CN122012425A - 甾体化合物11α-羟化酶及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了甾体化合物11α‑羟化酶及其用途。本发明提供的共表达载体能够在大肠杆菌或分枝杆菌中同时表达所述甾体化合物11α‑羟化酶和细胞色素P450还原酶，包含该共表达载体的基因工程菌株可适用于多种甾体底物的11α‑羟基转化，特异性较强，转化率最高可达90.39%，且生产技术简单、高效、可控，具有重要的工业应用价值。

Description

甾体化合物11α-羟化酶及其用途

技术领域

本发明属于生物转化技术领域，具体涉及甾体化合物11α-羟化酶及其用途。

背景技术

甾体类药物是临床应用上仅次于抗生素的第二大类药物，其具有抗炎、免疫抑制、抗血栓、抗肿瘤、抗凝血和抗休克等多种治疗作用，在现代医药产业中占据巨大份额。目前，制备甾体类药物的主要方式包括传统的化学合成法和微生物转化法。其中，微生物转化法凭借其反应专一高效、成本低廉、条件温和以及安全环保等诸多显著优势，正日益受到广泛关注，其关注度也与日俱增。

羟基基团是多种甾体类药物发挥其生理活性的必需基团，而11α-羟基化的甾体化合物更是作为重要的皮质激素药物中间体，在药物合成中具有不可替代的作用。早在1952年，Murray和Peterson便开创性地利用少根根霉（Rhizopus arrhizus）和黑根霉（Rhizopusnigricans）对黄体酮进行转化，成功生成了11α-OH黄体酮。这一成果不仅巧妙地解决了皮质激素生产过程中羟基化难题，还显著降低了后续皮质激素的生产成本，为甾体类药物的生产开辟了新的道路。

然而，多年来微生物转化法制备11α-羟基化甾体药物中间体的技术发展仍停留在较为原始的阶段。目前主要依赖于原始真菌或羟化酶过表达真菌的全细胞转化方式，而这种方式存在诸多不足之处。例如，转化周期较长，导致生产效率低下；同时，副产物较多，使得产物纯度难以达到理想水平。这些因素都极大地限制了该技术在工业生产中的广泛应用。

从真菌菌体中识别并分离独立的羟化酶，并将其在合适的异源宿主中进行功能性表达是真菌甾体羟化酶得以充分利用的重要研究方向。然而作为异源蛋白表达的首选细菌宿主的大肠杆菌（Escherichia coli）虽具有遗传背景清晰、易于遗传操作、繁殖快、易于达到高密度和成本低等优点，但其细胞内无典型的细胞器膜，从而导致需要膜锚定的真菌羟化酶很难在大肠杆菌中正确折叠、定位以及形成活性蛋白。此外，大肠杆菌还存在缺乏兼容的电子传递系统等问题，这些问题进一步导致羟基化反应难以顺利进行，从而严重影响了真菌甾体化合物11α-羟化酶的活性以及11α-羟基化甾体化合物的高效生产。分枝杆菌作为高效的甾体代谢菌，具有强大的甾体运输系统和维持多种内源的甾体代谢相关羟化酶功能化的内环境，是甾体化合物羟化的优势宿主，但其细胞内亦无典型的细胞器膜，因此同样很难实现真菌羟化酶高效表达。

由此可见，本领域目前亟待解决的核心问题在于真菌甾体化合物11α-羟化酶在大肠杆菌和分枝杆菌中活性低且难以实现高效异源表达，从而无法满足高效生产11α-羟基化甾体化合物的工业需求。

发明内容

因此，针对现有技术存在的不足之处，本发明的目的是提供一种甾体化合物11α-羟化酶及其表达载体和表达菌株以及它们在制备11α-羟基甾体化合物中的用途。

本发明的研究结果表明，本发明提供的甾体化合物11α-羟化酶及其双顺反子表达载体首次在大肠杆菌和分枝杆菌中实现了真菌甾体化合物11α-羟化酶的功能性表达与甾体化合物的羟基化，突破了真菌甾体化合物羟化酶活性低、异源表达难的困境，不仅增强了该11α-羟化酶的活性，并且发现其对多种甾体化合物均有11α-羟化作用，转化率最高可达90.39%，为实现甾体化合物11α-羟化酶的工业化应用奠定了重要基础。

本发明采用的甾体化合物11α-羟化酶来源于真菌米根霉（Rhizopus oryzae）的CYP509C12。CYP509C12是目前被报道的少数甾体化合物11α-羟化酶之一，但之前的研究者仅验证了其在真核宿主中的基础表达特性，尚未见关于该酶在大肠杆菌中表达以及其在甾体转化应用的公开报道。而本发明通过基因工程化手段对CYP509C12进行了成功地改造，使其具有在原核宿主中的表达能力，并且通过构建以大肠杆菌或分枝杆菌为宿主的、改造后的CYP509C12与细胞色素P450还原酶的共表达载体进一步提高了11α-羟化酶的活性和反应效率。

本发明的甾体化合物11α-羟化酶和细胞色素P450还原酶ATR2的编码基因可采用同一或不同启动子共同表达，优选以构建双顺反子表达载体的方式进行。术语“双顺反子表达载体”在本发明中的定义与其在本技术领域内普遍认可和遵循的定义保持一致。本发明中所述的双顺反子表达载体是指将本发明的甾体化合物11α-羟化酶和细胞色素P450还原酶ATR2的编码基因共用一个启动子，且每个基因前各有一个核糖体结合位点（RBS），以确保高效的翻译起始，这种设计使得两个基因在宿主细胞中能够同时被转录和翻译。本发明采用的甾体化合物11α-羟化酶属于细胞色素P450氧化酶家族，其需要细胞色素P450还原酶提供的电子来完成羟基化反应。本发明采用的细胞色素P450还原酶是来源于拟南芥的细胞色素P450还原酶（ATR2），其可通过NADPH将电子传递给P450氧化酶，从而激活该酶的活性中心，使其能够催化底物的羟基化反应。通过二者在同一宿主细胞中共表达，可以确保两种酶在细胞内同时存在并发挥作用，协同地提高了11α-羟化酶的活性和反应效率，从而实现11α-羟基甾体化合物的高效转化。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种甾体化合物11α-羟化酶，其氨基酸序列由SEQ IDNO. 1所示的氨基酸序列组成。

第二方面，本发明提供了一种编码根据本发明第一方面所述的甾体化合物11α-羟化酶的基因。

根据本发明的一些实施方案，其中，编码所述甾体化合物11α-羟化酶的基因的核苷酸序列由编码SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列的核苷酸序列组成。

根据本发明的一些实施方案，其中，编码所述甾体化合物11α-羟化酶的基因的核苷酸序列可以由SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 9所示的核苷酸序列组成。

第三方面，本发明提供了一种具有甾体化合物11α-羟化酶活性的共表达载体，其包含根据本发明第二方面所述的编码甾体化合物11α-羟化酶的基因和编码细胞色素P450还原酶的基因。

根据本发明的一些实施方案，其中，所述细胞色素P450还原酶的氨基酸序列由SEQID NO. 3所示的氨基酸序列组成。

根据本发明的一些实施方案，其中，所述编码细胞色素P450还原酶的基因的核苷酸序列由编码SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列的核苷酸序列组成。

根据本发明的一些实施方案，其中，所述编码细胞色素P450还原酶的基因的核苷酸序列可以由SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 10所示的核苷酸序列组成。

本发明对于引入和表达根据本发明所述的编码甾体化合物11α-羟化酶的基因和编码细胞色素P450还原酶的基因的方式没有特殊限制，其包括但不限于通过表达质粒或基因组插入引入等。

根据本发明的一些实施方案，所述编码甾体化合物11α-羟化酶的基因和编码细胞色素P450还原酶的基因整合于宿主菌的染色体上，或位于宿主菌染色体外的游离质粒上。

根据本发明的一些实施方案，其中，所述编码甾体化合物11α-羟化酶的基因和编码细胞色素P450还原酶的基因由同一或不同启动子控制。

根据本发明的一些实施方案，其中，所述启动子为真核启动子或原核启动子。

优选地，所述启动子可在大肠杆菌或分枝杆菌启动基因表达。

更优选地，所述大肠杆菌表达启动子选自T7启动子、Lac启动子和Tac启动子中的一种或多种。

更优选地，所述分枝杆菌表达启动子为Hsp60和G13启动子中的一种或两种。

根据本发明的一些实施方案，其中，所述共表达载体的初始载体为真核表达载体或原核表达载体。

优选地，所述共表达载体的初始载体为大肠杆菌表达载体或分枝杆菌表达载体。

更优选地，所述大肠杆菌表达载体选自pET26b (+)、pET28a (+)、pET32a (+)、pETDuet、pRSFDuet和pCDFDuet质粒中的一种或多种。

更优选地，所述分枝杆菌表达载体为pMV261质粒。

根据本发明的一些实施方案，其中，所述编码甾体化合物11α-羟化酶的基因和编码细胞色素P450还原酶的基因的核苷酸序列的上游分别包含编码核糖体结合位点的核苷酸序列。

第四方面，本发明提供了一种用于制备11α-羟基甾体化合物的基因工程菌株，其表达根据本发明第一方面所述的甾体化合物11α-羟化酶、包含根据本发明第二方面所述的编码甾体化合物11α-羟化酶的基因和/或包含根据本发明第三方面所述的共表达载体。

本发明第四方面所述的基因工程菌株的初始菌株没有特殊限制，其包括但不限于源自链霉菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、棒杆菌属、节杆菌属、红球菌属、分枝杆菌属、大肠杆菌属或酵母菌属的菌株等。

根据本发明的一些实施方案，其中，所述基因工程菌株的初始菌株优选为大肠杆菌或分枝杆菌。

更优选地，所述大肠杆菌基因工程菌株的初始菌株为大肠杆菌BL21（DE3）、大肠杆菌JM109或大肠杆菌C43（DE3），更进一步优选为大肠杆菌BL21（DE3）。

更优选地，所述分枝杆菌基因工程菌株的初始菌株为耻垢分枝杆菌、新金分枝杆菌或偶发分枝杆菌，更进一步优选为新金分枝杆菌。

第五方面，本发明提供了一种用于制备11α-羟基甾体化合物的方法，其包括采用根据本发明第一方面所述的甾体化合物11α-羟化酶、根据本发明第二方面所述的编码甾体化合物11α-羟化酶的基因、根据本发明第三方面所述的共表达载体和/或根据本发明第四方面的基因工程菌株将甾体化合物转化为11α-羟基甾体化合物。

根据本发明的一些实施方案，其中，所述转化是在含有甾体化合物的反应液中利用生长状态或静息状态的根据本发明第四方面所述的基因工程菌株实现的。

根据本发明的一些实施方案，其中，所述甾体化合物为甾体药物中间体，优选为雄烯二酮（AD）、雄二烯二酮（ADD）、双降醇（BA）、黄体酮（PG）和17α-羟基黄体酮中的一种或多种。

根据本发明的一些实施方案，其中，所述11α-羟基甾体化合物为甾体药物中间体经过本发明第一方面所述的甾体化合物11α-羟化酶转化生成的11α-羟基化产物；优选为11α-羟基雄烯二酮（11α-OH AD）、11α-羟基雄二烯二酮（11α-OH ADD）、11α-羟基双降醇（11α-OH BA）、11α-羟基黄体酮（11α-OH PG）和11α，17α-双羟基黄体酮中的一种或多种。

本发明的研究意外地发现，去除真菌米根霉来源的甾体化合物11α-羟化酶CYP509C12的N端疏水区域氨基酸片段能够提高其在原核宿主中的表达能力，同时进一步将拟南芥的细胞色素P450还原酶作为电子传递蛋白与N端截断的米根霉甾体11α-羟化酶共同克隆至同一双顺反子表达载体上，使两者在大肠杆菌或分枝杆菌中共同表达，从而形成了一种高效的羟化酶系统。该羟化酶系统可适用于多种甾体底物的11α-羟基转化，特异性较强，转化率最高可达90.39%，且生产技术简单、高效、可控，具有重要的工业应用价值。

第六方面，本发明提供了根据本发明第一方面所述的甾体化合物11α-羟化酶、根据本发明第二方面所述的编码甾体化合物11α-羟化酶的基因、根据本发明第三方面所述的共表达载体和/或根据本发明第四方面的基因工程菌株在通过转化甾体化合物制备11α-羟基甾体化合物中的用途。

根据本发明的一些实施方案，所述甾体化合物选自雄烯二酮、雄二烯二酮、双降醇、黄体酮和17α-羟基黄体酮中的一种或多种，且对应的所述甾体化合物的11α-羟化产物选自11α-羟基雄烯二酮（11α-OH AD）、11α-羟基雄二烯二酮（11α-OH ADD）、11α-羟基双降醇（11α-OH BA）、11α-羟基黄体酮（11α-OH PG）和11α，17α-双羟基黄体酮中的一种或多种。

附图说明

以下结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为实施例1制备的大肠杆菌双顺反子共表达载体pET26b-11AOH-C1-ATR2的质粒图；

图2展示了在实施例2中大肠杆菌工程菌株在转化AD底物48 h时的HPLC检测结果；

图3展示了在实施例2中大肠杆菌工程菌株或在实施例4中分枝杆菌工程菌株对AD底物进行11α-羟基化反应的过程示意图，其中11AOH-C1-ATR2表示共表达的甾体化合物11α-羟化酶和细胞色素P450还原酶；

图4展示了在实施例2中大肠杆菌工程菌株在转化ADD底物48 h时的HPLC检测结果；

图5展示了在实施例2中大肠杆菌工程菌株或在实施例4中分枝杆菌工程菌株对ADD底物进行11α-羟基化反应的过程示意图，其中11AOH-C1-ATR2表示共表达的甾体化合物11α-羟化酶和细胞色素P450还原酶；

图6展示了在实施例2中大肠杆菌工程菌株在转化PG底物48 h时的HPLC检测结果；

图7展示了在实施例2中大肠杆菌工程菌株或在实施例4中分枝杆菌工程菌株对PG底物的11α-羟基化反应的过程示意图，其中11AOH-C1-ATR2表示共表达的甾体化合物11α-羟化酶和细胞色素P450还原酶；

图8为实施例3制备的分枝杆菌双顺反子共表达载体pMV261-11AOH-C1-ATR2的质粒图；

图9展示了在实施例4中分枝杆菌工程菌株在转化AD底物72 h时的HPLC检测结果；

图10展示了在实施例4中分枝杆菌工程菌株在转化ADD底物72 h时的HPLC检测结果；

图11展示了在实施例4中分枝杆菌工程菌株在转化PG底物72 h时的HPLC检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

本发明所采用的基因操作技术主要为基因表达技术，分子生物学操作方法按照《分子克隆实验室手册》进行，其它未注明具体步骤和条件的实验方法按照常规步骤和条件、或厂商的建议进行。

以下为实施例中所使用的实验材料：

表达宿主新金分枝杆菌MN-L01菌株于2019年1月23日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通生物中心（简称CGMCC），保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.17227，该菌为新金分枝杆菌DSM44074的突变株，主要积累AD。

克隆宿主大肠杆菌DH5α、表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）、大肠杆菌表达质粒pET26b（+）和分枝杆菌表达质粒pMV261购买于武汉淼灵生物科技有限公司；分子生物学试剂购买于赛默飞世尔科技公司与南京诺唯赞生物科技股份有限公司；基因与引物的合成均由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

LB液体培养基：蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L和NaCl 10.0 g/L；

LB固体培养基：蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L和琼脂粉15.0g/L；

静息细胞反应液：Na₂HPO₄ 12.8 g/L，KH₂PO₄ 3.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，葡萄糖4.0g/L；

NA固体培养基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉粉1.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，琼脂粉15.0 g/L，调节pH至7.2-7.4；

BPYG种子培养基：牛肉膏0.3 g/L，蛋白胨1.0 g/L，酵母粉0.3 g/L，甘油1.5 g/L，调节pH至7.0；

转化发酵培养基：大豆蛋白胨3.0 g/L，酵母提取物1.2 g/L，葡萄糖1.2 g/L，柠檬酸0.2 g/L，柠檬酸铁铵0.03 g/L，K₂HPO₄ 1.2 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.05 g/L，NH₄NO₃ 0.3 g/L，调节pH至7.0。

其余实验材料均为常规生化试剂，由销售公司购买所得。

实施例1 共表达甾体化合物11α-羟化酶和细胞色素P450还原酶的大肠杆菌菌株的构建

1. 甾体化合物11α-羟化酶（11AOH-C1）基因全合成

采用的真菌甾体化合物11α-羟化酶来源于真菌米根霉，即名为CYP509C12（基因座标签：RO3G_05077.1）的蛋白。对其结构分析发现，CYP509C12的前49个氨基酸为疏水跨膜区。该段氨基酸序列在真菌中锚定到内质网膜上，但由于原核系统不存在内质网，其反而容易导致蛋白发生错误折叠、聚集或降解。为了实现CYP509C12在原核宿主中的表达，删除了该区域并将删除该区域后的CYP509C12命名为11AOH-C1，11AOH-C1的氨基酸序列如SEQ IDNO. 1所示。进一步将11AOH-C1的氨基酸序列按大肠杆菌密码子偏好性进行优化获得核苷酸序列，该核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。委托测序公司通过人工化学合成的方式从头合成完整的11AOH-C1基因，即全合成甾体化合物11α-羟化酶（11AOH-C1）基因。

SEQ ID NO. 1：

MVPKRFQHLPKLSYFPSAKSIFNNEPIYDRYKRLVFPVIKENNGIYVSKISFDWTVYIANPVAAKHVLLKADLYPKSHDFLKMLGSNSPVVQFLGYDSVGLTNGHVWKNQRKLMNPAFHRSMPINTMSTVIPDLFFVIEKENGTIAVPSVMRDFTLDVLGLTVFGFDFKALKGDPDEWTKTFTLANEGLFDPILNIFGPFSFILTAIFPKRREQLKAVAKLNGKLEQLIHQKRMEIENGAYSNTPENEKDLVALMLEAEKRGEGLTNDLELRHNIAGFFLAGHDTTANALSFCFYNLAKNKHVQNKLRQEIISVLGDDPKDVVPTLDQLKEMPYLNLVLKENLRLNGPADNILPRVAAKDMVVDGTFIPKGATVNIDIYGIHHNPKFWNNPDDFIPERLDENGEQDSHDGLTWLPFGNGARQCLGMNFSLTEQRLLLVMMIRKYEIDVPKDSIHYERVIFGSETTPPNSLELTFKKRY

SEQ ID NO. 2：

ATGGTCCCGAAGCGCTTTCAGCATCTGCCGAAGCTGAGTTATTTCCCGAGCGCCAAAAGCATCTTCAACAATGAACCGATTTACGATCGTTATAAGCGTCTTGTGTTTCCGGTGATTAAGGAAAACAATGGCATTTATGTTTCGAAGATCTCCTTCGATTGGACGGTCTATATCGCCAATCCGGTCGCCGCGAAACATGTACTGCTGAAAGCCGATCTTTACCCTAAATCTCACGACTTCCTCAAGATGTTGGGTTCGAACTCTCCGGTCGTACAGTTCCTGGGATATGATTCAGTGGGTCTGACGAATGGTCACGTGTGGAAAAATCAGCGCAAATTAATGAATCCGGCCTTCCACCGCTCTATGCCTATTAATACAATGAGCACCGTGATTCCGGACTTGTTTTTTGTGATTGAAAAAGAGAACGGTACCATTGCCGTGCCGTCAGTTATGCGTGACTTTACCTTAGATGTGTTAGGTTTGACTGTATTTGGGTTTGATTTCAAAGCGCTGAAGGGTGACCCGGATGAATGGACCAAGACCTTTACCCTTGCGAATGAAGGCCTGTTCGACCCGATCCTGAATATTTTTGGCCCTTTCAGCTTTATTCTGACCGCCATCTTTCCGAAACGCCGCGAGCAATTAAAAGCGGTTGCGAAACTGAACGGCAAGCTGGAACAGCTGATCCATCAAAAACGCATGGAGATCGAAAATGGCGCCTACTCGAATACGCCTGAAAACGAAAAAGACCTGGTTGCACTGATGCTGGAGGCGGAAAAACGCGGCGAGGGTTTGACTAATGACCTTGAACTCCGCCATAACATCGCAGGCTTCTTTTTGGCCGGTCACGATACAACTGCCAACGCCCTGAGCTTCTGCTTCTACAACCTGGCGAAAAATAAACATGTCCAGAACAAATTACGTCAAGAAATCATTAGCGTGTTGGGGGATGACCCAAAAGATGTTGTTCCGACCCTGGACCAACTCAAAGAAATGCCGTACCTGAACTTGGTATTGAAAGAGAATCTGCGCCTGAACGGCCCTGCAGATAACATTCTGCCGCGCGTCGCGGCGAAAGATATGGTGGTCGATGGTACCTTTATTCCGAAAGGTGCTACGGTTAATATCGACATCTACGGTATCCATCACAATCCGAAATTCTGGAATAACCCCGACGACTTCATTCCGGAACGCTTAGACGAAAATGGCGAGCAGGATTCGCATGATGGCCTGACTTGGCTGCCGTTTGGCAATGGCGCCCGCCAGTGTCTTGGCATGAACTTTTCGCTCACTGAACAACGTTTACTGTTAGTGATGATGATTCGCAAATACGAAATCGACGTACCTAAGGACTCAATCCACTATGAACGCGTGATCTTTGGCAGCGAAACCACCCCGCCCAACTCCCTTGAACTGACCTTTAAAAAGCGCTACTAA

2. 构建pET26b-11AOH-C1中间质粒

A. 以质粒pUC57-11AOH-C1（测序公司返回的按大肠杆菌密码子偏好性进行优化的11AOH-C1合成基因承载质粒）为模板、11AOH-C1-F1/11AOH-C1-R1为引物进行PCR扩增，其中PCR反应条件为：98℃预变性30 s，98℃变性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸75 s，30个循环，72℃充分延伸5 min。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收。

11AOH-C1（大肠杆菌密码子优化序列）的引物序列如下：

11AOH-C1-F1：

AAGAAGGAGATATACATATGGTCCCGAAGCGCTTTCAG（SEQ ID NO. 5）

11AOH-C1-R1：

TCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTAGTAGCGCTTTTTAAAGG（SEQ ID NO. 6）

B. 将pET26b（+）质粒进行Nde I/Hind III双酶切，产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收。使用试剂盒（CloneExpress II One Step Cloning Kit）将回收的质粒酶切产物和11AOH-C1的PCR产物连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态中，复苏后涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，挑取阳性转化子提取质粒，获得中间质粒pET26b-11AOH-C1。

3. 细胞色素P450还原酶（ATR2）基因全合成

细胞色素P450还原酶的基因名为ATR2（登录号：NP_194750.1），其是来源于拟南芥（Arabidopsis thaliana）的具有电子传递功能的蛋白。由于原核系统内缺乏电子传递系统，故将11AOH-C1与ATR2以构建双顺反子表达载体的形式共表达。将ATR2的氨基酸序列（如SEQ ID NO. 3所示）按大肠杆菌密码子偏好性进行优化获得核苷酸序列（如SEQ ID NO. 4所示），委托测序公司全合成ATR2基因。

SEQ ID NO. 3：

MSSSSSSSTSMIDLMAAIIKGEPVIVSDPANASAYESVAAELSSMLIENRQFAMIVTTSIAVLIGCIVMLVWRRSGSGNSKRVEPLKPLVIKPREEEIDDGRKKVTIFFGTQTGTAEGFAKALGEEAKARYEKTRFKIVDLDDYAADDDEYEEKLKKEDVAFFFLATYGDGEPTDNAARFYKWFTEGNDRGEWLKNLKYGVFGLGNRQYEHFNKVAKVVDDILVEQGAQRLVQVGLGDDDQCIEDDFTAWREALWPELDTILREEGDTAVATPYTAAVLEYRVSIHDSEDAKFNDINMANGNGYTVFDAQHPYKANVAVKRELHTPESDRSCIHLEFDIAGSGLTYETGDHVGVLCDNLSETVDEALRLLDMSPDTYFSLHAEKEDGTPISSSLPPPFPPCNLRTALTRYACLLSSPKKSALVALAAHASDPTEAERLKHLASPAGKDEYSKWVVESQRSLLEVMAEFPSAKPPLGVFFAGVAPRLQPRFYSISSSPKIAETRIHVTCALVYEKMPTGRIHKGVCSTWMKNAVPYEKSENCSSAPIFVRQSNFKLPSDSKVPIIMIGPGTGLAPFRGFLQERLALVESGVELGPSVLFFGCRNRRMDFIYEEELQRFVESGALAELSVAFSREGPTKEYVQHKMMDKASDIWNMISQGAYLYVCGDAKGMARDVHRSLHTIAQEQGSMDSTKAEGFVKNLQTSGRYLRDVW

SEQ ID NO. 4：

ATGAGTAGCTCCTCATCCTCATCAACCTCAATGATTGACCTGATGGCAGCAATCATCAAAGGTGAACCGGTCATTGTAAGTGACCCAGCCAACGCGAGCGCTTACGAGAGCGTCGCGGCGGAACTGAGCAGCATGCTGATTGAAAACCGCCAGTTTGCAATGATTGTCACCACCAGCATCGCAGTTCTTATCGGGTGTATTGTGATGTTGGTGTGGCGTCGCAGCGGTAGCGGCAACTCAAAACGCGTAGAACCTTTGAAACCGCTCGTGATTAAACCTCGCGAGGAAGAAATCGATGATGGCCGCAAAAAAGTTACCATCTTTTTTGGCACCCAGACGGGTACCGCGGAAGGCTTCGCGAAAGCCCTCGGCGAAGAGGCCAAGGCGCGCTATGAAAAAACGCGCTTTAAGATCGTGGATCTGGATGACTACGCTGCAGATGACGATGAATACGAAGAAAAGCTGAAGAAAGAAGATGTAGCGTTCTTTTTTCTGGCGACTTATGGGGATGGCGAACCGACCGATAACGCAGCGCGCTTCTACAAATGGTTCACAGAAGGGAATGACCGCGGTGAGTGGCTGAAGAACCTGAAATATGGTGTGTTTGGTCTTGGAAATCGTCAGTATGAGCATTTCAACAAGGTTGCTAAAGTGGTGGATGACATCCTGGTTGAACAGGGCGCGCAGCGTCTGGTCCAAGTAGGCCTCGGCGATGATGATCAGTGCATTGAGGACGACTTCACTGCATGGCGCGAGGCTCTGTGGCCAGAATTGGACACCATCCTGCGTGAAGAAGGTGATACCGCTGTAGCTACCCCGTATACCGCTGCAGTGCTGGAATATCGCGTAAGCATTCACGACTCCGAAGACGCAAAATTTAATGATATTAACATGGCAAACGGCAACGGCTACACTGTGTTTGACGCACAGCACCCATATAAGGCGAATGTAGCCGTGAAACGTGAATTACACACCCCGGAATCAGACCGCAGCTGTATCCATCTGGAATTCGATATTGCCGGGAGTGGTCTGACCTATGAAACCGGCGACCATGTTGGCGTGCTCTGTGATAACCTGAGCGAAACCGTCGATGAGGCCCTCCGCCTGCTTGATATGTCGCCGGATACGTATTTCAGTTTGCACGCCGAAAAAGAGGACGGAACGCCGATTTCTAGTAGCCTGCCTCCGCCATTTCCGCCGTGTAATCTGCGTACCGCGCTGACTCGCTATGCCTGCTTGTTATCCAGCCCTAAGAAATCTGCCCTCGTAGCATTAGCTGCGCACGCCAGCGATCCGACAGAAGCAGAGCGTCTGAAACACCTGGCCTCCCCTGCCGGCAAGGACGAGTATAGTAAGTGGGTAGTAGAATCGCAGCGCTCCCTGTTGGAAGTGATGGCTGAATTTCCGTCCGCAAAACCACCGCTGGGTGTTTTCTTCGCCGGCGTGGCCCCTCGCTTACAGCCGCGTTTTTACAGCATTAGCTCCAGCCCGAAAATTGCTGAGACCCGCATTCATGTGACGTGCGCCCTGGTTTACGAAAAAATGCCGACAGGCCGCATTCATAAGGGAGTATGCTCTACCTGGATGAAAAATGCAGTGCCGTACGAAAAGAGCGAGAACTGTAGTAGCGCGCCGATCTTTGTGCGCCAGAGTAATTTTAAGTTGCCGTCAGACTCCAAAGTCCCAATTATCATGATCGGTCCAGGTACCGGCCTGGCGCCGTTTCGCGGCTTTCTGCAGGAACGTTTAGCTCTGGTCGAAAGCGGCGTTGAACTGGGGCCGAGTGTTCTGTTCTTCGGGTGCCGCAACCGCCGCATGGATTTTATTTACGAGGAAGAACTGCAGCGTTTTGTCGAATCCGGCGCTCTGGCCGAACTCTCCGTTGCATTTAGCCGTGAAGGCCCTACGAAAGAGTACGTCCAACATAAAATGATGGATAAAGCGAGCGATATCTGGAACATGATCTCACAGGGCGCGTATCTTTACGTGTGTGGAGACGCGAAAGGCATGGCTCGTGATGTTCACCGCTCACTCCACACCATTGCGCAGGAGCAGGGCTCAATGGATAGCACCAAGGCGGAAGGTTTCGTGAAAAACTTACAGACTTCAGGGCGCTATCTGCGCGATGTGTGGTAA

4. 通过PCR扩增获得带有核糖体结合位点（RBS）的ATR2

以质粒pUC57-ATR2（测序公司返回的按大肠杆菌密码子偏好性进行优化的ATR2合成基因承载质粒）为模板，ATR2-F1/ATR2-R1为引物进行PCR扩增，其中PCR反应条件为：98℃预变性30 s，98℃变性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸2 min，30个循环，72℃充分延伸5min。

ATR2（大肠杆菌密码子优化序列）的引物序列如下：

ATR2-F1：

TTAAAAAGCGCTACTAAGCTTAAGGAGATATAAATATGAGTAGCTCCTCATCC（SEQ ID NO. 7）

ATR2-R1：

GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTACCACACATCGCGCAG （SEQ ID NO. 8）

上述引物ATR2-F1中添加RBS序列（AAGGAGA）以使11AOH-C1和ATR2采用双顺反子模式表达。

5. 构建双顺反子共表达载体pET26b-11AOH-C1-ATR2

将pET26b-11AOH-C1中间质粒使用Hind III/Xho I双酶切，产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收。使用试剂盒（CloneExpress II One Step Cloning Kit）将回收的质粒酶切产物和步骤4中的ATR2的PCR产物连接，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态中，复苏后涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，挑取阳性转化子提取质粒并送去测序，测序结果表明其与理论核苷酸序列一致，由此成功构建了双顺反子共表达载体pET26b-11AOH-C1-ATR2（见图1）。

6. 将质粒pET26b-11AOH-C1-ATR2转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态中，复苏后涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，获得阳性转化子即为共表达甾体化合物11α-羟化酶和细胞色素P450还原酶的大肠杆菌工程菌株。

实施例2 大肠杆菌工程菌株对多种甾体化合物的转化应用

1. 挑取实施例1制备的大肠杆菌工程菌株的单菌落接于含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养16 h获得种子液。

2. 将得到的种子液按1%的接种量接种至含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，培养至对数生长期时加入终浓度0.5 mM的诱导剂IPTG和0.6 mM的5-氨基乙酰丙酸（5-ALA），25℃诱导24 h后，于4℃、3500 rpm下离心10 min收集菌体。

3. 用等体积的静息细胞反应液重悬菌体，分别加入终浓度为50 mg/L的底物雄烯二酮和雄二烯二酮以及终浓度为100 mg/L的底物黄体酮，28℃下反应48 h。

4. 取500 μL反应液，用二倍体积乙酸乙酯萃取两次，合并上清，烘干。样品用200μL色谱级甲醇复溶，采用HPLC对产物进行定量分析，色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18（4.6×250 mm，5 μm），检测波长为241 nm，柱温为40℃。HPLC采用梯度洗脱。

检测AD和ADD的转化样品的色谱条件具体为：流动相乙腈（B）-水（A），流速1 mL/min，进样量10 μL，预平衡时间5 min，运行时间20 min。流动相梯度条件为32%-65% B，0-15min；65%-90% B，15-20 min。

检测PG的转化样品的色谱条件具体为：流动相甲醇（B）-水（A），流速1 mL/min，进样量10 μL，预平衡时间5 min，运行时间25 min。流动相梯度条件为40%-90% B，0-20 min；90% B，20-25 min。

5. 实验结果

（1）AD底物转化结果

工程菌转化AD底物48 h后，HPLC分析结果（见图2）显示反应液中11α-OH AD的终浓度为4.10 mg/L。据此计算得出该工程菌株对AD底物的转化率为7.78%。具体转化过程见图3。

（2）ADD底物转化结果：

工程菌转化ADD底物48 h后，HPLC分析结果（见图4）显示反应液中11α-OH ADD的终浓度为3.71 mg/L。由此计算得出该工程菌株对ADD底物的转化率为7.02%。具体转化过程见图5。

（3）PG底物转化结果：

工程菌转化PG底物48 h后，HPLC分析结果（见图6）显示反应液中11α-OH PG的终浓度为57.66 mg/L。经计算，该工程菌株对PG底物的转化率为54.86%。具体反应过程见图7。

实施例3 共表达甾体化合物11α-羟化酶和细胞色素P450还原酶的分枝杆菌菌株的构建

1. 甾体化合物11α-羟化酶（11AOH-C1）基因全合成

进一步将11AOH-C1的氨基酸序列按分枝杆菌密码子偏好性进行优化获得核苷酸序列，该核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示。委托测序公司通过人工化学合成的方式从头合成完整的11AOH-C1基因，即全合成甾体化合物11α-羟化酶（11AOH-C1）基因。

SEQ ID NO. 9：

ATGGTGCCGAAGCGCTTCCAGCACCTGCCGAAGCTGTCGTACTTCCCGTCGGCCAAGTCGATCTTCAACAACGAGCCGATCTACGACCGCTACAAGCGCCTGGTGTTCCCGGTGATCAAGGAGAACAACGGCATCTACGTCTCGAAGATCAGCTTCGACTGGACCGTGTACATCGCCAACCCGGTGGCCGCCAAGCACGTGCTGCTGAAGGCCGACCTGTACCCGAAGTCGCACGACTTCCTGAAGATGCTGGGTTCGAACTCGCCGGTGGTGCAGTTCCTGGGTTACGACTCGGTGGGTCTGACCAACGGTCACGTCTGGAAGAACCAGCGCAAGCTGATGAACCCGGCCTTCCACCGCTCGATGCCGATCAACACCATGTCGACCGTGATCCCGGACCTGTTCTTCGTGATCGAGAAGGAGAACGGTACCATCGCCGTCCCGTCGGTCATGCGCGACTTCACCCTGGACGTCCTGGGTCTGACCGTGTTCGGTTTCGACTTCAAGGCCCTGAAGGGCGACCCCGACGAGTGGACCAAGACCTTCACCCTGGCCAACGAGGGTCTGTTCGACCCGATCCTGAACATCTTCGGTCCGTTCTCGTTCATCCTGACCGCCATCTTCCCGAAGCGCCGCGAGCAGCTGAAGGCCGTGGCCAAGCTGAACGGTAAGCTGGAGCAGCTGATCCACCAGAAGCGCATGGAGATCGAGAACGGCGCCTACTCGAACACCCCGGAGAACGAGAAGGACCTGGTGGCCCTGATGCTGGAGGCCGAGAAGCGGGGTGAGGGTCTGACCAACGACCTGGAGCTGCGCCACAACATCGCGGGTTTCTTCCTGGCCGGTCACGACACCACCGCCAACGCCCTCAGCTTCTGCTTCTACAACCTGGCCAAGAACAAGCACGTGCAGAACAAGCTGCGCCAGGAGATCATCTCGGTGCTGGGCGACGACCCGAAGGACGTGGTGCCGACCCTGGACCAGCTGAAGGAGATGCCGTACCTGAACCTGGTGCTGAAGGAGAACCTGCGCCTGAACGGTCCGGCCGACAACATCCTGCCGCGCGTCGCCGCCAAGGACATGGTCGTGGACGGTACCTTCATCCCGAAGGGCGCCACCGTGAACATCGACATCTACGGTATCCACCACAACCCCAAGTTCTGGAACAACCCGGACGACTTCATCCCGGAGCGCCTGGACGAGAACGGCGAGCAGGACTCGCACGACGGTCTCACCTGGCTGCCCTTCGGTAACGGTGCCCGCCAGTGCCTCGGTATGAACTTCTCGCTGACCGAGCAGCGCCTGCTGCTGGTGATGATGATCCGCAAGTACGAGATCGACGTGCCGAAGGACTCGATCCACTACGAGCGCGTGATCTTCGGTTCGGAGACCACCCCGCCGAACTCGCTGGAGCTGACCTTCAAGAAGCGCTACTAA

2. 构建pMV261-11AOH-C1中间质粒

A. 以质粒pUC57-11AOH-C1（测序公司返回的按分枝杆菌密码子偏好性进行优化的11AOH-C1合成基因承载质粒）为模板、11AOH-C1-F2/11AOH-C1-R2为引物进行PCR扩增，其中PCR反应条件为：98℃预变性30 s，98℃变性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸75 s，30个循环，72℃充分延伸5 min。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收。

11AOH-C1（分枝杆菌密码子优化序列）的引物序列如下：

11AOH-C1-F2：

GGCCAAGACAATTGCGGATCCATGGTGCCGAAGCGCTTCC（SEQ ID NO. 11）

11AOH-C1-R2：

ACATCGATAAGCTTCGAATTCTTAGTAGCGCTTCTTGAAGG（SEQ ID NO. 12）

B. 将pMV261质粒进行BamH I/EcoR I双酶切，产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收。使用试剂盒（CloneExpress II One Step Cloning Kit）将回收的质粒酶切产物和11AOH-C1的PCR产物连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态中，复苏后涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，挑取阳性转化子提取质粒，获得中间质粒pMV261-11AOH-C1。

3. 细胞色素P450还原酶（ATR2）基因全合成

将ATR2的氨基酸序列（如SEQ ID NO. 3所示）按分枝杆菌密码子偏好性进行优化获得核苷酸序列（如SEQ ID NO. 10所示），委托测序公司全合成ATR2基因。

SEQ ID NO. 10：

ATGTCGTCGTCGTCGTCCTCGTCGACCTCGATGATCGATCTGATGGCCGCCATCATCAAGGGTGAACCGGTCATCGTCTCGGACCCGGCCAACGCCTCGGCCTACGAATCGGTCGCCGCCGAACTGTCGTCGATGCTGATCGAAAACCGCCAGTTTGCCATGATCGTCACCACCTCCATCGCCGTCCTGATCGGTTGCATCGTCATGCTGGTCTGGCGCCGCTCCGGTTCGGGTAACTCGAAGCGCGTCGAACCGCTGAAGCCGCTGGTCATCAAGCCGCGCGAAGAAGAAATCGACGACGGTCGCAAGAAGGTCACCATCTTTTTCGGCACCCAGACCGGCACCGCCGAAGGTTTTGCGAAGGCCCTGGGCGAAGAAGCCAAGGCCCGCTACGAAAAGACCCGCTTCAAGATCGTGGATCTGGACGATTACGCCGCCGACGACGACGAATACGAAGAGAAGCTGAAGAAGGAGGACGTCGCCTTCTTCTTCCTGGCCACCTACGGCGACGGCGAACCGACCGATAACGCCGCCCGCTTTTACAAGTGGTTCACCGAAGGTAACGATCGCGGCGAATGGCTGAAGAACCTGAAGTACGGCGTCTTTGGTCTGGGTAACCGCCAGTACGAGCACTTTAACAAGGTCGCCAAGGTCGTCGACGATATCCTGGTCGAACAGGGCGCCCAGCGCCTGGTGCAGGTCGGTCTGGGCGACGACGATCAGTGCATCGAAGACGATTTTACCGCCTGGCGCGAAGCCCTGTGGCCGGAACTGGATACCATCCTGCGCGAAGAAGGCGATACCGCCGTCGCCACCCCGTACACCGCCGCCGTCCTGGAATACCGCGTCTCGATCCACGATTCGGAAGATGCCAAGTTCAACGACATCAACATGGCCAACGGTAACGGTTACACCGTCTTTGACGCCCAGCACCCGTACAAGGCCAACGTCGCCGTCAAGCGCGAACTGCACACCCCGGAATCGGATCGCAGCTGCATCCACCTGGAATTTGATATCGCCGGTTCGGGTCTGACCTACGAAACCGGCGATCACGTCGGCGTCCTGTGCGATAACCTGTCGGAAACCGTCGACGAAGCCCTGCGCCTGCTGGATATGTCGCCGGATACCTACTTTTCCCTGCACGCCGAAAAGGAAGACGGCACCCCGATCTCGTCGTCGCTGCCGCCGCCGTTTCCGCCCTGCAACCTGCGCACCGCCCTGACCCGCTACGCCTGCCTGCTGTCGTCGCCGAAGAAGTCGGCCCTGGTCGCCCTGGCCGCCCACGCCTCGGACCCGACCGAAGCCGAACGCCTGAAGCACCTGGCCTCGCCGGCCGGTAAGGACGAATACAGCAAGTGGGTCGTCGAATCGCAGCGCTCGCTGCTGGAAGTCATGGCGGAATTTCCCTCGGCCAAGCCGCCGCTGGGCGTCTTCTTCGCCGGTGTCGCCCCGCGCCTCCAGCCGCGCTTTTACTCGATCTCGTCGTCGCCGAAGATCGCCGAAACCCGCATCCACGTCACCTGCGCCCTGGTCTACGAAAAGATGCCGACCGGTCGCATCCACAAGGGCGTCTGCTCGACCTGGATGAAGAACGCCGTCCCGTACGAAAAGTCCGAAAACTGCTCGTCGGCCCCGATCTTTGTCCGCCAGTCGAACTTTAAGCTGCCGTCGGATTCGAAGGTCCCGATCATCATGATCGGTCCGGGCACCGGCCTGGCCCCGTTTCGCGGTTTTCTCCAGGAGCGCCTGGCCCTGGTCGAATCGGGCGTCGAACTGGGTCCGTCGGTCCTGTTCTTCGGCTGCCGCAACCGCCGCATGGATTTCATCTACGAAGAGGAACTCCAGCGCTTTGTCGAATCGGGTGCCCTGGCGGAACTGTCGGTCGCCTTTTCGCGCGAAGGTCCGACCAAGGAATACGTCCAGCACAAGATGATGGACAAGGCCTCCGATATCTGGAACATGATCTCGCAGGGCGCCTACCTGTACGTCTGCGGTGACGCCAAGGGTATGGCCCGCGACGTCCACCGCTCGCTGCACACCATCGCCCAGGAACAGGGTTCGATGGATTCGACCAAGGCCGAAGGTTTCGTCAAGAACCTCCAGACCTCGGGTCGCTACCTGCGCGACGTCTGGTGA

4. 通过PCR扩增获得带有核糖体结合位点（RBS）的ATR2

以质粒pUC57-ATR2（测序公司返回的按分枝杆菌密码子偏好性进行优化的ATR2合成基因承载质粒）为模板，ATR2-F2/ATR2-R2为引物进行PCR扩增，其中PCR反应条件为：98℃预变性30 s，98℃变性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸2 min，30个循环，72℃充分延伸5min。

ATR2（分枝杆菌密码子优化序列）的引物序列如下：

ATR2-F2：

CAAGAAGCGCTACTAAGAATTCAAGGAGATATAAATATGTCGTCGTCGTCGTCCTC（SEQ ID NO.13）

ATR2-R2：

CTACGTCGACATCGATAAGCTTTCACCAGACGTCGCGCAG （SEQ ID NO. 14）

上述引物ATR2-F2中添加RBS序列以使11AOH-C1和ATR2采用双顺反子模式表达。

5. 构建双顺反子共表达载体pMV261-11AOH-C1-ATR2

将pMV261-11AOH-C1中间质粒使用EcoR I/Hind III双酶切，产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收。使用试剂盒（CloneExpress II One Step Cloning Kit）将回收的质粒酶切产物和步骤4中的ATR2的PCR产物连接，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态中，复苏后涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，挑取阳性转化子提取质粒并送去测序，测序结果表明其与理论核苷酸序列一致，由此成功构建了双顺反子共表达载体pMV261-11AOH-C1-ATR2（见图8）。

6. 制备新金分枝杆菌感受态细胞及质粒转化

将平板活化的新金分枝杆菌MN-L01以1%的接种量接种于10 mL的LB液体培养基中32℃过夜培养，第二天早上加入20 mL的LB液体培养基继续培养至OD600为0.8左右，离心收集菌体，用2倍体积的去离子双蒸水洗涤两次，最后用10%甘油悬浮菌体，每100 μL分装。

取构建的双顺反子共表达载体pMV261-11AOH-C1-ATR2 1 μL加入到100 μL感受态细胞中，吹吸混匀后加入到2 mm电转杯中电转化，电转条件：2500 V、25 μF、600 Ω。

7. 重组子的筛选及验证

向电转化后的产物中立即加入1 mL预冷的LB液体培养基，32℃复苏3-4h，涂布于含50 μg/mL卡那霉素的NA固体培养基上，获得阳性转化子即为共表达甾体化合物11α-羟化酶和细胞色素P450还原酶的分枝杆菌工程菌株。

实施例4 分枝杆菌工程菌株对多种甾体化合物的转化应用

1. 挑取实施例3制备的分枝杆菌工程菌株的单菌落依次进行一级种子培养和二级种子培养：将单菌落接于种子培养基BPYG中，32℃培养3天获得一级种子液，以1%的接种量转接至种子培养基BPYG中32℃继续培养3天获得二级种子液。

2. 将得到的二级种子液按5%的接种量接种至转化发酵培养基中，分别加入终浓度为200 mg/L的底物雄烯二酮、雄二烯二酮和黄体酮，32℃下转化72 h。

3. 取500 μL反应液，用二倍体积乙酸乙酯萃取两次，合并上清，烘干。样品用200μL色谱级甲醇复溶，采用HPLC对产物进行定量分析，具体方法与实施例2中大肠杆菌工程菌株转化产物定量分析方法一致。

4. 实验结果

（1）AD底物转化结果

工程菌转化AD底物72 h后，HPLC分析结果（见图9）显示反应液中11α-OH AD的终浓度为139.20 mg/L。据此计算得出该工程菌株对AD底物的转化率为65.91%。具体转化过程见图3。

（2）ADD底物转化结果：

工程菌转化ADD底物72 h后，HPLC分析结果（见图10）显示反应液中11α-OH ADD的终浓度为61.88 mg/L。由此计算得出该工程菌株对ADD底物的转化率为29.29%。具体转化过程见图5。

（3）PG底物转化结果：

工程菌转化PG底物72 h后，HPLC分析结果（见图11）显示反应液中11α-OH PG的终浓度为189.99 mg/L。经计算，该工程菌株对PG底物的转化率为90.39%。具体反应过程见图7。

对比例1

将11AOH-C1分别与已报道的其它真菌来源的细胞色素P450还原酶TcCPR（登录号：AVW80114.1）、RoCPR1（登录号：EIE89541.1）和ClCPR1（登录号：ABW86977.1）组合，上述三种细胞色素P450还原酶与ATR2的氨基酸序列一致性分别为34.06%、36.49%和34.30%。按照实施例1的方法构建双顺反子共表达载体及大肠杆菌表达菌株并按照实施例2的方法进行底物转化检测。检测结果显示，各表达菌株转化AD和ADD底物时均无明显产物生成，转化PG底物虽生成产物，但转化率均降低，具体为11AOH-C1搭配TcCPR、RoCPR1和ClCPR1的表达株转化PG的产物终浓度分别为46.84 mg/L、19.27 mg/L和14.63 mg/L，转化率分别为44.59%、18.36%和13.92%。

对比例2

将未删除前49个氨基酸的原始CYP509C12与拟南芥ATR2（登录号：NP_194750.1）按照实施例1的方法构建双顺反子共表达载体及大肠杆菌表达菌株并按照实施例2的方法进行底物转化检测。检测结果显示，其表达株转化AD、ADD和PG的产物终浓度分别为3.25 mg/L、2.78 mg/L和48.02 mg/L，转化率分别为6.16%、5.26%和45.69%。

对比例3

将11AOH-C1分别与已报道的其它真菌来源的细胞色素P450还原酶TcCPR、RoCPR1和ClCPR1组合，按照实施例3的方法构建双顺反子共表达载体及分枝杆菌表达菌株并按照实施例4的方法进行底物转化检测。检测结果显示，各表达菌株转化AD、ADD和PG底物虽生成产物，但转化率均降低，具体为11AOH-C1搭配TcCPR、RoCPR1和ClCPR1的表达株转化AD的产物终浓度分别为120.85 mg/L、90.52 mg/L和86.04 mg/L，转化率分别为57.22%、42.86%和40.74%；11AOH-C1搭配TcCPR、RoCPR1和ClCPR1的表达株转化ADD的产物终浓度分别为50.23mg/L、38.44 mg/L和38.56 mg/L，转化率分别为23.78%、18.19%和18.25%；11AOH-C1搭配TcCPR、RoCPR1和ClCPR1的表达株转化PG的产物终浓度分别为170.66 mg/L、134.28 mg/L和125.06 mg/L，转化率分别为81.19%、63.88%和59.50%。

对比例4

将未删除前49个氨基酸的原始CYP509C12与拟南芥ATR2按照实施例3的方法构建双顺反子共表达载体及分枝杆菌表达菌株并按照实施例4的方法进行底物转化检测。检测结果显示，其表达株转化AD、ADD和PG的产物终浓度分别为128.01 mg/L、53.26 mg/L和178.50 mg/L，转化率分别为60.61%、25.21%和84.92%。

由以上数据可知，相对于对比例1提供的大肠杆菌表达菌株仅对黄体酮具有11α-羟化作用，本发明实施例1提供的大肠杆菌工程菌株对包括雄烯二酮、雄二烯二酮和黄体酮在内的多种甾体化合物均具有11α-羟化作用；而相比于对比例2提供的大肠杆菌表达菌株，本发明实施例1提供的大肠杆菌工程菌株在转化雄烯二酮、雄二烯二酮和黄体酮等甾体化合物时，其转化产物浓度和转化率更高，对黄体酮的转化率可达54.86%。

相比于对比例3和对比例4提供的分枝杆菌表达菌株，本发明实施例3提供的分枝杆菌工程菌株在转化雄烯二酮、雄二烯二酮和黄体酮等甾体化合物时，其转化产物浓度和转化率更高，对黄体酮的转化率可达90.39%，具有较高的工业生产价值。

进一步比较可得，本发明构建的分枝杆菌工程菌株对包括雄烯二酮、雄二烯二酮和黄体酮在内的多种甾体化合物的转化能力均优于本发明构建的大肠杆菌工程菌株。

尽管在此公开了本发明的各个方面和实施例，但其他方面和实施例对于本领域技术人员而言也是显而易见的。在此公开的各个方面和实施例仅用于说明目的，而非限制目的。本发明的保护范围和主旨仅通过所附的权利要求书来确定。

Claims (20)

1.一种甾体化合物11α-羟化酶，其特征在于，其氨基酸序列由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列组成。

2.一种编码权利要求1所述的甾体化合物11α-羟化酶的基因。

3.根据权利要求2所述的编码甾体化合物11α-羟化酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列由编码SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列的核苷酸序列组成。

4.一种具有甾体化合物11α-羟化酶活性的共表达载体，其特征在于，其包含根据权利要求2或3所述的编码甾体化合物11α-羟化酶的基因和编码细胞色素P450还原酶的基因。

5.根据权利要求4所述的共表达载体，其特征在于，所述细胞色素P450还原酶的氨基酸序列由SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列组成。

6.根据权利要求4所述的共表达载体，其特征在于，所述编码细胞色素P450还原酶的基因的核苷酸序列由编码SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列的核苷酸序列组成。

7.根据权利要求4所述的共表达载体，其特征在于，所述编码甾体化合物11α-羟化酶的基因和编码细胞色素P450还原酶的基因整合于宿主菌的染色体上，或位于宿主菌染色体外的游离质粒上。

8.根据权利要求4所述的共表达载体，其特征在于，所述编码甾体化合物11α-羟化酶的基因和编码细胞色素P450还原酶的基因由同一或不同启动子控制。

9.根据权利要求8所述的共表达载体，其特征在于，所述启动子为真核启动子或原核启动子。

10.根据权利要求4所述的共表达载体，其特征在于，所述共表达载体的初始载体为真核表达载体或原核表达载体。

11.根据权利要求4所述的共表达载体，其特征在于，所述编码甾体化合物11α-羟化酶的基因和编码细胞色素P450还原酶的基因核苷酸序列的上游分别包含编码核糖体结合位点的核苷酸序列。

12.一种用于制备11α-羟基甾体化合物的基因工程菌株，其特征在于，其表达根据权利要求1所述的甾体化合物11α-羟化酶、包含根据权利要求2或3所述的编码甾体化合物11α-羟化酶的基因和/或包含根据权利要求4-11中任一项所述的共表达载体。

13.根据权利要求12所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株的初始菌株选自链霉菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、棒杆菌属、节杆菌属、红球菌属、分枝杆菌属、大肠杆菌属和酵母菌属的菌株。

14.根据权利要求13所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株的初始菌株为大肠杆菌或分枝杆菌。

15.一种用于制备11α-羟基甾体化合物的方法，其特征在于，其包括采用根据权利要求1所述的甾体化合物11α-羟化酶、根据权利要求2或3所述的编码甾体化合物11α-羟化酶的基因、根据权利要求4-11中任一项所述的共表达载体和/或根据权利要求12-14中任一项所述的基因工程菌株将甾体化合物转化为11α-羟基甾体化合物。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述转化是在含有甾体化合物的反应液中利用生长状态或静息状态的根据权利要求12-14中任一项所述的基因工程菌株实现的。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其特征在于，所述甾体化合物为甾体药物中间体，且所述11α-羟基甾体化合物为所述甾体药物中间体经过所述甾体化合物11α-羟化酶转化生成的11α-羟化产物。

18.根据权利要求15或16所述的方法，其特征在于，所述甾体化合物选自雄烯二酮、雄二烯二酮、双降醇、黄体酮和17α-羟基黄体酮中的一种或多种，且所述甾体化合物的11α-羟化产物选自11α-羟基雄烯二酮、11α-羟基雄二烯二酮、11α-羟基双降醇、11α-羟基黄体酮和11α，17α-双羟基黄体酮中的一种或多种。

19.根据权利要求1所述的甾体化合物11α-羟化酶、根据权利要求2或3所述的编码甾体化合物11α-羟化酶的基因、根据权利要求4-11中任一项所述的共表达载体和/或根据权利要求12-14中任一项所述的基因工程菌株在通过转化甾体化合物以制备11α-羟基甾体化合物中的用途。

20.根据权利要求19所述的用途，其特征在于，所述甾体化合物选自雄烯二酮、雄二烯二酮、双降醇、黄体酮和17α-羟基黄体酮中的一种或多种，且所述甾体化合物的11α-羟化产物选自11α-羟基雄烯二酮、11α-羟基雄二烯二酮、11α-羟基双降醇、11α-羟基黄体酮和11α，17α-双羟基黄体酮中的一种或多种。