CN121991027A - 苯甲酰胺类化合物及其制备方法、药物组合物和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于制药技术领域，涉及苯甲酰胺类化合物及其制备方法、药物组合物和用途。所述苯甲酰胺类化合物由式(I)所示，其为EPHB4抑制剂。通过体外磷酸化反应验证了该类化合物对EPHB4激酶活性的抑制作用。同时，在胰岛素抵抗的细胞模型体系验证了其具有增加模型细胞胰岛素敏感性的作用。

Description

苯甲酰胺类化合物及其制备方法、药物组合物和用途

技术领域

本发明属于制药技术领域，涉及一种苯甲酰胺类化合物及其制备方法、用途和药物组合物。

背景技术

近年来，肥胖、糖尿病等代谢性疾病的发病率呈现快速上升的趋势。相关研究数据表明，仅2021年，我国糖尿病发病人数就超过400万，其中超过98％的病人为2型糖尿病患者。而中国糖尿病患病总人数已经超过1.17亿，是当今世界糖尿病病人最多的国家。肥胖、糖尿病如果没有及时得到有效治疗和控制，还会诱发心血管/肾脏/眼部等组织器官的相关代谢综合症，在给国民身心健康带来严重威胁的同时，也给社会带来沉重的经济负担。

胰岛素信号对于机体内葡萄糖的代谢稳态的调控起着重要作用，而胰岛素抵抗是2型糖尿病的重要病理特征之一，也是公认多种代谢性疾病的重要诱因。研究表明，在2型糖尿病病人确诊前10-20年，体内已经发生胰岛素抵抗，其可能原因包括慢性组织炎症、内质网应激以及肠道菌群等。在发生胰岛素抵抗的情况下，机体会代偿性增加胰岛素的分泌，进而导致高胰岛素血症的发生。我们的研究表明，高水平的胰岛素会进一步促进胰岛素受体与EphB4蛋白的相互作用，EphB4通过与接头蛋白Ap2结合的结合，促进胰岛素受体的以Clathrin依赖的方式发生内吞，并通过溶酶体途径降解，进而抑制胰岛素信号的传导，加剧胰岛素抵抗的发生。

现在临床上依然缺乏好的胰岛素增敏药物。已被证实可以改善胰岛素抵抗、增加胰岛素敏感性的噻唑烷二酮(TZD)类化合物，其作用靶点是PPARγ，属于哺乳动物核受体超家族。但是，TZD类药物因为其存在增加体重和心血管风险等副作用，已经被撤市或者限制应用。因此，目前实际应用的药物中并没有较好的胰岛素增敏剂。我们的研究证明EphB4可以作为胰岛素增敏药物的作用靶点，因此，本发明是以EphB4为靶点，开发其新型抑制剂，并作为一种新的胰岛素增敏剂以解决目前的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的EPHB4抑制剂，其对EPHB4激酶有较强的抑制活性，从而对由EPHB4介导的相关疾病，尤其是胰岛素抵抗及相关代谢性疾病具有预防和/或治疗效果。

为解决本发明的技术问题，本发明提供了如下技术方案：

本发明技术方案的第一方面是提供了一种式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐：

其中：R₁选自氢、C_1-3烷基。

具体来说，根据本发明优选的化合物如下：

本发明技术方案的第二方面是提供了所述化合物的制备方法，其包括以下步骤：

(1)以化合物A为起始物料，与4-吡啶硼酸经过Suzuki反应制备化合物B；

(2)化合物B经浓硫酸水解制备化合物C；

(3)化合物C经过溴代反应制备化合物D；

(4)化合物D经Suzuki反应制备得到式(Ⅰ)所示的化合物或其药学上可接受的盐；

本发明技术方案的第三方面是提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含所述化合物或其药学上可接受的盐，以及任选的药学上可接受的载体和/或赋形剂；优选地，所述药物组合物还包含除所述化合物或其药学上可接受的盐之外的一种或多种预防和/或治疗肿瘤的药物活性成分。

又一方面，本发明还提供了一种药物制剂，其包含至少一种所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及任选的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂；优选地，所述药物制剂选自下列药物剂型：胃肠道外给药制剂，例如注射溶液或混悬剂；经肠给药制剂，例如口服制剂，如片剂或胶囊剂；局部给药制剂，例如洗剂、凝胶、软膏、乳剂、经鼻给药制剂、栓剂、经皮给药制剂或眼用制剂。

又一方面，本发明还提供了所述化合物或其药学上可接受的盐、或者所述药物组合物在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途。换言之，本发明提供了一种预防和/或治疗肿瘤的方法，该方法包括给予有需要的受试者预防和/或治疗有效量的所述化合物或其药学上可接受的盐，或者所述药物组合物。

以下就本发明所使用的部分术语定义如下，其它未定义的术语具有所属技术领域技术人员公知的含义。

“烷基”是指通式为C_nH_2n+1的烃基。该烷基可以是直链或支链的。例如，术语“C₁-C₃烷基”应理解为表示具有1、2或3个碳原子的直链或支链饱和一价烃基。此类基团的实例包括但不限于：甲基、乙基、丙基、异丙基。

“C_1-3烷基”是指含有1至3个碳原子的烷基此类基团的实例包括但不限于：甲基、乙基、丙基、异丙基。

术语“抑制剂”是指能够抑制靶蛋白或多肽的生物功能，如抑制靶蛋白或多肽的活性或表达的化合物或药剂。

术语“有效量”是指足以实现下文说明的预期应用的本文所述的化合物或药物组合物的量，所述预期应用包括但不限于疾病治疗。有效量可根据以下变化：预期应用(体内或体外)；或所治疗的个体及疾病状况，例如，个体的体重和年龄、疾病的严重程度；给药方式等。有效量可以由本领域普通技术人员容易地确定。

本发明所述的化合物还包括其同位素标记化合物。术语“同位素标记化合物”是指其中一个或多个原子被具有相同原子序数、但是原子质量数与自然界中通常发现的原子质量数不同的原子替代的化合物。适合本发明的同位素实例包括但不限于：氢的同位素²H和³H；碳的同位素¹¹C、¹³C和¹⁴C；氯的同位素³⁶Cl；氟的同位素¹⁸F；碘的同位素¹²³I和¹²⁵I；氮的同位素¹³N和¹⁵N；氧的同位素¹⁵O、¹⁷O和¹⁸O；磷的同位素³²P和硫的同位素³⁵S。

本发明所述的化合物或其盐的各种溶剂化物和水合物以及其多晶型物也包括在本发明的范围内。

术语“溶剂化物”是指还包括化学计量的或非化学计量的通过非共价分子间力结合的溶剂的化合物。溶剂化物可以是所公开的化合物或其药学上可接受的盐。当溶剂为水时，溶剂化物为“水合物”。药学上可接受的溶剂化物和水合物是例如可以包括1个至约100个、或1个至约10个、或1个至约2个、约3个或约4个溶剂或水分子的复合物。术语“多晶型物”是指存在两种或两种以上不同的晶体形式的化合物。

本发明所述的化合物的前药也包括在本发明的范围内。本发明所述的化合物的某些衍生物自身具有较弱药理活性或没有药理活性，但当这些衍生物给药到体内或身体上时，它们可通过例如水解断裂等方式被转化成具有药理活性的本发明所述的化合物，这些衍生物称为“前药”。关于前药用途的进一步信息可以在Pro-drugs as Novel DeliverySystems,Vol.14,ACS Symposium Series(T.Higuchi and W.Stella)和BioreversibleCarriers in Drug Design,Pergamon Press,1987(ed.E.B.Roche,AmericanPharmaceutical Association)中找到。

本发明所述的化合物包括其药学上可以接受的盐。术语“药学上可接受的盐”是指为药学上可接受的并且具有母体化合物所需的药理活性的盐。Berge等人在J.Pharma.Sci.,1977,66,1-19中详细描述了医药学上可接受的盐，所述文献以引用的方式并入本文中。本发明所述的化合物可以含有足够的酸性基团、足够的碱性基团或兼具这两种类型的功能基团，并相应地与一些无机或有机碱、或无机和有机酸反应形成药学上可接受的盐。药学上可接受的盐的实例包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、单氢磷酸盐、二氢磷酸盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、醋酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1,4-二酸盐、己炔-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯代苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、羟乙酸盐、酒石酸盐、甲烷磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐和扁桃酸盐。

本发明所述的化合物在作为药物使用时，通常是以药物组合物的形式给药。因此，包含本发明所述的化合物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物也包括在本发明的范围。本文所用的载体、助剂、赋形剂包括适合于期望的特定剂型的任意的和所有的溶剂、稀释剂或其他液体赋形剂、分散剂或助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。在Remington：The Science and Practice ofPharmacy，21st edition，2005，ed.D.B.Troy，Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，和Encyclopedia of Pharmaceutical Technology，eds.J.Swarbrick和J.C.Boylan，1988-1999，Marcel Dekker，New York中，公开了用于配制药学可接受的组合物的各种载体和用于其制备的已知技术，将它们的内容都通过参考引入本文。

本发明所述的组合物可通过适于待治疗的病症的任何途径给药。特别是经以下列形式给药：胃肠道外，例如以可注射溶液或混悬剂形式；经肠，例如口服，例如以片剂或胶囊剂形式；局部，例如以洗剂、凝胶、软膏或乳剂形式或以鼻或栓剂形式。局部施用例如施用于皮肤。局部给药的另一种形式是给药于眼。

药物组合物可以以固体、半固体、液体或气态形式施用，或可呈干燥的散剂，诸如冻干形式。药物组合物可包装为便于传递的形式，包括例如固体剂型，诸如胶囊、药囊、扁囊剂、明胶、纸、片剂、栓剂、团粒、丸剂、含片及锭剂。包装的类型一般将取决于施用途径。也涵盖可植入的持续释放的制剂，以及经皮制剂。

能够作为药学可接受的载体的材料的一些实例包括但不限于：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白质(例如人血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸或山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐)、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、蜡类、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、羊毛脂、糖类(例如乳糖、葡萄糖和蔗糖)、淀粉(例如玉米淀粉和马铃薯淀粉)、纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；西黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，例如可可脂和栓剂用蜡；油类，例如花生油、棉籽油；红花油；芝麻油；橄榄油；玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇或聚乙二醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等渗盐水；林格液；乙醇；和磷酸盐缓冲液，以及其他无毒的可相容的润滑剂，例如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁。根据制剂人员的判断，在组合物中也可以存在着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。

本发明所述的化合物可以单独使用或与其它治疗本发明所述的疾病或病症(例如癌症)的治疗剂联合使用。在某些实施方案中，本发明所述的化合物与具有抗高度增殖性质或用于治疗高度增殖性疾病(例如癌症)的第二种化合物在药物组合制剂中联合，或作为联合治疗在给药方案中联合。药物联合制剂或者定量给药方案的第二化合物优选具有与本发明所述化合物互补的活性，以使它们不会相互产生不利影响。这样的化合物适当地以对计划目的有效的量存在于组合中。在一个实施方案中，本发明的化合物与其他抗肿瘤药物联合。所述抗肿瘤药物包括：烷化剂类，包括但不仅限于环磷酰胺、氮芥、马法兰、瘤可宁、卡莫司汀；金属铂类，包括但不仅限于卡铂、顺铂、奥沙利铂；拓扑异构酶抑制剂，包括但不仅限于拓扑特肯、喜树碱、拓扑替康、依立替康；抗生素类，包括但不仅限于茴环霉素、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素；抗微管或抗有丝分裂剂，包括但不仅限于紫杉醇、长春瑞滨、多西他赛、多柔比星；抗代谢物类，包括但不仅限于氟尿嘧啶，甲氨蝶呤，阿糖胞苷，巯嘌呤(mecaptopurine)，硫鸟嘌呤，及吉西他滨；抗体类，包括但不仅限于赫赛汀、贝伐单抗；激素类，包括但不仅限于来曲唑(Letrazole)、伏罗唑(vorazole)、他莫西芬、托瑞米芬，氟维司群、氟他胺、尼鲁米特，曲普瑞林；激酶抑制剂类，EGFR激酶抑制剂，包括但不仅限于吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、阿法替尼(afatinib)；VEGFR抑制剂，包括但不仅限于索拉非尼(Sorafenib)、瑞格菲尼(Regorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、卡博替尼(Cabozantinib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、凡德他尼(vandetanib)、阿昔替尼(axitinib)；ALK抑制剂，包括但不仅限于克唑替尼(Crizotinib)、色瑞替尼(ceritinib)、Alectinib；Bcr-Abl抑制剂，包括但不仅限于伊马替尼(Imatinib)、帕纳替尼(Ponatinib)、尼洛替尼(Nilotinib)、达沙替尼(Dasatinib)；BTK抑制剂，包括但不仅限于依鲁替尼(Ibrutinib)；B-RAF抑制剂，包括但不仅限于维罗非尼(Vemurafenib)；细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4/6抑制剂，帕博西尼(Palbociclib)；mTOR抑制剂，包括但不仅限于雷帕霉素(rapamycin)、依维莫司(everolimus)；去乙酰化酶抑制剂，包括但不仅限于伏立诺他(vorinostat)；PD1/PDL1抗体，Keytruda(Pembrolizumab)、Opdivo(Nivolumab)。

有益技术效果：

本发明化合物具有独特的骨架结构,对EPHB4具有较高的抑制活性；与EPHB4蛋白具有较强的结合能力；并且体内药效研究表明，本发明化合物能够以剂量依赖的形式激活胰岛素信号。

附图说明

图1是对EphB4激酶抑制剂活性检测,其显示了实施例1能够有效抑制EPHB4激酶活性。

图2是细胞毒性检测，实施例1的IC50为26.87μM。

图3是对胰岛素信号的激动作用，实施例1能够以剂量依赖的形式激活胰岛素信号。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，其对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或是等同替代均包括在本发明的保护范围内。

制备方法

本发明所述的化合物可以根据本文中的合成方案和/或本领域熟知的技术来合成。例如，本发明提供的化合物可以根据以下通用合成方法制备。

在一种通用合成方法中，根据方法-1制备式(Ⅰ)所示的化合物。

方法-1

具体地，在方法-1中，本发明所述的苯甲酰胺类化合物可以通过4步反应制备。以化合物A为起始物料，与4-吡啶硼酸经过Suzuki反应制备化合物B；化合物B经浓硫酸水解制备化合物C；化合物C经过溴代反应制备化合物D；化合物D经Suzuki反应制备得到式(Ⅰ)所示的化合物。

本发明所述的化合物可以根据本文中一个或多个合成方案和/或本领域熟知的技术来合成。本领域技术人员应认识到，本发明中详细描述的某些实施方式的合成方法，可容易适用于合成其他实施方式。在一些实施方式中，本文所述的化合物可以通过本领域熟知的合成方法的适当组合来制备。许多起始物料和其他试剂可购自商业供应商，例如阿法埃莎(中国)化学有限公司，或使用本领域常用的合成方法容易地制备。

¹H NMR谱在400MHz或500MHz下操作的仪器上记录。¹H NMR谱以溶液形式获得(以ppm报道)，使用CDCl₃(7.26ppm)或DMSO-d₆(2.50ppm)或内标四甲基硅烷(0.00ppm)作为参考标准。当报导峰多重性时，使用以下缩写：s(单峰)，d(双峰)，t(三重峰)，q(四重峰)，m(多重峰)，br(宽峰)，dd(双二重峰)，dt(双三重峰)。给出的偶合常数以赫兹(Hz)计。

在以下制备方法及实例中，“PE”是指石油醚，“EA”是指乙酸乙酯，“MeOH”是指甲醇，“DMSO-d₆”是指氘代二甲亚砜，“DCM”是指二氯甲烷，“NBS”是指N-溴代丁二酰亚胺，“Pd(dppf)Cl₂”是指[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯，“M”是指体积摩尔浓度，“rt”是指室温，“h”是指小时，“mL”是指毫升，

“μL”是指微升，“mmol”是指毫摩尔，“μM”是指微摩尔，“nM”是指纳摩尔，“℃”是指摄氏度。

中间体2-氨基-3-溴-5-(吡啶-4-基)苯甲酰胺的制备

步骤1：2-氨基-5-(吡啶-4-基)苯甲腈的合成

依次将2-氨基-5-溴苯甲腈(9.85g,50mmol)、4-吡啶硼酸(8.60g,70mmol)、200mL二氧六环、2M碳酸钾水溶液75mL，Pd(dppf)Cl₂(1.83g,2.5mmol)加入反应瓶中,氩气置换，100℃反应10h。硅藻土过滤，EA萃取(300mL×3)，用饱和食盐水洗涤合并的有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩有机相，硅胶柱层析(DCM/MeOH＝

25:1,v/v)得棕色固体8.08g，收率82.9％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.57–8.51(m,2H),7.95(d,J＝2.3Hz,1H),7.82(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),7.68–7.62(m,2H),6.90(d,J＝8.8Hz,1H),6.45(s,2H)。

步骤2：2-氨基-5-(吡啶-4-基)苯甲酰胺的合成

将2-氨基-5-(吡啶-4-基)苯甲腈(2.02g,10.4mmol)在0℃下加入25mL浓硫酸中，rt下反应过夜。将反应液倒入冰水中，饱和碳酸氢钠溶液调节pH至7，EA萃取(150mL×3)，饱和食盐水洗涤合并的有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩有机相，得黄色固体1.79g,收率81.3％。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ8.55–8.50(m,2H),8.05(d,J＝

2.2Hz,2H),7.72–7.64(m,3H),7.23(s,1H),6.98(s,2H),6.82(d,J＝8.6Hz,1H)。

步骤3：2-氨基-3-溴-5-(吡啶-4-基)苯甲酰胺的合成

将2-氨基-5-(吡啶-4-基)苯甲酰胺(535mg,2.5mmol)溶解于10mL冰醋酸中，分批加入NBS(463mg,2.6mmol)，rt下反应过夜。将反应液用甲醇稀释，浓缩，硅胶柱层析(DCM/MeOH＝10:1,v/v)得淡黄色固体700mg，收率95.6％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.59–8.53(m,2H),8.20(s,1H),8.11–8.04(m,2H),7.78–7.72(m,2H),7.48(s,1H),7.03(s,2H)。

实施例1：2-氨基-3-(1H-吲唑-4-基)-5-(吡啶-4-基)苯甲酰胺的合成

依次将2-氨基-3-溴-5-(吡啶-4-基)苯甲酰胺(50mg,0.17mmol)、1H-吲唑-4-硼酸(39mg,0.24mmol)、3mL二氧六环、2M碳酸钾水溶液250μL、Pd(dppf)Cl₂(14mg,0.02mmol)加入反应瓶中，氩气置换，100℃反应10h。浓缩，制备型薄层色谱(DCM/MeOH＝10:1,v/v)得黄色固体41mg，收率73.2％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ13.22(s,1H),8.53(d,J＝6.1Hz,2H),8.19(s,1H),8.14(d,J＝2.2Hz,1H),7.81(s,1H),7.75(d,J＝6.2Hz,2H),7.68(d,J＝2.2Hz,1H),7.60(d,J＝8.5,1H),7.48(t,J＝7.1Hz,1H),7.40(s,1H),7.17(d,J＝7.0Hz,1H),6.52(s,2H)。

MS(ESI+)m/z:330.1[M+H]⁺。

实施例2：2-氨基-3-(5-甲基-1H-吲唑-4-基)-5-(吡啶-4-基)苯甲酰胺

根据实施例1中的方法，由5-甲基-1H-吲唑-4-硼酸制备标题化合物。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ13.07(s,1H),8.52(d,J＝5.3Hz,2H),8.19(s,1H)，8.17(d,J＝2.2Hz,1H),7.75(d,J＝5.5Hz,2H),7.59(d,J＝2.1Hz,1H),7.51(d,J＝8.0Hz,2H),7.39(s,1H)，7.35(d,J＝8.5Hz,1H),6.29(s,2H),2.20(s,3H)。

MS(ESI+)m/z:344.2[M+H]⁺。

药理活性评价

实验例1：实施例1对EphB4激酶抑制剂活性检测

利用体外磷酸化反应建立EphB4激酶活性抑制剂的验证体系。以通用型激酶底物多肽(Poly(4:1Glu,Tyr)Peptide，义翘神州，P61-58)作为底物，终浓度为0.4μg/μl，与纯化的人源EPHB4(0.1μg/ml)、ATP(100μM)以及溶剂/阳性药(NVP-BHG712，20nM)/实施例1(1μM)在激酶反应缓冲液(20mM MgCl₂，2mM MnCl₂,40mM Tris pH 7.5,0.1mg/ml BSA，2mM DTT，100μM钒酸钠)中于37℃孵育30min。然后终止反应，并在硝酸纤维素膜上点样，进行斑点印迹检测。利用抗泛酪氨酸磷酸化激酶抗体(P-Y-1000，CST，#8954)检测底物磷酸化程度,抗GST抗体检测蛋白基础水平。结果如图1所示，实施例1能够有效抑制EPHB4激酶活性。

实验例2：实施例1细胞毒性检测

将HepG2细胞接种于96孔板中，每孔加入100μL培养基，细胞铺板密度为10⁴个细胞/孔。于条件为37℃、5％的培养箱中培养24小时。然后，弃去原培养基，加入含有不同浓度实施例1的培养基，具体浓度分别为：1.5625μM、3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM以及400μM。每个浓度分别有8个独立重复孔，并设立溶剂对照组和空白对照组。在实施例1处理24小时之后，在每个培养孔中加入10μL CCK-8工作液，继续孵育2个小时，然后使用酶标仪，在波长为450nm条件下测定吸光度(OD值)，并根据细胞活力(％)＝[OD₄₅₀值(加药)-OD₄₅₀(空白)]/[OD₄₅₀(溶剂)-OD₄₅₀(空白)]×100的公式，计算细胞存活率，并计算实施例1的半数抑制浓度(Inhibitory Concentration 50，IC50)。结果如附图2所示，实施例1的IC50为26.87μM。

实验例3：实施例1对胰岛素信号的激动作用

将HepG2细胞接种于培养板中，带细胞汇合度为50％-60％时，将培养基置换为含有30mM的葡萄糖的完全培养基，处理24小时，然后，加入实施例1及阳性药NVP-BHG712(简写为“NVP”)处理，时间是过夜12小时。实施例1的处理浓度分别为0.2μM,、0.5μM、2.0μM和5.0μM。NVP-BHG712处理浓度为10nM。在收细胞前，加入10nM胰岛素刺激处理，时间是20min，然后进行蛋白质免疫印迹分析胰岛素信号激活的标志物磷酸化胰岛素受体(pIR)和磷酸化Akt(pAkt)的相对水平。结果如附图3所示，实施例1能够以剂量依赖的形式激活胰岛素信号。

Claims (6)

1.一种式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐：

其中：R₁选自氢、C_1-3烷基。

2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物选自：

3.一种药物组合物，其包含至少一种根据权利要求1-2中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐以及任选的药学上可接受的载体和/或赋形剂。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其还包含除所述化合物或其药学上可接受的盐之外的药物活性成分。

5.根据权利要求1-2任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，或根据权利要求3或4任一项所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗与EPHB4相关的疾病药物中的应用。

6.根据权利要求1-2任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，或根据权利要求3或4任一项所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗胰岛素抵抗及相关代谢性疾病的药物中的用途。