CN122003183A - 用于改善血管内皮功能的组合物 - Google Patents

Abstract

在一个实施方式中，本发明要解决的问题是提供一种用于改善血管内皮功能的新型手段。在一个实施方式中，本发明提供一种用于改善血管内皮功能的组合物，其包含双歧杆菌和水溶性膳食纤维。

Description

用于改善血管内皮功能的组合物

技术领域

本发明涉及一种用于改善血管内皮功能的组合物。

背景技术

心血管疾病（CVD）已成为全球主要的死亡原因，对低收入和中等收入国家的影响尤其巨大。据估计，2019年估计有1790万人死于CVD，代表全球所有死亡人数的32%。尽管目前有预防和治疗策略，但未来十年CVD的死亡率预计将进一步增加。动脉硬化是一种心血管系统的炎症性疾病，其特征在于因斑块形成导致的动脉管腔狭窄，其进展直接导致CVD的发展。血管内皮功能障碍导致斑块形成和疾病进展，从而导致动脉粥样硬化的发展。

类似地，已广泛报道CVD与代谢综合征相关。代谢综合征是一种与以下代谢危险因素中的至少三种相关的临床病症：过量内脏脂肪（腹部肥胖）、胰岛素抵抗、高血糖、高血压和血脂异常（即，高甘油三酯水平和低高密度脂蛋白（HDL）胆固醇）。已发现这些代谢综合征组分各自损害内皮功能，并且已知患有代谢综合征的患者以高频率发生血管内皮功能障碍。在这些情况下，强烈需要开发一种用于改善血管内皮功能的新型手段。

引用列表

专利文献

专利文献1：JP2021-169517A

专利文献2：JP5881801B

非专利文献

非专利文献1：J Biosci Bioeng. 2012; 113: 587-91。

非专利文献2：Sci Rep. 2017; 7: 43522。

非专利文献3：Food Sci Nutr. 2019; 7: 1828-37。

非专利文献4：Scientific Reports.; volume 4, Article number: 4548(2014)。

非专利文献5：Hypertension. 2018; 72: 1060-71。

非专利文献6：Biosci Microbiota Food Health. 2016; 35(4): 163-171。

非专利文献7：Genome Biol. 2022 Apr 14; 23(1): 95。

非专利文献8：Microbiome. 2021 Apr 29; 9(1):95. doi: 10.1186/s40168-021-01048-3。

非专利文献9：The Japanese Circulation Society and the Japanese Societyfor Vascular Failure (eds.), “Kekkan Fuzen no Seirigakuteki Shindan Shishin”[Physiological Diagnostic Guidelines for Vascular Failure], Life SciencePublishing Co., Ltd., 2021。

非专利文献10：Am J Clin Nutr. 2018; 107: 965-83。

发明内容

技术问题

本发明要解决的问题是提供一种用于改善血管内皮功能的新型手段。

问题的解决方案

在上述情况下，本发明人进行了广泛的研究，并发现双歧杆菌（bifidobacteria）和水溶性膳食纤维的组合可以改善血管内皮功能。本发明基于此类新发现。因此，本发明提供以下项目：

项目1. 一种用于改善血管内皮功能的组合物，其包含双歧杆菌和水溶性膳食纤维。

项目2. 根据项目1的组合物，其中改善血管内皮功能包括降低血液LDL-c水平或降低PAI-1水平、或两者。

项目3. 一种用于维持血管柔韧性或弹性、或预防其下降的组合物，其包含双歧杆菌和水溶性膳食纤维。

项目4. 一种用于预防动脉硬化的组合物，其包含双歧杆菌和水溶性膳食纤维。

项目5. 一种用于改善肾功能的组合物，其包含双歧杆菌和水溶性膳食纤维。

项目6. 根据项目1至5中任一项的组合物，其中水溶性膳食纤维包含菊粉。

项目7. 根据项目1至6中任一项的组合物，其中双歧杆菌具有在肠道中增殖的能力。

项目8. 根据项目1至7中任一项的组合物，其中双歧杆菌具有抗代谢综合征效果。

项目9. 根据项目1至8中任一项的组合物，其为食品。

项目10. 根据项目1至9中任一项的组合物，其还包含精氨酸。

项目11. 双歧杆菌和水溶性膳食纤维在制造用于改善血管内皮功能的组合物中的用途。

项目12. 根据项目11的用途，其中改善血管内皮功能包括降低血液LDL-c水平或降低PAI-1水平、或两者。

项目13. 双歧杆菌和水溶性膳食纤维在制造用于维持血管柔韧性或弹性、或预防其下降的组合物中的用途。

项目14. 双歧杆菌和水溶性膳食纤维在制造用于预防动脉硬化的组合物中的用途。

项目15. 双歧杆菌和水溶性膳食纤维在制造用于改善肾功能的组合物中的用途。

项目16. 水溶性膳食纤维在制造用于改善血管内皮功能的组合物中的用途，该组合物包含双歧杆菌。

项目17. 根据项目16的用途，其中改善血管内皮功能包括降低血液LDL-c水平或降低PAI-1水平、或两者。

项目18. 水溶性膳食纤维在制造用于维持血管柔韧性或弹性、或预防其下降的组合物中的用途，该组合物包含双歧杆菌。

项目19. 水溶性膳食纤维在制造用于预防动脉硬化的组合物中的用途，该组合物包含双歧杆菌。

项目20. 水溶性膳食纤维在制造用于改善肾功能的组合物中的用途，该组合物包含双歧杆菌。

项目21. 双歧杆菌在制造用于改善血管内皮功能的组合物中的用途，该组合物包含水溶性膳食纤维。

项目22. 根据项目21的用途，其中改善血管内皮功能包括降低血液LDL-c水平或降低PAI-1水平、或两者。

项目23. 双歧杆菌在制造用于维持血管柔韧性或弹性、或预防其下降的组合物中的用途，该组合物包含水溶性膳食纤维。

项目24. 双歧杆菌在制造用于预防动脉硬化的组合物中的用途，该组合物包含水溶性膳食纤维。

项目25. 双歧杆菌在制造用于改善肾功能的组合物中的用途，该组合物包含水溶性膳食纤维。

项目26. 根据项目11至25中任一项的用途，其中水溶性膳食纤维包含菊粉。

项目27. 根据项目11至26中任一项的用途，其中双歧杆菌具有在肠道中增殖的能力。

项目28. 根据项目11至27中任一项的用途，其中双歧杆菌具有抗代谢综合征效果。

项目29. 根据项目11至28中任一项的用途，其中组合物为食品。

项目30. 根据项目11至29中任一项的用途，其中组合物还包含精氨酸。

项目31. 一种用于改善血管内皮功能的方法，包括将有效量的双歧杆菌和水溶性膳食纤维施用于有需要的受试者。

项目32. 根据项目31的方法，其中改善血管内皮功能包括降低血液LDL-c水平或降低PAI-1水平、或两者。

项目33. 一种用于维持血管柔韧性或弹性、或预防其下降的方法，包括将有效量的双歧杆菌和水溶性膳食纤维施用于有需要的受试者。

项目34. 一种用于预防动脉硬化的方法，包括将有效量的双歧杆菌和水溶性膳食纤维施用于有需要的受试者。

项目35. 一种用于改善肾功能的方法，包括将有效量的双歧杆菌和水溶性膳食纤维施用于有需要的受试者。

项目36. 根据项目31至35中任一项的方法，其中水溶性膳食纤维包含菊粉。

项目37. 根据项目31至36中任一项的方法，其中双歧杆菌具有在肠道中增殖的能力。

项目38. 根据项目31至37中任一项的方法，其中双歧杆菌具有抗代谢综合征效果。

项目39. 根据项目31至38中任一项的方法，其中双歧杆菌和水溶性膳食纤维以食品形式摄入。

项目40. 根据项目31至39中任一项的方法，还包括施用精氨酸。

项目41. 一种用于改善血管内皮功能的双歧杆菌和水溶性膳食纤维的组合。

项目42. 根据项目41的组合，其中改善血管内皮功能包括降低血液LDL-c水平或降低PAI-1水平、或两者。

项目43. 一种用于维持血管柔韧性或弹性、或预防其下降的双歧杆菌和水溶性膳食纤维的组合。

项目44. 一种用于预防动脉硬化的双歧杆菌和水溶性膳食纤维的组合。

项目45. 一种用于改善肾功能的双歧杆菌和水溶性膳食纤维的组合。

项目46. 根据项目41至45中任一项的组合，其中水溶性膳食纤维包含菊粉。

项目47. 根据项目41至46中任一项的组合，其中双歧杆菌具有在肠道中增殖的能力。

项目48. 根据项目41至47中任一项的组合，其中双歧杆菌具有抗代谢综合征效果。

项目49. 根据项目41至48中任一项的组合，其为食品。

项目50. 根据项目41至49中任一项的组合，其还包含精氨酸。

项目51. 用于与双歧杆菌组合以改善血管内皮功能的水溶性膳食纤维。

项目52. 根据项目41的水溶性膳食纤维，其中改善血管内皮功能包括降低血液LDL-c水平或降低PAI-1水平、或两者。

项目53. 用于与双歧杆菌组合以维持血管柔韧性或弹性、或预防其下降的水溶性膳食纤维。

项目54. 用于与双歧杆菌组合以预防动脉硬化的水溶性膳食纤维。

项目55. 用于与双歧杆菌组合以改善肾功能的水溶性膳食纤维。

项目56. 根据项目51至55中任一项的水溶性膳食纤维，其中水溶性膳食纤维包含菊粉。

项目57. 根据项目51至56中任一项的水溶性膳食纤维，其中双歧杆菌具有在肠道中增殖的能力。

项目58. 根据项目51至57中任一项的水溶性膳食纤维，其中双歧杆菌具有抗代谢综合征效果。

项目59. 根据项目51至58中任一项的水溶性膳食纤维，其为食品。

项目60. 根据项目51至59中任一项的水溶性膳食纤维，其用于与精氨酸进一步组合。

项目61. 用于与水溶性膳食纤维组合以改善血管内皮功能的双歧杆菌。

项目62. 根据项目61的双歧杆菌，其中改善血管内皮功能包括降低血液LDL-c水平或降低PAI-1水平、或两者。

项目63. 用于与水溶性膳食纤维组合以维持血管柔韧性或弹性、或预防其下降的双歧杆菌。

项目64. 用于与水溶性膳食纤维组合以预防动脉硬化的双歧杆菌。

项目65. 用于与水溶性膳食纤维组合以改善肾功能的双歧杆菌。

项目66. 根据项目61至65中任一项的双歧杆菌，其中水溶性膳食纤维包含菊粉。

项目67. 根据项目61至66中任一项的双歧杆菌，其具有在肠道中增殖的能力。

项目68. 根据项目61至67中任一项的双歧杆菌，其具有抗代谢综合征效果。

项目69. 根据项目61至68中任一项的双歧杆菌，其为食品。

项目70. 根据项目61至69中任一项的双歧杆菌，其用于与精氨酸进一步组合。

发明的有益效果

本发明可以提供一种用于改善血管内皮功能的新型手段。

附图说明

图1示出实施例中从受试者招募到分析的过程流程图。

图2示出在亚组分析人群中摄入含有GCL2505和菊粉的测试食品对粪便微生物群的影响（测试食品组：n=22，安慰剂组：n=21）。箱线图表示第5百分位数、第95百分位数、四分位距（25%至75%）和中位数。A）α-多样性（Chao1）。B）β-多样性（属水平的Bray-Curtis距离的主成分分析）。C）第12周时动物双歧杆菌（B. animalis）的相对丰度。数据通过LinDA进行分析。

具体实施方式

用于改善血管内皮功能的组合物

本发明提供一种用于改善血管内皮功能的组合物，其包含双歧杆菌和水溶性膳食纤维。本发明中，双歧杆菌的种类的实例包括但不特别限于动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）、青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）、两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）、短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）、链状双歧杆菌（Bifidobacterium catenulatum）、长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）和假链状双歧杆菌（Bifidobacterium pseudocatenulatum），其中优选动物双歧杆菌。在动物双歧杆菌中，优选动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）。双歧杆菌优选为具有在肠道中增殖能力的那些。更具体地，双歧杆菌优选为能够增加肠道中双歧杆菌总数的那些。例如，可以通过使用实时PCR测量粪便样品中的双歧杆菌数量来确定其是否具有在肠道中增殖的能力。更具体地，测量和评估可根据非专利文献1中描述的方法进行。在本发明中，如果在肠道中的增殖通过以上方法得到证实，则任选择双歧杆菌作为本发明的优选双歧杆菌。优选地，该细菌能够增殖，使得双歧杆菌的数量与通过以上方法测量的摄入体内的细菌数量相比，变为两倍或更多，优选五倍或更多，更优选十倍或更多。此外，在本发明中，双歧杆菌优选是具有抗代谢综合征效果的那些。抗代谢综合征效果可例如通过测量内脏脂肪面积来证实。更具体地，测量和评估可根据非专利文献6中描述的方法进行。在本发明中，如果通过以上方法证实内脏脂肪面积减少，则任选择双歧杆菌作为本发明的优选双歧杆菌。双歧杆菌优选是当通过以上方法测量时，将内脏脂肪面积减少至0.98倍或更少，更优选0.96倍或更少的那些。在本发明的优选实施方式中，双歧杆菌的实例包括属于动物双歧杆菌乳亚种的GCL2505。GCL2505菌株以登录号FERM ABP-21918保藏。该菌株于2010年2月17日根据《布达佩斯条约》保藏于日本国立技术评价研究所（NITE）专利微生物保藏中心（日本千叶县木更津市和坂绵2-5-8，120室，292-0818）。

本发明组合物中双歧杆菌的数量不受限制，可适当设定在例如1000万/g、优选3000万/g、更优选5000万/g、甚至更优选8000万/g或更多、尤其优选1亿/g或更多的范围内。上限也无特别限制，例如10万亿/g或更少、1000亿/g或更少、或100亿/g或更少。在本发明的典型实施方式中，使用活的双歧杆菌。

水溶性膳食纤维的实例包括菊粉、不可消化糊精、水溶性大豆多糖、聚葡萄糖、海藻酸钠、车前子、岩藻依聚糖、褐藻淀粉、羧甲基纤维素钠、普鲁兰多糖、凝胶多糖和低分子量半纤维素，其中优选菊粉。这些水溶性膳食纤维可以单独使用，或以多种类型组合使用。

本发明组合物中水溶性膳食纤维的含量不受限制，例如，可以基于组合物的总质量，设定在例如0.5至10 wt%、优选1至5 wt%、更优选1.5至3 wt%的范围内。

在本发明中，作为本发明活性成分的双歧杆菌和水溶性膳食纤维的组合可以以用于改善血管内皮功能的组合物的形式使用。替代地，该组合可以以与各种药学上可接受的载体或可添加至食品中的载体（例如，等渗剂、螯合剂、稳定剂、pH调节剂、防腐剂、抗氧化剂、增溶剂、增稠剂、赋形剂和粘合剂）组合的组合物的形式使用。在包含各种载体的实施方式中，组合物中双歧杆菌和水溶性膳食纤维的总含量不受限制，可以适当地设定在例如50质量%或更多、60质量%或更多、70质量%或更多、80质量%或更多、90质量%或更多、95质量%或更多、99质量%或更多等范围内。

等渗剂的实例包括糖，例如葡萄糖、海藻糖、乳糖、果糖、甘露醇、木糖醇和山梨醇；多元醇，例如甘油、聚乙二醇和丙二醇；以及无机盐，例如氯化钠、氯化钾和氯化钙。这些等渗剂可以单独使用，或以两种或更多的组合使用。

螯合剂的实例包括依地酸盐，例如依地酸二钠、依地酸钙钠、依地酸三钠、依地酸四钠和依地酸钙，以及乙二胺四乙酸盐、次氮基三乙酸或其盐、六偏磷酸钠和柠檬酸。这些螯合剂可以单独使用，或以两种或更多的组合使用。

稳定剂的实例包括亚硫酸氢钠。

pH调节剂的实例包括酸，例如盐酸、碳酸、乙酸和柠檬酸；碱金属氢氧化物，例如氢氧化钠和氢氧化钾；碱金属碳酸盐或碳酸氢盐，例如碳酸钠；碱金属乙酸盐，例如乙酸钠；碱金属柠檬酸盐，例如柠檬酸钠；以及碱，例如氨丁三醇。这些pH调节剂可以单独使用，或以两种或更多的组合使用。

防腐剂的实例包括山梨酸、山梨酸钾、对羟基苯甲酸酯（例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯）、季铵盐（例如葡萄糖酸氯己定、苯扎氯铵、苄索氯铵和西吡氯铵）、烷基聚氨基乙基甘氨酸、氯丁醇、聚季铵盐、聚六亚甲基双胍和氯己定。这些防腐剂可以单独使用，或以两种或更多的组合使用。

抗氧化剂的实例包括亚硫酸氢钠、干燥的亚硫酸钠、焦亚硫酸钠和混合生育酚浓缩物。这些抗氧化剂可以单独使用，或以两种或更多的组合使用。

增溶剂的实例包括苯甲酸钠、甘油、D-山梨醇、葡萄糖、丙二醇、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和D-甘露醇。这些增溶剂可以单独使用，或以两种或更多的组合使用。

增稠剂的实例包括聚乙二醇、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、黄原胶、硫酸软骨素钠、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇。这些增稠剂可以单独使用，或以两种或更多的组合使用。

赋形剂的实例包括乳糖、玉米淀粉、L-半胱氨酸、海藻糖、麦芽糖醇和山梨糖醇。这些辅料可以单独使用，或以两种或更多的组合使用。

粘合剂的实例包括结晶纤维素、淀粉、蔗糖、羟丙基纤维素、明胶、阿拉伯胶粉、聚乙烯吡咯烷酮、普鲁兰多糖、糊精、环糊精、甲基纤维素、乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇和聚乙二醇。这些粘合剂可以单独使用，或以两种或更多的组合使用。

受试者（优选哺乳动物，例如人类）摄入本发明的组合物可以改善血管内皮功能。专利文献1在实施例2中公开，每日两次（早餐和晚餐后）摄入一组动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）LKM512菌株活菌粉（约6×10⁹ cfu/包×1包）组合精氨酸片（100 mg/片×3片），持续8周，导致改善了血管内皮功能（EndoPAT测量值）。然而，专利文献1还公开了在将LKM512菌株与淀粉（而非精氨酸片）组合的安慰剂组中，血管内皮功能并未改善。因此，专利文献1公开了当单独使用双歧杆菌时血管内皮功能并未改善。此外，迄今为止，包括专利文献1在内，尚无关于通过组合双歧杆菌与水溶性膳食纤维可以改善血管内皮功能的报道。因此，本发明的效果是从现有技术无法预见的。

专利文献2公开了摄入精氨酸增加肠道细菌代谢物中多胺（腐胺）的浓度，而非专利文献4公开了组合摄入LKM512菌株与精氨酸导致多胺（腐胺）上调。因此，这表明组合摄入LKM512菌株与精氨酸导致EndoPAT测量值增加是由于通过精氨酸摄入产生多胺（腐胺）。本发明通过组合双歧杆菌与水溶性膳食纤维所实现的效果并非由于多胺（腐胺）的产生，而是通过与施用精氨酸完全不同的机制来改善血管内皮功能；因此，本发明的组合是有用的。

本发明组合物的摄入量不受限制，作为活性成分的双歧杆菌的每日摄入量可适当设定在例如1000万至10万亿个、优选1亿至1万亿个、更优选10亿至1000亿个、甚至更优选50亿至300亿个、尤其优选100亿至200亿个双歧杆菌的范围内。基于双歧杆菌重量的本发明组合物的摄入量也不受限制，作为活性成分的双歧杆菌的每日摄入量可适当设定在例如1 mg至10 g、优选10 mg至1000 mg、更优选40 mg至300 mg、甚至更优选200 mg或更多的范围内。

除了上述双歧杆菌外，本发明的组合物还可以包含已知改善血管内皮功能的物质。已知改善血管内皮功能的物质的实例包括精氨酸、松树皮衍生的原花青素、黑大豆多酚和鲣鱼衍生的弹性蛋白肽。这些物质可以单独使用或者两种或多种组合使用。

本发明的组合物优选为口服组合物。口服组合物包括食品或饮料组合物和药物组合物。在本发明中，食品或饮料组合物包括保健功能性食品（具有营养功能声称的食品、特定保健用途的食品和具有功能声称的食品）。

食品或饮料组合物的实例包括饮料，例如蔬菜汁饮料、果汁饮料、混合蔬菜和果汁饮料、发酵乳饮料和含杏仁饮料；以及食品，例如冰淇淋、冰冻果子露、糖果、软糖、含杏仁食品、饼干（例如奶油夹心饼干）、巧克力（包括准巧克力）和发酵乳制品（酸奶和奶酪）。冰淇淋优选为乳酸冰淇淋（例如含有发酵乳的乳酸冰淇淋）。准巧克力包括含玉米的准巧克力。乳制品包括发酵乳、冰淇淋和牛奶饮料。本发明的食品或饮料组合物还包括补充剂等。

其他组合物等

虽然以上参考一些实施方式描述了本发明，但本发明不限于这些实施方式。例如，如下文所述实施例中所证明的，根据本发明，双歧杆菌和水溶性膳食纤维的组合可以改善血管柔韧性（通常为收缩后血管扩张的程度）。在本发明中，短语“血管内皮功能”、“血管柔韧性”等中的术语“血管”不受特别限制，包括例如脑、心脏等的血管。此外，在本发明中，“血管的（vascular）”和“血管（blood vessel）”不受限制，包括例如动脉。双歧杆菌和水溶性膳食纤维的组合可以改善血管弹性。因此，可以预期该组合对此类受老化等影响的血管状况具有预防效果。因此，在一个实施方式中，本发明提供一种用于维持血管柔韧性或弹性、或预防其下降的组合物，其包含双歧杆菌和水溶性膳食纤维。血管柔韧性（或弹性）可以例如通过FMD（血流介导的扩张）测试来测量。维持血管柔韧性（或弹性）或预防其下降意味着例如FMD值维持在4%或更大（优选6%或更大，更优选7%或更大）或从4%或更大（优选6%或更大，更优选7%或更大）的FMD值增加（非专利文献5）。如下文实施例中所证明的，双歧杆菌和水溶性膳食纤维的组合改善血管内皮功能并降低血液LDL-c水平。因此，根据本发明，可以降低动脉硬化的风险。因此，在一个实施方式中，本发明提供一种用于预防动脉硬化的组合物，其包含双歧杆菌和水溶性膳食纤维。此外，如下文实施例中所证明的，双歧杆菌和水溶性膳食纤维的组合改善通过FMD测试测量的血管柔韧性；由于已有关于FMD测量值与肾功能之间相关性的报道，改善血管内皮功能障碍可以降低患肾病的风险。因此，本发明提供一种用于改善肾功能的组合物，其包含双歧杆菌和水溶性膳食纤维。在这些实施方式中，所用双歧杆菌和水溶性膳食纤维的类型和量、其他成分的条件等可以与“用于改善血管内皮功能的组合物”部分中描述的相同。

在另一个实施方式中，本发明提供双歧杆菌和水溶性膳食纤维在制造用于改善血管内皮功能的组合物中的用途；双歧杆菌和水溶性膳食纤维在制造用于维持血管柔韧性或弹性、或预防其下降的组合物中的用途；双歧杆菌和水溶性膳食纤维在制造用于预防动脉硬化的组合物中的用途；双歧杆菌和水溶性膳食纤维在制造用于改善肾功能的组合物中的用途；双歧杆菌在制造用于改善血管内皮功能的组合物中的用途，该组合物包含水溶性膳食纤维；根据项目21的用途，其中改善血管内皮功能包括降低血液LDL-c水平或降低PAI-1水平、或两者；双歧杆菌在制造用于维持血管柔韧性或弹性、或预防其下降的组合物中的用途，该组合物包含水溶性膳食纤维；双歧杆菌在制造用于预防动脉硬化的组合物中的用途，该组合物包含水溶性膳食纤维；双歧杆菌在制造用于改善肾功能的组合物中的用途，该组合物包含水溶性膳食纤维；一种用于改善血管内皮功能的方法，包括将有效量的双歧杆菌和水溶性膳食纤维施用于有需要的受试者；一种维持血管柔韧性或弹性、或预防其下降的方法，包括将有效量的双歧杆菌和水溶性膳食纤维施用于有需要的受试者；一种预防动脉硬化的方法，包括将有效量的双歧杆菌和水溶性膳食纤维施用于有需要的受试者；一种改善肾功能的方法，包括将有效量的双歧杆菌和水溶性膳食纤维施用于有需要的受试者；一种用于改善血管内皮功能的双歧杆菌和水溶性膳食纤维的组合；一种用于维持血管柔韧性或弹性、或预防其下降的双歧杆菌和水溶性膳食纤维的组合；一种用于预防动脉硬化的双歧杆菌和水溶性膳食纤维的组合；一种用于改善肾功能的双歧杆菌和水溶性膳食纤维的组合；用于与双歧杆菌组合以改善血管内皮功能的水溶性膳食纤维；用于与双歧杆菌组合以维持血管柔韧性或弹性、或预防其下降的水溶性膳食纤维；用于与双歧杆菌组合以预防动脉硬化的水溶性膳食纤维；用于与双歧杆菌组合以改善肾功能的水溶性膳食纤维；用于与水溶性膳食纤维组合以改善血管内皮功能的双歧杆菌；用于与水溶性膳食纤维组合以维持血管柔韧性或弹性、或预防其下降的双歧杆菌；用于与水溶性膳食纤维组合以预防动脉硬化的双歧杆菌；以及用于与水溶性膳食纤维组合以改善肾功能的双歧杆菌。

在这些实施方式中，关于双歧杆菌、水溶性膳食纤维和任选的其他成分的细节（类型、量等）、使用方法（药品、食品和饮料等）以及使用目的（改善血管内皮功能、预防动脉硬化、改善肾功能等）与上述相同。在本发明中，适合施用（或摄入）双歧杆菌和水溶性膳食纤维的受试者的实例包括哺乳动物，例如人类、小鼠、大鼠和豚鼠（优选人类）。在人类受试者的情况下，实例包括但不特别限于未患动脉硬化、肾病、高血压等的人类。虽然受试者的年龄也不受特别限制，但年龄的实例包括通常认为血管内皮功能、肾功能等随老化而下降的年龄组。在一个非限制性的优选实施方式中，本发明的受试者包括尚未发展为动脉硬化、肾病、高血压等的人类（特别是中老年人类）。

下面将参照实施例对本发明的具体实施方式进行更详细的描述。然而，本发明并不限于这些实施例。

实施例

进行随机、双盲、安慰剂对照、平行组比较研究，以检查具有抗代谢综合征效果的GCL2505和菊粉对血管内皮功能的影响，从而评估降低动脉硬化风险的潜力。

受试者（分析目标人群）

在本研究中，所有参与者均基于《赫尔辛基宣言》签署了书面知情同意书。参与者为显示血管内皮功能下降趋势的年龄在40岁至65岁以下的日本男性和女性，其满足纳入标准、不满足排除标准且被主要研究者认为合格。纳入标准如下：

（1）完全理解测试的意义、内容和目的并提供参与测试的书面知情同意书者；

（2）筛选时年龄在40岁至65岁以下的日本男性和女性；

（3）筛选时具有高正五聚蛋白3（PTX3）水平者；和

（4）筛选时具有高LDL-胆固醇与HDL-胆固醇比率（L/H比率）者。

排除标准如下：

（1）难以在右臂进行FMD测量者；

（2）正在接受医生关于高血压、血脂异常或糖尿病的治疗、用药或生活方式指导者；

（3）具有支气管疾病（如哮喘、结核病或胸膜炎）病史者；

（4）使用心脏起搏器或除颤器者；

（5）患有严重脑血管疾病、心脏病、肝病、肾病、胃肠病或需要报告的传染病者；

（6）具有重大胃肠手术史（如胃切除术、胃肠吻合术或肠切除术）者；

（7）血压测量、身体测量或血液测试中具有显著异常者；

（8）患有严重贫血者；

（9）具有显著身体变化的绝经前或绝经后女性；

（10）处于对药物或食品（特别是牛奶成分）表现出过敏症状风险者；

（11）从开始摄入前12周至测试结束期间正在服用或计划服用抗生素者；

（12）定期摄入影响排便的药物（例如，益生菌、泻药、止泻药）者；

（13）在测试期间无法停止食用酸奶、乳酸菌饮料或具有肠道调节效果的健康食品（含有成分如乳酸菌、双歧杆菌、低聚糖和富含膳食纤维的食品）者；

（14）吸烟者、重度饮酒者或生活方式极其不规律者；

（15）在开始摄入前16周内捐献过400 mL血液的女性、在开始摄入前12周内捐献过400 mL血液的男性、在开始摄入前4周内捐献过200 mL血液者、或在开始摄入前2周内捐献过血液成分者；

（16）怀孕或疑似怀孕、或正在哺乳的女性；

（17）从测试期开始前4周至摄入结束期间参与其他临床测试、观察性研究、临床试验或家庭使用测试者；和

（18）任何其他被主要研究者认为不合格者。

测试期的概述如图1流程图所示。在本研究中，筛选了149名参与者。筛选结果显示，60名参与者符合条件：30名被分配到测试食品组，30名被分配到安慰剂组。到测试结束时，三名参与者因个人原因退出（测试食品组n=1，安慰剂组n=2）。此外，根据依从性判定一名参与者中止。整个测试完成后，一名参与者因确认患有与测试无关但可能影响结果的疾病而被剔除。因此，共有55名受试者（测试食品组27名，安慰剂组28名）被纳入分析目标人群。

测试食品组和安慰剂组的参与者每天各摄入一次具有下表1所示组成的饮料。除饮料外的膳食菜单虽未限制，但设定了禁止项目，包括禁止摄入含有乳酸菌的食品。饮料的摄入持续84天。

表1

下表2显示完整分析目标人群中受试者的背景和安全性评估概述。表3显示完整分析目标人群中测试食品组（活性）和安慰剂组（安慰剂）的FMD及血液成分的测量结果。

表2

表3

下表4显示在第0周FMD（%）为4%或更大的受试者人群中，测试食品组（活性）和安慰剂组（安慰剂）的FMD及血液成分测量结果。

表4

安全性评估

确认了分析目标人群的安全性（表2），不存在临床显著问题。此外，未观察到副作用或医学上有问题的不良事件。因此，认为测试中使用的乳饮料可以安全食用。

FMD

在测试的第0天、第56天和第84天，根据以下方法测量FMD。对于测量，使用UNEX-EF18VG（UNEX Corporation）。使用右臂进行测量。首先，在静息下测量右肱动脉的血管直径，然后将右前臂阻断5分钟。解除阻断后，再次测量最大扩张时的血管直径。血管直径相对于静息直径的扩张百分比表示为FMD（%）。

测试食品组在第12周的FMD（%）的增加在第0周FMD（%）为4%或更大的受试者人群中得到确认（0.88% ± 2.23%）。此外，测试食品组与安慰剂组之间从第0周至第12周的FMD（%）变化存在统计学显著差异（-0.68% ± 2.81%）（通过学生t-检验的p = 0.046）（表4）。在分析目标人群中，测试食品组在第12周观察到FMD（%）增加（1.05 ± 2.21%）。测试食品组从第0周至第12周的FMD（%）变化大于安慰剂组（-0.26% ± 2.87%）（通过学生t-检验的p =0.065）（表3）。

粪便微生物群

通过鸟枪法宏基因组分析，第0周和第12周在亚组分析人群中检测了粪便微生物群。进行α-多样性（Chao1）和β-多样性分析以比较两组的粪便微生物群。有趣的是，在第0周和第12周，两组之间或组内均未观察到差异（图2A和B）。然而，测试食品组肠道中动物双歧杆菌的相对丰度在第0周为0.061% ± 0.002%，在第12周增加至1.503% ± 0.018%。在安慰剂组中，其丰度在第0周为0.085% ± 0.004%，在第12周为0.014% ± 0.001%。针对组成数据，使用用于差异丰度（LinDA）方法的线性模型评估两组之间丰度的差异，并使用Benjamini-Hochberg程序校正p-值以最小化错误发现率（非专利文献7）。在第12周，测试食品组与安慰剂组之间动物双歧杆菌的相对丰度存在统计学显著差异（p = 5.62×10^-9）（图2C）。

测试方法

粪便样品收集

粪便样品由参与者在第0周、第8周和第12周，从预定到访日的前3天至当天早上，在家中使用含有RNAlater稳定性溶液（Invitrogen，Carlsbad，CA）的粪便收集器收集。粪便样品在家中冰箱中保存，并在测试当天用制冷剂冷却带到实验室。

粪便DNA提取

根据上述方法（非专利文献8），使用ISOSPIN粪便DNA试剂盒（Nippon Gene Co.,Ltd.，东京，日本）从粪便样品的10倍稀释液中提取细菌DNA。具体地，将样品（此处为200 μL粪便稀释液）、700 μL FE1缓冲液和10 μL RNase加入至含有磁珠的试管中。使用FastPrep-24（MP Biomedicals，Irvine，CA）以6 m/s的速率进行1分钟的珠磨，以破碎细胞。进行珠磨3次，期间样品在室温下保持5分钟。随后，加入90 μL FE2缓冲液，并将样品以12,000×g离心15分钟。收集上清液（至多500 μL），并与FB缓冲液和异丙醇混合，每种为所得上清液体积的0.4倍。最后，将样品上样至离心柱，并根据制造商的说明进行洗涤。用50 μL Tris-EDTA缓冲液（pH 8.0）洗脱纯化的DNA。

鸟枪法文库构建和测序

除非另有说明，使用QIAseq FX DNA文库试剂盒（Qiagen，Hilden，Germany），根据制造商的说明构建宏基因组测序文库。简言之，每个酶切片段化反应（50 μL）包含10× FX缓冲液、10 μL FX酶混合物和500 ng DNA模板，反应在32℃下孵育9分钟。对于衔接子连接，加入5 μL衔接子，连同20 μL DNA连接酶缓冲液、10 μL DNA连接酶和15 μL无RNase H₂O，反应在20℃下孵育15分钟。衔接子连接的片段用Agencourt AMPure XP PCR纯化系统（Beckman Coulter, Brea, CA）依次使用1倍和0.8倍体积的磁珠溶液进行纯化和大小筛选，并用10 mM Tris-HCl缓冲液洗脱。

宏基因组读段的质量控制

使用fastp（版本0.20.0）进行宏基因组读段的质量控制和衔接子序列修剪。小于50 bp的读段排除在进一步分析之外。使用minimap2（版本2.17）将剩余读段比对至人（hg38）和phiX噬菌体基因组，并排除比对上的读段。在过滤步骤中其配对被排除的读段也被移除。

非冗余基因集的构建和功能注释

非冗余基因集基于HMP和人群水平宏基因组数据构建。对所有基因使用cd-hit（版本4.8.1）以95%的同一性阈值进行聚类。对非冗余基因的功能注释使用eggNOG-mapper（版本2.1.9）基于eggNOG直系同源数据库（版本5.0.2）进行。序列搜索使用DIAMOND（版本2.0.15）进行。

样品的分类和功能谱

使用基于标志物基因的方法，用mOTUs2（版本3.0.3）获取种和属水平的分类谱。为了量化基因功能，使用minimap2以95%或更高的同一性阈值将宏基因组读段比对至非冗余基因，并对每个基因比对上的读段数进行计数。多重比对读段的数量基于唯一比对读段与基因的数量比例分配给比对的基因。将计数归一化为每百万转录本，形成每百万转录本矩阵。

身体参数

在第0周FMD（%）为4%或更大的受试者人群中，测试食品组的血液总胆固醇水平下降（第8周：-2.75 ± 11.51 mg/dL，第12周：-3.75 ± 21.09 mg/dL），测试食品组从第0周至第8周的变化大于安慰剂组（3.87 ± 13.74 mg/dL）（通过学生t-检验的p = 0.081）。测试食品组的血液LDL-c水平下降（第8周：-4.17 ± 9.18 mg/dL，第12周：-4.29 ± 15.14mg/dL）。测试食品组与安慰剂组（3.57 ± 10.93 mg/dL）之间从第0周至第8周的血液LDL-c水平变化存在统计学显著差异（通过学生t-检验的p = 0.012）。测试食品组从第0周至第12周的血液LDL-c水平变化大于安慰剂组（2.14 ± 9.73 mg/dL）（通过学生t-检验的p =0.092）。测试食品组的血液PAI-1水平下降（第8周：-1.83 ± 5.25 ng/mL，第12周：-1.25± 4.66 ng/mL）。测试食品组从第0周至第8周的血液PAI-1水平变化大于安慰剂组（0.52± 2.61 ng/mL）（通过学生t-检验的p = 0.058），测试食品组从第0周至第12周的血液PAI-1水平变化大于安慰剂组（0.86 ± 3.12 ng/mL）（通过学生t-检验的p = 0.076）（表4）。

根据上述测试，研究了摄入含有动物双歧杆菌乳亚种GCL2505和菊粉的酸奶对健康成人血管内皮功能的影响。

血流介导的扩张（FMD）用于本测试。FMD是一种血管内皮功能测试，其利用上臂阻断解除后发生的血流依赖性血管舒张应答。阻断解除后血流增加对血管内皮产生剪切应力，进而产生血管舒张物质如一氧化氮。这些物质作用于与血管内皮相邻的血管平滑肌，导致血管平滑肌松弛，进而引发血管舒张应答。最大扩张时血管直径与静息血管直径的比定义为FMD（%）。当发生血管内皮功能障碍时，血管内皮产生和释放的一氧化氮的生物利用度降低，导致血管舒张应答减弱和FMD（%）低。FMD被认为无创、患者负担小，且对评估患CVD的风险有用（非专利文献9）。

在本测试中，测试食品组在食用含有GCL2505和菊粉的酸奶12周后，FMD（%）增加0.85%。此外，测试食品组从第0周至第12周的FMD（%）变化显著大于安慰剂组。

对受试者粪便微生物群的分析显示，在α-多样性和β-多样性分析中，GCL2505和菊粉没有效果。已有报道称，对健康人类进行膳食纤维干预增加特定细菌的丰度，但不影响肠道微生物群的多样性（非专利文献10）。粪便微生物群没有变化可能是因为本研究中的受试者是健康的，没有肠道菌群失调。动物双歧杆菌的相对丰度仅在活性组受试者的肠道中增加，在安慰剂组中没有增加。换言之，摄入的GCL2505存活到达了肠道。肠道中增加的动物双歧杆菌相对丰度可能增加乙酸（一种主要的SCFA）的产生。

在本测试中，确认了对测试食品组中血液LDL胆固醇（LDL-c）水平的影响。沉积在血管壁的LDL-c转化为氧化型LDL，此类刺激导致血管内皮细胞功能障碍和粘附因子表达增加。氧化型LDL由巨噬细胞摄取并参与泡沫细胞的形成，从而通过促进局部和全身斑块炎症来维持动脉粥样硬化病变的生长。具体地，本测试中观察到的血管内皮功能改善可能是由血液LDL-c水平下降引起的。此外，在本测试中，测试食品组的血液纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）水平低于安慰剂组（第8周，p = 0.058；第12周，p = 0.076）。PAI-1是一种调节纤溶系统的细胞因子，其通过阻断组织纤溶酶原激活物（t-PA，一种已知的纤维蛋白溶栓剂）强烈抑制血栓溶解。已有报道称，PAI-1水平升高与动脉粥样硬化血栓形成相关，并且PAI-1水平在肥胖代谢综合征患者和II型糖尿病患者中升高。具体地，可以认为摄入GCL2505和菊粉改善血管内皮功能的原因在于，经由减少内脏脂肪使血液PAI-1水平下降，并激活纤溶系统。此外，由于已有报道称内脏脂肪与血液LDL-c水平之间存在正相关关系，因此在本测试中，已确认血液LDL-c水平降低的测试食品组，其内脏脂肪质量可能受到影响。

据推测，GCL2505和菊粉改善血管内皮功能通过由以下两个步骤组成的作用机制实现。步骤1：摄入GCL2505和菊粉经由改变肠道微生物群发挥减少内脏脂肪的效果。临床研究已阐明，每日食用含有GCL2505的酸奶减少腹部内脏脂肪质量。此外，Horiuchi等人证明，在GPR43敲除小鼠中，施用GCL2505增加肠道中乳双歧杆菌（B. lactis）计数和血浆中乙酸的浓度，随后以GPR43-依赖性方式调节宿主能量代谢（例如，抑制体脂积累、改善胰岛素敏感性和增强全身脂肪酸代谢）。GPR43是G蛋白-偶联受体家族的成员，被称为宿主中的短链脂肪酸受体，已有报道称乙酸通过激活脂肪细胞中的GPR43和调节脂肪细胞中的胰岛素信号传导来抑制脂肪积累。步骤2：通过以下由减少内脏脂肪引发的子步骤来预防血管内皮功能障碍的发展：1）通过经由减少内脏脂肪从而降低血脂水平进而降低血液LDL-c水平：LDL-c是斑块形成的致病因子，其合成与从内脏脂肪组织释放的游离脂肪酸的量相关；以及2）经由减少内脏脂肪抑制纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）的表达：PAI-1是由脂肪细胞产生的脂肪细胞因子，调节纤溶系统，与动脉硬化密切相关。在本测试中，已证明GCL2505和菊粉经由其对脂肪积累的抑制效果来促进血管内皮功能。

以上结果表明，摄入含有GCL2505和菊粉的合生元饮料减少内脏脂肪，从而改善血管内皮功能。由于一项汇总分析报告称，FMD（%）增加1%，导致患CVD的风险降低约13%，因此本研究的发现被认为具有临床显著性。此外，由于FMD（%）与肾功能之间的相关性也已有报道，改善血管内皮功能障碍也可能降低患肾病的风险。因此，因为该组合不仅具有潜力降低患CVD的风险，还有潜力降低患多种疾病的风险，并对促进健康做出巨大贡献，所以认为本次获得的结果具有临床显著性。

PCT/RO/134表

Claims (25)

1.一种用于改善血管内皮功能的组合物，其包含双歧杆菌（bifidobacteria）和水溶性膳食纤维。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述改善血管内皮功能包括降低血液LDL-c水平或降低PAI-1水平、或两者。

3.一种用于维持血管柔韧性或弹性、或预防其下降的组合物，其包含双歧杆菌和水溶性膳食纤维。

4.一种用于预防动脉硬化的组合物，其包含双歧杆菌和水溶性膳食纤维。

5.一种用于改善肾功能的组合物，其包含双歧杆菌和水溶性膳食纤维。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述水溶性膳食纤维包含菊粉。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述双歧杆菌具有在肠道中增殖的能力。

8.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述双歧杆菌具有抗代谢综合征效果。

9.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其为食品。

10.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其还包含精氨酸。

11.双歧杆菌和水溶性膳食纤维在制造用于改善血管内皮功能的组合物中的用途。

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述改善血管内皮功能包括降低血液LDL-c水平或降低PAI-1水平、或两者。

13.双歧杆菌和水溶性膳食纤维在制造用于维持血管柔韧性或弹性、或预防其下降的组合物中的用途。

14.双歧杆菌和水溶性膳食纤维在制造用于预防动脉硬化的组合物中的用途。

15.双歧杆菌和水溶性膳食纤维在制造用于改善肾功能的组合物中的用途。

16.水溶性膳食纤维在制造用于改善血管内皮功能的组合物中的用途，所述组合物包含双歧杆菌。

17.根据权利要求16所述的用途，其中所述改善血管内皮功能包括降低血液LDL-c水平或降低PAI-1水平、或两者。

18.水溶性膳食纤维在制造用于维持血管柔韧性或弹性、或预防其下降的组合物中的用途，所述组合物包含双歧杆菌。

19.水溶性膳食纤维在制造用于预防动脉硬化的组合物中的用途，所述组合物包含双歧杆菌。

20.水溶性膳食纤维在制造用于改善肾功能的组合物中的用途，所述组合物包含双歧杆菌。

21.根据权利要求11至20中任一项所述的用途，其中所述水溶性膳食纤维包含菊粉。

22.根据权利要求11至20中任一项所述的用途，其中所述双歧杆菌具有在肠道中增殖的能力。

23.根据权利要求11至20中任一项所述的用途，其中所述双歧杆菌具有抗代谢综合征效果。

24.根据权利要求11至20中任一项所述的用途，其中所述组合物为食品。

25.根据权利要求11至20中任一项所述的用途，其中所述组合物还包含精氨酸。