CN1283636C - 儿茶素单体的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及儿茶素单体EGCG和ECG的分离纯化方法。其特点是：以葡聚糖凝胶Sephadex LH-20为柱填料，无水乙醇为洗脱剂；再以葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱，以40%乙醇水溶液为洗脱剂，进行柱层析；即采用层析柱非梯度一次性分离。本发明方法与原有方法相比，大大简化了儿茶素单体分离纯化设备，方法简便，成本低廉，溶剂无毒，分离周期短，单体提取率及产品纯度均较高。
Description
技术领域
本发明涉及茶叶中两类重要的儿茶素单体L-表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG和L-表儿茶素没食子酸酯ECG的分离纯化方法。
背景技术
儿茶素是茶叶中重要的一类天然活性物质，属于黄烷醇类化合物，1929年由日本人首次提取分离出来。它由八种左右的单体组成，即D、L-儿茶素(D、L-C)，L-表儿茶素(L-EC)，L-表没食子儿茶素(L-EGC)，D、L-没食子儿茶素(D、L-GC)，L-表儿茶素没食子酸酯(L-ECG)，L-儿茶素酸酯(L-CG)、L-表没食子儿茶素没食子酸酯(L-EGCG)、L-没食子儿茶素没食子酸酯(L-GCG)。由于CG、ECG、GCG、和EGCG中发生了儿茶素与没食子酸的酯化作用，故称其为酯型儿茶素；而没有发生酯化作用的C、EC、GC、EGC称为非酯型儿茶素，各儿茶素的结构较为相似，有些为同分异构体，结构的主要区别在于羟基取代的数量和位置不同。各种单体的含量也因茶叶品质不同各异，一般来说其中的两类酯型儿茶素-epigallocatechin gallate(EGCG)和-epicatechin gallate(ECG)含量较大，药理活性最强，也是研究的重点。研究表明茶多酚的主体化合物儿茶素既是理想的天然抗氧化剂，又是一类极有价值的天然药物原料，它具有抗肿瘤、降血压、降血脂、抗氧化、抗衰老以及抑菌、抗艾滋病病毒等多种独特功效。近年来，世界发达国家积极推进儿茶素应用产品的开发，以其作为天然抗氧化剂和自由基清除剂，已广泛应用于食品加工、医药保健和日用化工等领域，研究茶叶儿茶素单体的提取纯化方法和生产工艺具有重要的现实意义。近十年来，国内外，特别是我国和日本对探索新的儿茶素提取分离工艺日益关注。除传统方法外，又发展了一些新的提取分离技术，如超临界萃取法、高速逆流色谱分离法等等。
目前分离儿茶素的方法一般分为二步：首先从茶末中提取含有儿茶素的茶多酚粗品(TP)；其次从粗提物中纯化分离儿茶素组分。若要得到几茶素中的各种单体组分，则需进一步经过柱色谱法、半制备高效液相色谱法(HPLC)纯化或者其它仪器方法纯化。由于儿茶素各组分的化学结构与性质十分相近，采用一般的方法很难分离，根据资料分析，目前分离制备儿茶素单体的方法主要有以下几种。
(1)柱层析分离法
该方法是将茶多酚粗品经一定的溶剂溶解后，上柱分离，用洗脱剂洗脱，收集儿茶素。柱层析的关键是柱填料与洗脱剂的选择。国内外报道的柱填料有三大类型：吸附型柱、离子交换柱、凝胶柱。这种分离方法繁琐、费时，溶剂有毒。
(2)高效液相(HPLC)制备色谱法
制备型HPLC主要用于分离纯化出儿茶素的单体组分。工艺流程是TP粗品经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱分离纯化出儿茶素混合物，一般以不同梯度的丙酮水溶液作洗脱剂，分离得到酯型儿茶素和非酯型儿茶素两组流分，再经HPLC制备柱分离纯化，采用甲醇/水为洗脱剂，进一步纯化得到儿茶素单体组分。所得儿茶素产品纯度较高，但存在成本高，周期长后期溶剂难以完全除尽等缺点。
(3)高速逆流色谱法(HSCCC)
HSCCC法是80年代发展起来的新技术，其特点是高速运转产生的重力场使固定相能在分离柱中实现高的保留，从而大大提高了分离能力。该法属仪器分离法，溶剂系统中各溶剂在分液漏斗中混合后，上层为固定相，灌入色谱分离柱；下层为流动相，将TP粗品溶解成5％-10％的溶液。当流动相流经色谱柱时，儿茶素各组分得到分离。这种分离方法是在两相之间进行的，克服了使用固体吸附材料造成的样品不可逆吸附或降解的缺点，样品可最大限度地得以回收。
儿茶素单体分离纯化技术中的问题
近年来，儿茶素提取分离技术得到了不断的完善和发展，一方面表现在产品得率不断提高；另一方面是产品多样化，即每个工艺都能对儿茶素进行不同程度地提纯分离，进而获得纯度不一的儿茶素系列产品，同时产品颜色也有黄棕色、绿色、黄白色等不同型号，以满足市场的需要。我们将目前报道的儿茶素单体分离纯化方法总结于表1。
表1 儿茶素单体分离纯化方法比较
| 分离方法 | 优点 | 缺点 |
| 柱层析法高效液相制备色谱法 | 成本低，制备量相对较大纯度高，操作简单 | 操作步骤多，周期长，提取率低，条件不易控制，产品纯度低制备量小，成本高，制备柱易污染 |
| 高速逆流色谱法 | 分离能力高 | 成本高，制备量小，目前难以普及 |
其中，高效液相色谱(HPLC)制备法是报道最多，也是最常用的方法，该技术主要存在以下几方面问题：
(1)分离步骤繁琐，分离效率不高
采用用葡聚糖凝胶层析，丙酮水溶液梯度洗脱可大致把酯型儿茶素和非酯型儿茶素分离开，而占主要含量的EGCG及ECG单体并未分离，需进半制备色谱仪器进一步纯化。对于与EGCG的同分异构体GCG目前报道也只有通过制备型HPLC分离。另外葡聚糖凝胶层析方法中所用洗脱剂也存在洗脱时间较长，产品易氧化等缺点。
(2)分离成本高
目前儿茶素单体分离纯化普遍采用的是制备型HPLC方法，即TP粗品经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱分离纯化出儿茶素混合物后，经过浓缩干燥，再经HPLC制备柱分离纯化得到儿茶素单体组分。由于制备型HPLC色谱柱价格昂贵，且极易污染而堵塞，寿命短，生产成本较高，且一次性上样量很小(每次进样量约1mL左右)，纯化周期长。
(3)有毒溶剂残留
目前国内外遍采用的半制备HPLC方法后期纯化溶剂较为复杂，多为三元混合溶剂，且含有甲醇、四氢呋喃等有毒溶剂，难以回收除尽，制约了产品的应用领域。
综上，对于儿茶素单体提取分离技术的高效集成化还有待进一步提高，即在儿茶素分离纯化工艺上尽量使过程高效化，用最简单的过程获得高纯度的产品，简化分离纯化操作步骤，以获得最大的经济效益。
发明内容
本发明旨在通过对现有儿茶素单体提取分离技术工艺的改进，提供一种分离纯化操作步骤简单、分离效率高、制备量大的儿茶素单体L-表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG和L-表儿茶素没食子酸酯ECG的的分离纯化方法。
实现上述发明目的的技术解决方案如下：
儿茶素单体的分离纯化方法，包括从茶末中提取含儿茶素的粗制茶多酚，其次从粗提物中纯化分离儿茶素组分；其特征在于：所述从粗提物中纯化分离儿茶素组分，是指纯化分离儿茶素L-表没食子儿茶素没食子酸酯和L-表儿茶素没食子酸酯组分，具体的工艺方法包括：柱层析预分离、柱层析纯化及分离纯化；
A、所述柱层析预分离工序为：以以葡聚糖凝胶Sephadex LH-20为柱填料，其柱高50cm，取粗制茶多酚5-6g，100％乙醇为洗脱剂，洗脱流速0.75mL/min，洗脱剂用量1500mL，柱层析时间30-38小时，收集液经检测后合并含L-表儿茶素没食子酸酯ECG儿茶素单体的洗脱液，浓缩后冷冻干燥得成品；合并含L-表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG(含有L-没食子儿茶素没食子酸酯GCG)儿茶素单体的洗脱液，45℃水浴中旋转蒸发浓缩至15-20mL，待纯化；
B、所述柱层析纯化工序为：再以葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱，柱高50cm，以40％乙醇水溶液为洗脱剂，洗脱流速0.60mL/min，洗脱用量1800mL，对浓缩后待纯化的含L-表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG(含有GCG)儿茶素单体的洗脱液进行柱层析，收集液经检测后合并L-表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG单体组分，浓缩冷冻干燥得成品。
本发明采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析，分别以100％乙醇和40％乙醇作为洗脱剂，进行预分离及纯化试验，可将粗制茶多酚中的主要酯型儿茶素(EGCG、GCG、ECG)实现连续高效的分离。该方法操作简便，成本低廉，溶剂无毒，单体提取率及产品纯度均较高，并可实现EGCG一次性克量级以上的制备，经济效益十分可观。
(1)儿茶素单体L-表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG和L-表儿茶素没食子酸酯ECG的预分离方法和技术效果：葡聚糖凝胶Sephadex LH-20为柱填料，以100％乙醇为洗脱剂工艺条件为：柱高50cm，洗脱流速0.75mL/min，可实现粗制茶多酚原料中主要酯型儿茶素(EGCG与ECG、GCG)的有效预分离。EGCG(含GCG)单体洗脱率为98.45％，纯度可达88.66％；ECG单体洗脱率为97.64％，纯度达97.62％，提取率85.67％；一次性上样量(TP)可达6g，洗脱剂用量1500mL。
(2)儿茶素单体L-表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG纯化方法和技术效果：分离得到的EGCG(GCG)馏分经适度浓缩至20mL，再经Sephadex LH-20柱层析分离纯化，具体工艺条件为：洗脱剂为40％乙醇，柱高50cm，洗脱流速0.60mL/min，洗脱剂用量1500mL，可制备高纯度EGCG单体，洗脱率可达98％以上，纯度达99.9％以上，提取率85.31％，且无色素残留。
本发明具有三方面的有益技术效果：
(1)预分离阶段采用100％乙醇做洗脱剂替代了目前常用的丙酮水溶液洗脱剂，具有以下优点：
a、一次性分离主要酯型儿茶素EGCG(含有GCG)与ECG，分离效果及分离效率均较高，且非酯型儿茶素、咖啡因以及茶色素可同时分离除去，解决了已报道得到茶多酚经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析后，一般只能将原料茶多酚中的儿茶素分为酯型和非酯型儿茶素两类，而EGCG与与ECG无法分离的问题，可大大降低后续纯化手续；
b、剂廉价无毒、洗脱时间短，降低了生产成本，一次洗脱周期只需30多小时，而丙酮水溶液做洗脱剂大致需要77小时；
c、脱效果好，色带均匀，不易拖尾和产生气泡；
d、溶剂回收方便，由于收集液均为儿茶素单体的无水乙醇液，采用旋转蒸发仪，回收十分快速方便，缩短了与后续纯化的连接过程，而丙酮水溶液洗脱液体由于含有水成分，收集液不易充分浓缩。
(2)EGCG柱层析纯化方法采用柱层析技术，大大简化了目前报道的半制备HPLC纯化工艺，只需经过常规的柱层析系统即可完成单体EGCG的分离提纯，提取率(24.56％)和色谱纯度(99％)均接近或高于目前国内外的报道，且EGCG一次纯化制备量可以达1克以上，远远超过了半置备HPLC的毫克级的制备量，这在很大程度上降低了生产成本，增加了产率；
(3)整个分离、纯化过程采用无水乙醇及40％乙醇水溶液，兼容性及连续性强，且极易回收，廉价无毒，避免了半制备HPLC纯化溶剂带来的安全问题。
附图说明
图1为本发明工艺路线图。
具体实施方式
下面结合附图，通过实施例对本发明作详细描述。
实施例：
参见图1，按照工艺路线操作如下，
(1)首先从茶叶末中提取含有儿茶素的茶多酚粗品(TP)；
(2)儿茶素单体L-表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG与L-表儿茶素没食子酸酯ECG预分离：
a、凝胶柱的预处理：称取70g葡聚糖凝胶Sephadex LH-20干凝胶，用洗脱剂无水乙醇300ml充分溶胀(可用沸水浴加热2小时溶胀缩短溶胀时间)；
b、装柱：将溶胀好的凝胶缓慢倒入层析柱，使其均匀沉降。待沉降到所需高度后50cm左右，继续用3-5倍柱床体积的无水乙醇淋洗以平衡柱子；
c、上样：称取5.8140克原料茶多酚溶于20ml无水乙醇中充分溶解，超声排气后，常温下(25℃)下用滴管缓慢将其加入柱内，待样品完全渗入凝胶后接上自动部分收集器开始收集，洗脱流速0.75ml/min，20min/管，12ml/管，共收集1500ml；
d、采用高效液相色谱法对收集液的成份和含量进行检测；
e、合并含ECG儿茶素单体的洗脱液，45℃水浴中旋转蒸发浓缩至15ml-20ml，低温冷冻干燥得成品0.3975g；
f、合并含EGCG(含有GCG)儿茶素单体的洗脱液，45℃水浴中旋转蒸发浓缩至20ml。
(3)儿茶素单体L-表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG纯化
a、凝胶柱的预处理：称取30g葡聚糖凝胶Sephadex LH-20干凝胶，用洗脱剂40％乙醇水溶液150ml充分溶胀(可用沸水浴加热2小时溶胀缩短溶胀时间)；
b、装柱：将溶胀好的凝胶缓慢倒入层析柱，使其均匀沉降。待沉降到所需高度后50cm左右，继续用3-5倍柱床体积的40％乙醇淋洗以平衡柱子；
c、上样：称取已浓缩后EGCG(含有GCG)儿茶素单体收集液20ml，超声排气后，常温下(25℃)下用滴管缓慢将其加入柱内，待样品完全渗入凝胶后接上自动部分收集器开始收集，洗脱流速0.60ml/min，20min/管，12ml/管，共收集1800ml；
d、采用高效液相色谱法对收集液的成分和含量进行检测，合并含EGCG儿茶素单体的洗脱液，45℃水浴中旋转蒸发浓缩至15ml-20ml，低温冷冻干燥得成品1.4280g。
Claims (1)
1、儿茶素单体的分离纯化方法，包括从茶末中提取含儿茶素的粗制茶多酚，其次从粗提物中纯化分离儿茶素组分；其特征在于：所述从粗提物中纯化分离儿茶素组分，是指纯化分离儿茶素L-表没食子儿茶素没食子酸酯和L-表儿茶素没食子酸酯组分，具体的工艺方法包括：柱层析预分离、柱层析纯化及分离纯化；
A、所述柱层析预分离工序为：以葡聚糖凝胶Sephadex LH-20为柱填料，其柱高50cm，取粗制茶多酚5-6g，100％乙醇为洗脱剂，洗脱流速0.75mL/min，洗脱剂用量1500mL，柱层析时间30-38小时，收集液经检测后合并含L-表儿茶素没食子酸酯ECG儿茶素单体的洗脱液，浓缩后冷冻干燥得成品；合并含L-表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG及L-没食子儿茶素没食子酸酯GCG的儿茶素单体的洗脱液，45℃水浴中旋转蒸发浓缩至15-20mL，待纯化；
B、所述柱层析纯化工序为：再以葡聚糖凝胶Sephadex LH-20为柱填料，柱高50cm，以40％乙醇水溶液为洗脱剂，洗脱流速0.60mL/min，洗脱用量1800mL，对浓缩后待纯化的含L-表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG及L-没食子儿茶素没食子酸酯GCG的儿茶素单体的洗脱液进行柱层析，收集液经检测后合并L-表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG单体组分，浓缩冷冻干燥得成品。
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