9）对生成颗粒尺寸和数量的影响。图2L显示，通过监测流体力学直径和颗粒浓度随时间（1小时）的增加，不同数量比不影响ssEV的尺寸群体和反应动力学。图2M显示，杂合过程的速度取决于温度，在37℃下比在4℃下更快，而图2N显示EV的杂合对pH高度敏感。pH 7.4是形成ssEV的最佳值，而pH 5会产生大型杂合体（Hyb）。此外，在pH 5条件下，5分钟后无法检测到颗粒浓度，这可能是由于存在多种颗粒种类，包括较大的聚集体。

实施例4：pH对未负载与负载mRNA的LNV理化特性的影响及pH 7.4下由负载mRNA的LNV制备的ssEV的理化特性表征

如实施例1所述，在pH 5和7.4条件下制备未负载LNVs和负载mRNA的LNVs，并用于在pH 7.4条件下制备ssEVs。

所制备的负载mRNA的LNVs（N/P 25，60 mol % MC3）的平均流体力学直径约为130nm（图3A），多分散系数值（PDI）较低，约为0.11（图3B）。数据还显示，无论是在酸性还是中性pH条件下，一旦mRNA被装载入颗粒，LNVs的ζ电位略有降低（图3C）。mRNA被包封入LNVs的装载效率（LE）为94% ± 5（图3D）。

负载mRNA的LNVs的结构如冷冻电镜显微图所示（负载mRNA的LNVs与EVs的数量比为4:1，LNVs以N/P比25和60 mol% MC3制备）（图3E）。

负载mRNA的LNVs与EVs的融合过程也在冷冻电镜显微图中展示，可以看到与负载siRNA的LNVs类似，负载mRNA的LNV在37℃和pH 7.4（即非常温和的条件下）与EVs自发融合形成ssEVs（图3F）。mRNA在ssEVs中的装载通过图3G-H得到证实。如上所述，将CFSE标记的EVs与Cy5-FLuc-mRNA负载的LNVs或与FLuc-mRNA负载的LNVs一起孵育。将Cy5-mRNA负载的LNVs与CFSE标记的EVs混合后，出现了双阳性群体（方框内），表明在pH 7.4条件下形成了负载mRNA的ssEVs。例如，当仅将裸Cy5-FLuc-mRNA加入EVs时，或者当未标记的FLuc-mRNA被包封在LNV内并与未标记的EV混合时，该群体不存在。

实施例5：体外模型中LNV及负载siRNA的LNV处理对HeLa细胞活力的影响

HeLa细胞在37℃下培养，并使用实施例1所述方法测试其活力。

在所有测试的浓度（12.5、25、50、100和200 μg/mL）和时间点（4小时和24小时）下，未负载LNV和负载siRNA的LNV均未导致细胞活力下降（图4A-B）。

实施例6：杂合后EV膜蛋白生物活性的保留

按照实施例1所述方法，测定EV膜蛋白CD73和CD26的酶活性。结果显示，在pH 7.4、4℃和37℃条件下与负载siRNA的LNV杂合后，其活性未发生改变（图5A-B）。相反，在pH 5条件下，与负载siRNA的LNV杂合后，CD73的酶活性显著降低（图5A）。与ssEV（pH 7.4，4℃和37℃）相比，Exo-Fect™试剂在杂合后也显著降低了两种酶（CD73和DPP4）的酶活性（图5A-B）。

实施例7：负载siRNA的ssEVs在表达GFP的HeLa细胞中的转染效率

未处理细胞（仅接受培养基）、PBS、游离GFP-siRNA作为阴性对照，而用负载GFP-siRNA的Lipofectamine™ RNAiMAX处理的细胞作为阳性对照。随后，在约8% (v/v) FBS存在下，评估了负载GFP-siRNA的LNVs与负载GFP-siRNA的ssEVs在HeLa-GFP细胞中的转染效率。结果显示，负载GFP-siRNA的LNVs (LNVs (w siGFP))将归一化的GFP荧光强度降低了约59%，而EVs在杂合后显著增强了LNVs的转染效率，表现为GFP荧光下降了约75%(ssEVs (wsiGFP))，这与阳性对照Lipofectamine™ RNAiMAX (RNAiMAX (w siGFP))的效果相当（图6）。

实施例8：负载mRNA的ssEVs在HeLa细胞中的转染效率

PBS处理的细胞和接受裸FLuc-mRNA的细胞作为阴性对照，而用负载FLuc-mRNA的Lipofectamine™ MessengerMAX™处理的细胞作为阳性对照。在约90% (v/v)血清存在下，评估包封于LNVs、ssEVs或Lipofectamine™ MessengerMAX™中不同剂量的mRNA（100、10、1和0.1 ng）在HeLa细胞中的转染效率。结果显示，与LNVs相比，ssEVs显著提高了荧光素酶的表达，表现为mRNA剂量为100 ng时，荧光信号增加了约七倍；mRNA剂量为10 ng时，荧光信号增加了约十倍（图7）。

实施例9：用CPP > 1的磷脂和CPP值< 1的非离子型表面活性剂（但不含可电离阳离子脂质）制备的纳米结构

使用DOPE和KLP但不含MC3制备了类似于多层脂质体的纳米结构，如图8所示。

实施例10：用可电离阳离子脂质、CPP ~ 1的磷脂和CPP值< 1的非离子型表面活性剂制备的纳米颗粒

使用MC3、DOPC（一种CPP ≈ 1的磷脂）和KLP制备纳米颗粒，并在pH 5和7.4条件下，使用Zeta-Sizer和RiboGreen检测评估了其d_h、PDI、ζ-pot和LE%（图9A-B和下表II）。

表 II：DOPC-NPs 及负载 siRNA 的 DOPC-NPs 的理化性质（dh、PDI、ζ-电位和LE%）汇总

在pH 5条件下，SAXS分析显示DOPC-NPs呈现出六角相，其特征为三个尖锐的峰，其q值位置比为1:√3:2，特别是在系统中加入siRNA时（图9H）。冷冻电镜图像也显示，DOPC-NPs在 pH 5条件下形成明确的非层状结构（图9D）。

然而，在可以发生融合的 pH 7.4 条件下（见图 2A-E、G-I），加入siRNA后，发现在非层状排列区域附近出现了多层/囊泡状区域（图9F）。冷冻电镜图像（图9C-G）还显示基于DOPC的颗粒具有多囊泡结构。

如图9G所示，基于siRNA/DOPC的纳米颗粒确实无法与MSC来源的EV形成ssEVs。

实施例11：用CPP > 1的磷脂和CPP值< 1的非离子型表面活性剂、但使用固定阳离子脂质替代可电离阳离子脂质制备的纳米颗粒

使用DOTMA（固定阳离子脂质）、DOPE和KLP制备了纳米颗粒，并在pH 5和7.4条件下，使用Zeta-sizer和RiboGreen检测评估其d_h、PDI、ζ-pot和LE%（图10A-B和下表III）。

表III：DOTMA-NPs及负载siRNA的DOTMA-NPs的理化性质（dh、PDI、ζ-电位和LE%）汇总

冷冻电镜图像显示，负载或不负载siRNA的DOTMA-NPs在pH 5和pH 7.4条件下的形成了小于LNVs和DOPC-NPs（< 100 nm）的多层和单层脂质体（分别见图10C、10E和图10D、10F）。图10G展示在pH 7.4条件下、EVs存在时，由负载siRNA的DOTMA-NPs获得的颗粒结构。SAXS图（图10H）显示一系列宽的振荡，表明在pH 5和pH 7.4条件下，无论是否负载siRNA，都形成了多层化程度较低的双层结构。与SAXS和冷冻电镜图像数据一致，DOTMA-NPs的结构不随缓冲液pH变化和siRNA货物的存在而改变。此外，图10G显示，负载siRNA的DOTMA颗粒在pH7.4条件下与MSC源性EVs共存时形成大量聚集体，证实了只有LNVs才能在中性pH下自发形成具有适当理化性质的ssEVs。

实施例12：用可电离阳离子脂质、具有CPP > 1的磷脂，以及（替代CPP值< 1的非离子型表面活性剂）具有CPP < 1的溶血磷脂制备的纳米颗粒

如实施例1所述，使用MC3、DOPE和MPPC（CPP < 1的溶血磷脂）制备纳米颗粒。如实施例1所述，在pH 7.4条件下使用DLS仪器评估了纳米颗粒的粒径分布（图11）。检测到颗粒具有宽的粒径分布，包含不止一个颗粒群体，这证明非离子型表面活性剂（例如KLP）在形成具有适当粒径和PDI值的颗粒中的关键作用。

实施例13：用不同浓度的、显示CPP值< 1的表面活性剂制备的纳米颗粒

使用MC3、DOPE和KLP制备纳米颗粒，其中KLP的浓度在5至15 mol %之间变化。如实施例1所述，在pH 7.4条件下使用配备Malvern Zetasizer™的DLS仪器测量了纳米颗粒的流体力学尺寸。在这些浓度下获得的颗粒尺寸在约800至1050 nm之间（图12），远大于使用表面活性剂浓度≥20 mol %时获得的尺寸（参见例如图2C-2E、2K-2N），证实在这些表面活性剂浓度下发生了聚集。

权利要求的范围不应受示例中阐述的实施例的限制，而应被赋予与整个说明书一致的最宽泛的解释。

参考文献

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Claims (15)

1.一种pH诱导的结构转换非层状脂质纳米载体（LNV），包含：

(a) 至少一种可电离阳离子脂质；

(b) 至少一种临界堆积参数值（CPP）大于1的磷脂；以及

(c) 至少一种CPP小于1的非离子型表面活性剂，其摩尔浓度为20%至50%。

2.如权利要求1所述的LNV，其中：

(a) 所述至少一种可电离阳离子脂质在掺入LNV前的表观酸解离常数(pKa)为5至7.5；

(b) 所述至少一种磷脂为磷脂酰乙醇胺（PE）类脂质；

(c) 所述至少一种表面活性剂为脂肪酸聚乙二醇酯或聚山梨酯；或

(d) (a)至(c)中至少两项的组合。

3.如权利要求1或2所述的LNV，其中：

(a') 所述至少一种可电离阳离子脂质为D-Lin-MC3-DMA（MC3）；

(b') 所述至少一种磷脂为二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）；

(c') 所述至少一种非离子型表面活性剂为脂肪酸聚乙二醇酯，例如聚乙二醇12-羟基硬脂酸酯，优选Kolliphor^® HS15（KLP）；或

(d') (a')至(c')中至少两项的组合。

4.如权利要求1-3任一项所述的LNV，其负载有药物或诊断剂，优选地，其中所述药物或诊断剂为核酸分子。

5.组合物，包含如权利要求1至4中任一项所定义的LNV以及至少一种药学上可接受的赋形剂。

6.制备如权利要求1至3中任一项所定义的LNV的方法，包括混合：(a)一种有机相，其包含至少一种可电离阳离子脂质、至少一种磷脂和至少一种表面活性剂，且溶于有机溶剂中；以及(b)水性介质。

7.如权利要求6所述的方法，其中，满足以下至少一种条件：

(i) 所述有机相还包含亲脂性药物或诊断剂；以及

(ii) 所述水相还包含亲水性药物或诊断剂，优选地，其中所述亲水性药物或诊断剂为核酸分子。

8.如权利要求7所述的方法，其中(ii)所述水相还包含亲水性药物或诊断剂，且所述水性介质的pH值为约4至约6。

9.如权利要求6-8任一项所述的方法，其中，所述混合使用微流控装置进行。

10.制备半合成细胞外囊泡（ssEV）的方法，其包括将如权利要求1-4任一项所定义的LNV或如权利要求5所定义的组合物，在高于6且最高约10的pH值下与细胞外囊泡（EV）混合，从而生成所述ssEV。

11.半合成细胞外囊泡（ssEV），其通过如权利要求10所定义的方法制备。

12.半合成细胞外囊泡（ssEV），其基本上包含以下组分的全部或部分混合成分：

(a) 如权利要求1-4任一项所定义的脂质纳米载体；以及

(b) 细胞外囊泡（EV）。

13.组合物，包含如权利要求11或12所定义的ssEV以及至少一种药学上可接受的赋形剂。

14.试剂盒，包含：

(A) (a) 如权利要求1-4任一项所定义的LNP或如权利要求5所定义的组合物；以及

(b) (i) 用于水化(a)的溶液；

(ii) 细胞外囊泡（EVs）或包含所述EVs及至少一种药学上可接受赋形剂的组合物；

(iii) 使用(a)以及(i)和/或(ii)的说明书；或，

(iv) (i)至(iii)中至少两项的组合；

或，

(B) (a') 如权利要求11或12所定义的ssEV，或如权利要求13所定义的组合物；以及

(b') (i') 用于水化(a')的溶液；

(ii') 使用(a')和(i')的说明书；或，

(iii') (i')和(ii')的组合。

15.如权利要求11或12所定义的ssEV或如权利要求13所定义的组合物，其用作药物或诊断剂。