CN1276830A - 抗乙型肝炎病毒核心蛋白的单链抗体及其基因和含有它们的乙型肝炎治疗药物 - Google Patents

Abstract

特征在于编码能够与乙型肝炎病毒核心蛋白结合的单链抗体的DNA;编码单链抗体的DNA;含有作为活性成分的所述单链抗体的乙型肝炎治疗药物;以及含有作为活性成分的所述DNA的基因治疗药物。

Description

抗乙型肝炎病毒核心蛋白的单链抗体及其基因 和含有它们的乙型肝炎治疗药物

技术领域

本发明涉及抗乙型肝炎病毒核心蛋白的单链抗体及其基因，和应用所述单链抗体、其基因的乙型肝炎治疗药物。具体地说，本发明涉及其特征在于通过与乙型肝炎病毒的核心蛋白结合而抑制乙型肝炎病毒的DNA合成的单链抗体、编码所述单链抗体的DNA、包含所述DNA的载体、用所述载体转化的转化体、生产所述单链抗体的方法和应用这种单链抗体或其基因的乙型肝炎治疗药物。

技术背景

在日本，乙型肝炎病毒(此后有时缩写为HBV)以及丙型肝炎病毒占慢性肝炎病因学的大部分。虽然病毒携带者的比例由于最近的疫苗接种预防治疗而趋向减少，但是仍然存在大量慢性乙型肝炎患者，并且该病的医学治疗对预防原发性肝癌是非常重要的。

作为慢性乙型肝炎病人的医疗措施，目前正在应用目的在于通过引发宿主免疫排除所述病毒的治疗方法，诸如干扰素治疗、类固醇停药治疗和propagermanium治疗或抗病毒剂治疗(单磷酸阿糖腺苷(此后有时缩写为ara-AMP)、Lmivudine)。然而，在干扰素治疗中，尽管发生病毒活性血清学标志物量的短暂下降，但是未观察到长期的临床改善。同样，尽管已经应用具有一定效果的ara-AMP，但是目前难以说该结果是令人满意的。其中将干扰素和ara-AMP组合并交替给予的治疗表现出神经毒性，所以在其应用中存在困难。此外，暴发性乙型肝炎是急性乙型肝炎形式之一，是导致高致死率的疾病，而目前仍无该病的有效治疗药物。因此，尽管强烈需要研制基于与常规方法不同机制的抗乙型肝炎病毒的治疗，但是仍未开发出有用的治疗方法。

作为一种抗病毒治疗方法，有一种使用病毒抗原特异性抗体的方法。尽管细胞内表达这种抗体的方法借助于所述抗体的高特异性可能只抑制所述靶抗原而不损害宿主细胞，但当细胞外给予IgG时，由于摄入所述细胞的效率低，它们不能抑制存在于细胞内的病毒抗原的功能。此外，当抗病毒抗原IgG的H和L链基因引入非天然抗体形成细胞的细胞时，所述转基因表达的H和L链将不一定象抗体产生细胞一样有效地形成二硫键，以形成其活性形式的IgG。

另一方面，表达连续cDNA序列产生的蛋白尽管不具有二硫键结构，但是可以特异性结合至所述抗原，在所述cDNA序列中对应于抗体L链可变区(此后有时简写为V_L)的一种cDNA和对应于所述抗体H链可变区(此后有时简写为V_H)另一种cDNA通过编码高度柔性肽序列的合适寡核苷酸接头连接在一起。这类蛋白称为“单链抗体”，其特征在于它们不需要在抗体产生细胞表达以形成与上述IgG一样的其合适的三维结构，即使在非抗体产生细胞的细胞表达时，它们也具有与所述抗原特异性结合的活性(McCafferty J.等，Nature(伦敦)，348，552-554(1990)；和Marks J.D.等，J.Mol.Biol.222，581-597(1991))。

作为单链抗体用于疾病例如癌症的研究实例，可以提及这些研究，在这些研究中：(a)单链抗体cDNA和诸如毒素的生理活性物质cDNA连接在一起并表达，同时希望它们攻击并由此减少所述靶细胞，或者(b)希望所述单链抗体与所述抗原特异性结合本身产生所需要的效应。

作为上述(a)的特定实例，已经报道了关于缀合物的研究，在所述缀合物中TGF-α或诸如白喉毒素的毒素偶联至抗-EGFR单链抗体(Schmidt M.和Wels W.，Br.J.Cancer，74，853-862(1996))、抗-erbB-2单链抗体(Wels W.等，Cancer Res.，52，6310-6317(1992)；和Schmidt M.和Wels W.，Br.J.Cancer，74，853-862(1996))和抗-CD40单链抗体(Francesco JA.等，Cancer Res.，55，3099-3104(1995))，或者在所述缀合物中源自嗜酸性粒细胞的神经毒素偶联至抗-转铁蛋白受体的单链抗体(Newton DL.等，J.Biol.Chem.，269，26739-26745(1994))。在这些研究中，制备毒素和单链抗体之间的缀合物，并使所述单链抗体可以特异性结合到例如靶细胞，同时希望所述毒素仅引起所述单链抗体结合的靶细胞坏死。

作为上述(b)的特定实例，已经报道了关于抗erbB-2(Grim J.等，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.，15，348-354(1996)；Jannot CB.等，Oncogene，13，275-282(1996))、EGFR(Jannot CB.等，Oncogene，13，275-282(1996))和Ras(Werge TM.等，FEBS Lett.，351，393-396(1994))单链抗体的研究。此外，进行工程改造、使其在其表面表达抗MHC单链抗体的MMLV，已经在将其用于直接传递到MHC的应用中。

报道的抗病毒单链抗体用于疾病的研究实例是抗HIV(Wu Y.等，J.Virol.，70，3290-3297(1996)；Levy-Mintz P.，J.Virol.，70，8821-8832(1996)；Mhashilkar AM.等，EMBO J.，14，1542-1551(1995))、抗口蹄疫病毒(Mason P.等，Virology，224，548-554(1996))和抗蜱传fravivirus(Jiang W.，J.Virrol.，69，1044-1049(1995))的研究。在这些研究中，抗HIV单链抗体的靶是诸如Rev(Wu Y.等，J.Virol.，70，3290-3297(1996))和Tat(Mhashilkar AM.等，EMBO J.，14，1542-1551(1995))的非结构蛋白。因为Rev蛋白结合到含在HIV-1感染细胞中表达的RRE的HIV-1mRNA并促进表达gag、pol和env基因，所以单链抗体与该蛋白的结合可使Rev失活，由此通过降低gag、pol和env基因的表达而抑制该病毒的繁殖。

Tat蛋白具有反式激活蛋白活性，而单链抗体与该蛋白的特异性结合抑制该活性并由此抑制HIV的繁殖。在抗蜱传fravivirus单链抗体的情况下，其靶是病毒表面抗原，它具有中和活性，它与病毒表面的结构蛋白的结合降低病毒感染和病毒蛋白的合成。

然而，这些单链抗体针对的所有抗原均是非结构蛋白或病毒表面的结构蛋白。病毒表面抗原的缺点是所述靶抗原由于对其施加的强免疫压力而容易发生突变，由此使单链抗体的特异性结合受到干扰。例如，存在称为高变区的易于突变的区，而该区可能是抑制所述单链抗体的特异性结合的原因。同样，非结构蛋白可能突变，即使其突变频率低于病毒表面抗原，所以它们的缺点是单链抗体的结合因此同样受到干扰。

另一方面，抗HBV单链抗体的唯一已知实例是抗HBV表面抗原的单链抗体(Biotechniques 18：832(1995)，WO95/33832)。然而，因为该单链抗体是抗上述表面抗原的，所以它的缺点是所述特异性结合受到所述靶抗原中产生的突变的抑制。此外，生产的抗HBV的上述单链抗体仅将其用于所述抗原的纯化或免疫分析。

本发明说明书

因此，鉴于上述常见问题已经进行了本发明，本发明的目的是提供抗乙型肝炎病毒核心蛋白的单链抗体及其基因、和采用所述抗体及其基因的治疗药物。更具体地说，本发明的目的是提供特征在于通过结合到乙型肝炎病毒核心蛋白抑制所述病毒DNA合成的单链抗体、编码所述单链抗体的DNA、含有所述DNA的载体、用所述载体转化的转化体、生产上述单链抗体的方法和应用这类单链抗体或其基因的乙型肝炎的治疗药物。

由于注意到这样的事实：乙型肝炎病毒的繁殖通过嗜肝DNA病毒特征性过程进行，所以本发明人已经开发了抑制乙型肝炎病毒繁殖的一种新方法，它作为解决上述问题的手段。

已知乙型肝炎病毒的复制通过下述过程进行。

在血液中的病毒体中，所述病毒基因以具有约10％单链部分的环状不完全双链体DNA存在。然而，感染后，当转移到所述细胞核中时，所述单链部分被修复产生闭环双链DNA，而所述病毒蛋白mRNA和前基因组RNA由细胞RNA聚合酶从所述四个可读框转录。在这些物质中，所述前基因组RNA与乙型肝炎病毒DNA聚合酶和逆转录酶一起包装到核心蛋白构成的核心颗粒中，通过反转录在所述核心颗粒中合成负链和部分合成正链后由外被蛋白包被，然后所述成熟乙型肝炎病毒体释放出所述细胞。

据认为，所述核心蛋白在从所述前基因组RMA反转录的过程中起着重要的作用，而所述核心蛋白是所述病毒具有能被包装的结构所必需的(Ganem，D.，嗜肝DNA病毒科及其复制，载于“FieldsVirology”(B.N.Fields，D.M.Knipe和P.M.Howley，主编)第三版，2703-2737(1996)，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia；Hirsh，R.等，Nature，344，552-555(1990)；和Lavinem J.等，J.Virol.，63，4257-4263(1989))。因此，可以预期的是，假如人们可以抑制所述核心蛋白的功能，则发生于病毒壳体、在所述反转录后的病毒成熟过程由此受到抑制。

因为所述病毒壳体存在于所述细胞中，所以抑制所述核心蛋白功能的药物必须存在于所述细胞中。作为抑制所述细胞中的核心蛋白功能的方法，可以设想这些方法，在这些方法中抗核心蛋白抗体在细胞内表达或者表达突变的核心蛋白。

本发明人已经用乙型肝炎病毒核心蛋白免疫小鼠，从脾纯化RNA，通过PCR方法制备编码的多肽对应于抗乙型肝炎病毒核心蛋白抗体的V_L和V_H区的cDNA片段，然后获得抗所述核心蛋白的单链抗体(简写为抗核心蛋白单链抗体)，从而完成本发明。

另外，本发明人已经将上述基因引入哺乳动物表达载体中，以在持续产生乙型肝炎病毒的人源培养细胞中表达所述抗核心蛋白单链抗体，由此成功观察到在乙型肝炎病毒复制中间体DNA的数量明显减少，即：尽管与阴性照转化体中的mRNA量相比，在所述转化细胞中转录的乙型肝炎病毒mRNA量未受影响，但是乙型肝炎病毒的繁殖被抑制。本发明人因此实现了本发明。

因此，本发明要点涉及：

(1)特征在于所编码的单链抗体能够与乙型肝炎病毒核心蛋白结合的DNA；

(2)上述(1)中的DNA，包含选自以下的DNA：

    (A)编码包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽的DNA，

    (B)编码包含其中在SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个氨基酸的氨基酸序列的多肽的DNA，

    (C)包含SEQ ID NO：3中所示碱基序列的DNA，

    (D)包含其中在SEQ ID NO：3所示碱基序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个碱基的碱基序列的DNA，和

    (E)在严格条件下与(A)-(D)任一项中的所述DNA杂交的DNA；

(3)上述(1)中的DNA，包含选自以下的DNA：

    (F)编码包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽的DNA，

    (G)编码包含其中在SEQ ID NO：6所示氨基酸序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个氨基酸的氨基酸序列的多肽的DNA，

    (H)包含SEQ ID NO：5中所示碱基序列的DNA，

    (I)包含其中在SEQ ID NO：5所示碱基序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个碱基的碱基序列的DNA，和

    (J)在严格条件下与(F)-(I)任一项中的所述DNA杂交的DNA；

(4)上述(1)中的DNA，包含选自以下(A)-(E)的一种DNA和选自以下(F)-(J)的一种DNA：

    (A)编码包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽的DNA，

    (B)编码包含其中在SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个氨基酸的氨基酸序列的多肽的DNA，

    (C)包含SEQ ID NO：3中所示碱基序列的DNA，

    (D)包含其中在SEQ ID NO：3所示碱基序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个碱基的碱基序列的DNA，

    (E)在严格条件下与(A)-(D)任一项中的所述DNA杂交的DNA；

    (F)编码包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽的DNA，

    (G)编码包含其中在SEQ ID NO：6所示氨基酸序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个氨基酸的氨基酸序列的多肽的DNA，

    (H)包含SEQ ID NO：5中所示碱基序列的DNA，

    (I)包含其中在SEQ ID NO：5所示碱基序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个碱基的碱基序列的DNA，和

    (J)在严格条件下与(F)-(I)任一项中的所述DNA杂交的DNA；

(5)上述(1)中的DNA，包含选自以下的DNA：

    (K)编码包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽的DNA，

    (L)编码包含其中在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个氨基酸的氨基酸序列的多肽的DNA，

    (M)包含SEQ ID NO：1中所示碱基序列的DNA，

    (N)包含其中在SEQ ID NO：1所示碱基序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个碱基的碱基序列的DNA，和

    (O)在严格条件下与(K)-(N)任一项中的所述DNA杂交的DNA；

(6)能够与乙型肝炎病毒核心蛋白结合的单链抗体，该抗体由上述(1)-(5)任一项中的所述DNA编码；

(7)含有上述(1)-(5)任一项中的所述DNA的载体；

(8)用上述(7)的载体转化的转化体；

(9)生产能够结合乙型肝炎病毒核心蛋白的单链抗体的方法，该方法的特征在于，在容许表达由上述(1)-(5)任一项中的所述DNA编码的单链抗体的条件下，培养上述(8)的转化体；

(10)包含作为活性成分上述(6)的单链抗体的乙型肝炎治疗药物；

(11)抗乙型肝炎的基因治疗药物，包含作为活性成分的上述(1)-(5)任一项中的所述DNA；

(12)上述(11)的基因治疗药物，其特征在于它使用腺病毒载体；和

(13)上述(11)或(12)的基因治疗药物，其中乙型肝炎是急性或慢性肝炎。

以下详细描述本发明。

本发明的DNA的特征在于，它编码能够与乙型肝炎核心蛋白结合的单链抗体。一般来说，单链抗体由连续的肽组成，其中编码高度柔性肽序列的合适接头序列夹在抗体的V_H和V_L部分之间。

以下1)-3)是具体实例：

1)单链抗体，包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列组成的V_H部分或功能与所述V_H部分相同的另一个部分，并且能够与乙型肝炎病毒核心蛋白结合；

2)单链抗体，包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列组成的V_L部分或功能与所述V_L部分相同的另一个部分，并且能够与乙型肝炎核心蛋白结合；和

3)单链抗体，通过SEQ ID NO：4所示氨基酸序列组成的V_H部分或功能与所述V_H部分相同的另一个部分同SEQ ID NO：6所示氨基酸序列组成的V_L部分或功能与所述V_L部分相同的另一个部分结合，从而发展了其与乙型肝炎病毒核心蛋白的结合能力。

编码满足上述1)要求的单链抗体的DNA可以是例如包含选自以下DNA、并编码能够与乙型肝炎病毒核心蛋白结合的单链抗体的DNA：

(A)编码包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽的DNA，

(B)编码包含其中在SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个氨基酸的氨基酸序列的多肽的DNA，

(C)包含SEQ ID NO：3中所示碱基序列的DNA，

(D)包含其中在SEQ ID NO：3所示碱基序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个碱基的碱基序列的DNA，和

(E)在严格条件下与(A)-(D)任一项中的所述DNA杂交的DNA。

因为SEQ ID NO：3所示碱基序列是编码抗乙型肝炎病毒核心蛋白的抗体V_H部分的DNA碱基序列，而SEQ ID NO：4所示氨基酸序列是从SEQ ID NO：3所示碱基序列推定的氨基酸序列，所以上述(A)-(E)的DNA是编码抗乙型肝炎病毒核心蛋白抗体的V_H部分或功能与所述V_H部分相同的另一种多肽的DNA。

同样，编码满足上述2)要求的单链抗体的DNA可以是例如包含选自以下DNA、并编码能够与乙型肝炎病毒核心蛋白结合的单链抗体的DNA：

(F)编码包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽的DNA，

(G)编码包含其中在SEQ ID NO：6所示氨基酸序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个氨基酸的氨基酸序列的多肽的DNA，

(H)包含SEQ ID NO：5中所示碱基序列的DNA，

(I)包含其中在SEQ ID NO：5所示碱基序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个碱基的碱基序列的DNA，和

(J)在严格条件下与(F)-(I)任一项中的所述DNA杂交的DNA。

因为SEQ ID NO：5所示碱基序列是编码抗乙型肝炎病毒核心蛋白抗体V_L部分的DNA碱基序列，而SEQ ID NO：6所示氨基酸序列是从SEQ ID NO：5所示碱基序列推定的氨基酸序列，所以上述(F)-(J)的DNA是编码抗乙型肝炎病毒核心蛋白抗体的V_L部分或功能与所述V_L部分相同的另一种多肽的DNA。

此外，编码满足上述3)要求的单链抗体的DNA可以是例如包含选自以下(A)-(E)的一种DNA和选自以下(F)-(J)的一种DNA、并编码能够与乙型肝炎病毒核心蛋白结合的单链抗体的DNA：

(A)编码包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽的DNA，

(B)编码包含其中在SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个氨基酸的氨基酸序列的多肽的DNA，

(C)包含SEQ ID NO：3中所示碱基序列的DNA，

(D)包含其中在SEQ ID NO：3所示碱基序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个碱基的碱基序列的DNA，和

(E)在严格条件下与(A)-(D)任一项中的所述DNA杂交的DNA，

(F)编码包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽的DNA，

(G)编码包含其中在SEQ ID NO：6所示氨基酸序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个氨基酸的氨基酸序列的多肽的DNA，

(H)包含SEQ ID NO：5中所示碱基序列的DNA，

(I)包含其中在SEQ ID NO：5所示碱基序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个碱基的碱基序列的DNA，和

(J)在严格条件下与(F)-(I)任一项中的所述DNA杂交的DNA。

这种DNA含有一种编码抗乙型肝炎病毒核心蛋白抗体的V_H部分或功能与所述V_H部分相同的另一多肽的DNA和一种编码所述抗体的V_L部分或功能与所述V_L部分相同的另一多肽的DNA。更优选满足上述3)要求的这类DNA，因为它们编码只与乙型肝炎病毒核心蛋白特异性结合的抗体。

满足上述3)要求的DNA实例还可以是具有选自以下序列、并编码与乙型肝炎病毒核心蛋白结合的单链抗体的DNA：

(K)编码包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽的DNA，

(L)编码包含其中在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个氨基酸的氨基酸序列的多肽的DNA，

(M)包含SEQ ID NO：1中所示碱基序列的DNA，

(N)包含其中在SEQ ID NO：1所示碱基序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个碱基的碱基序列的DNA，和

(O)在严格条件下与(K)-(N)任一项中的所述DNA杂交的DNA。

在这方面，SEQ ID NO：1所示碱基序列是编码PRE-HV、抗乙型肝炎病毒核心蛋白抗体的V_H部分、接头、所述抗体的V_L部分和TALL的DNA的碱基序列，而SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列是从SEQ ID NO：1所示的碱基序列推定的氨基酸序列。

在严格条件下杂交的上述DNA的实例是于下述条件下杂交的DNA：采用组成为0.1％SDS、50％甲酰胺、5×SSC、1×Denhardt试剂和250μg/ml鲑精DNA的溶液作为杂交缓冲液，于42℃杂交过夜，随后用2×SSC于室温洗涤1小时，用2×SSC、0.1％SDS于室温洗涤30分钟，然后用0.1×SSC、0.1％SDS于50-65℃洗涤30分钟，。

尽管引入上述碱基或氨基酸缺失、取代、插入或加入的方法没有特别限定，但是实现它可以通过用采用限制性酶、核酸酶等的方法将突变引入目的碱基序列，或用定点诱变(W.ITO等，Gene，102，67-70(1991))将所述产物加入载体用于表达，并用该载体转化宿主细胞。此外，尽管关于上述碱基或氨基酸突变的术语“几个”未具体限定，但是它是指诸如上述定点诱变的众所周知的方法容许缺失、取代、插入或加入的数目。

同样，对应于单链抗体中的PRE-HV、接头和TAIL的肽的氨基酸序列以及编码所述肽的DNA的碱基序列未具体限定，而它们可以具有已知单链抗体对应部位肽的氨基酸序列和编码所述肽的DNA的碱基序列。例如，当用Pharmacia生产的重组噬菌体抗体系统制备单链抗体时，对应于PRE-HV、接头和TAIL的肽的氨基酸序列分别是SEQ ID NO：8、10和12所示的氨基酸序列，而编码所述肽的DNA的碱基序列分别是SEQ ID NO：7、9和11所示碱基序列。

在本发明中，用诸如Pharmacia生产的重组噬菌体抗体系统的制备单链抗体的试剂盒，可以容易地获得本发明的DNA。因为用这种试剂盒制备的本发明的DNA是以加入载体的形式获得的，所以更容易获得所述单链抗体的表达。

以下详述制备本发明单链抗体DNA的方法。用作为抗原的乙型肝炎病毒核心蛋白和佐剂的混合物免疫动物，从而可以在所述动物中产生抗乙型肝炎病毒核心蛋白抗体。

待免疫动物未具体限定，可以是例如兔、豚鼠、山羊、驴、家禽、大鼠和小鼠(Balb/c小鼠，SWISS 3T3小鼠，C3H小鼠，C57BL/6小鼠等)。

用作抗原的乙型肝炎病毒核心蛋白可以例如通过基因重组技术(J.Electron Microsc.，(Tokyo)，43(6)，386-393(1994))获得。

所述佐剂未具体限定，可以是常用的已知佐剂，例如弗氏完全或不完全佐剂。

按照常规方法，可以通过从免疫动物脾脏纯化poly(A)-RNA，制备mRNA并反转录该mRNA，从而获得cDNA。

尽管未具体限定从这种cDNA获得编码抗乙型肝炎核心蛋白抗体的V_H和V_L部分的DNA的方法，但是通过用分别是V_H和V_L部分特异性的核酸探针进行杂交或用PCR方法特异性扩增V_H和V_L部分，可以例如从cDNA文库获得所述cDNA。

当应用PCR方法时，例如，通过分别用V_H和V_L部分特异性引物对、在容许用上述cDAN作模板进行特异性扩增的条件下进行PCR，从而获得分别编码V_H和V_L部分的cDNA。作为这种特异性的引物对，可以使用上述重组噬菌体抗体系统中包含的引物对。

所获得的V_H和V_L部分的cDNA可以各自转化为双链cDNA，它们可以在将末端平端化后或在用诸如PCR或定点诱变的方法引入限制性酶位点并用限制性酶处理后，连接到诸如噬菌粒载体的载体。

例如，将以上获得的V_H和V_L部分的各自的cDNA以线性形式连接到编码接头区的DNA，并还通过用对应于具有V_H-接头-V_L结构的连续线性DNA的引物对进行PCR，将限制性酶位点引入具有V_H-接头-V_L结构的连续线性DNA，其中所述各个引物在其5’端具有一个限制性酶识别序列以促进其与载体的连接。

在该方法中，最好使用已经构建的载体，使得编码PRE-HV的DNA和编码TAIL的DNA与编码V_H部分的DNA-接头-编码V_L部分的DNA的末端连接。这种载体的实例是在Pharmacia生产的重组噬菌体抗体系统中包含的噬菌粒载体pCANTAB5E。

用这种试剂盒获得的本发明的DNA是加入载体的形式。所以，通过用所述载体转化大肠杆菌，然后与辅助噬菌体一起感染所获得的大肠杆菌克隆，从而可以获得呈现单链抗体的重组噬菌体。

本发明单链抗体是由满足上述要求1)、2)和3)之一的本发明DNA编码的蛋白。

人们用ELISA测定荧光强度，可以确定本说明书中所述单链抗体能否与乙型肝炎病毒核心蛋白结合。在该方法中，荧光强度明显高于用不与乙型肝炎病毒核心蛋白结合的单链抗体的阴性对照、并可重复性检测到的单链抗体，被认为是能够与乙型肝炎病毒核心蛋白结合的单链抗体。

本发明的载体是含有上述本发明的DNA的载体。用于构建本发明载体的载体未具体限定，只要是容许表达由所述DNA编码的单链抗体即可。当宿主是大肠杆菌时的具体实例是噬菌粒载体pCANTAB5E(Pharmacia)，或者当宿主是哺乳动物细胞时的具体实例为pZeoSV2(Invitrogen)。插入本发明的DNA到所述载体的方法未具体限定，可以是例如采用T4 DNA连接酶的已知方法。

本发明的转化体可以通过引入本发明的载体到需要的宿主细胞而获得。

宿主细胞未具体限定，包括例如人细胞(诸如肝细胞瘤来源的HepG2、Chang肝细胞、和肾脏来源的腺病毒EIA和EIB转化细胞(293))、动物细胞(诸如COS-1、COS-7、CHO和NIH 3T3)、昆虫细胞(诸如粘虫来源的SF9细胞)、酵母和大肠杆菌(诸如大肠杆菌K12株衍生物)。为了表达人来源的抗HBV的单链抗体，更优选应用人来源的培养细胞。

为了将含有本发明DNA的载体引入宿细胞，可以使用诸如磷酸钙法、电穿孔、脂质转染法或重组病毒感染法的方法。

生产能够与乙型肝炎病毒核心蛋白结合的单链抗体的本发明方法的特征在于，在容许表达本发明DNA编码的单链抗体的条件下培养本发明的转化体。作为容许表达已经加入含有本发明DNA的载体的编码单链抗体的基因产物的条件，要求从位于本发明DNA上游的载体中的启动子的转录有效发挥作用，以及要求在翻译中必须可以将正确氨基酸的可读框定位。

用上述方法测定获得的单链抗体与乙型肝炎病毒核心蛋白结合的能力，可以证实本发明的单链抗体的表达。

用常规已知的方法可以实现从所述重组体纯化抗核心蛋白单链抗体。例如，可以破碎培养细胞，可以例如用亲合柱层析从所述上清液获得表达的所需单链抗体。具体来说，在本发明中，用针对所表达的抗核心蛋白单链抗体C末端的E-tag的亲合柱层析，可以容易地纯化所述抗体。上述获得的抗核心蛋白单链抗体具有通过与乙型肝炎病毒核心蛋白结合从而抑制所述病毒的DNA合成的能力，并可进一步达到抑制所述病毒繁殖的作用。

本发明的乙型肝炎治疗药物可以用作包括作为活性成分的本发明抗核心蛋白单链抗体本身的治疗药物，或可以用作基因治疗药物，通过它把作为药物活性成分的编码抗核心蛋白单链抗体的DNA给予病人，并在所述病人体内表达所述基因。

包含作为活性成分的抗核心蛋白单链抗体本身的治疗药物可以与佐剂一起给予或以颗粒剂型给予。更具体地说，可以使用的剂型有诸如脂质体剂、所述活性成分结合在珠上的直径为几个μm的颗粒剂和其中脂质与所述成分结合的制剂。例如用持续释放的小丸制剂可以实现给药。此外，也可以加入增强所述抗体跨细胞膜转移效率的肽。具体来说，将疏水区连接到所述单链抗体的N末端和C末端。通过连接特定碳水化合物链而增强所述细胞膜的通透性也是可能的。尽管可以根据所述病人携带的乙型肝炎病毒量、患者的年龄、体重等将给药量调适，但是通常开始时连续数天给予剂量为0.001-1000mg/kg/次，然后几天或几个月给予一次。关于给药方式，该药可以根据剂型口服、动脉内、静脉内或肌内给予。

当用作基因治疗药时，该药物可以细胞内高表达抗核心蛋白单链抗体，由此抑制乙型肝炎病毒感染细胞中的病毒DNA的复制，并进一步抑制所述病毒的繁殖。

在将含有作为活性成分的抗核心蛋白单链抗体的编码DNA的基因治疗药物引入感染细胞的情况下，给药方式大致分为两种实施方案，一种是用非病毒载体，而另一种是用病毒载体。具体来说，前一种实施方案的典型实例是其中将本发明的DNA分子直接引入细胞的方法(诸如其中表达质粒直接肌内给予的方法)、其中所述DNA分子用脂质体引入的方法(诸如脂质体法或脂质转染法)、其中所述DNA分子用基因枪、微注射、磷酸钙法和电穿孔法与载体一起转移入细胞的方法。

后一实施方案的典型实例是用诸如重组腺病毒或逆转录病毒的病毒载体的方法，具体来说，包括这些方法，在这些方法中将编码抗核心蛋白单链抗体的DNA加入DNA或RNA病毒(诸如无毒性逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、新培斯病毒或仙台病毒)，并引入细胞。

在这些病毒中，已知腺病毒具有向肝组织的高转移性并还显示较其它病毒载体高得多的感染效率。因此，优选使用腺病毒载体系统。

通过使用这些方法中的一种，可以把抗核心蛋白单链抗体基因引入乙型肝炎病毒感染的细胞。此外，在用非病毒载体的基因治疗的情况下，希望例如通过局部给药将所述基因导入受感染细胞的周围，然而在用病毒载体的基因治疗的情况下，局部给予所述药物是不必要的，静脉给药也可以。

作为使得本发明的基因治疗药物可以以实施中的药物起作用的方法，有体内法和体外法，在体内法中将DNA直接引入机体，在体外法中从人体取出某些细胞，将DNA体外引入所述细胞，再将所述细胞返回所述机体内(Nikkei Science，1994年4月，第20-45页和1997年9月，第27-62页；Gekkan-Yakuji，36(1)，23-48(1994)；和Jikkenn-lgaku，12(15)，1994)。在本发明中，更优选体内法。尽管所述制剂中的DNA含量可以根据要治疗的疾病、病人的年龄、体重调适，但是通常为数天或几个月给予一次，每次剂量为0.0001-100mg，优选0.001-10mg。

包含作为活性成分的抗核心蛋白单链抗体的乙型肝炎治疗药物、和包含作为活性成分的抗核心蛋白单链抗体编码DNA的抗乙型肝炎基因治疗药物，是抗乙型肝炎病毒引起的乙型肝炎的治疗药物，而所述乙型肝炎可以是急性或慢性肝炎。

附图简述

图1图示用克隆1C9和γ9的ELISA中的吸光度。

图2是显示蛋白印迹分析结果的电泳凝胶照片。左侧泳道：分子量标记(30KDa)；右侧泳道：用产生1C9抗体的噬菌体(sFv)感染的HB2151的周质。

图3是显示关于单链抗体mRNA的RNA印迹分析结果的电泳凝胶照片。1-3道：得自引入pZeoSVγ9获得的克隆(N4、N7和N8)的RNA；4-6道：得自引入pZeoSV1C9获得的克隆(P3、P8和P9)的RNA。

图4是显示对其它克隆进行与图3相同分析的结果的电泳凝胶照片。1-4道：得自通过引入pZeoSV1C9获得的克隆(P9、P12-1、P10和P20)的RNA(图中的“sFv”)，道5和道6：得自通过引入pZeoSVγ9获得的克隆(N4和N8)的RNA(图中的“sFv”)。

图5是显示HBV mRNA的RNA印迹分析结果的电泳凝胶照片。1-3道：得自通过引入pZeoSVγ9获得的克隆(N4、N7和N8)的RNA；4-6道：得自通过引入pZeoSV1C9获得的克隆(P3、P8和P9)的RNA。

图6是显示对其它克隆进行与图5相同分析的结果的电泳凝胶照片。1-4道：得自通过引入pZeoSV1C9获得的克隆(P9、P12-1、P10和P20)的RNA；道5和道6：得自通过引入pZeoSVγ9获得的克隆(N4和N8)的RNA。

图7是显示得自转化体的乙型肝炎病毒DNA的DNA印迹分析结果的电泳凝胶照片。

在“I”带位置发现所述转化体的染色体DNA中的乙型肝炎病毒DNA，而在“S”带(单链DNA)和“D₁”(线性双链DNA)位置发现乙型肝炎病毒的复制中间体DNA。1道显示分子量标记(1kb梯)；2-7道显示得自通过引入pZeoSVγ9获得的克隆的DNA(2和3道：N4 DNA；4和5道：N7 DNA；以及6和7道：N8 DNA)；8-14道显示得自通过引入pZeoSV1C9获得的克隆的DNA(8和9道：P3DNA；10和11道：P8 DNA；12和13道：P9 DNA)。

图8是显示对其它克隆进行与图7中相同分析的结果的凝胶电泳照片。在所述图中，I、D1和S分别表示与1图7相同的意义。D2表示所述环状双链DNA。1道：分子标记；2-5道：得自通过引入pZeoSV1C9获得的克隆(P9、P12-2、P10和P20)的DNA；6和7道：得自通过引入pZeoSVγ9获得克隆(N4和N8)的DNA。

图9是显示免疫沉淀蛋白的蛋白质印迹分析结果的电泳凝胶照片。显示用抗血清(1道)或抗核心蛋白单链抗体(2道)免疫沉淀后从通过引入pZeoSVγ9获得的克隆(N8)得到的蛋白。也显示用抗血清(3道)或抗HBV核心蛋白抗体(4道)免疫沉淀后从通过引入pZeoSV1C9获得的克隆(P12-2)得到的蛋白。

图10图示引入pZeoSV1C9的HB 611细胞和引入pZeoSVγ9的HB 611细胞的细胞生长。符号“■”表示引入pZeoSV1C9的HB 611细胞，而符号“●”表示引入pZeoSVγ9的HB 611细胞。

图11是电泳凝胶照片，显示已经插入单链抗体基因的粘粒克隆DNA的限制酶切割结果。左侧图(A)显示含有所述插入1C9基因的粘粒载体的切割结果，而右侧图(B)显示含有所述插入的γ9基因的粘粒载体的切割结果。(A)2和3道：用Hind III，Xba I消化；5和6道：用Nhe I，Spe I消化；1和4道：大小标记；(B)1和2道：用Nhe I，SpeI消化；4和5道：用Hind III，Xba I消化；3和6道：大小标记。

图12是显示表达单链抗体的各种腺病毒载体DNA的限制酶XhoI切割结果的电泳凝胶照片。图片(A)表示含有所述1C9基因的腺病毒载体的克隆，而图片(B)表示含有所述γ9基因的腺病毒载体的克隆。(A)1和10道：大小标记；2道：Ax1CAwt；9道：插入1C9基因的粘粒；3-8道：各种腺病毒克隆；(B)1和16道：大小标记；2道：Ax1Cawt；15道：插入γ9基因的粘粒；3-14道：各种腺病毒克隆。

实施本发明的最佳模式

参照以下实施例更详细地描述本发明，但是本发明并不在任何方面受限于这些实施例。实施例1制备细胞培养物和免疫动物

用添加10％胎牛血清的Dulbecco的改良Eagle培养基(GibcoBRL)，在塑料组织培养板(Corning Glass Ware，Corning Inc.)中培养持续产生乙型肝炎病毒的人肝胚细胞瘤来源的细胞系(HB611；由Osaka大学，分子和细胞生物学研究所/科学和技术Nara研究所的KenichiMatsubara教授提供；或者可以按照Proc Natl.Acad.Sci.USA，84(2)，444-448(1987)制备相似的细胞)。在37℃和5％CO₂的条件下进行HB611的培养。用于选择抗性菌株的Zeocin(Invitrogen)和G418的浓度分别为125μg/ml和200μg/ml。

如下进行小鼠免疫。乙型肝炎病毒核心蛋白抗原(50μg/250μlPBS，Chemo-Sero-Therapertic Research Institute)和250μL弗氏完全佐剂(Defco)的混合物皮下给予每只体重约20g的3只Balb/c小鼠。用弗氏不完全佐剂(Difco)间隔10天加强给予两次，然后通过静脉给予乙型肝炎病毒核心蛋白抗原(20μg)，使产生最高量抗核心蛋白抗体的小鼠接受最后一次强化。三天后，处死小鼠，取脾，用Trisol(Gibco BRL)从中提取总RNA，用Fast-track(Invitrogen)纯化poly(A)-RNA。实施例2克隆以及筛选抗乙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体

用重组噬菌体抗体系统(Pharmacia)，进行抗乙型肝炎病毒核心蛋白抗原的单链抗体的cDNA的制备。

以下概述所述实验方法。用上述获得的mRNA 25μg进行逆转录后，用分别为V_H和V_L部分的序列特异性的引物对，通过PCR法扩增V_H和V_L部分的cDNA。V_H和V_L部分的cDNA用一种DNA接头序列以线性方式连接在一起，然后用在其末端具有限制酶识别序列的一对引物通过PCR法扩增所述产物。用限制内切酶处理由此获得的DNA，然后插入噬菌粒(pCANTAB5E)的Sfi I和Not I切割位点。噬菌粒pCANTAB5E含有对应于单链抗体的PRE-HV和TAIL的DNA。

为了获得呈现单链抗体的重组单链噬菌体，用含有所述PCR扩增的片段的噬菌粒载体转化大肠杆菌TG1细胞，用辅助噬菌体M13K07感染所述大肠杆菌克隆，以制备呈现单链抗体的重组噬菌体。为了从这些噬菌体中选择具有与乙型肝炎病毒核心蛋白抗原结合能力的噬菌体，将所述重组噬菌体溶液加入到所述核心蛋白抗原固定在其上的组织培养瓶中，结合所述核心蛋白抗原的重组噬菌体用来再次感染TG1细胞。

上述筛选方法总共重复两次后，从所获得的95个大肠杆菌克隆产生所述噬菌体单链抗体，用所述核心蛋白抗原吸附在其上的ELISA板，通过间接ELISA方法检测每个分离克隆中所述噬菌体单链抗体与所述抗原结合的能力。结果，95个克隆中有1个克隆显示与阳性对照相当的吸光度，由此获得产生具有与所述核心蛋白抗原强结合能力的噬菌体单链抗体的噬菌体克隆。所述结果示于图1。

在重组噬菌体抗体系统(Pharmacia)中，包括分别对V_H和V_L部分序列的序列特异性引物对、所述DNA接头序列、在其末端具有限制酶识别序列的引物对、噬菌粒pCANTAB5E和辅助噬菌体M13K07。实施例3选择的克隆1C9的结合特异性

为了证实克隆1C9的结合能力不因为噬菌体载体来源的蛋白非特异性吸附到所述板上的缘故，用ELISA进行以下检测。在所述核心蛋白抗原(HBc)或牛血清白蛋白(BSA)吸附在其上的孔中，或在刚好用2％脱脂奶粉封闭的孔(未包被的)中，检测得自阳性克隆1C9和不产生与所述核心蛋白抗原结合的噬菌体单链抗体的阴性对照克隆γ9的噬菌体抗体。结果，1C9只在含有所述核心蛋白抗原吸附其上的孔中显示其结合能力，而γ9对任何孔都不表现出所述结合能力。所述结果示于图1。实施例4检测克隆1C9中的所述单链抗体区的碱基序列

用Pfu聚合酶和具有加至其相应末端的Nhe I和Xho I识别序列的引物，扩增插入得自阳性克隆1C9的噬菌粒载体pCANTAB5E的编码所述单链抗体的DNA片段。所用引物的碱基序列示于SEQ ID NO：13和14。

所扩增的片段暂时插入克隆载体pBluescript SK(+)(Stratagene)中，以检测所述DNA碱基序列。

所获得的碱基序列和推定的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：1和2。编码所述抗核心蛋白抗体的V_H和V_L的DNA的碱基序列分别示于SEQ ID NO：3和5，推定的V_H和V_L的氨基酸序列分别示于SEQID NO：4和6。

对应于PRE-HV、接头和TAIL的部分的氨基酸序列分别示于SEQID NO：8、10和12，编码所述肽的DNA的碱基序列分别示于SEQ IDNO：7、9和11。质粒pZeoSV1C9为在表达载体pZeoSV2中已插入编码上述单链抗体的DNA片段的质粒，携带质粒pZeoSV1C9的大肠杆菌DH5α(pZeoSV1C9)，在检测其碱基序列后已经保藏于工业科学技术局的国立生命科学和人体技术研究所，(1-1-3，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，305日本)(微生物标记：大肠杆菌DH5α(pZeoSV1C9)；接收日期：1997年8月1日；保藏号：FERM P-216361)(转移到国际保藏机构的日期：1998年8月20日；保藏号：FERM BP-6467)。实施例5用抗-E-tag抗体进行在HB2151中表达的可溶性单链抗体的蛋白质印迹分析

从以上获得的1C9衍生的重组噬菌体再次用来感染大肠杆菌HB2151，以产生所述可溶性单链抗体。用1mM EDTA处理所获得的克隆，以洗脱周质溶液，20μl的所述周质溶液进行SDS-PAGE，接着用针对连接到所述单链抗体C末端的E-tag的抗体进行蛋白质印迹分析。结果如图2所示(右侧泳道)，检测到约30kDa的单一条带(箭头所示)。实施例6用RNA印迹分析研究在已引入所述单链抗体基因的克隆中编码所述单链抗体的RNA的表达

将得自阳性克隆1C9和阴性对照克隆γ9、表达所述单链抗体的基因区，插入到哺乳动物细胞表达质粒载体pZeoSV2(Invitrogen)的EcoR I切割位点。将所获得的重组表达载体pZeoSV1C9和pZeoSVγ9通过磷酸钙法，引入产生乙型肝炎病毒的人肝胚细胞瘤来源的细胞系(HB611)中，对于每种载体，获得3个不同的显示抗Zeocin抗性的克隆(引入pZeoSV1C9的克隆：P3、P8和P9；引入pZeoSVγ9的克隆：N4、N7、N8)。从各个克隆制备RNA，用各个单链抗体的cDNA片段序列作探针进行RNA印迹分析，以研究所述单链抗体的RNA量。用Dupont NEN生产的滤器(+基因筛(Gene screen plus))进行RNA印迹分析。杂交条件按照Dupont NEN提供的方案。所述结果示于图3。

如图3所示，所有引入pZeoSV1C9的克隆(4-6道：P3、P8、P9)和引入pZeoSVγ9的克隆(1-3道：N4、N7、N8)均产生编码所引入单链抗体的mRNA。在任何克隆之间，编码所述单链抗体的mRNA量无可检测的差异。

此外，对其它显示抗Zeocin抗性的克隆进行相似检测的结果示于图4。在图4中，1-4道分别表示引入pZeoSV1C9的克隆P9、P12-2、P10的结果，5和6道分别表示引入pZeoSVγ9的克隆N4和N8结果。与图3所示的上述结果类似，所有克隆产生源自所述引入的单链抗体基因的mRNA，并且在任何克隆之间源自所述单链抗体基因的mRNA量无可检测的差异。实施例7转化细胞的乙型肝炎病毒的RNA和DNA分析

将表达单链抗体的转化细胞(引入pZeoSV1C9的HB611细胞和引入pZeoSVγ9的HB611细胞)平板接种到组织培养用的6cm培养皿和6孔板中，当所述培养物融合铺满时回收RNA和DNA。

用实施例1中所述方法进行RNA的回收，用实施例6中所述方法进行分析。在所述分析中，用³²P标记的HBV DNA(GenBank登记号：X01587)作探针，用Rediprime^TM(Amersham)通过RNA印迹分析研究HBV RNA量。结果，所有携带pZeoSV1C9(4-6道：分别为P3、P8、P9)和pZeoSVγ9(1-3道：分别为N4、N7和N8)的HB611转化细胞均显示类似的乙型肝炎病毒mRNA表达(图5)。

另外，用其它克隆进行类似方法的结果示于图6。在图6中，1-4道分别表示P9、P12-2、P10和P20的结果，5和6道分别表示N4和N8的结果。与上述图5所示结果相似，所有克隆均显示类似的乙型肝炎病毒mRNA表达。

如下进行DNA的提取。在6孔皿中，用3ml PBS清洗各个孔后，加入1ml裂解缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM EDTA，1％SDS)，用细胞刮除器回收所述细胞。然后加入1/100体积的蛋白酶K(20mg/ml)，于37℃温育过夜，再加入1/100体积的RNA酶A(10mg/ml)，然后于37℃温育2小时。从经过上述处理的细胞，用苯酚/氯仿/异戊醇提取DNA，然后通过加入1/10体积的3M乙酸钠和2倍体积的乙醇进行沉淀。用70％乙醇洗涤后，将所述沉淀溶解于TE溶液(10mM Tris-HCl，pH 8.0，0.1mM EDTA)中以产生DNA溶液。

通过与限制酶Hind III于37℃温育4小时，切割由此制备的DNA。如上所述用苯酚/氯仿/异戊醇提取，用乙醇沉淀，和用70％乙醇洗涤后，将切割的DNA溶解于TE溶液中，用Hybond N+滤膜(Amersham)通过DNA印迹分析，以研究在所述转化细胞中HBV的DNA复制中间体的量。杂交条件按Amersham提供的方案。作为探针，使用上述RNA印迹分析中所用相同探针作探针。

结果，如图7所示，如所述相似密度的带所证实，在引入pZeoSV1C9的HB611细胞(8和9道：P3；10和11道：P8；12和13道：P9)和引入pZeoSVγ9的HB611细胞(2和3道：N4；4和5道：N7；6和7道：N8)中检测到的整合入所述宿主染色体的HBV DNA量无明显差别，证实在所有情况下，在所述宿主染色体DNA中存在几乎相同拷贝数的乙型肝炎病毒基因(图7中的“I”带位置)。

然而，如图7中的“D₁(线性双链DNA)”和“S(单链DNA)”带的位置所示，与引入pZeoSVγ9的细胞(2-7道)相比时，引入pZeoSV1C9的细胞(8-13道)中的HBV复制中间体的量显著减少，表明含有作为其主要成分的抗乙型肝炎病毒核心蛋白小鼠抗体可变区的本发明的单链抗体，具有抑制乙型肝炎病毒DNA复制的效应，即抑制乙型肝炎病毒繁殖的效应。

另外，用其它克隆实施相似方法的结果示于图8。在图8中，2-5道分别表示P9、P12-2、P10和P20的结果，而6和7道分别表示N4和N8的结果。

与上述结果相似，尽管在引入pZeoSV1C9的克隆和引入pZeoSVγ9的克隆之间，整合入所述宿主染色体的HBV DNA量无差别(图8中的I带)，但是与引入pZeoSVγ9的克隆比较，在引入pZeoSV1C9的克隆中HBV的复制中间体量明显降低(图8中和D2、D1和S带，其中D2对应于环状双链DNA)，表明该结果与上述图7结果相同。实施例8在转化细胞中的单链抗体蛋白产生的分析

用裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，10mM EDTA，0.5％TritonX-100，1μg/ml抑蛋白酶肽，1μg/ml亮抑蛋白酶肽，100μg/ml PMSF，1μg/ml抑胃酶肽A)，由引入pZeoSV1C9的HB611克隆(P12-2)和引入pZeoSVγ9的HB611克隆(N8)制备细胞裂解物。用10μg正常兔IgG(Dako)对5μg所述裂解物(100μg蛋白/1ml缓冲液)进行预清除，然后与5μg抗HBV核心蛋白兔抗体(Dako)或正常兔IgG抗体(Dako)进行抗原-抗体反应。然后用25μl具有被IgG结合特性的蛋白G-Sepharose 4FF(Pharmacia)，通过免疫沉淀回收上述抗原-抗体反应的产物。所回收的物质经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用针对加到所述sFvC末端的E-标记的抗体进行蛋白质印迹分析。结果如图9所示，只有当使用P12-2的裂解物并用抗HBV核心蛋白兔抗体进行免疫沉淀(4道)时，可以检测到单一的约30kDa的带。该结果证实，在抗HBV核心蛋白单链抗体基因引入其中并且其中HBV复制被抑制的转化细胞(P12-2)中，在细胞内产生所述单链抗体，而且它与HBV核心蛋白形成复合物。实施例9单链抗体对HB611增殖的影响

为了证实图7和8所示的单链抗体对HBV复制的抑制效应不是由于所述单链抗体的产生引起的对细胞增殖的抑制引起的，用MTT检测法(溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎓，MTT，Sigma)，研究引入pZeoSV1C9的HB611克隆和引入pZeoSVγ9的HB611克隆的增殖。

检测引入pZeoSV1C9的HB611克隆(6个克隆)和引入pZeoSVγ9的HB611克隆(3个克隆)的均值±SD示于图10。在图10中，●表示引入pZeoSV1C9的HB611克隆的结果，而■表示引入pZeoSVγ9的HB611克隆的结果。如图10所示，在开始检测后的180小时内，在这些转化细胞之间的增殖无差别。由此证实，抗HBV核心蛋白单链抗体通过与HBV核心蛋白形成复合物从而直接抑制HBV复制，而不引起对所述宿主细胞的增殖的抑制。实施例10重组粘粒载体的制备

用从位于起始密码子ATG上游57个碱基对的EcoR I切割位点延伸至位于终止密码子TAG下游114个碱基对的EcoR I切割位点、编码抗HBV核心蛋白的单链抗体的1C9基因的大约1.1kb DNA片段，制备粘粒载体。另外，对于作为抗HBV核心蛋白的单链抗体的无活性的γ9基因，可以类似地用大约1.1kb EcoR I片段制备另一种粘粒载体。具体来说，在上述平端化的大约1.1kb EcoR I片段连接到用Swa I切割的pAx1Cawt粘粒载体后，用Swa I消化不含有插入片段的粘粒载体，体外包装等分的所述反应液。在感染大肠杆菌DH5α后，从出现的菌落回收粘粒DNA，并用Hind III/Xba I切割后在1％琼脂糖凝胶电泳上分析。结果获得4个所述1C9基因已经以正确方向插入其中的克隆和3个所述γ9基因已经以正确方向插入其中的克隆。从这些克隆中，对每个基因选择3个克隆，并用Hind III/Xba I或SpeI/Nhe I切割。对于各个克隆，因为在Hind III和Xba I消化后检测到约1kb片段，或在Nhe I和Spe I消化后检测到约1.7kb和约1.1kb片段，证实所需DNA片段已经以正确的方向插入。用限制酶所证实的结果示于图11。实施例11重组腺病毒的制备

为了制备其中上述1C9或γ9表达单位已经插入人5型腺病毒衍生的复制缺陷型重组腺病毒载体(缺乏E1和E3基因)中的E1基因缺失位点的重组腺病毒载体，实施以下步骤。在该实施例中，将在日本专利公布号H3-168087(1991)中公开的CAG启动子用作高表达启动子，并按照现有的方法(Miyake等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第93卷，1320-1324(1996)；和日本专利公布号H7-298877(1995))制备所述重组腺病毒载体。

从其中只有所述CAG启动子已经插入腺病毒E1基因缺失位点的重组腺病毒载体Ax1Cawt(Kanegae等，Nucleic Acid Res.，23，3816-3821，1996)开始，按照现有方法(日本专利公布号H7-298877(1995))制备所述病毒DNA-终末蛋白复合物，并同时用限制酶EcoT22 I和ClaI消化。用该限制性的病毒DNA-终末蛋白复合物和按照实施例10制备的、所述单链抗体1C9基因或所述单链抗体γ9基因已经插入其中的粘粒载体，通过磷酸钙共沉淀法转化293细胞。在克隆所产生的重组腺病毒后，通过所述病毒DNA的限制酶消化(Xho I)选择所需要的病毒。当用Xho I消化时，亲代病毒产生4.8Kb DNA片段，而所需克隆产生5.9Kb DNA片段。病毒DNA的限制酶消化的结果示于图12。根据所述结果的分析，获得2个表达所述1C9基因的重组腺病毒载体和9个表达所述γ9基因的重组腺病毒载体。

通过用表达所述1C9基因的重组腺病毒载体作基因治疗的药物，可以抑制乙型肝炎病毒的繁殖。工业应用范围

本发明的DNA编码抗乙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体，当在细胞内表达时，所述单链抗体可以抑制乙型肝炎病毒的DNA合成，由此抑制乙型肝炎病毒的繁殖。此外，可以预测，本发明的抗核心蛋白单链抗体甚至在其中通过增强所述宿主免疫以消除所述病毒的治疗几乎无效的前核心突变病毒的情况下，具有出色的效果，因为本发明抗体的靶是所述核心蛋白抗原。

                        序列表SEQ ID NO：1序列长度：894序列类型：核酸链型：双链拓朴学：线性分子类型：cDAN到mRNA假说：无原始来源：

生物：小鼠

品系：Balb/c

组织类型：脾直接来源：

克隆：pZeoSV1C9特征：

特征关键词：

位置：1..111

其它信息：编码PRE-HV序列特征：

特征关键词：CDS

位置：112..435

鉴别方法：E特征：

特征关键词：

位置：436..528

其它信息：编码接头序列特征：

特征关键词：CDS

位置：529..837

鉴别方法：E特征：

特征关键词：

位置：838..891

其它信息：编码TAIL序列序列描述：ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTT GGA GCC TTT TTT TTG GAG ATT TTC     48Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Phe Gly Ala Phe Phe Leu Glu Ile Phe

              5                  10                  15AAC GTG AAA AAA TTA TTA TTC GCA ATT CCT TTA GTT GTT CCT TTC TAT     96Asn Val Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr

         20                  25                  30GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTG AAG CTG CAG GAG TCA GGA CCT    144Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro

     35                  40                  45GAG CTG GAG AAG CCT GGC GCT TCA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT    192Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser

 50                  55                  60GGT TAC TCA TTC ACT GGC TAC AAC ATG AAG TGG GTG AAA CAG AGC AAT    240Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Asn Met Lys Trp Val Lys Gln Ser Asn65                  70                  75                  80GGA AAG AGC CTT GAG TGG ATT GGA TAT ATT TAT CCT TAC AAT GGT GGT    288Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly

            85                  90                  95ACT GGC TAC AAC CAG AAG TTC AAG AGC AAG GCC ACA TTG ACT GTA GAC    336Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp

        100                 105                 110AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC ATG CAA CTG AGC AGC CTG ACA TCT GAG    384Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu

    115                 120                 125GAC TCT GCA GTC TAT TAC TGT GCA AGA CTG GGA CTT GAC TAC TGG GGC    432Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Leu Asp Tyr Trp Gly

130                 135                 140CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA    480Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly145                 150                 155                 160GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT CCA    528Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro

            165                 170                 175ACC ACC ATG GCT GCA TCT CCC GGG GAG AAG ATC ACT ATC ACC TGC AGT    576Thr Thr Met Ala Ala Ser Pro Gly Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser

        180                 185                 190GCC AGC TCA AGT ATA AGT TCC AAT TAC TTG CAT TGG TAT CAG CAG AAG    624Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys

    195                 200                 205CCA GGA TTC TCC CCT AAA CTC TTG ATT TAT AGG ACA TCC AAT CTG GCT    672Pro Gly Phe Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala

210                 215                 220TCT GGA ATC CCA GCT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC    720Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr225                 230                 235                 240TCT CTC ACA ATT GGC ACC ATG GAG GCT GAA GAT GTT GCC ACT TAC TAC    768Ser Leu Thr Ile Gly Thr Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr

            245                 250                 255TGC CAG CAG GGT AGT AGT ATA CCA CGC ATA TTC ACG TTC GGT GCT GGG    816Cys Gln Gln Gly Ser Ser Ile Pro Arg Ile Phe Thr Phe Gly Ala Gly

        260                 265                 270ACA AAG TTG GAA ATA AAA CGG GCG GCC GCA GGT GCG CCG GTG CCG TAT    864Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Gly Ala Pro Val Pro Tyr

    275                 280                 285CCG GAT CCG CTG GAA CCG CGT GCC GCA TAG                            894Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala

290                 295SEQ ID NO：2序列长度：297序列类型：氨基酸拓朴学：线性分子类型：肽原始来源：

生物：小鼠

品系：Balb/c

组织类型：脾特征：

特征关键词：肽

位置：1..145

鉴别方法：P特征：

特征关键词：肽

位置：177..279

鉴别方法：P序列描述：Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Phe Gly Ala Phe Phe Leu Glu Ile Phe

              5                  10                  15Asn Val Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr

         20                  25                  30Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro

     35                  40                  45Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser

 50                  55                  60Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Asn Met Lys Trp Val Lys Gln Ser Asn65                  70                  75                  80Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly

             85                  90                  95Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp

        100                 105                 110Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu

    115                 120                 125Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Leu Asp Tyr Trp Gly

130                 135                 140Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly145                 150                 155                 160Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro

            165                 170                 175Thr Thr Met Ala Ala Ser Pro Gly Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser

        180                 185                 190Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys

    195                 200                 205Pro Gly Phe Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala

210                 215                 220Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr225                 230                 235                 240Ser Leu Thr Ile Gly Thr Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr

            245                 250                 255Cys Gln Gln Gly Ser Ser Ile Pro Arg Ile Phe Thr Phe Gly Ala Gly

        260                 265                 270Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Gly Ala Pro Val Pro Tyr

    275                 280                 285Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala

290                 295SEQ ID NO：3序列长度：324序列类型：核酸链型：双链拓朴学：线性分子类型：cDAN到mRNA假说：无原始来源：

生物：小鼠

品系：Balb/c

组织类型：脾直接来源：

克隆：pZeoSV1C9特征：

特征关键词：CDS

位置：1..324

鉴别方法：E序列描述：ATG GCC CAG GTG AAG CTG CAG GAG TCA GGA CCT GAG CTG GAG AAG CCT     48Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro

              5                  10                  15GGC GCT TCA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGT TAC TCA TTC ACT     96Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr

         20                  25                  30GGC TAC AAC ATG AAG TGG GTG AAA CAG AGC AAT GGA AAG AGC CTT GAG    144Gly Tyr Asn Met Lys Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu

     35                  40                  45TGG ATT GGA TAT ATT TAT CCT TAC AAT GGT GGT ACT GGC TAC AAC CAG    192Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln

 50                  55                  60AAG TTC AAG AGC AAG GCC ACATTG ACT GTA GAC AAA TCC TCC AGC ACA     240Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr65                  70                  75                  80GCC TAC ATG CAA CTG AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA GTC TAT    288Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

             85                  90                  95TAC TGT GCA AGA CTG GGA CTT GAC TAC TGG GGC CAA                    324Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

        100                 105SEQ ID NO：4序列长度：108序列类型：氨基酸拓朴学：线性分子类型：肽原始来源：

生物：小鼠

品系：Balb/c

组织类型：脾特征：

特征关键词：肽

位置：1..108

鉴别方法：P序列描述：Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro

              5                  10                  15Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr

         20                  25                  30Gly Tyr Asn Met Lys Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu

     35                  40                  45Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln

 50                  55                  60Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr65                  70                  75                  80Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

             85                  90                  95Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

        100                 105SEQ ID NO：5序列长度：309序列类型：核酸链型：双链拓朴学：线性分子类型：cDAN到mRNA假说：无原始来源：

生物：小鼠

品系：Balb/c

组织类型：脾直接来源：

克隆：pZeoSV1C9特征：

特征关键词：CDS

位置：1..309

鉴别方法：E序列描述：ACC ACC ATG GCT GCA TCT CCC GGG GAG AAG ATC ACT ATC ACC TGC AGT     48Thr Thr Met Ala Ala Ser Pro Gly Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser

              5                  10                  15GCC AGC TCA AGT ATA AGT TCC AAT TAC TTG CAT TGG TAT CAG CAG AAG     96Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys

         20                  25                  30CCA GGA TTC TCC CCT AAA CTC TTG ATT TAT AGG ACA TCC AAT CTG GCT    144Pro Gly Phe Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala

     35                  40                  45TCT GGA ATC CCA GCT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC    192Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr

 50                  55                  60TCT CTC ACA ATT GGC ACC ATG GAG GCT GAA GAT GTT GCC ACT TAC TAC    240Ser Leu Thr Ile Gly Thr Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr65                  70                  75                  80TGC CAG CAG GGT AGT AGT ATA CCA CGC ATA TTC ACG TTC GGT GCT GGG    288Cys Gln Gln Gly Ser Ser Ile Pro Arg Ile Phe Thr Phe Gly Ala Gly

             85                  90                  95ACA AAG TTG GAA ATA AAA CGG                                        309Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

        100SEQ ID NO：6序列长度：103序列类型：氨基酸拓朴学：线性分子类型：肽原始来源：

生物：小鼠

品系：Balb/c

组织类型：脾特征：

特征关键词：肽

位置：1..103

鉴别方法：P序列描述：Thr Thr Met Ala Ala Ser Pro Gly Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser

              5                  10                  15Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys

         20                  25                  30Pro Gly Phe Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala

     35                  40                  45Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr

 50                  55                  60Ser Leu Thr Ile Gly Thr Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr65                  70                  75                  80Cys Gln Gln Gly Ser Ser Ile Pro Arg Ile Phe Thr Phe Gly Ala Gly

             85                  90                  95Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

        100SEQ ID NO：7序列长度：111序列类型：核酸链型：双链拓朴学：线性分子类型：其它核酸(合成的)假说：无特征：

特征关键词：CDS

位置：1..111

鉴别方法：P序列描述：ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTT GGA GCC TTT TTT TTG GAG ATT TTC     48Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Phe Gly Ala Phe Phe Leu Glu Ile Phe

              5                  10                  15AAC GTG AAA AAA TTA TTA TTC GCA ATT CCT TTA GTT GTT CCT TTC TAT     96Asn Val Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr

         20                  25                  30GCG GCC CAG CCG GCC                                                111Ala Ala Glu Pro Ala

     35SEQ ID NO：8序列长度：37序列类型：氨基酸拓朴学：线性分子类型：肽序列描述：Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Phe Gly Ala Phe Phe Leu Glu Ile Phe

              5                  10                  15Asn Val Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr

         20                  25                  30Ala Ala Gln Pro Ala

     35SEQ ID NO：9序列长度：93序列类型：核酸链型：双链拓朴学：线性分子类型：其它核酸(合成的)假说：无特征：

特征关键词：CDS

位置：1..93

鉴别方法：P序列描述：GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT     48Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

              5                  10                  15GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT CCA         93Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro

         20                  25                  30SEQ ID NO：10序列长度：31序列类型：氨基酸拓朴学：线性分子类型：肽序列描述：Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

              5                  10                  15Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro

         20                  25                  30SEQ ID NO：11序列长度：57序列类型：核酸链型：双链拓朴学：线性分子类型：其它核酸假说：无特征：

特征关键词：CDS

位置：1..54

鉴别方法：P序列描述：GCG GCC GCA GGT GCG CCG GTG CCG TAT CCG GAT CCG CTG GAA CCG CGT     48Ala Ala Ala Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg

              5                  10                  15GCC GCA TAG                                                         57Ala AlaSEQ ID NO：12序列长度：18序列类型：氨基酸拓朴学：线性分子类型：肽序列描述：Ala Ala Ala Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg

              5                  10                  15Ala AlaSEQ ID NO：13序列长度：32序列类型：核酸链型：单链拓朴学：线性分子类型：其它核酸(合成DNA)序列描述：GGGCTAGCGT GTGGAATTGT GAGCGGATAA CA                        32SEQ ID NO：14序列长度：32序列类型：核酸链型：单链拓朴学：线性分子类型：其它核酸(合成DNA)序列描述：GGCTCGAGCA GCCCTCATAG TTAGCGTAAC GA                        32

Claims (13)

1.一种DNA，其牲特征在于它编码能够与乙型肝炎病毒核心蛋白结合的单链抗体。

2.权利要求1的DNA，包含选自以下的DNA：

(A)编码包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽的DNA，

(B)编码包含其中在SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个氨基酸的氨基酸序列的多肽的DNA，

(C)包含SEQ ID NO：3中所示碱基序列的DNA，

(D)包含其中在SEQ ID NO：3所示碱基序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个碱基的碱基序列的DNA，和

(E)在严格条件下与(A)-(D)任一项中的所述DNA杂交的DNA。

3.权利要求的DNA，包含选自以下的DNA：

(F)编码包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽的DNA，

(G)编码包含其中在SEQ ID NO：6所示氨基酸序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个氨基酸的氨基酸序列的多肽的DNA，

(H)包含SEQ ID NO：5中所示碱基序列的DNA，

(I)包含其中在SEQ ID NO：5所示碱基序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个碱基的碱基序列的DNA，和

(J)在严格条件下与(F)-(I)任一项中的所述DNA杂交的DNA。

4.权利要求1的DNA，包含一种选自以下(A)-(E)的DNA和一种选自以下(F)-(J)的DNA：

(A)编码包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽的DNA，

(B)编码包含其中在SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个氨基酸的氨基酸序列的多肽的DNA，

(C)包含SEQ ID NO：3中所示碱基序列的DNA，

(D)包含其中在SEQ ID NO：3所示碱基序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个碱基的碱基序列的DNA，和

(E)在严格条件下与(A)-(D)任一项中的所述DNA杂交的DNA。

(F)编码包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽的DNA，

(G)编码包含其中在SEQ ID NO：6所示氨基酸序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个氨基酸的氨基酸序列的多肽的DNA，

(H)包含SEQ ID NO：5中所示碱基序列的DNA，

(I)包含其中在SEQ ID NO：5所示碱基序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个碱基的碱基序列的DNA，和

(J)在严格条件下与(F)-(I)任一项中的所述DNA杂交的DNA。

5.权利要求1的DNA，包含选自以下的DNA：

(K)编码包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽的DNA，

(L)编码包含其中在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个氨基酸的氨基酸序列的多肽的DNA，

(M)包含SEQ ID NO：1中所示碱基序列的DNA，

(N)包含其中在SEQ ID NO：1所示碱基序列中缺失、取代、插入或加入一个或几个碱基的碱基序列的DNA，和

(O)在严格条件下与(K)-(N)任一项中的所述DNA杂交的DNA。

6.能够与乙型肝炎病毒核心蛋白结合的单链抗体，所述抗体由根据权利要求1-5任一项的DNA编码。

7.含有按照权利要求1-5任一项的DNA的载体。

8.用权利要求7的载体转化的转化体。

9.生产能够结合乙型肝炎病毒核心蛋白的单链抗体的方法，所述方法的特征在于，在容许表达由按照权利要求1-5任一项的DNA编码的单链抗体的条件下培养权利要求8的转化体。

10.包含作为活性成分的权利要求6的单链抗体的乙型肝炎治疗药物。

11.包含作为活性成分的按照权利要求1-5任一项的DNA的乙型肝炎基因治疗药物。

12.权利要求11的基因药物，其特征在于它采用腺病毒载体。

13.权利要求11或12的基因治疗药物，其中乙型肝炎是急性或慢性肝炎。

Images