CN1237184C - 抗SARS－CoV药物作用靶标、药物筛选方法及抗SARS药物 - Google Patents

抗SARS－CoV药物作用靶标、药物筛选方法及抗SARS药物 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于筛选治疗和/或预防SARS病毒感染药物的药物作用靶标，所述靶标为包含SARS病毒N蛋白和人体CypA相互作用活性位点的SARS病毒N蛋白Val235-Pro369片断和人体CypA复合物三维结构模型。本发明还提供所述药物作用靶标的构建方法，用所述药物作用靶标筛选治疗和/或预防SARS病毒感染药物的方法，及通过筛选确认环孢素衍生物在治疗和/或预防SARS病毒感染上的新用途。

Description

抗SARS-CoV药物作用靶标、药物筛选方法及抗SARS药物
技术领域
本发明涉及用生物信息技术和分子生物学方法筛选药物，具体涉及用SARS冠状病毒核衣壳蛋白(N蛋白)和人亲环素A(CypA)相互作用模型作为药物作用靶标在分子和细胞水平筛选药物的方法。
背景技术
传染性非典型肺炎称为严重急性呼吸综合症(Severe Acute RespiratorySydrome，SARS)。研究发现，一种新型的冠状病毒极可能是病因，在香港和加拿大的病人和死亡病人的尸体中都分离出了这种病毒，在一些SARS病人的血清中也发现了抗hMPV的抗体。2003年4月16日，世界卫生组织(WHO)正式确认SARS病毒是传染性非典型肺炎的病因。传染性非典型肺炎病人中90％以上感染SARS病毒的人能够治愈，致死率约为10％左右。SARS病人的呼吸道切片和细胞培养物的电子显微镜照片显示，存在冠状病毒颗粒。这是一种新型的冠状病毒，与冠状病毒属中其他已知的成员不同，该病毒可引起绿猴肾细胞(VERO-E6)发生病变效应，病毒复制能够被SARS感染康复人的血清所抑制，可以利用感染的细胞和康复病人的血清进行免疫荧光检测法(Immunofluorescence assays，IFA)检测培养细胞中细胞感染有SARS病毒的情况，该方法表现出特异性的反应。美国、加拿大和香港的研究表明，非SARS病人的血清不能和新冠状病毒发生反应；传染性肠胃炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV)、鼠肝炎病毒(Murine HepatitisVirus，MHV)、猫传染性腹膜炎病毒(Feline Infectious Peritonitis virus，FIPV)、229E人冠状病毒的超抗血清可以抑制培养的病毒生长。几个实验室对病毒的测序表明，新病毒和冠状病毒属相关，但不同于同属的其它冠状病毒个群，是冠状病毒的一个新的变种。SARS冠状病毒在种属分类上属于正链RNA病毒(ssRNA positivestrand viruses)家系的巢状病毒(Nidovirales)族中的冠状病毒(Coronaviridae)系。它是冠状病毒家族中新出现的一个子类。2003年三月，科学家们发现了导致SARS的元凶SARS冠状病毒(SARS Coronaviruses，SARS-CoV)，并且成功地完成了SARS-CoV基因组的完整测序。SARS-CoV基因组由29727个核苷酸、11个开放阅读框(Opening Reading Frames)组成。它的基因组结构和其他的冠状病毒非常相似。但通过比较遗传史和序列比对表明SARS-CoV的特征和以前发现的冠状病毒的特征并不完全相似，它不仅表现有其他冠状病毒共有的特征，还有SARS-CoV本身特有的特征(Paul A.Rota，M.Steven Oberste，Stephan S.Monroe，W.Allan Nix，Ray Campagnoli，et al.Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratorysyndrome.Science(Sciencexpress)1May，2003；Marco A.Marra，Steven J.M.Jones，Caroline R.Astell，Robert A.Holt，Angela Brooks-Wilson，et al.Thegenome sequence of the SARS-associated coronavirus.Science(Sciencexpress)lMay，2003)。科学家同时进行了SARS相关的冠状病毒加拿大多伦多(Tor2)分离株29751个碱基的基因组测序。基因组序列揭示这个冠状病毒与已知的冠状病毒(包括人类冠状病毒HcoVOC43，HCoV-229E)无密切相关。预测病毒蛋白的种系分析表明，该冠状病毒与已知的三族冠状病毒均非密切相似。基因组序列将有助于人类了解SARS病毒感染的机制、潜在动物宿主的诊断检测(使用PCR和免疫测试法)，同时也有助于发展抗病毒制剂(包括中和抗体)和找出疫苗抗原决定簇(Marco A.Marra，Steven J.M.Jones，Caroline R.Astell，Robert A.Holt，Angela Brooks-Wilson，et al.The genome sequence of the SARS-associatedcoronavirus.Science(Sciencexpress)1May，2003)。
但迄今为止，人们对SARS-CoV病毒的感染机制研究还很不充分，为降低感染率和死亡率，临床上对能够预防和/或治疗的SARS-CoV感染的特效药物有着十分紧迫的需求。
因此，本发明的第一个目的是提供一种快速筛选治疗和/或预防SARS病毒感染药物的药物作用靶标。
本发明的第二个目的是提供这种药物作用靶标的构建方法。
本发明的第三个目的是提供用这种药物作用靶标筛选治疗和/或预防SARS病毒感染药物的方法。
本发明的第四个目的是提供用这种药物作用靶标筛选出的治疗和/或预防SARS病毒感染的药物。
发明概述
药物作用靶标是指疾病发生和发展过程中能够在最关键病理环节上起决定作用的关键功能生物大分子，包括细胞膜受体、蛋白酶、激素与细胞因子、离子通道、DNA、RNA、核受体等。现代药物研究的核心是以药物作用靶标为基础，筛选或设计与靶标结构互补、能够激动或拮抗靶标介导的生物功能，具有治疗作用的药物先导物。这种基于机理和结构的新药物发现和选择性地阻断疾病发生和发展过程中最关键的病理环节，研发出高效低毒副作用的特异性药物。
本发明者对SARS-CoV的基因表达产物进行了深入的生物信息学分析，从而识别了SARS病毒感染人体的途径；然后用分子生物学和生物物理方法验证这一作用途径；根据这一作用途径筛选化合物，并进行病毒水平的测试，确证传染性非典型肺炎(SARS)药物作用的靶标，用这一药物作用靶标筛选预防和/或治疗传染性非典型肺炎药物，从而完成了本发明。
本发明提供的用于筛选治疗和/或预防SARS病毒感染药物的药物作用靶标是在非典型肺炎冠状病毒复制、转录、翻译和组装过程中起关键作用的核衣壳蛋白(SARS Nucleocapsid)、宿主(人体)作用蛋白质人亲环素A(Cyelophilin A)及两者之间的相互作用途径，所述靶标为包含SARS病毒N蛋白和人体CypA相互作用活性位点的SARS病毒N蛋白Val235-Pro369片断和人体CypA复合物三维结构模型，其中靶标SARS病毒N蛋白的序列特征为：MSDNGPQSNQ RSAPRITFGG PTDSTDNNQN GGRNGARPKQ RRPQGLPNNT ASWFTALTQH GKEELRFPRGQGVPINTNSG PDDQIGYYRR ATRRVRGGDG KMKELSPRWY FYYLGTGPEA SLPYGANKEG IVWVATEGALNTPKDHIGTR NPNNNAATVL QLPQGTTLPK GFYAEGSRGG SQASSRSSSR SRGNSRNSTP GSSRGNSPARMASGGGETAL ALLLLDRLNQ LESKVSGKGQ QQQGQTVTKK SAAEASKKPR QKRTATKQYN VTQAFGRRGPEQTQGNFGDQ DLIRQGTDYK HWPQIAQFAP SASAFFGMSR IGMEVTPSGT WLTYHGAIKL DDKDPQFKDNVILLNKHIDA YKTFPPTEPK KDKKKKTDEA QPLPQRQKKQ PTVTLLPAAD MDDFSRQLQNSMSGASADST QA
靶标人体CypA的序列特征为：MVNPTVFFDI AVDGEPLGRV SFELFADKVP KTAENFRALS TGEKGFGYKGSCFHRIIPGF MCQGGDFTRH NGTGGKSIYG EKFEDENFIL KHTGPGILSMANAGPNTNGS QFFICTAKTE WLDGKHVVFG KVKEGMNIVE AMERFGSRNGKTSKKITIAD CGQLE
本发明提供的药物作用靶标中，靶标SARS病毒N蛋白功能区域序列编号为：235  VSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFG289  DQDLIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYHGAIKLDDKDPQFK349  DNVILLNKHIDAYKTFPPTEP
所述药物作用靶标中，靶标人体CypA蛋白功能区域序列编号为：
Arg55、Ile57、Phe60、Met61、Gln63、Gly72、Thr73、Gly74、Ala101、Asn102、Ala103、Gln111、Phe113、Trp121、Leu122、Lys125、His126
所述药物作用靶标中，SARS病毒N蛋白和人体CypA相互作用活性位点包括：
N蛋白：Trp302到Phe315残基组成的loop，其中主要氨基酸残基为Trp302、Pro303、Gln304、Ile305、Ala306、Aln307、Phe308、Ala309、Pro310、Ser311、Ala312、Ser313、Ala314和Phe315；
人体CypA：Arg55、Ile57、Phe60、Met61、Gln63、Gly72、Thr73、Gly74、Ala101、Asn102、Ala103、Gln111、Phe113、Trp121、Leu122、Lys125和His126。
本发明提供的药物作用靶标的构建方法包括以下步骤：
1)用生物信息学方法对SARS-CoV中的蛋白质与人体蛋白质相互作用进行网络分析，揭示SARS-CoV N蛋白和人CypA的相互作用；
2)用同源蛋白模建方法构建SARS-CoV病毒N蛋白的三维结构，用分子模拟方法计算SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA的相互作用，构建N蛋白与人体CypA复合物的结构，确立这两个蛋白相互作用的区域；
3)用分子生物学方法表达N蛋白与人体CypA，用表面等离子激光共振生物传感技术研究N蛋白与人体CypA的相互作用，揭示这两个蛋白间存在强烈的相互作用；
4)针对N蛋白与人体CypA相互结合的区域，用计算机虚拟筛选方法搜寻化合物数据库，找到阻止N蛋白与人体CypA结合的化合物，确证药物作用靶标的建立。
本发明提供的用药物作用靶标筛选治疗和/或预防SARS病毒感染药物的方法，包括如下步骤：
1)测定候选物与CypA的结合常数，选出具有较强亲和力的化合物；
2)将获选化合物进行抑制SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA结合的测试；
3)测试获选化合物对受SARS-CoV病毒感染细胞的保护作用。
附图说明
图1显示SARS-CoV病毒N蛋白Val235-Pro369片断与HIV-1病毒CA蛋白Pro401-Tyr545的序列联配。图中“*”代表相同或保守的残基，“.”代表保守残基的取代，“：”代表半保守的取代，相似性为47.8％。
图2显示SARS-CoV病毒N蛋白Val235-Pro369片断(带状结构)与CypA(球状表面结构)复合物三维结构模型。
图3显示SARS-CoV病毒N蛋白与CypA之间的氢键和疏水相互作用。其中符号的意义如下：
Figure C0312906700081
配体键                疏水接触中涉及的非配体残基
Figure C0312906700083
非配体键              疏水接触中涉及的相应原子
Figure C0312906700085
氢键及其长度
图4显示SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA相互作用动力学测试结果。所用仪器为BIACORE3000，分析软件为Application Wizard中Kinetic Analysis。测定时CypA固定在CM5芯片上，N蛋白浓度依次为：0.214nM、1.07nM、5.35nM、10.7nM、21.4nM、42.8nM、85.63nM、0.171uM、0.343uM、0.685uM和1.37uM。
图5显示环孢素A抑制SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA结合动力学测试结果。CypA固定在CM5芯片上，N蛋白的浓度为1.37μM环孢素A(CsA)的浓度依次为832、1664、2496和3328μM。
图6显示环孢素A对感染SARS-CoV病毒的Vreo-E6细胞的保护作用。
发明详述
本发明者运用生物信息学方法对SARS-CoV中的蛋白质与人体蛋白质相互作用的网络进行了分析，发现SARS-CoV的核衣壳蛋白(SARS Nucleocapsid，以下简称N蛋白)和人体中的人亲环素A(CyclophilinA，以下简称CypA)有相互作用；本发明用同源蛋白模建方法构建了SARS-CoV病毒N蛋白的三维结构，用分子模拟方法计算了SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA的相互作用，构建了N蛋白与人体CypA复合物的结构，确立了这两个蛋白相互作用的区域；用分子生物学方法表达了N蛋白与人体CypA，用表面等离子激光共振生物传感(SPR)技术研究了N蛋白与人体CypA的相互作用，发现这两个蛋白间存在强烈的相互作用；针对N蛋白与人体CypA相互结合的区域，用计算机虚拟筛选方法搜寻了化合物数据库，发现已有免疫抑制剂环孢素A能阻止N蛋白与人体CypA的结合；用SPR技术测定了环孢素A阻止N蛋白与人体CypA的结合的活性；在病毒水平筛选了环孢素A抑制病毒感染Vero-E6细胞的活性，确证了这一SARS-CoV病毒感染人体的途径和靶标，并建立了相应的分子水平和细胞水平的筛选方法。
1、生物信息学分析和SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA相互作用模拟：1994年，Luban等发现CypA能与HIV-1病毒核整合，与HIV-1病毒二聚化的Gap多聚蛋白中的衣壳域作用(Luban，J.；Bossolt，K.L.；Franke，E.K.；Kalpana，G.V.；Goff，S.P. Human immunodefficiency virus type 1 Gag protein binds toCyclophilins A and B.Cell 1993，73，1067-1078；Luban，J.Absconding with thechaperone：essential Cyclophilin-Gag interaction in HIV-1 virions.Cell 1996，87，1157-1159；Franke，E.K.；Yuan，H.E.H.；Luban，J.Specific incorporation ofCyclophilin A into HIV-1 virions.Nature 1994，372，359-362；Thali，M.；Bukovsky，A.；Kondo，E.；Rosenwirth，B.；Walsh，C.T.；Sodroski，J.；Gottlinger，H.G.Functional association of Cyclophilin A with HIV-1 virions.Nature 1994，372，363-365)，进而在病毒成熟过程中，多聚蛋白分解成基质蛋白、衣壳蛋白(CA蛋白)和核衣壳蛋白(N蛋白)，但这些蛋白依然结合在一起，CypA与衣壳蛋白大约以1∶10的比例结合。因此，CypA与衣壳蛋白的直接结合在HIV-1病毒的成熟、病毒的复制和新病毒颗粒的形成中起重要作用(Gitti，R.K.；Lee，B.M.；Walker，J.；Summers，M.F.；Yoo，S.；Sundquist，W.I.Structure of theamino-terminal core domain of the HIV-1 capsid protein.Science 1996，273，231-235；Gamble，T.R.；Vajdos，F.E.；Yoo，S.；Worthylake，D.K.；Houseweart，M.；Sundquist，W.I.；Hill，C.P.Crystal structure of human Cyclophilin A bound to theN-terminal domain of HIV-1 capsid.Cell 1996，87，1285-1294；Colgan，J.；Yuan，H.E.H.；Franke，E.K.；Luban，J.Binding of the human immunodefficiency virus type1 Gag polyprotein to Cyclophilin A is mediated by the central region of capsid andrequires Gag dimerization.J.Virol.1996，70，4299-4310；Ott，D.E.Cellularproteins in HIV virions.Rev.Med.Virol.1997，7，167-180)。蛋白-蛋白相互作用分析表明，SARS-CoV病毒的N蛋白与人体CypA有相互作用。在SARS-CoV病毒中没有发现CA蛋白，设想同是衣壳蛋白，SARS-CoV病毒的N蛋白的功能之一是与HIV-1病毒中的CA蛋白类似，与CypA结合，对病毒的成熟、病毒的复制和新病毒颗粒的形成起重要作用。因此，本发明进行了进一步的序列比较和结构模建。
序列分析表明，SARS-CoV病毒N蛋白与HIV-1病毒的CA蛋白同源性较高，但全序列比较，两者相似性依然很低，序列相似性为37.6％、同源性为26.9％、序列间隙小于4.8％。然而，进一步分析发现，SARS-CoV病毒N蛋白的Val235-Pro369片断与HIV-1病毒CA蛋白与CypA的结合区域Trp302-Phe315有较高的相似性，序列相似性为42.2％、同源性为24.4％、序列间隙小于4.1％。这一序列分析表明，SARS-CoV病毒N蛋白可能通过Val235-Pro369区域与CypA结合(见图1)。
根据HIV-1病毒CA蛋白Pro401-Tyr545片断与CypA复合物的晶体结构(蛋白质三维结构数据库PDB编号为1AK4)，本发明模建了SARS-CoV病毒N蛋白Val235-Pro369片断与CypA复合物三维结构模型(见图2)。模建的结构模型显示，SARS-CoV病毒的N蛋白上存在一段与人体CypA活性口袋作用的一段loop。
2、SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA相互作用活性位点：由SARS-CoV病毒N蛋白Val235-Pro369片断与CypA复合物三维结构模型(附图2)，可以获得SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA相互作用活性位点的一些信息。SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA结合区域为从Trp302到Phe315残基组成的loop，组成CypA结合口袋的主要残基为：Arg55、Ile57、Phe60、Met61、Gln63、Gly72、Thr73、Gly74、Ala101、Asn102、Ala103、Gln111、Phe113、Trp121、Leu122、Lys125、His126。两个蛋白间形成的氢键和疏水相互作用分别列于图3以及表1和表2。
表1.SARS-CoV病毒N蛋白与CypA氢键相互作用
  CypA残基   作用原子   SARS-CoV病毒N蛋白   作用原子   距离()
  Trp121Arg55Arg55Gln63Gly72   N1N2N1N2O   Phe308Gln307Gln307Ile305Ile305   OOOON   3.312.733.012.762.78
表2.SARS-CoV病毒N蛋白与CypA疏水相互作用
  CypA残基   作用原子   SARS病毒N蛋白残基   作用原子   距离()
  Trp121Trp121Phe60Phe60Phe60Phe60Phe60Phe60Phe113Phe113Phe113Phe113   C2C2C2C2CC2C2CC1C2C1C   Pro310Pro310Ala309Ala309Ala309Ala309Ala309Phe308Gln307Gln307Gln307Gln307   CCCCCCCCCCCC   3.593.853.583.563.703.423.843.703.463.823.173.30
  Phe113Phe113Phe113Phe113Phe113Phe60His126His126Leu122Leu122Phe60His126Arg55Asn102Asn102Ala101Ala103Gly72Asn71Thr73Thr73Asn71Arg69Arg69Thr73Thr73Arg69Thr73   CCC2C1C1CC1C2C2C1CC1CCCCCCCC2CCCCC2CCC2   Gln307Gln307Gln307Gln307Gln307Gln307Gln307Gln307Gln307Gln307Gln307Gln307Ala306Ile305Ile305Ile305Ile305Gln304Trp302Trp302Trp302Trp302Trp302Trp302Trp302Trp302Trp302Trp302   CCCCCCCCCCCCCC2C2C2C1CC2C3C3C3C3C3C3C3C3C2   3.753.653.773.713.893.743.493.903.793.85.883.753.473.003.333.343.583.883.763.373.373.553.593.762.962.983.153.49
3、SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA的表达及相互作用测定：将构建好的pQE30/SARS_N质粒转化于大肠杆菌M15中，以IPTG(浓度0.8mM)诱导，在氨苄西林和卡那霉素为双抗生素，温度为30℃，表达时间为10小时条件下，表达SARS-CoV病毒N蛋白。以NTA-His柱层析法初步纯化SARS-CoV病毒N蛋白，再利用FPLC—凝胶过滤进一步纯化SARS-CoV病毒N蛋白。利用pETll/CyPA质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG(0.5mM)诱导表达人体CypA蛋白(表达温度25℃)，利用50％饱和硫酸铵沉淀蛋白得到蛋白粗品，以Mono-Q和分子筛进一步提纯人体CypA蛋白得到纯品。
使用表面等离子激光共振(SPR)技术得到SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA相互作用的离解常数(KD)为7.65×10-8M，表明SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA相互作用有较强的结合。测定结果见图4。
4、针对N蛋白与人体CypA相互作用的虚拟筛选：确定SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA相互作用方式和结合区域后，本发明以CypA与SARS-CoV病毒N蛋白作用的表面结合口袋为靶标，用分子对接(MolecularDocking)虚拟筛选(Virtual Screening)方法，搜寻了MDL公司的药物数据库CMC、现有化合物数据库ACD、药物报道数据库MDDR和中国科学院上海药物研究所的化合物样品库，获得了一批与CypA具有较强亲和力的获选化合物，包括CypA的配体环[[(E)-(2S，3R，4R)-3-羟基-4-甲基-2-甲氨基-6-八烯酰]-L-2-氨基丁酰-N-甲基甘氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-缬氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-丙氨酰-D-丙氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基L-亮氨酰-N-甲基-L-缬氨酰](环孢素A，CyclosporinA)。分子模拟表明，环孢素A能阻止确定SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA结合。
5、环孢素A阻止N蛋白与人体CypA结合研究：利用表面等离子共振生物传感技术BIACORE3000研究环孢素A阻止SARS-CoV病毒N蛋白与人体CyPA结合，实验结果如图5所示，结果显示随着环孢素A的浓度的增加，SARS-CoV病毒N蛋白与人体CyPA结合降低，表明环孢素A能够抑制SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA结合。
6、环孢素A抗SARS-CoV病毒活性测试：为确证上述SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA作用途径与SARS-CoV病毒感染人体的相关性，本发明选择了在分子水平能阻止SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA结合的环孢素A进行病毒水平的测试。
测试原理：以Vero-E6细胞作为病毒宿主细胞(易感细胞)，测试样品对病毒感染细胞的保护作用，检测指标为细胞变性反应(CPE)以及观察感染细胞保护率。
测试方法：把Vero-E6细胞接种于96孔培养板，置于37℃，5％CO2孵化箱培养，加入不同稀释浓度的SARS病毒和2.5mg/ml和1250ug/ml的环孢素A，观察CPE，并用中性红染色测定OD值，计算样品抗SARS病毒活性作用。
测试结果：在病毒-细胞水平模型的抗SARS病毒活性实验中，用不同有效浓度的SARS病毒感染Vero-E6细胞，当加入2.5mg/ml和1250ug/ml浓度的环孢素A时有较明显的抑制SARS病毒感染Vero-E6细胞的保护活性(结果见图6)。表明SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA作用途径与SARS-CoV病毒感染人体具有明确的相关性。
如上所述，本发明的一个方面通过生物信息分析，发现SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA有相互作用。序列分析表明，SARS-CoV病毒N蛋白与HIV-1病毒的CA蛋白同源性较高，但全序列比较，两者相似性依然很低，序列相似性为37.6％、同源性为26.9％、序列间隙小于4.8％。然而，进一步分析发现，SARS-CoV病毒N蛋白的Val235-Pro369片断与HIV-1病毒CA蛋白与CypA的结合区域Trp302-Phe315有较高的相似性，序列相似性为42.2％、同源性为24.4％、序列间隙小于4.1％。提示SARS-CoV病毒N蛋白与HIV-1病毒CA蛋白具有相似的功能，即在SARS-CoV病毒感染人体后，SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA的直接结合在SARS-CoV病毒的成熟、复制和新病毒颗粒的形成中起重要作用。
根据人体CypA与HIV-1病毒CA蛋白Trp302-Phe315片断复合物的晶体结构，模建了人体CypA与SARS-CoV病毒N蛋白Val235-Pro369片断复合物的三维结构模型。结果表明，SARS-CoV病毒N蛋白能与人体CypA的结合区为从Trp302到Phe315残基组成的loop，其主要氢键相互作用和疏水相互作用分别见附图3即附表1和附表2，CypA与SARS-CoV病毒N蛋白的结合口袋由Arg55、Ile57、Phe60、Met61、Gln63、Gly72、Thr73、Gly74、Ala101、Asn102、Ala103、Gln111、Phe113、Trp121、Leu122、Lys125和His126残基组成。
在确定SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA相互作用的方式和结构模型的基础上，本发明采用等离子表面激光共振生物传感(SPR)研究了SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA相互作用的动力学行为，表明两者有较强的结合(将附图4)，结合常数(KD)为7.65×10-8M。
由上述结果可以初步判定，SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA相互作用与SARS-CoV感染人体有关，SARS-CoV病毒N蛋白、人体CypA蛋白以及它们之间的相互作用可以作为筛选抗SARS-CoV病毒药物的方法。按一般药物靶标确证的原则，必须根据假设的靶标筛选出活性化合物。于是，本发明针对人体CypA与SARS-CoV病毒N蛋白相互作用的结合口袋，用虚拟筛选方法筛选了MDL公司的药物数据库CMC、现有化合物数据库ACD和我所自己的化合物样品库，获得了一批与CypA具有较强亲和力的获选化合物，包括CypA的配体环孢素A。本发明继而采用等离子表面激光共振生物传感(SPR)研究了环孢素A抑制SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA结合的动力学行为(结果见图5)，结果表明，环孢素A能有效地抑制SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA结合，随着环孢素A浓度的增加，抑制蛋白结合的强度也增加，呈现了良好的剂量关系。
为了进一步确证本发明提出抗SARS-CoV病毒药物作用靶标的有效性，本发明进行了环孢素A保护Vero-E6细胞受SARS-CoV病毒感染的测试。以Vero-E6细胞作为病毒宿主细胞，测试环孢素A对病毒感染细胞的保护作用，检测指标为细胞变性反应(CPE)以及观察感染细胞保护率。结果表明2.5mg/m和1250ug/ml浓度的环孢素A有较明显的抑制SARS病毒感染Vero-E6细胞的保护活性(结果见附图6)。表明SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA作用途径与SARS-CoV病毒感染人体具有明确的相关性。
根据以上生物信息学分析、分子模拟、SPR蛋白—蛋白相互作用研究、虚拟筛选、化合物分子水平和病毒细胞水平的筛选，本发明确定SARS-CoV病毒N蛋白、人体CypA及其相互作用途径是治疗和/或预防SARS-CoV病毒感染的药物作用靶标。
本发明另一方面涉及根据确定的药物作用靶标SARS-CoV病毒N蛋白、人体CypA及其相互作用途径，采用分子模拟方法建立了SARS-CoV病毒N蛋白功能片断Val235-Pro369与人体CypA复合物的三维结构模型，确定SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA相互结合的关键部位和氨基酸残基。在此基础上，用虚拟筛选方法获得了能阻断SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA结合的候选物，经SPR分子水平的活性测试和抑制Vero-E6细胞感染病毒活性测试，筛选出靶标生物功能抑制剂。
靶标生物功能抑制剂为与靶标SARS病毒N蛋白功能区域或靶标人体CypA蛋白功能区域相互结合、并阻断所述SARS病毒N蛋白和人体CypA功能区域结合的有机分子化合物或或多肽化合物或寡糖化合物或单克隆抗体或核苷类化合物。
本发明的另一个方面发现了具有通式I的环孢素A衍生物可以特异性地与CypA结合，从而有效地抑制SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA的结合，具有较明显的抑制SARS病毒感染Vero-E6细胞的保护活性，具有用于治疗和/或预防SARS-CoV病毒感染的用途。
在临床上，环孢素A主要用于抑制器官和组织移植后的排异反应，此外也用于自身免疫性疾病的治疗，如对I型糖尿病、牛皮癣、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等均有肯定的疗效。美国专利US6270957和US5840305披露了含有通式I的化合物可以作用于T淋巴细胞、抑制HIV蛋白酶抑制细胞摄取病毒、干扰HIV-1病毒Gag蛋白与CypA相互作用、抑制CypA整合进入HIV-1病毒颗粒、阻止病毒颗粒成熟和复制；美国专利US6521595、US4885276和US19891205披露了含有通式I的化合物新的制备方法。
通式I的环孢素A衍生物或其药学上可接受的盐或水合物中各取代基的定义如下：
式中
R1为H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基、羟基；
R2为H、乙酰基、C1-C4取代烷基酰基、C1-C4取代烷基；
R3为H、羟基、羟基烷氧基、羟基烷硫基、C1-C4烷基硫醚基、烷氧羰基烷基硫醚基、芳基烷基硫醚基、芳基硫基、烷基磺酰基、羟基烷基磺酰基、多烷氧基取代甲硫醚基；
R4为H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基；
R5为H、甲硫醚基、多烷基取代硫甲基；
R6为H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基；
R7为H、羟基、羟基烷基、羟基烷氧基、C1-C4烷基硫醚基；
R8为H、羟基、羟基烷基、羟基烷氧基、C1-C4烷基硫醚基；
R9为H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基。
本说明书中所述的“药学上可接受的盐”具体地可列举与丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、等有机酸和天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸形成酯后再与无机碱形成的盐，如钠、钾、钙、铝盐和铵盐，或与有机碱形成的盐，如甲胺盐、乙胺盐、乙醇胺盐等，或与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等碱性氨基酸形成酯后的盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸的盐，或与甲酸、乙酸，苦味酸、甲磺酸、乙磺酸等有机酸的盐。
本发明的实验发现通式I的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，可以有效地抑制SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA的结合，具有较明显的抑制SARS-CoV病毒感染Vero-E6细胞的保护活性，因此，具有治疗和/或预防SARS-CoV病毒感染的用途。
本发明方法筛选出的通式I化合物或其药学上可接受的盐或水合物中最优选的化合物为：环孢素A(Cyclosporin A)，环[[(E)-(2S，3R，4R)-3-羟基-4-甲基-2-甲氨基-6-八烯酰]-L-2-氨基丁酰-N-甲基甘氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-缬氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-丙氨酰-D-丙氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-缬氨酰]。
本发明的另一方面还涉及可用于预防和/或治疗冠状病毒感染引起的传染性非典型性肺炎的药物组合物，其包括预防和/或治疗有效量的至少一种通式I化合物或者其药学上可接受的盐或其水合物以及至少一种药用载体或赋形剂。
这里所述的药用载体包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血白蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛脂。
本发明还涉及这种药物组合物在制备预防和/或治疗传染性非典型性肺炎(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)药物上的新用途。
所述药物组合物可以根据不同给药途径而制备成各种剂型。这些剂型以下面方式之一施用：口服，喷雾吸入，直肠用药，鼻腔用药，颊部用药，局部用药，非肠道用药，如皮下，静脉、肌内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中预防SARS病毒感染时优选口服或肌肉注射，治疗SARS病毒感染时优选腹膜内或静脉内给药方式。
另外需要指出，本发明化合物的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。建议剂量如为开始每日5mg～10mg/kg，维持量可减至每日3mg/kg。胶囊剂：0.25g/粒。注射液0.25g/5ml。口服溶液：5g/50ml。
具体实施方案
下面的实施例是为了对本发明进行进一步说明的具体优选实施方案，但这些实施例绝不是对本发明的任何限制。
实施例1：SARS-CoV病毒N蛋白序列的多重比对结果
对比的序列源自美国国家生物信息中心NCBI，它们分别来自不同地区的SARS病例标本，包括NCBI登录号为gi|30275668(BJ01)、gi|30027618(Vietnam)、gi|29836495(Tor2)、gi|30023962(CUHKW1)、gi|29837498(GZ01)、gi|30275667(BJ02)、gi|30023953(HKU-39849)、gi|30124074(Canada)、gi|30173234(BJ03)。采用ClustalX(1.8版)的方法进行多重序列比对，结果表明所有已测序的SARS-CoV病毒N蛋白序列相同。
实施例2：SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA复合物构建
序列分析表明全长SARS-CoV病毒N蛋白与HIV-1的CA蛋白序列的同源性并不高，相似性不到30％；但SARS-CoV病毒N蛋白上的一段序列(Val235-Pro369)与HIV-1病毒CA蛋白与CypA的结合区域(Pro401-Tyr545)的同源性很高，相似性高达47.8％(图1)。这一序列分析表明，SARS-CoV病毒N蛋白可能通过Val235-Pro369区域与CypA结合。
根据HIV-1病毒CA蛋白Pro401-Tyr545片断与CypA复合物的晶体结构(蛋白质三维结构数据库PDB编号为1AK4)，模建了SARS-CoV病毒N蛋白Val235-Pro369片断与CypA复合物三维结构模型(见图2)。模建的结果模型显示，SARS-CoV病毒的N蛋白上存在一段与人体CypA活性口袋作用的一段loop。SARS-CoV病毒N蛋白Val235-Pro369片断三维结构模建采用InsightII的MODELLER软件，并用3D-Profile和Prostat软件评价结构模型的质量。Loop搜寻发现SARS-CoV病毒N蛋白的Trp302-Phe315区域与HIV-1病毒CA蛋白与CypA结合区域相似，于是将SARS-CoV病毒N蛋白loop区Trp302-Phe315对接到CypA结合口袋中，获得复合物的初始结构，再用分子力学进行优化，采用的力场参数到Amber力场和Kollman-all-atom电荷。复合物结构如图2所示。
实施例3：SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA相互作用的SPR实验测定
将CypA固定在CM5芯片上，N蛋白为流动相。用BIACORE3000测定N蛋白与CypA的动力学行为，N蛋白的浓度以此为N蛋白浓度依次为：0.214nM、1.07nM、5.35nM、10.7nM、21.4nM、42.8nM、85.63nM、0.171uM、0.343uM、0.685uM和1.37uM。用Application Wizard/Kinetic Analysis软件分析数据(图4)。获得上述两蛋白见的结合常数(KD)为7.65×10-8M。
实施例4：阻止SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA相互作用化合物的虚拟筛选
用分子对接方法DOCK程序对MDL公司的药物数据库CMC、现有化合物数据库ACD、药物报道数据库MDDR和国家新药筛选中心样品库进行了虚拟筛选，筛选时所用的靶标模型是人体CypA与SARS-CoV病毒N蛋白作用的结合口袋。分子对接时考虑了小分子化合物的柔性，根据打分的高低从上述数据库中先挑选1000个候选物，用AutoDock的打分函数和Cscore打分函数对候选物进行进一步的评价，最后挑选了300个化合物进行分子水平的筛选。分子水平筛选方法是先测定候选物与CypA的结合常数，获得活性化合物。
实施例5：环孢素A阻止SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA结合测试
通过虚拟筛选和分子水平测试，获得活性化合物进行抑制SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA结合的测试。本实施例以环孢素A来说明测试过程，动力学测试方法同实施例4。测试SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA结合动力学行为时，加入不同浓度的环孢素A。本发明所用环孢素A的浓度为832、1664、2496和3328μM，测试结果见图5。
实施例6：环孢素A抑制SARS-CoV病毒测试
以Vero-E6细胞作为病毒宿主细胞(易感细胞)，测试样品对病毒感染细胞的保护作用，检测指标为细胞变性反应(CPE)以及感染细胞保护率。
把Vero-E6细胞接种于96孔培养板，置37℃，5％CO2孵箱培养，分别加入SARS病毒和不同稀释浓度的环孢素A，设病毒对照、细胞对照和样品对照。每日镜下观察结果，记录CPE，并用中性红染色测定OD值，参照对照进行样品抗SARS病毒活性作用的计算和评价。测试结果见图6。

Claims (3)

1、一种用于筛选治疗和/或预防SARS病毒感染药物的药物作用靶标，所述靶标为包含SARS病毒N蛋白和人体CypA相互作用活性位点的SARS病毒N蛋白Val235-Pro369片断和人体CypA复合物三维结构模型，其中靶标SARS病毒N蛋白的序列特征为：
MSDNGPQSNQ RSAPRITFGG PTDSTDNNQN GGRNGARPKQ RRPQGLPNNT ASWFTALTQH GKEELRFPRG
QGVPINTNSG PDDQIGYYRR ATRRVRGGDG KMKELSPRWY FYYLGTGPEA SLPYGANKEG IVWVATEGAL
NTPKDHIGTR NPNNNAATVL QLPQGTTLPK GFYAEGSRGG SQASSRSSSR SRGNSRNSTP GSSRGNSPAR
MASGGGETAL ALLLLDRLNQ LESKVSGKGQ QQQGQTVTKK SAAEASKKPR QKRTATKQYN VTQAFGRRGP
EQTQGNFGDQ DLIRQGTDYK HWPQIAQFAP SASAFFGMSR IGMEVTPSGT WLTYHGAIKL DDKDPQFKDN
VILLNKHIDA YKTFPPTEPK KDKKKKTDEA QPLPQRQKKQ PTVTLLPAAD MDDFSRQLQN
SMSGASADST QA
靶标人体CypA的序列特征为：
MVNPTVFFDI AVDGEPLGRV SFELFADKVP KTAENFRALS TGEKGFGYKG
SCFHRIIPGF MCQGGDFTRH NGTGGKSIYG EKFEDENFIL KHTGPGILSM
ANAGPNTNGS QFFICTAKTE WLDGKHVVFG KVKEGMNIVE AMERFGSRNG
KTSKKITIAD CGQLE
靶标SARS病毒N蛋白功能区域序列编号为：
235  VSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFG
289  DQDLIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYHGAIKLDDKDPQFK
349  DNVILLNKHIDAYKTFPPTEP
靶标人体CypA蛋白功能区域序列编号为：
Arg55、Ile57、Phe60、Met61、Gln63、Gly72、Thr73、Gly74、Ala101、Asn102、Ala103、Gln111、Phe113、Trp121、Leu122、Lys125、His126
所述SARS病毒N蛋白和人体CypA相互作用活性位点包括：
N蛋白：Trp302到Phe315残基组成的loop，其中主要氨基酸残基为Trp302、Pro303、Gln304、Ile305、Ala306、Aln307、Phe308、Ala309、Pro310、Ser311、Ala312、Ser313、Ala314和Phe315；
人体CypA：Arg55、Ile57、Phe60、Met61、Gln63、Gly72、Thr73、Gly74、Ala101、Asn102、Ala103、Gln111、Phe113、Trp121、Leu122、Lys125和His126。
2、权利要求1所述药物作用靶标的构建方法，包括以下步骤：
1)用生物信息学方法对SARS-CoV中的蛋白质与人体蛋白质相互作用进行网络分析，揭示SARS-CoV N蛋白和人CypA的相互作用；
2)用同源蛋白模建方法构建SARS-CoV病毒N蛋白的三维结构，用分子模拟方法计算SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA的相互作用，构建N蛋白与人体CypA复合物的结构，确立这两个蛋白相互作用的区域；
3)用分子生物学方法表达N蛋白与人体CypA，用表面等离子激光共振生物传感技术研究N蛋白与人体CypA的相互作用，实验证明这两个蛋白间确实存在相互作用；
4)对N蛋白与人体CypA相互结合的区域，用计算机虚拟筛选方法搜寻化合物数据库，找到阻止N蛋白与人体CypA结合的化合物，确证药物作用靶标的建立。
3、用权利要求1所述药物作用靶标筛选治疗和/或预防SARS病毒感染药物的方法，包括如下步骤：
1)测定候选物与CypA的结合常数，根据亲和力筛选化合物；
2)将获选化合物进行抑制SARS-CoV病毒N蛋白与人体CypA结合的测试；
3)测试获选化合物对受SARS-CoV病毒感染细胞的保护作用。
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