CN1402003A - 一种基于抗原抗体反应的新型试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
目前以抗－抗体反应为基础的试剂盒，其探针板上一个反应器中都只是或者固定抗原，或者固定抗体，其标记系统中只包含或者对目标抗体或者对目标杭原进行标记的标记物，试剂盒中的一套反应物不能用于对一个样品中的抗原和抗体同时进行测定。本发明的试剂盒其特征是：在其探针板上的同一个选择性反应器中，既固定有抗原又固定有抗体，其标记系统既能对探针捕捉的目标抗原又能对探针捕捉的目标抗体进行标记，只用一套反应物就可对同一样品中不同的抗原和抗体进行定性和定量检测，使检测所需的反应器数目下降，检测时间下降和检测可比性提高，具有检测经济、快速、高效的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于抗原抗体反应的试剂盒，特别是一种在一个反应器中既固定有抗原探针又有抗体探针，用以对同一样品中的目标抗体和目标抗原进行定性和/或定量检测的试剂盒。
本发明还涉及本发明试剂盒的生产方法及其应用。
背景技术
本发明中所谓的试剂盒，是指某些定性和/或定量检测中必不可少的一种耗材，被用以同目标物进行反应并将反应结果以可确定的方式表达出来，其核心部分是含有选择性反应器的探针板，重要部分是含有标记物的标记系统，此外还有辅助部分(例如缓冲液等)。本发明中所谓的选择性反应器，是指固定有探针的、可进行选择性反应及相关操作的固定场所，例如反应板、反应池等等。本发明中所谓的探针板，是指包含有一个或多个选择性反应器的、用于目标物定性和/或定量检测中的产品，例如96孔(反应池)ELISA板。本发明中所谓的标记系统，是指用于目标物定性和/或定量检测中的、可对探针固定的目标物进行标记的有关物质的总和，例如ELISA试剂盒中的酶标抗抗体和底物。目前，将抗原或抗体分别固定在固相载体上制成抗原探针板和抗体探针板，利用其特异选择反应以检测样品中相应的抗体或抗原，是一类广泛应用的定性或/和定量检测方法。在这类方法所用的试剂盒中，有代表性的两种是ELISA试剂盒和多肽芯片试剂盒。
现有ELISA试剂盒的基本特征是，其探针板是在孔内表面上以随机分布的方式固定有抗原或抗体的塑料或玻璃微孔板，其标记系统含有酶标记的抗原或抗体或抗抗体和底物，其应用在于检测样品中与固定化探针相应的抗体或抗原。根椐探针板上和标记系统中不同的抗原-抗体组合，ELISA方法可细分为间接法，双抗体夹心法和双抗原夹心法等。例如，对抗原包被板(探针板上固定的是特异抗原)，检测时样品中的目标抗体和探针抗原发生特异性结合，如果标记系统中的酶标物为酶标特异抗原则是双抗原夹心法，如果标记系统中的酶标物为酶标抗抗体则是间接法；如果探针板上固定的是特异抗体，检测时样品中的目标抗原和探针板上的抗体探针发生特异性反应，标记系统中的标记物为酶标特异抗体则是双抗体夹心法。不管那种方法，洗去未结合的酶标物后，加入标记系统中的底物溶液，显色检测0D值，即可对结合的目标抗体或者目标抗原进行定性或定量检测。
本发明中所谓的多肽芯片，相当于英语术语中的＂peptide arrays＂，＂peptide microarrays＂，＂peptide chips＂，＂protein arrays＂或＂proteinchips＂。现有的以抗原-抗体反应为基础的多肽芯片，即抗原芯片试剂盒和抗体芯片试剂盒，其基本特征是：1)，试剂盒探针板上的选择性反应器，是一种以非随机的方式，例如可寻址的方式，固定有m种抗原(m等于和大于1)或n种抗原(n等于和大于1)的固相载体，例如固定有m种抗原的抗原芯片，或固定有n种抗体的抗体芯片；2)，试剂盒标记系统为荧光物质或其它染色物质标记的抗原或抗体或抗抗体；3)，其应用在于检测样品中与固定化探针群相应的m种抗体或n种抗原。抗原-抗体芯片试剂盒具有广泛的应用前景，特别是在临床免疫学诊断上。然而，尽管研究开发工作已进行了十多年，此一产品还有若干关键问题尚待解决，故还未进入大规模应用阶段。目前，其基本方法可视为ELISA的发展，即将在固相载体上以随机分布的方式固定一种抗原或一种抗体，发展为在固相载体上以可寻址方式固定多种抗原或多种抗体。其选择性反应器中与标记系统中的抗原-抗体反应模式亦与ELISA方法中的反应模式相同，也只能是间接法、双抗体夹心法、双抗体夹心法等方法中之一种方法。
总而言之，目前上述试剂盒，其探针板上一个反应器中都只是或者固定抗原、或者固定抗体，其标记系统中包含的已标记物或是抗抗体、或是特异抗体、或是特异抗原，所以上述试剂盒中的一套反应物(一个反应器加标记系统和辅助部分中用于一个反应器的全部物质)不能用于对一个样品中的抗原和抗体同时进行测定。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种只用一套反应物就可对同一样品中不同的抗体和抗原进行定性和/或定量检测的试剂盒。本发明还涉及符合这一目的的试剂盒的制作方法及其应用。
本发明的目的是这样实现的：
一种基于抗原抗体反应的新型试剂盒，其基本特征在于：1)，其探针板上同一个反应器中既固定有抗原又固定有抗体；2)，其标记系统既能对探针捕捉的目标抗原又能对探针捕捉的目标抗体进行标记；3)，其应用为从同一样品中既对目标抗体又对目标抗原进行定性和/或定量测定。当待测样品被加到本发明试剂盒的探针板上的反应器内，探针抗原和探针抗体与样品中可能存在的相应的目标抗体和目标抗原发生特异反应。加入标记系统后，标记系统中已标记的特异性抗体和已标记的特异性抗原(或/和已标记的特异性抗抗体)将分别同目标抗原和目标抗体发生特异反应。洗去未结合的已标记抗体和抗原(和/或抗抗体)后，可对所有这些特异反应的结果进行测定。
本发明的试剂盒可以分为两类：抗原抗体包被ELISA试剂盒和抗原抗体芯片试剂盒。抗原抗体包被ELISA试剂盒的特征为，其探针板是在孔内表面以随机分布的方式固定有特异抗原和特异抗体探针的微孔板，其标记系统含有可分别同目标抗原和目标抗体进行特异反应的酶标物质以及底物，其应用为检测样品中有无目标抗原或目标抗体发生阳性反应和/或样品中全部目标抗原和目标抗体的阳性反应程度。抗原抗体芯片试剂盒的特征为，探针板上的一个反应器内以非随机的方式固定有探针抗原和探针抗体，标记系统中含有可分别同目标抗原和目标抗体进行特异反应的以荧光物质或其它染色物质标记的物质，其应用为同一检测中对同一样品中不同的目标抗原和目标抗体进行定性和/或定量的分析。
本发明试剂盒中述及的探针板，是将抗原和抗体固定在固相载体上制成的。本发明中的固相载体，是各种可用于制备ELISA试剂盒和多肽芯片试剂盒中选择性反应器的固相载体(例如微孔板，芯片基片等)。本发明中的探针板的材料，包括各种有机、无机，透明或不透明、吸水或不吸水、质硬或质软的材料，如玻璃、塑料、橡胶、金属、纤维材质的膜、片、板等其中的一种或几种的复合物。本发明中的探针板的形状，可以是各形平板、各形孔板，各形条状物等各种几何体。本发明中的探针板上，可以有一个或多个选择性反应器。每一个反应器内固定有检测特异反应所要求的抗原探针和抗体探针，它们可以以随机分布的的形式或非随机分布的方式固定在反应器内。本发明中的探针板上固定的特异抗体和抗原，既可以是天然物又可以是合成物，包括多肽和蛋白质等所有具备抗原或抗体特性的物质。在本发明试剂盒的生产中，特异抗原和特异抗体在探针板上的固定，既可以同时进行，也可以分前后进行。其点样方式可以手工进行，也可利用各种点样、印章和喷墨等印刷设备。
本发明试剂盒中的标记系统，含有分别能同特异抗原和特异抗体进行选择反应的标记物。这些标记物是已标记的、具有选择反应性的抗体、抗原和抗抗体。选择反应是指特异抗原和特异抗体之间的反应性，以及抗体与不同来源或制备的抗体发生反应或不发生反应的选择性。其标记原理可以利用所有能够用于E LISA试剂盒和多肽芯片试剂盒的标记原理，例如酶标、金标、金加银标、荧标等等。为了既能标记抗体又能标记抗原，本发明试剂盒中的标记系统包含有下列四种标记物配对中的一种：1)，已标记的针对目标抗原的特异抗体和针对目标抗体的特异抗原；2)，已标记的针对目标抗原的特异抗体和针对目标抗体的特异抗抗体；3)，已标记的针对目标抗原的特异抗体及针对目标抗体的特异抗原和特异抗抗体；4)，在上述三种基本配对基础上的各种衍生配对，例如，针对目标抗原的特异抗体、已标记的针对目标抗原特异抗体的抗抗体及已标记的针对目标抗体的特异抗抗体等。在生产中，本发明试剂盒中的标记系统中的各种配对标记物，如上述的标记特异抗体/标记特异抗原、标记特异抗体/标记特异抗抗体、标记特异抗体/标记特异抗原+标记特异抗抗体等，可以以混合物的形式也可以不以混合物的形式来进行生产。标记系统中用以制备标记物的，具有选择反应性的抗体、抗原和抗抗体，包括所有可以与各种抗原和抗体发生选择性反应的各种制备的抗体、抗原和抗抗体。例如人源或动物源的单克隆或多克隆的、单链或多链的及合成多肽的制备。标记系统中的示踪剂为能用于标记抗体、抗原和抗抗体而不影响其生物活性的物质，这些物质有各种荧光物质、放射性物质、金属化合物类着色剂、有机化合物着色剂、如荧光素、胶体金、硝酸银、卡马斯亮兰等。
本发明的试剂盒的优点是，可以利用同一反应器对样品中不同的抗体和抗原进行定性和/或定量的检测，从而使上述捡测所需的反应器数目下降，检测时间下降和检测可比性提高，本发明提供了一种经济、快速、高效的试剂盒。
具体实施方式例一，献血员快速筛选试剂盒的制备
本例中的试剂盒可用于献血员的快速筛选。试剂盒探针板的生产，是先将HBsAg免疫的兔抗HBsAg、HCV的融合抗原、HIV的融合抗原、梅毒融合抗原按最适浓度和比例混合，包被于96孔酶标板，再用牛血清白蛋白封闭，然后干燥而成。试剂盒的标记系统由标记物和底物(底物显色液A和B)组成，标记物使用有异于包被抗原抗体而又与包被抗原抗体配对的抗原和抗体：抗HBsAg、HCV的融合蛋白抗原、HIV1+2的融合蛋白抗原、梅毒抗原。这些用于标记系统的抗原和抗体，以已确定的浓度和比例分别或混合进行酶标记后备用。本例中试剂盒的辅助部分包括阴阳性对照、洗涤液、终止液等。由于对献血员的筛选有别于临床对病人的诊断，只要上述几种病毒指标有一项不合格即出现检测结果阳性，献血员不能献血。虽然本试剂盒不能用于HBV、HCV、HIV、梅毒等其中任一种病毒的检测，但由于用它能够对献血员进行经济、快速的筛查，在临床上仍是有利的。例二，输血芯片试剂盒的制备例
本例中试剂盒探针板的制备使用已活化的玻片作为载体，使用的探针有抗HBsAg、HCV抗原、HIV1+2抗原、梅毒抗原、HTLV1+2抗原，手工点样，每个抗原以已确定的最佳浓度点6个样点，每个样点直径为40um。点样完毕后，用牛血清白蛋白封闭空白的载体表面后干燥。本例中试剂盒的标记系统，使用与包被抗原抗体配对的、有异于原包被抗原抗体的抗原和抗体：抗HBsAg、HCV的融合蛋白抗原、HIV1+2的融合蛋白抗原、梅毒抗原、HTLV1+2抗原。这些抗原和抗体以已确定的最佳浓度和比例用罗丹明进行标记后备用，也可以分别将这些抗原和抗体以已确定的最佳浓度和比例用罗丹明进行标记，然后混合、部分混合或不混合备用。本例中试剂盒的其它辅助部分为阴阳性对照、洗涤液等。例三，献血员快速筛选试剂盒应用例
本例使用例一中制备的96孔板试剂盒，设3孔阴性对照，2孔阳性对照，1孔空白对照，8份已知检测样品(其抗原抗体反应阴阳性已由ELISA方法测定见表一)。试验时除空白外依不同的孔加入稀释液以及阴阳对照和被检测样品，反应完成后加入酶标记的配对抗原和抗体以及显色剂，终止液。然后使用酶标仪测定，其结果如下：
表一，献血员快速筛选结果
样品 HBsAg HCV HIV 梅毒 HTLV 本试剂盒
1 + - - - - 0.249
2 - + - - - 0.253
3 - - + - - 0.328
4 - - - + - 0.225
5 - - - - + 0.214
6 + + - - - 0.265
7 - - + + - 0.384
8 + - - - + 0.295
阴性对照(均值) 0.061
阳性对照(均值) 0.732
空白对照 0.005例四，输血芯片试剂盒的应用例
本试验使用例二中制备的芯片，设1块阴性对照板，1块阳性对照板，1块空白对照板，8块检测样品板。首先分别加入50ul 50倍稀释的人血清样品(8份)及阳性对照和空白对照，在37度反应半小时。然后，用缓冲液洗去未结合血清成分，再加入标记物。在37度反应半小时后，用缓冲液洗去未结合的标记物，再用无水乙醇洗涤后吹干。干燥的芯片用芯片扫描仪(GMS 418 ARRAY SCANNER)阅读、计算机软件处理，得到以下结果。
表二，病毒筛选结果
样品 ELISA方法 本试剂盒
HBsAg HCV HIV 梅毒 HTLV HBsAg HCV HIV 梅毒 HTLV
1 + - - - - 16249 15621 14736 17241 15649
2 - + - - - 17453 14589 15237 16984 16843
3 - - + - - 17681 15423 15647 17568 15679
4 - - - + - 19725 14976 15264 17235 16147
5 - - - - + 16394 15421 15671 17852 15943
6 + + - - - 19965 18637 17357 19383 19875
7 - - + + - 21324 19473 19324 19214 19678
8 + - - - + 22295 18639 18536 20452 20123
阴性对照 65 76 43 67 61
阳性对照 26334 22194 21867 24123 23176
空白对照 54 34 45 57 56
Claims (5)
1、基于抗原抗体反应的试剂盒，由探针板和标记系统为主要组成，其特征在于：在其探针板上的同一个选择性反应器中，既固定有抗原又固定有抗体；在其标记系统中含有能对探针捕捉的目标抗原和目标抗体进行标记的标记物。
2、按照权利要求1所述的新型试剂盒，其特征在于：组成检测试剂盒的探针板，是由各种有机、无机或复合材料的膜、片、板等其中一种或几种复合制成的形状为无凹凸结构的各种形状的孔或池形板，板面上有一个或多个选择性反应器，每个反应器内固定有检测特异反应所要求的、可以随机分布的形式或非随机分布的形式分布的用以捕捉目标抗原和目标抗体发生选择性特异反应的抗原探针和抗体探针。
3、按照权利要求1所述的新型试剂盒，其特征在于：组成检测试剂盒的标记系统，是含有分别能同特异抗原和特异抗体进行选择反应的标记物。这些标记物是已标记的、具有选择反应性的抗体、抗原和抗抗体。选择反应性是指特异抗原和特异抗体之间的反应性，以及抗体与不同来源或制备的抗抗体发生反应或不发生反应的选择性。本权利要求中的标记系统中包含有下列四种标记物配对中的一种：A、已标记的针对目标抗原的特异抗体和针对目标抗体的特异抗原；B、已标记的针对目标抗原的特异抗体和针对目标抗体的特异抗抗体；C、已标记的针对目标抗原的特异抗体及针对目标抗体的特异抗原和特异抗抗体；D、在上述三种基本配对基础上的各种衍生配对。
4、按照权利要求2所述的抗原抗体包被ELISA试剂盒，其特征在于：其探针板是在孔内表面以随机分布的方式固定有抗原和抗体探针的微孔板；其标记系统中含有能对探针捕捉的目标抗原和目标抗体进行标记的标记物。
5、按照权利要求2所述的抗原抗体芯片试剂盒，其特征在于：其探针板上选择性反应器中以非随机方式固定有m种抗原探针(m等于和大于1)和n种抗体探针(n等于和大于1)；其标记系统中含有能对探针捕捉的目标抗原和目标抗体进行标记的标记物。
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