CN1423660A - 抗体 - Google Patents

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Abstract

描述了应用能够识别疾病相关分子(DAM)的ScFv Ab(ScFv Ab)生产预防和/或治疗与DAM相关病症的药物。所述ScFv Ab具有治疗、诊断和预后应用。

Description

抗体
发明领域
本发明涉及抗体。
具体地说，本发明涉及识别疾病相关分子(DAM)的抗体。
更具体地讲，本发明涉及这些抗体在与DAM相关疾病的诊断和治疗中的体外和体内/离体应用。
发明背景
在某些疾病状态下，细胞代谢的紊乱可以影响一种或多种DAM的表达水平。在某些情况下，这种细胞紊乱可能导致所述DMA表达水平的改变。因此，在宿主生物中，每种致病因子或疾病状态都可能与一种在免疫识别和/或致病因子或疾病状态的消除和/或控制中可能是关键性的DAM相关。这样，所述DAM可能能够不仅用作疾病状态诊断的标记，而且能够用作所述疾病全貌(disease profile)准确的病期分类的标记，使得可以设计合适的疗法。
已经充分表征的DAM的一个具体实例包括肿瘤相关抗原(TAA)。已经在人类和动物肿瘤中鉴定出许多癌胚抗原或肿瘤相关抗原(TAA)，并对其进行了表征。
这些TAA包括癌胚抗原(CEA)、TAG72、c-erB2、(糖基化不足的)MUC-1和p53、上皮糖蛋白-2抗原(EGP-2；也称为EGP40、Ep-CAM、KSA、CO17-1A或GA733-2)和5T4抗原。一般而言，TAA是在胎儿发育期间表达而在成体细胞中被负调节的抗原，因而在成体内通常不存在或仅以非常低水平存在。然而，在肿瘤发生期间，已经观察到肿瘤细胞重新开始表达TAA。因而，认为恶性肿瘤细胞与其非恶性对应物的区别在于重新开始表达TAA。因此，已有建议将TAA(i)应用于肿瘤疾病的体外和/或体内/离体诊断，(ii)应用于癌的成象和/或免疫疗法，和(iii)用作肿瘤相关疾病进程的指标。
为了建立针对特定疾病的体液免疫应答和/或细胞免疫应答，宿主免疫系统必须与DAM接触。除识别外来抗原外，T细胞通常需要额外的刺激，以完全被激活。现在更加明显的是，原初T细胞被带有抗原的靶细胞的激活需要两种信号。一种信号是抗原特异性信号，通过T细胞受体来传递，而第二种信号是引起淋巴因子产生的不依赖抗原的信号或共同刺激信号。这些额外的信号通过T细胞上与专门的抗原呈递细胞(APC)(例如树突细胞和巨噬细胞)上存在、但在其它细胞上不存在的配体(例如B7和CD40)相互作用的其它受体(例如CD28和CD40L)来传递。这些共同刺激配体通常被称为共同刺激分子。
作为实例，B7家族(即B7.1、B7.2和可能的B7.3)代表最新发现的但却重要的一组共同刺激分子。B7.1和B7.2都是Ig基因超家族的成员。如果T淋巴细胞遇到单独的抗原而无B7的共同刺激，则它将反应为或者无反应性，或者细胞凋亡(程序性细胞死亡)。如果提供所述共同刺激信号，则它将反应为针对所述靶抗原的克隆扩充。认为无共同刺激时不发生针对给定抗原的免疫应答的显著放大(June等(Immunology Today 15：321-331，1994)；Chen等(Immunology Today14：483-486)；Townsend等(Science 259：368-370))。Freeman等(J.Immunol.143：2714-2722，1989)。Azuma等(Nature 366：76-79，1993)。因此，已经假定，刺激对免疫原性差的患病细胞的免疫识别的一种方法可能是增强抗原呈递和在所述DAM存在下共同刺激淋巴细胞。
作为实例，已经表明，例如癌症、已建立的肿瘤的疾病状态虽然事实上它们共同表达DAM，但它们的免疫原性差。已经表明，用或者单独或者与细胞因子结合的编码B7-1和B7-2的基因转染，在动物模型中增强了针对实验性肿瘤的免疫的产生(例如Leong等1997 Int.J.Cancer 71：476-482；Zitvogel等1996 Eur.J.Immunol.26：1335-1341；Cayeux等1997 J.Immunol.158：2834-2841)。然而，在将这些结果转译为对人类癌症的实际治疗时，有许多重大的问题需要解决。在这些研究中的一个主要问题一直是为达到功效需要将B7基因体内传递至大量的肿瘤细胞。第二个问题一直是将B7的表达选择性地靶向肿瘤细胞，以避免不当的针对其它细胞类型的免疫细胞的激活。在WO98/55607中论述了这些问题的某些解决方法，其中使用肿瘤相互作用蛋白(TIP)例如肿瘤结合蛋白(TBP)将共同刺激分子选择性地靶向肿瘤细胞。
已经用重组DNA技术来产生识别DAM的抗体(Hoogenboom等(1998 Immunotechnology 4：1-20；和Winter 1998 FEBS Lett 458：92-94)。最近，非常关注应用抗体基因文库来产生抗体，例如单链抗体(ScFv Ab)。众所周知，在某些情况下，不用完整抗体，而使用ScFv Ab有许多优点。所述片段的大小更小，使得可以快速清除，并且可能导致改进肿瘤与非肿瘤的比率。然而，许多研究不能产生高特异性的ScFvAb。此外，完整的IgG被认为是供治疗Mab用比ScFv Ab更好的形式，因为认为它们的血清半寿期延长(参见Vaughan等1998，Nature Biotech16：535-539)。
本发明力图提供针对DAM产生的、可用于治疗与DAM相关疾病状态的ScFv Ab。
本发明的概述方面
本发明提供一种能够识别一种DAM并且在与DAM相关疾病中具有治疗效应的ScFv Ab(ScFv Ab)。这种ScFv Ab可以作为肽(合成或基因表达的)或作为“裸DNA”(例如在质粒中)直接给予，或者可以通过传递载体例如包含编码所述ScFv Ab的核苷酸序列的病毒载体给予。对于某些病例而言，这种ScFv Ab可能比与分泌型共同刺激分子(SCM)例如B7或IgG融合的ScFv Ab的功效更强。在例如癌的疾病的治疗方面，使用ScFv Ab作为治疗剂并不是一种显而易见的选择，尤其是因为人们可能预计包含与ScFv融合的SCM的融合蛋白的表现可能比单独的ScFv要好。
本发明由于以下原因是有利的：
(i)它提供了一种能够识别DAM的ScFv Ab。对于某些病例而言，其治疗效应比与SCM例如B7或免疫球蛋白例如IgG融合的ScFvAb的治疗效应更强。
(ii)它提供了可应用于以下方面的高亲和性ScFv Ab：
(a)体外和体内/离体诊断和治疗；
(b)表达DAM的细胞的成象和治疗；
(c)当将所述ScFv Ab单独使用或与合适的诊断上和/或治疗上有用的因子联合使用时，预防和/或治疗不同的人类疾病例如癌；
(d)有关与分离和/或纯化与所述ScFv Ab特异性结合的DAM的研究；和
(e)提供用于进一步合理治疗性ScFv Ab设计的构件和筛选能够与靶DAM结合的ScFv Ab和/或筛选能够与靶ScFv Ab结合的DAM。本发明的详述方面
在所附的权利要求书和以下描述及附图中，介绍了本发明的其它方面。这些方面在独立小节标题下介绍。然而，应该理解，每一小节下的内容不一定限于该特定的小节标题。ScFv抗体
一方面，本发明提供识别DAM的重组ScFv Ab。
本文所用的术语“ScFv Ab”是指能够识别DAM抗原、具有一个轻链可变区(vL)和一个重链可变区(VH)的抗体。所述VH配偶体区和VL配偶体区通常通过柔性寡肽/肽接头连接/结合。所述VH配偶体区和VL配偶体区可以以VH后接VL或VL后接VH的顺序连接。通常，所述序列可以通过一个接头序列，以VH-接头-VL或VL-接头-VH的顺序连接。本文所用的该术语包括蛋白酶解的或重组制备的ScFv Ab分子的多个部分的片段，该片段能够选择性地与DAM反应或识别DAM。这类蛋白酶解和/或重组片段的非限制性实例包括嵌合ScFv抗体，所述嵌合ScFv抗体对于本发明而言可以是指具有由得自除人类免疫球蛋白基因以外的哺乳动物免疫球蛋白基因的核苷酸序列编码的重链和轻链可变区(VH和VL)中任一个或两者的ScFv Ab以及具有由得自人类免疫球蛋白基因的核苷酸序列编码的重链和轻链之一或两者的ScFv Ab。所述ScFv Ab可以与另一个实体(例如另一ScFv Ab)共价或非共价连接，形成具有两个或多个结合部位的抗体。例如，一个ScFvAb可以与DAM例如5T4结合，而第二个ScFv Ab可以与免疫增强分子结合。
按照本发明，提及的术语“ScFv Ab”包括但不限于提及所述肽本身以及作为融合蛋白一部分的所述肽以及编码所述肽的核苷酸序列和/或编码所述融合蛋白的核苷酸序列。所述肽本身和/或融合蛋白可以是合成肽。或者，所述肽和/或融合蛋白可以是基因表达/重组肽/融合蛋白。对于某些应用而言，术语“ScFv Ab”是指肽本身。术语“ScFv Ab”也包括具有分泌前导(L)序列的ScFv Ab，在本文中，这种ScFv Ab被称为LScFv。
本文所用的术语“可变区”是指轻链(VL)和轻链(VH)的可变区，含有结合识别特异性以所述ScFv Ab对DAM的总体亲和性的决定簇。每对轻链(VL)和重链(VH)的可变区参与抗原识别并形成抗原结合部位。轻链和重链的所述区具有相同的总体结构，每个区具有由三个互补性决定区(CDR)连接的四个构架(FR)区，构架区的序列相对保守。FR区维持可变区的结构完整性。CDR是可变区中介导抗原(例如DAM)结合的多肽区段。
最好是，本发明ScFv Ab对5T4抗原的亲和性(KD)为约5×10-10至约10×10-10。
最好是，本发明ScFv Ab对5T4抗原的亲和性(KD)为约6×10-10至约9×10-10。
最好是，本发明ScFv Ab对5T4抗原的亲和性(KD)为约7×10-10至约8×10-10。
最好是，本发明ScFv Ab对于5T4抗原的亲和性(KD)为约7.9×10-10。所述ScFv Ab的KD用BIAevaluation软件(Pharmacia)测定。
本文所用的术语“解离速率”是指ScFv Ab与抗原解离的速率(Koff)。在本发明的正文中，它用BIAevaluation软件(Pharmacia)测定。由于解离速率反映Fab片段对抗原(例如DAM)的亲和性，因而理想的是解离速率低。
本文所用的术语“亲和性”根据ScFv Ab与DAM抗原的解离速率(Koff)来定义。解离速率越低，则ScFv Ab对抗原(例如DAM)的亲和性越高。DAM
本文所用的术语“DAM”可以包括但不限于生物反应调节物，包括但不限于免疫调节剂、细胞因子、生长因子、细胞表面受体、激素、循环分子、炎性细胞因子和致病因子(例如病毒、细菌、寄生虫或酵母)。这些生物反应调节物的实例包括但不限于ApoE、Apo-SAA、BDNF、心脏营养蛋白(Cardiotrophin)-1、EGF、ENA-78、Eotaxin、Eotaxin-2、Exodus-2、酸性FGF(FGF-acidic)、碱性FGF、成纤维细胞生长因子-10(Marshall 1998 Nature Biotechnology 16：129)、FLT3配体(Kimura等(1997)Fractalkine(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、胰岛素、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72a.a.)、IL-8(77a.a)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素α、抑制素β、IP-10、角质形成细胞生长因子-2(KGF-2)、KGF、Leptin、LIF、 Lymphotactin、缪氏抑制物质、单核细胞集落抑制因子、单核细胞引诱蛋白(Marshall1998出处同上)、M-CSF、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髓祖细胞抑制因子-1(MPIF-1)、NAP-2、Neurturin、神经生长因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制癌蛋白M、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、干细胞生长因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNIL-1、TPO、VEGF、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β和GRO-γ。
致病因子的实例可以包括但不限于病毒、细菌以及寄生虫和酵母。作为实例，致病病毒包括但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒、马脑炎病毒、肝炎病毒、猫白血病病毒、犬瘟热病毒和狂犬病病毒、流感病毒、痘病毒、禽痘病毒(FPV)、金丝雀痘病毒、昆虫痘病毒、缺乏DNA复制酶的痘苗病毒、甲病毒属、腺病毒、疱疹病毒、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)。致病细菌的实例可以包括但不限于衣原体属(Chlamydia)、分枝杆菌属(Mycobacteria)、恶性疟原虫（Plasmodium Falciparum)、军团菌属(Legioniella)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrheae)、白喉棒杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfrngens)、大肠杆菌(Escherichia coli)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和鼠伤寒沙门氏菌。致病寄生虫的实例包括但不限于锥虫属(Trypanosoma)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、利什曼原虫属(Leishmania)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、热带利什曼原虫(L.tropica)、墨西哥利什曼原虫(L.mexicana)、巴西利什曼原虫(L.Braziliensis)、贾第鞭毛虫属(Giardia)、兰氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)、毛滴虫属(Trichomonas)、内阿米巴属(Entamoeba)、耐格里原虫属(Naegleria)、棘阿米巴属(Acanthamoeba)、Acanthamoeba castellanii、A.culbertsoni和其它物种疟原虫属、弓形虫属(Toxoplasma)、鼠弓形虫(Toxoplasma gondii)、隐孢子虫属(Crytosporidium)、微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、等孢子球虫属(Isospora)、贝氏等孢子球虫(Isospora belli)、耐格里原虫属、福氏耐格里原虫(Naegleria fowleri)、小袋纤毛虫属(Balantidiurn)、结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、巴贝虫属(Babesia)、血吸虫属(Schistosoma)、Toxiplasma和犬弓蛔虫(Toxocara canis)。致病酵母的实例包括曲霉属(Aspergillus)和侵袭性念珠菌属(Candida)。在一个优选实施方案中，所述致病微生物是胞内生物。
所述DAM最好是胞内致病因子。
所述DAM最好是疾病相关细胞表面分子(DACSM)。
按照本发明，所述DACSM可以包括但不限于粘着蛋白的受体，例如生长因子受体。生长因子受体的实例包括但不限于ApoE、Apo-SAA、BDNF、心脏营养蛋白-1、EGF、ENA-78、Eotaxin、Eotaxin-2、Exodus-2、酸性FGF、碱性FGF、成纤维细胞生长因子-10(Marshall 1998Nature Biotechnology 16：129)、FLT3配体(Kimura等(1997)Fractalkine(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、胰岛素、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72a.a.)、IL-8(77a.a)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素α、抑制素β、IP-10、角质形成细胞生长因子-2(KGF-2)、KGF、Leptin、LIF、Lymphotactin、缪氏抑制物质、单核细胞集落抑制因子、单核细胞引诱蛋白(Marshall 1998出处同上)、M-CSF、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髓祖细胞抑制因子-1(MPIF-1)、NAP-2、Neurturin、神经生长因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制癌蛋白M、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、干细胞生长因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNIL-1、TPO、VEGF、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-λ、HCC1、1-309。生长因子受体的非竭尽一览表可以在Molecular Biology and Biotechnology(RA Meyers编著1995 VCH Publishers Inc)的第392-297页上找到；纤溶酶原激活物；金属蛋白酶(例如胶原蛋白酶)、粘蛋白；糖蛋白；其组织分布有限的抗原；和/或在肿瘤细胞生长、迁移或转移中起作用的细胞表面分子(例如5T4抗原、肿瘤特异性糖部分或癌胚抗原)。术语DACSM也可以包括抗原决定簇。抗原决定簇
本文所用的术语“抗原决定簇”是指与疾病或障碍相关的任何抗原。作为实例，所述抗原决定簇也可以来源于与在生物中无限制增殖并因此可能导致病理性生长的患病细胞(例如肿瘤细胞)相关的致病因子。在Davis，B.D.等(Microbiology，第3版，Harper International Edition)中描述了这类致病因子的实例。所述抗原决定簇可以是抗原和/或抗原上的优势免疫表位。作为实例，所述抗原决定簇可以包括可作为宿主免疫系统的靶并且诱发导致肿瘤破坏的应答的肿瘤相关抗原(TAA)。TAA
术语“肿瘤相关抗原(TAA)”在本文用来指任何TAA或其抗原性肽。所述抗原是由肿瘤自身或与肿瘤相关的细胞(例如实质细胞或相关血管系统的细胞)表达的抗原。术语“肿瘤相关抗原(TAA)”包括使所述肿瘤细胞区别于其正常细胞对应物、在其中可能以微量存在的抗原。
TAA的实例包括但不限于MART-1(T细胞所识别的黑素瘤抗原-1)、MAGE-1、MAGE-3、5T4、gp100、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSS)、粘蛋白(MUC-1)、酪氨酸酶。特别优选的TAA是细胞表面分子，因为它们定位以供免疫系统的组分识别，并且是治疗(例如治疗和/或免疫疗法)极好的靶。本发明决不限于编码以上所列TAA的抗原决定簇。通过本领域已知的方法，例如在美国专利第4,514,506号中公开的方法，可以鉴定、分离和克隆其它TAA。5T4 TAA
TAA 5T4(参见WO89/07947)已经被广泛地表征。它是一种在癌中广泛表达、但在正常成体组织中表达模式高度有限的72kDa糖蛋白。它看来在结肠直肠癌和胃癌中与转移密切相关。人5T4的完整核酸序列是已知的(Myers等，1994 J Biol Chem 169：9319-24)。共同刺激分子
为了对DAM应答，淋巴细胞需要至少两种不同的信号来激活其效应子功能(Bretscher和Cohn 1970 Science 169：1042-1049；Crabtree1989 Science 243：355-361)。初级信号对于抗原是特异性的。在分离中对初级信号的刺激通常导致所述淋巴细胞的细胞凋亡(程序性细胞死亡)，或导致建立持续无应答性或无反应性状态(Weiss等，参见上文)。为了达到对淋巴细胞的激活，需要辅助信号，辅助信号可能通过细胞因子或抗原呈递细胞(APC)上存在的细胞表面共同刺激配体来传递。
现在已鉴定出许多这类共同刺激分子，包括粘着分子、LFA-3、ICAM-1、ICAM-2。APC上存在的主要共同刺激分子是B7家族成员，包括B7-1(CD80)、B7-2(CD86)和B7-3。这些分子是淋巴细胞上共同刺激受体包括CD28(WO92/00092)的配体，CD28也许是静息T细胞最为重要的共同刺激受体。糖蛋白B7家族的不同成员可能精细地将不同信号传递至T细胞(Nunes等1996 J.Biol.Chem.271：1591-1598)。
在本发明的一个实施方案中，使用一种ScFv Ab，所述ScFv Ab包含一个对DAM(例如肿瘤抗原)具有结合亲和性的分泌型共同刺激分子(“SCM”)。ScFv Ab的来源
本发明的ScFv Ab可由任何合适的来源(无论是天然的还是非天然的)获得或产生，或者它可以是合成ScFv Ab、半合成ScFv Ab、模拟物、衍生化ScFv Ab、重组ScFv Ab、发酵优化的ScFv Ab、融合蛋白或等同物、突变体和其衍生物，只要它保留本发明ScFv Ab的所需DNA结合特异性即可。这些包括具有DAM结合特异性的ScFv Ab，所述ScFv Ab可以具有氨基酸取代，或者可以具有与氨基酸官能团连接的糖或其它分子。
术语“模拟物”涉及具有与本发明的ScFv Ab相同的结合特异性的任何化学制剂，它可以是肽、多肽、抗体或其它有机化学物质。
本文所用的术语“衍生物”或“衍生化的”包括对ScFv Ab的化学修饰。作为这类修饰的例证可以是氢被烷基、酰基或氨基取代。最好是，所述ScFv Ab包括已经通过重组DNA技术制备或通过化学合成技术产生或其组合而制备或产生的ScFv Ab的至少一个部分。
所述ScFv Ab最好利用化学合成技术来制备。化学合成方法
采用化学方法来完全或部分合成所述ScFv Ab的氨基酸序列，可以产生本发明的ScFv Ab或其变异体、同源物、衍生物、片段或模拟物。例如，可以通过固相技术合成肽，将其从树脂上切下，并通过制备性高效液相色谱纯化(例如Creighton(1983)Proteins Structures AndMolecular Principles，WH Freeman and Co.，New York NY)。所述合成肽的组成可以通过氨基酸分析或测序加以证实(例如Edman降解法；Creighton，参见上文)。
采用各种固相技术，进行所述ScFv Ab或其变异体、同源物、衍生物、片段或模拟物的直接合成(Poberge JY等(1995)Science 269：202-204)，可以例如采用ABI 43 1A肽合成仪(Perkin Elmer)，按照生产商提供的说明，完成自动合成。另外，可以在直接合成期间对可得自所述ScFv Ab或其任何部分的氨基酸序列加以改变和/或采用化学方法将其与得自其它亚基的序列或其任何部分组合，产生变异型ScFvAb。
在本发明的一个替代实施方案中，采用本领域众所周知的化学方法，可以完全或部分合成所述ScFv Ab或其变异体、同源物、衍生物、片段或模拟物的编码序列(参见Caruthers MH等(1980)Nuc.Acids ResSymp Ser 215-23，Horn T等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。
本发明的ScFv Ab最好包含SEQ ID No 1中所示的氨基酸序列(参见图1)。
本发明的ScFvAb最好包含SEQ ID No 3中所示的氨基酸序列(参见图2)。
本发明的ScFvAb最好包含SEQ ID No 4中所示的氨基酸序列(参见图6)。氨基酸序列
本文所用的术语“氨基酸序列”是指肽序列、多肽序列、蛋白质序列或其部分。
所述ScFv Ab最好是分离的ScFv Ab和/或纯化的和/或非天然的ScFv Ab。
本发明的ScFv Ab可以是基本上分离的形式。人们会理解，所述蛋白质可以与不干扰所述ScFv Ab计划目的的载体或稀释剂混合，并且仍被认为是基本上分离的。本发明的ScFv Ab也可以是基本上纯化的形式，在这种情况下，它一般在制剂中包含所述ScFv Ab，其中在所述制剂中超过90％(例如95％、98％或99％)的所述ScFv Ab是包含SEQ ID No 1或SEQ ID No 3或SEQ ID No 4的肽、或其变异体、同源物、衍生物或片段。氨基酸序列的变异体/同源物/衍生物
本发明的优选氨基酸序列示于SEQ ID No 1或SEQ ID No 3或SEQ ID No 4中，它们是可得自本发明ScFv Ab的序列，但也包括得自任何来源的同源序列，例如相关的病毒/细菌蛋白、细胞同源物和合成肽以及其变异体或衍生物。
本发明也首次提供完整的犬5T4氨基酸序列和核酸序列(图26和SEQ ID No 14和15)。因此，本发明也提供：
i)一种犬5T4多肽或其变异体、同源物、片段或衍生物，所述多肽具有SEQ ID No 14中所示的氨基酸序列；和
ii)能够编码这种犬5T4多肽的核苷酸序列或其变异体、同源物、片段或衍生物，所述核苷酸序列最好具有SEQ ID No 15所示的序列。
因此，本发明包括本文介绍的氨基酸序列的变异体、同源物或衍生物、以及编码这些氨基酸序列的核苷酸序列的变异体、同源物或衍生物。
在本发明的正文中，用同源序列来包括在氨基酸水平上在至少例如本文序列表中SEQ ID No 1或SEQ ID No 3或SEQ ID No 4或SEQID No 14所示的氨基酸序列范围内有至少75％、85％或90％相同、优选至少95％或98％相同的氨基酸序列。具体地说，同源性应该通常根据所述序列中已知对于结合特异性而言必需的区(例如各位置的氨基酸)来考虑，而不是根据非必需的相邻序列来考虑。虽然同源性也可以根据相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)来考虑，但在本发明的正文中，最好是根据序列同一性来表示同源性。
同源性比较可以借助眼睛来进行，或更通常借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些市售的计算机程序可以计算出两个或更多个序列之间的同源性百分率。
同源性百分率可以在连续序列范围内进行计算，即将一个序列与另一序列对齐，并且将一个序列中的每个氨基酸直接与另一序列中的相应氨基酸进行比较，每次比较一个残基。这称为“没有空位的(ungapped)”比对。通常，这种没有空位的比对仅在相对短数目的残基范围内进行。
虽然这是一种非常简单而一致的方法，但它不能考虑例如在其它情况下相同的一对序列中，一个插入或缺失将引起随后的氨基酸残基不能对齐，从而当进行全序列比对时，潜在地导致同源性百分率大大降低。因此，大多数的序列比较方法设计产生最佳比对，最佳比对考虑到可能的插入和缺失，而对整体同源性分值不会处以过高的罚分。通过在序列比对中插入“空位”以尝试使局部同源性最大化，来达到这一点。
然而，这些更为复杂的方法为在序列比对中发生的每个空位指定“空位处罚”，使得对于相同数目的相同氨基酸而言，具有尽可能少的空位、反映出两个比较序列之间较高相关性的序列比对将获得比具有许多空位的序列比对有更高的分值。“Affine空位罚分”通常用来对存在一个空位处以相对高的罚分，而对该空位的每个后续残基的罚分较低。这是最常用的空位打分系统。不用说，高空位处罚会产生具有较少空位的最佳序列比对。大多数的序列比对程序允许对空位处罚进行修改。然而，当使用这类软件进行序列比较时，最好使用默认值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit软件包(参见下文)时，氨基酸序列的默认空位处罚为：一个空位为-12，而每个空位延伸为-4。
因此，最大同源性百分率的计算首先需要考虑空位处罚，产生最佳比对。用于进行这种序列比对的合适计算机程序是GCG WisconsinBestfit软件包(University of Wisconsin，U.S.A.；Devereux等，1984，Nucleic Acids Research 12∶387)。可以进行序列比较的其它软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel等，1999，出处同上-第18章)、FASTA(Atschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和GENEWORKS比较工具程序组。BLAST和FASTA都可用于脱机和在线搜索(参见Ausubel等，1999，出处同上，第7-58页至第7-60页)。然而，最好是使用GCG Bestfit程序。一种称为BLAST 2 Sequences的新工具可用来比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)：187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。
虽然可以根据同一性测量最终的同源性百分率，但序列比对过程本身通常不基于全或无成对比较。而是，通常用绘制的相似性分值矩阵，该分值矩阵根据化学相似性或进化距离，为每个成对比较指定分值。常用的这种矩阵的一个实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序组的默认矩阵。GCG Wisconsin程序一般或者使用公共默认值，或者使用用户符号比较表(如果供应的话)(有关进一步的细节，参见用户手册)。最好使用GCG软件包的公共默认值，或在其它软件的情况下，使用默认矩阵，例如BLOSUM62。
一旦软件产生了最佳比对，则有可能计算出同源性百分率，最好是序列同一性百分率。软件通常将此作为序列比较的一部分来进行，并且产生数字结果。
与本发明氢基酸序列相关的术语“变异体”或“衍生物”包括所述序列中的一个(或多个)氨基酸的任何取代、变异、修饰、取代、缺失或添加，条件是所得氨基酸序列具有结合特异性，最好具有与本文序列表的SEQ ID No 1或SEQ ID No 3或SEQ ID No 4或SEQ ID No 14中所示氨基酸序列至少相同的结合特异性。
可以对本文序列表的SEQ ID No 1或SEQ ID No 3或SEQ ID No 4或SEQ ID No 14进行修饰，以用于本发明。通常，进行维持所述序列的结合特异性的修饰。可以进行例如1个、2个或3个至10个或20个取代的氨基酸取代，条件是所述经修饰的序列保留所需的结合特异性。氨基酸取代可以包括利用非天然存在的类似物。
本发明的ScFv Ab也可以具有产生沉默改变并且产生功能等同的ScFv Ab的氨基酸残基的缺失、添加或取代。可以根据所述残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质方面的相似性，进行有意的氨基酸取代，只要保留所述ScFv Ab的结合特异性即可。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；而其不带电极性头基团具有相似亲水性值的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。这些也适用于犬5T4序列。
可以例如按照下表，进行保守取代。第二栏同一框中的氨基酸、最好是第三栏同一行中的氨基酸可以相互取代：
脂族 非极性 GAP
ILV
极性-不带电 CSTM
NQ
极性-带电 DE
KR
芳族 HFWY
最好是，利用重组技术制备所述分离的ScFv Ab和/或纯化的ScFvAb和/或非天然ScFv Ab和/或5T4序列。
关于犬5T4序列的片段，所述片段最好包含SEQ ID No 14中所示氨基酸1-182和/或297-420中的至少一个、优选其中某些、最优选全部。核苷酸序列
技术人员会理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的核苷酸序列可以编码本发明的同一ScFv Ab。另外，人们会理解，技术人员可以利用常规技术，制备不影响由本发明核苷酸序列编码的ScFv Ab的核苷酸取代，以反映出待表达本发明ScFv Ab的任何特定宿主生物的密码子选择。
与本发明的SEQ ID No 5(参见图1)或SEQ ID No 7(参见图2)或SEQ ID No 8(参见图6)中所示核苷酸序列有关的术语“变异体”、“同源物”或“衍生物”，包括所述序列中一个(或多个)核酸的任何取代、变异、修饰、取代、缺失或添加，条件是所得核苷酸序列编码具有结合特异性的ScFv Ab，最好是具有与本发明序列表的SEQ ID No 5或SEQ ID No 7或SEQ ID No 8中所示核苷酸序列至少相同的结合特异性的ScFv Ab。
与本发明的SEQ ID No 15(参见图26)中所示核苷酸序列有关的术语“变异体”、“同源物”或“衍生物”，包括所述序列中一个(或多个)核酸的任何取代、变异、修饰、取代、缺失或添加，条件是所得核苷酸序列编码犬5T4多肽、最好是本发明序列表的SEQ ID No 14中所示多肽。
如上所述，就序列同源性而言，优选与本文序列表中所示序列具有至少75％同源性，更优选具有至少85％同源性，更优选具有至少90％同源性。更优选具有至少95％同源性，更优选具有至少98％同源性。核苷酸同源性比较可以如上所述进行。一种优选的序列比较程序是以上所述的GCG Wisconsin Bestfit程序。默认打分矩阵对于每个相同核苷酸的匹配值为10，而每个错配为-9。对于每个核苷酸而言，默认空位产生罚分为-50，而默认空位延伸罚分为-3。
本发明也包括能够选择性地与本文所述序列的任何变异体、片段或衍生物杂交的核苷酸序列或与任何上述序列互补的序列。核苷酸序列最好长至少15个核苷酸，更优选长至少20个、30个、40个或50个核苷酸。
就犬5T4序列的片段而言，所述片段优选包含SEQ ID No 15中所示核酸1-546和/或890-1263中的至少一个、优选某些、最优选全部。杂交
本文所用的术语“杂交”将包括“一条核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程”以及在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行的扩增过程。
本发明的能够选择性地与本文所述核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列，在至少20个、优选至少25个或30个、例如至少40个、60个或100个或更多个连续核苷酸的区内与本文所述相应的核苷酸序列的同源性一般至少为75％、优选至少为85％或90％，更优选至少为95％或98％。优选的本发明核苷酸序列将包含与本发明序列表的SEQ ID No 5或SEQ ID No 7或SEQ ID No 8或SEQ ID No 15中所示核苷酸序列同源的区域，所述同源区域与本发明序列表的SEQ ID No 5或SEQ ID No 7或SEQ ID No 8中所示核苷酸序列的同源性优选至少为80％或90％，更优选至少为95％。
术语“选择性地杂交”是指用作探针的核苷酸序列在发现本发明的靶核苷酸序列可与所述探针以显著高于本底的水平杂交的条件下使用。本底杂交的发生可能是由于在例如待筛选的cDNA文库或基因组DNA文库中存在的其它核苷酸序列所致。在这一事件中，本底意味着通过所述探针和所述文库的非特异性DNA成员之间的相互作用而产生的信号水平，其强度是用靶DNA观测到的特异性相互作用的强度的10分之一，最好是100分之一。相互作用的强度可以例如通过用32P对所述探针进行放射性标记来测量。
杂交条件基于所述核酸结合复合物的解链温度(Tm)，如Berger和Kimmel(1987，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods inEnzymology，第152卷，Academic Press，San Diego CA)中所述，并且提供在下文解释的限定的“严格性”。
最高严格性通常发生在约Tm-5℃(比所述探针Tm低5℃)；高严格性发生在低于Tm约5℃至10℃；中等严格性发生在低于Tm约10℃至20℃；而低严格性发生在低于Tm约20℃至25℃。正如本领域技术人员会理解的，可以用最高严格性杂交来鉴定或检测相同的核苷酸序列，而可以用中等(或低)严格性杂交来鉴定或检测相似或相关的多核苷酸序列。
在一个优选方面，本发明包括可以在严格条件下(例如65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠pH7.0})与本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。当本发明的核苷酸序列是双链时，则本发明包括或者单独或者组合的所述双链体的两条链。当所述核苷酸序列是单链时，人们会理解，该核苷酸序列的互补序列也包括在本发明的范围内。
可以以多种方式，获得与本发明序列并非100％同源、但属于本发明范围内的核苷酸序列。本文所述序列的其它变异体可以例如通过探测由各种各样来源制备的DNA文库来获得。另外，可以获得其它病毒/细菌或细胞同源物、特别是在哺乳动物细胞(例如大鼠、小鼠、牛和灵长类细胞)中发现的细胞同源物，这类同源物及其片段一般将能够与本文序列表中所示序列选择性地杂交。通过探测由其它动物物种制备的cDNA文库或基因组文库，以及在中等严格性至高严格性条件下用包含本发明序列表的SEQ ID No 5或SEQ ID No 7或SEQ ID No 8或SEQ ID No 15中所示核苷酸序列的全部或其部分的探针来探测这类文库，可以获得这类序列。相似的考虑适用于获得本发明氨基酸序列和/或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变异体。
也可以利用简并PCR获得变异体和株系/物种同源物，简并PCR所利用的引物设计用以靶向所述变异体和同源物内编码本发明序列中保守氨基酸序列的序列。通过对来自几种变异体/同源物的氨基酸序列进行序列比对，可以预测保守序列。序列比对可以用本领域已知的计算机软件来进行。例如，广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。用于简并PCR的引物将含有一个或多个简并位置，并且将在低于用针对已知序列的单一序列引物克隆序列所用的严格性条件下使用。
或者，通过对已表征序列例如本发明序列表的SEQ ID No 5或SEQ ID No 7或SEQ ID No 8或SEQ ID No 15中所示核苷酸序列进行定点诱变，可以获得这类核苷酸序列。这在例如需要对序列进行沉默密码子改变以对于表达所述核苷酸序列的特定宿主细胞优化密码子偏好时可能是有用的。为了导入限制性酶识别位点，或为了改变由所述核苷酸序列编码的ScFv Ab的结合特异性，可能需要其它的序列改变。
可以利用本发明的核苷酸序列产生引物(例如PCR引物、用于可变扩增反应的引物)、探针(例如采用放射性或非放射性标记通过常规方法用揭示性标记来标记的探针)，或可以将所述核苷酸序列克隆到载体中。这类引物、探针和其它片段的长度至少为15个核苷酸，优选至少20个核苷酸，例如至少25个、30个或40个核苷酸，本文所用的术语本发明的核苷酸序列也包括这些引物、探针和其它片段。
按照本发明的核苷酸序列(例如DNA多核苷酸和探针)可以重组产生、合成产生，或通过本领域技术人员可利用的任何方法来产生。也可以通过标准技术将其克隆。
一般而言，通过合成方法产生引物，包括分步制备所需的核酸序列，每次一个核苷酸。采用自动化技术完成这一步的技术是本领域容易获得的。
较长的核苷酸序列一般采用重组方法产生，例如采用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术。这将包括制备邻接需要克隆的打靶序列中一个区的一对引物(例如约15-30个核苷酸)，使所述引物与得自动物细胞或人类细胞的mRNA或cDNA接触，在引起扩增所需区的条件下进行聚合酶链式反应(PCR)，分离所扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)，并且回收所扩增的DNA。可以设计所述引物，以使其含有合适的限制性酶识别位点，使得可以将所扩增的DNA克隆到合适的克隆载体中。
由于遗传密码固有的简并性，可以运用编码基本相同或功能上等同的氨基酸序列的其它DNA序列，来克隆和表达所述ScFv Ab。正如本领域技术人员会理解的，可能最好产生具有非天然存在的密码子的编码所述ScFv Ab的核苷酸序列。可以选择特定原核宿主或真核宿主优选的密码子(Murray E等(1989)Nuc Acids Res 17：477-508)，例如以增加所述ScFv Ab的表达速率，或产生具有所需特性的重组RNA转录物，所述所需特性例如为半寿期比由天然存在的序列产生的转录物的半寿期长。
在本发明的一个实施方案中，所述ScFv Ab是一种重组ScFv Ab。
所述重组ScFv Ab最好是用遗传载体来制备。载体
正如本领域众所周知的，载体是一种工具，允许或促进一种实体从一种环境转移到另一种环境。按照本发明，并且作为实例，重组DNA技术中所用的某些载体允许实体例如DNA区段(例如异源DNA区段，例如异源cDNA区段)转移到宿主和/或靶细胞中，以复制包含本发明核苷酸序列的载体和/或表达本发明核苷酸序列所编码的本发明蛋白。重组DNA技术中所用的载体的实例包括但不限于质粒、染色体、人工染色体或病毒。
术语“载体”包括表达载体和/或转化载体。
术语“表达载体”是指能够体内或体外/离体表达的构建体。
术语“转化载体”是指能够从一个物种被转移到另一个物种的构建体。“裸DNA”
可以将包含编码本发明ScFv Ab的核苷酸序列、用于影响病毒感染的载体作为“裸核酸构建体”直接给予，所述构建体最好还包含与宿主细胞基因组同源的侧翼序列。
本文所用的术语“裸DNA”是指包含编码本发明ScFv Ab的核苷酸序列以及控制其产生的短启动子区的质粒。它称为“裸”DNA，是因为所述质粒不载于任何传递载体中。当这样一种DNA质粒进入宿主细胞例如真核细胞中时，它所编码的蛋白质(例如所述ScFv Ab)则可以在所述细胞中被转录和翻译。非病毒传递
或者，可以采用本领域已知的各种各样的非病毒技术，例如转染、转化、电穿孔和基因枪转化，将包含本发明核苷酸序列的载体导入合适宿主细胞中。
本文所用的术语“转染”是指采用非病毒载体传递基因至靶哺乳动物细胞的过程。
转染方法通常包括电穿孔、DNA基因枪、脂质介导的转染、压缩(compacted)DNA介导的转染、脂质体、免疫脂质体、脂质转染、阳离子试剂介导的转染、阳离子面式两亲物(CFA)(Nature Biotechnology1996 14；556)、多价阳离子例如精胺、阳离子脂质或聚赖氨酸、1，2-双(油酰氧基)-3-(三甲基铵基)丙烷(DOTAP)-胆固醇复合物(Wolff和Trubetskoy 1998 Nature Biotechnology 16：421)和它们的组合。
通过几种已知的转染技术，例如包括利用转染剂的转染法，增强哺乳动物细胞对裸核酸构建体的摄取。这些试剂的实例包括阳离子试剂(例如磷酸钙和DEAE-葡聚糖)和脂质转染剂(例如lipofectamTM和transfectamTM)。通常，将核酸构建体与转染剂混合，产生组合物。病毒载体
或者，可以运用各种各样的本领域已知的病毒技术，例如用重组病毒载体(例如逆转录病毒、单纯疱疹病毒和腺病毒)感染，可以将包含本发明核苷酸序列的载体导入合适的宿主细胞中。
所述载体最好是一种重组病毒载体。合适的重组病毒载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、痘病毒载体或细小病毒载体(参见Kestler等1999 Human Gene Ther 10(10)：1619-32)。就病毒载体而论，通过病毒感染靶细胞，介导基因传递。逆转录病毒载体
逆转录病毒的实例包括但不限于：鼠类白血病病毒(murineleukemia virus)(MLV)、人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus)(HIV)、马传染性贫血病病毒(equine infectious anaemia virus)(ELAV)、小鼠乳腺瘤病毒(mouse mammary tumour virus)(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma viaus)(RSV)、弗吉纳米肉瘤病毒(Fujinami sarcomavirus)(FuSV)、莫洛尼鼠类白血病病毒(Moloney murine leukemia virus)(Mo-MLV)、FBR鼠类骨肉瘤病毒(FBR murine osteosarcoma virus)(FBRMSV)、莫洛尼鼠类肉瘤病毒(Moloney murine sarcoma virus)(Mo-MSV)、艾贝尔逊鼠类白血病病毒(Abelson murine leukemia virus)(A-MLV)、禽髓细胞瘤病病毒-29(Avian myelocytomatosis virus-29)(MC29)和禽成红细胞增生病毒(Avian erythroblastosis virus)(AEV)。
按照本发明使用的优选载体是重组病毒载体，特别是重组逆转录病毒载体(RRV)，例如慢病毒载体。
术语“重组逆转录病毒载体”(RRV)是指具有足够逆转录病毒遗传信息以允许在包装组分存在下将RNA基因组包装到能够感染靶细胞的病毒粒子中的载体。对靶细胞的感染包括逆转录和整合到靶细胞基因组中。RRV携带将由所述载体传递至靶细胞的非病毒编码序列。RRV不能在最终的靶细胞中独立地复制产生感染性逆转录病毒粒子。通常所述RRV缺乏功能性gag-pol和/或env基因和/或复制所必需的其它基因。本发明的载体可以构成为断裂-内含子载体。断裂内含子载体在PCT专利申请WO99/15683中有描述。
在Coffin等(“Retroviruses”1997 Cold Spring Harbour LaboratoryPress编著：JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus，第758-763页)中可以找到逆转录病毒的详细一览表。慢病毒载体
慢病毒可以分为灵长类和非灵长类两个组。灵长类慢病毒的实例包括但不限于：人免疫缺陷病毒(HIv)-人自身免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒组包括原型“慢病毒(slow virus)”维纳斯/梅迪病毒(visna/maedi virus)(VMS)以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒(caprine arthritis-encephalitis virus)(CAEV)、马传染性贫血病病毒(equine infectious anaemia virus)(EIAV)和新近描述的猫免疫缺陷病毒(feline immunodeficiency virus)(FIV)和牛免疫缺陷病毒(bovine immunodeficiency virus)(BIV)。
慢病毒科和其它类型的逆转录病毒之间的区别在于：慢病毒有既可感染分裂中的细胞又可感染不分裂细胞的能力(Lewis等1992 EMBO.J 11：3053-3058；Lewis和Emerman 1994 J.Virol.68：510-516)。相反，其它逆转录病毒例如MLV不能感染不分裂的细胞，例如构成例如肌肉、脑、肺和肝组织的那些细胞。腺病毒
在本发明的一个实施方案中，可以将腺病毒的特征与逆转录病毒/慢病毒的遗传稳定性结合在一起，这可以用来转导靶细胞，使其成为能够稳定感染相邻细胞的瞬时逆转录病毒生产细胞。可以将已被工程改造以表达本发明ScFv Ab的这类逆转录病毒生产细胞植入生物(例如动物或人类)体内，用于治疗疾病例如癌症。痘病毒
按照本发明使用的优选载体是重组痘病毒载体，例如禽痘病毒(FPV)、昆虫痘病毒、痘苗病毒例如NYVAC、金丝雀痘病毒、MVA或其它非复制型病毒载体系统，诸如在例如WO95/30018中描述的那些病毒载体系统。杂种病毒载体
在另一广义方面，本发明提供一种用于体内传递编码本发明ScFvAb的核苷酸序列的杂种病毒载体系统，该系统包含一种或多种第一病毒载体，所述第一病毒载体编码第二病毒载体，所述第一载体能够感染第一靶细胞并能够在所述细胞中表达所述第二病毒载体，所述第二载体能够转导第二靶细胞。
所述第一载体最好可得自或基于腺病毒载体和/或所述第二病毒载体可得自或基于逆转录病毒载体，最好是慢病毒载体。定向载体
术语“定向载体”是指其感染/转染/转导细胞或在宿主和/或靶细胞中表达的能力被限于宿主生物中的某些细胞类型的载体，所述某些细胞类型通常为具有共同或相似表型的细胞。复制型载体
可以将编码本发明ScFv Ab的核苷酸序列加入到重组复制型载体中。可以用所述载体在匹配的宿主细胞中复制所述核苷酸序列。因而在本发明的一个实施方案中，本发明提供一种制备本发明ScFv Ab的方法，所述方法包括将本发明的核苷酸序列导入一种复制型载体中，将所述载体导入匹配的宿主细胞中，并让所述宿主细胞在引起所述载体复制的条件下生长。可以从所述宿主细胞中回收所述载体。表达载体
最好将插入到载体中的本发明的核苷酸序列与能够保证宿主细胞表达所述编码序列(例如本发明ScFv Ab的编码序列)的控制序列有效连接，即所述载体是一种表达载体。根据所用的序列和/或载体，由重组宿主细胞产生的ScFv Ab可以被分泌出或可以包含在细胞内。正如本领域技术人员会理解的，可以设计含有所述ScFv Ab编码序列的表达载体，使其具有指导所述ScFv Ab编码序列穿过特定的原核或真核细胞膜分泌的信号序列。体外表达
可以如下所述，将本发明的载体转化或转染到合适的宿主细胞和/或靶细胞中，以保证本发明的ScFv Ab表达。这种方法可以包括在保证表达载体表达编码所述ScFv Ab的编码序列的条件下培养用所述载体转化的宿主细胞和/或靶细胞，并任选地回收所表达的ScFv Ab。所述载体可以是例如配有复制起点、任选的用于表达所述多核苷酸的启动子和任选的所述启动子调节基因的质粒或病毒载体。所述载体可以含有一种或多种选择标记基因，例如就细菌质粒而言的氨苄青霉素抗性基因或就哺乳动物载体而言的新霉素抗性基因。本发明ScFv Ab的表达可以是组成型的，使得它们可以被持续产生，或可以是诱导型的，这需要刺激物来起始表达。在诱导型表达的情况下，需要时例如通过添加诱导物(例如地塞米松或IPTG)至培养基中，可以起始ScFv Ab的产生。ScFv Ab构建体融合蛋白
本发明的ScFv Ab也可以作为融合蛋白来产生，例如以便于提取和纯化。融合蛋白配偶体的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合结构域和/或转录激活结构域)和β-半乳糖苷酶。融合蛋白配偶体的其它实例包括但不限于包含一种可使ScFv Ab蛋白增溶或有利于ScFv Ab蛋白的产生和纯化的抗原性辅蛋白融合的重组ScFv Ab蛋白，所述辅蛋白例如GST、β-半乳糖苷酶或相对大的辅蛋白流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的脂蛋白D。或者，所述融合蛋白可以包含一种载体蛋白，例如牛血清白蛋白(BSA)或匙孔血蓝蛋白(KLH)。在本发明的某些实施方案中，所述标记序列是六组氨酸肽，六组氨酸肽在pQE载体(Qiagen Inc)中提供，并且在Gentz等(1989PNAS 86：821-824)中有描述。这类融合蛋白在酵母培养物中可容易地表达(如Mitchell等1993 Yeast 5：715-723中所述)并且容易通过亲和层析纯化。
其它重组构建可以将所述ScFv Ab编码序列加至编码有利于可溶性蛋白纯化的多肽结构域的核苷酸序列(Kroll DJ等(1993)DNA CellBiol12：441-53)。这种纯化促进结构域包括但不限于金属螯合肽例如便于在固定化金属上纯化的组氨酸-色氨酸模块(Porath J(1992)ProteinExpr Purif 3-.263281)、便于在固定化免疫球蛋白上纯化的A蛋白结构域、以及在FLAGS延伸/亲和纯化系统中利用的结构域(ImmunexCorp，Seattle，WA)。
也可以方便地在所述融合蛋白配偶体和感兴趣的蛋白序列之间包括一个蛋白酶解位点，以便于除去融合蛋白序列。作为实例，也可以对融合蛋白进行工程改造，使其含有位于编码所述ScFv Ab的核苷酸序列和所述异源蛋白序列之间的一个切割位点，使得可以切割所述ScFv Ab并从所述异源部分纯化出。在纯化结构域和所述ScFv Ab之间包括一个可切割接头序列例如因子XA或肠激酶(Invitrogen，SanDiego，CA)，也可以用来促进纯化。所述融合蛋白最好不妨碍包含本发明所述氨基酸序列的ScFv Ab的结合特异性。
在一个优选实施方案中，所述融合蛋白包含或编码一种分泌型共同刺激分子(SCM)。SCM融合蛋白
本发明的分泌型共同刺激分子(SCM)可以是一种工程融合蛋白，它包含可供从哺乳动物细胞中分泌的一个信号肽和至少一个用作免疫系统细胞的共同刺激信号的另一结构域。也可以想象利用含有不同共同刺激结构域的SCM组合。通过在待治疗个体的自体细胞中表达SCM编码基因，可以产生包含所述SCM的ScFv Ab，因而由所述宿主细胞加入到所述蛋白质中的任何翻译后修饰都是真正的，并且提供具有完全功能性的蛋白和合适的药代动力学。
WO-A-02/00092描述多种截短形式的B7-1，所述截短形式的B7-1是通过将翻译终止密码子置于跨膜结构域之前而衍生的，并且从哺乳动物细胞中分泌。在这种特定情况下，使用来自制癌蛋白M基因的异源信号肽。WO-A92/00092也描述含有与免疫球蛋白Fc区融合的B7-1的胞外结构域的融合蛋白。这类分子可以与T细胞上的CD28结合，并且可以用来刺激T细胞增殖。然而，这种刺激仅以中等程度发生，除非将所述B7或B7衍生物固定化于固相表面。
Gerstmayer等(1997 J.Immunol.158：4584-4590)描述了一种B7-2融合物，在所述融合物中B7-2与对ErbB2特异性的ScFv融合，后接一个myc附加表位和聚组氨酸标志，所述融合物在酵母巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达时被分泌。这种分子保留了对抗原的结合以及对用PMA和IL-2预先刺激的T细胞的共同刺激增殖。然而，这种分子的糖基化属于酵母类型，这有可能在人体内导致不当的药代动力学。
按照本发明，可以使用任何合适的共同刺激结构域。作为实例，共同刺激结构域可以选自细胞表面糖蛋白B7家族(包括B7-1、B7-2和B7-3)或其它共同刺激细胞表面糖蛋白(例如但不限于共同刺激受体-配体分子，包括CD2/LFA-3、LFA-1/ICAM-1和ICAM-3)的胞外部分。研究已经表明，单核细胞对T细胞的共同刺激依赖于两种受体配体途径CD2/LFA-3和LFA-1/ICAM-1中的每一种(Van Seventer等1991 Eur JImmunol 21：1711-1718)。另外，已经表明，第三种LFA-1反受体ICAM-3是静息和活化T淋巴细胞的共同刺激分子(Hernandez-Caselles等1993Eur J Immunol 23：2799-2806)。
其它可能的共同刺激分子可以包括名为SLAM的新型糖蛋白受体，该受体已经被鉴定出，当被占用时，以不依赖CD28的方式增强T细胞扩充，并诱导Th0/Th1细胞因子产生分布型(Cocks等1995 Nature376：260-263)。
CD6是一种细胞表面糖蛋白，也已经表明它作为T细胞上的共同刺激和粘着受体起作用。已经描述了四种CD6同种型(CD6a、b、c、d)(Kobarg等1997 Eur J Immunol 27：2971-2980)。也已经提出了极晚期抗原(VLA-4)整联蛋白在人记忆B细胞活化中的作用(Silvy等1997 EurJ Immunol 27：2757-2764)。内皮细胞也提供独特的影响活化CD4+T细胞表型的共同刺激信号(Karmann等1996 Eur J Immunol 26：610-617)。已经描述了脂多糖活化的B细胞表面存在的一种B3蛋白，该蛋白可以为静息T细胞提供共同刺激，导致主要释放白介素-4(IL-4)和IL-5以及可忽略量的IL-2和干扰素λ(Vinay等1995 J Biol Chem 270：23429-23436)。T细胞和肿瘤细胞上的一种新型共同刺激T细胞抗原(A6H)的共同表达已经提示一种与这些细胞共同特性有关的可能的功能(Labuda等1995 Int Immunol 7：1425-1432)。
在本发明的一个优选实施方案中，所述共同刺激结构域是B7-1或B7-2的一部分，更优选是B7-1或B7-2的完整胞外部分。
在一个优选实施方案中，通过表达一种编码融合蛋白的新基因，所述融合蛋白含有一个或多个所述DAM结合结构域和一个或多个所述共同刺激结构域，来生成本发明的ScFv Ab。在本发明的正文中，所述共同刺激结构域与所述ScFv融合。可以将所述结构域以以下顺序(N末端至C末端)放置：抗原结合结构域后接共同刺激结构域；或共同刺激结构域后接抗原结合结构域。共同刺激结构域最好置于N末端，后接抗原结合结构域。在N末端包括一个信号肽，所述信号肽可以例如是所述共同刺激胞外结构域的天然信号肽。所述不同的结构域可以被额外的序列隔开，所述额外序列可能是由于在所述新基因中包含便利的限制性酶切位点而产生，以有利于其构建，或者用作所述结构域之间的肽间隔区，或用作柔性肽接头或提供另外的功能。所述结构域最好被一个柔性接头隔开。
可以用两种或更多种编码不同SCM的不同基因来达到改善的共同刺激或共同刺激原初T细胞并且诱导记忆反应。例如，可以将含B7-1胞外结构域的SCM的编码基因与含B7-2胞外结构域的SCM的编码基因一起给予。ScFv抗体产生的定量
虽然标记基因表达的存在/缺乏可以提示也存在所述核苷酸序列和/或其ScFv Ab，但其存在和表达可以通过常规方法来证实。例如，如果将编码所述ScFv Ab的核苷酸序列插入标记基因序列中，则根据所述标记基因功能的缺乏，可以鉴定出含有所述ScFv Ab编码区的重组细胞。或者，可以将标记基因与编码ScFv Ab的核苷酸序列串连置于单一启动子的控制之下。对诱导或选择应答而表达所述标记基因，也表明所述ScFv Ab的表达。
定量测定特定分子表达的其它方法包括放射性标记(Melby PC等1993 J Immunol Methods 159：235-44)或生物素化(Duplaa C等1993 AnalBiochem 229-36)核苷酸、共同扩增一种控制核酸、和可内推实验结果的标准曲线。通过以ELISA形式进行所述测定，其中感兴趣的ScFv Ab以各种稀释度存在，可以加速对多种样品的定量，并且分光光度或量热反应可提供快速定量。宿主细胞/靶细胞
可以用包含本发明核苷酸序列的宿主细胞和/或靶细胞来在体外、体内和离体条件下表达本发明的ScFv Ab。
术语“宿主细胞和/或靶细胞”包括可来源于载体能够转染或转导的合适生物的任何细胞。宿主细胞和/或靶细胞的实例可以包括但不限于能够在体外、体内和离体条件下表达本发明ScFv Ab的细胞。这类细胞的实例包括但不限于巨噬细胞、内皮细胞或它们的组合。其它实例包括呼吸道上皮细胞、肝细胞、肌细胞、心肌细胞、滑膜细胞、初级乳腺上皮细胞和有丝分裂后终末分化的非复制型细胞例如巨噬细胞和/或神经元。
在一个优选实施方案中，所述细胞是一种哺乳动物细胞。
在一个高度优选的实施方案中，所述细胞是一种人类细胞。
术语“生物”包括任何合适的生物。在一个优选实施方案中，所述生物是哺乳动物。在一个高度优选的实施方案中，所述生物是人类。
虽然本发明的ScFv Ab可以采用原核细胞作为宿主细胞来生产，但最好使用真核细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞，特别是哺乳动物细胞。合适的宿主细胞包括细菌例如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞系和其它真核细胞系，例如昆虫Sf9细胞。
本发明也提供一种用一种或多种本发明的核苷酸序列转化宿主细胞和/或靶细胞的方法。
术语“转化细胞”是指具有经修饰遗传结构的宿主细胞和/或靶细胞。对于本发明而言，如果已经将按照本发明的载体导入细胞，则所述细胞具有经修饰的遗传结构。
可以在允许本发明的ScFv Ab表达的合适条件下培养宿主细胞和/或靶细胞。
本发明也提供一种方法，所述方法包括将转化宿主细胞即已经用一种或多种按照本发明的核苷酸序列转化了的细胞在适合于表达由所述核苷酸序列编码的ScFv Ab的条件下培养。
本发明也提供一种方法，所述方法包括将转化宿主细胞即已经用一种或多种按照本发明的核苷酸序列或其衍生物、同源物、变异体或片段转化了的细胞在适合于表达由所述核苷酸序列编码的ScFv Ab的条件下培养；然后从所述转化宿主细胞培养物中回收所述ScFv Ab。
通过各种各样的本领域已知的技术，包括酶裂解、化学裂解和/或渗透压裂解和物理破碎，可以从宿主细胞中提取本发明的ScFv Ab。所述ScFv Ab可以用本身已知的方法来纯化和分离。体外/体内/离体表达的调节
本发明也包括体外/体内/离体调节本发明的ScFv Ab编码核苷酸序列的基因疗法。例如，通过给予与本发明的ScFv Ab编码核苷酸序列结合的化合物、或与本发明的ScFv Ab编码核苷酸序列相关的控制区、或其相应RNA转录物，以改变转录或翻译的速率，可以完成表达的调节。控制序列
与本发明的ScFv Ab编码序列有效连接的控制序列包括启动子/增强子以及其它表达调节信号。可以选择这些控制序列，以使其与设计在其中应用所述表达载体的宿主细胞和/或靶细胞相匹配。例如通过添加其它转录调节元件以使由控制序列所指导的转录水平对转录调节物的应答更强，可以对所述控制序列进行修饰。有效连接的
术语“有效连接的”是指所述组分的关系使其以其计划的方式起作用。与编码序列“有效连接的”调节序列的连接方式，使得在与所述控制序列相匹配的条件下达到所述编码序列的表达。
本发明的核苷酸序列最好与转录单位有效连接。
本文所述的术语“转录单位”是含有编码序列和用来达到那些编码序列独立于任何其它编码序列表达的信号的核酸区。因而，每个转录单位一般包含至少一个启动子、一个任选的增强子和一个聚腺苷酸化信号。启动子
术语启动子是本领域众所周知的，并且以本领域通常的含义使用，例如作为RNA聚合酶结合部位。该术语包括大小和复杂性的范围从基本启动子至包括上游元件和增强子的启动子的核酸区。
所述启动子通常选自在哺乳动物细胞中有功能的启动子，虽然可以可以使用原核启动子和在其它真核细胞中有功能的启动子。所述启动子通常来源于病毒或真核基因的启动子序列。例如，它可以是来源于将发生表达的细胞的基因组的启动子。对于真核启动子，它们可以是以普遍存在的方式起作用的启动子(例如α-肌动蛋白、β-肌动蛋白、微管蛋白的启动子)，或者可以是以组织特异性方式起作用的启动子(例如丙酮酸激酶基因的启动子)。低氢型启动子/增强子
所述增强子和/或启动子可以在低氧或局部缺氧环境或低葡萄糖环境中优先有活性，使得所述ScFv Ab编码核苷酸序列优先在感兴趣的特定组织中表达，例如优先在肿瘤、关节炎性关节或局部缺氧的其它部位的环境中表达。因而，可以减轻或消除所述ScFv Ab编码核苷酸序列对待治疗个体的任何显著的生物学效应或有害效应。提供受调节表达的增强子元件或其它元件可以以多拷贝存在。同样，或另外，所述增强子和/或启动子可以优先在一个或多个特定细胞类型中有活性，所述特定细胞类型例如为一种或多种巨噬细胞、内皮细胞或它们的组合。其它实例可以包括但不限于呼吸道上皮细胞、肝细胞、肌细胞、心肌细胞、滑膜细胞、初级乳腺上皮细胞和有丝分裂后终末分化的非复制型细胞，例如巨噬细胞和/或神经元。组织特异性启动子
本发明的启动子可以是组织特异性启动子。合适的组织限制型启动子/增强子的实例是在肿瘤细胞中活性高的那些启动子，例如来自MUC1基因、CEA基因或5T4抗原基因的启动子/增强子。时序限制型启动子/增强子的实例是对局部缺氧和/或低氧应答的那些启动子/增强子，例如低氧效应元件或grp78或grp94基因的启动子/增强子。甲胎蛋白(AFP)启动子也是一种肿瘤特异性启动子。一种优选的启动子-增强子组合是人巨细胞病毒(hCMV)主要立即早期(MIE)启动子/增强子组合。
本发明的启动子最好是组织特异性的。亦即它们能够驱动ScFvAb编码核苷酸序列在一种组织中转录，而在其它组织类型中基本上保持“沉默”。
术语“组织特异性”是指这样的启动子，所述启动子的活性被限于单一的组织类型，但是虽然如此，它也可表现出选择性，因为它们可以在一类组织中有活性，而在另一类组织中活性较低或沉默。本发明启动子的一个理想的特征是，它们在缺乏被激活的低氧调节型增强子元件的情况下，甚至在靶组织中，也具有相对低的活性。达到这一点的一种方法是运用“沉默子”元件，所述元件在缺乏低氧的情况下抑制所选定启动子的活性。
术语“低氧”是指特定器官或组织接受的氧供应不足的条件。
所述ScFv Ab编码核苷酸序列在特定启动子控制之下的表达水平，可以通过操作所述启动子区来加以调节。例如，启动子区内的不同结构域可能具有不同的基因调节活性。通常采用具有缺失特定区的所述启动子的不同变异体的载体构建体，来评估这些不同区的作用(亦即缺失分析)。这种方法可以用来鉴定例如能够提供组织特异性的最小区或提供低氧敏感性的最小区。
多种上述组织特异性启动子在实施本发明中可能特别有利。在大多数情况下，这些启动子可以作为便利的适合于在选定载体中克隆的限制性消化片段来分离。或者，可以用聚合酶链式反应来分离启动子片段。通过在引物的5’端加入限制性位点，可以便于扩增片段的克隆。诱导型启动子
本发明的启动子也可以是对特定刺激物应答的启动子，例如结合类固醇激素受体的启动子。也可以使用病毒启动子，例如莫洛尼鼠类白血病病毒长末端重复(MMLV LTR)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子或人巨细胞病毒(CMV)IE启动子。
也可以最好是所述启动子是诱导型启动子，使得可以在所述细胞的生存期内调节异源基因的表达水平。诱导型是指采用可以被调节的启动子获得的表达水平。增强子
另外，通过添加其它调节序列，例如增强子序列，可以对这些启动子中的任一种进行修饰。也可以使用包含来自两种或更多种上述不同启动子的序列元件的嵌合启动子。
术语“增强子”包括与转录起始复合物的其它蛋白组分结合并因此促进其相关启动子所指导的转录起始的DNA序列。
本发明ScFv Ab的体外/体内/离体表达可以与感兴趣的蛋白(POI)或编码其的感兴趣的核苷酸序列(NOI)联合使用。与POI/NOI组合
本发明的ScFv Ab或编码其的核苷酸序列可以直接与POI(例如为前体药物活化酶)联合使用，或通过载体传递至例如靶细胞或靶组织，与POI联合使用。不在靶组织中选择性表达，或者除外在靶组织中选择性表达外，本发明的ScFv Ab或编码其的核苷酸序列可以与另外的POI(例如一种或多种前体药物活化酶)或编码一种或多种前体药物活化酶的一种或多种感兴趣的核苷酸序列(NOI)联合使用。这些前体药物活化酶可以直至用所述合适的前体药物酶所作用的一种或多种前体药物治疗所述个体时才具有显著的效应或无有害效应。在存在所述活性POI或编码其的NOI的情况下，用所述合适的前体药物治疗个体，可能导致增强病症的减轻，例如肿瘤生长减弱或生存率降低。前体药物POI
可以将POI(例如前体药物活化酶)传递至患病部位，例如传递至肿瘤部位以治疗癌症。在所有情况下，联合使用合适的前体药物与合适的前体药物活化酶，来治疗所述患者。合适的前体药物可以与所述ScFv Ab或包含编码ScFv Ab的核苷酸序列的载体一起给予。前体药物的实例包括：磷酸依托泊苷(与碱性磷酸酶，Senter等1988 Proc NatlAcad Sci 85：4842-4846)；5-氟胞嘧啶(与胞嘧啶脱氨酶，Mullen等1994Cancer Res 54：1503-1506)；多柔比星-N-对羟基苯氧基乙酰胺(与青霉素V酰胺酶，Kerr等1990 Cancer Immunol Immunother 31：202-206)；对N-双(2-氯乙基)氨基苯甲酰谷氨酸(与羧肽酶G2)；头孢菌素氮芥氨基甲酸盐(与βb-内酰胺酶)；SR4233(与P450还原酶)；更昔洛韦(与HSV胸苷激酶，Borrelli等1998 Proc Natl Acad Sci 85：7572-7576)；氮芥前体药物与硝基还原酶(Friedlos等1997 J Med Chem 40：1270-1275)和环磷酰胺(与P450，Chen等1996 Cancer Res 56：1331-1340)。
用于本发明的合适前体药物活化酶的实例包括：胸苷磷酸化酶，它激活5-氟尿嘧啶前体药物capcetabine和furtulon；得自单纯疱疹病毒的胸苷激酶，它激活更昔洛韦；细胞色素P450，它将例如环磷酰胺的前体药物激活为DNA损害剂；和胞嘧啶脱氨酶，它激活5-氟胞嘧啶。最好使用来源于人类的前体药物活化酶。POI和NOI
用于本发明中的其它合适的感兴趣的蛋白(POI)或编码其的NOI包括具有治疗用途和/或诊断用途的那些POI和NOI，例如但不限于编码以下分子的序列：细胞因子、趋化因子、激素、抗体、工程免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、酶、免疫共同刺激分子、免疫调节分子、反义RNA、靶蛋白的反式显性失活(transdominant negative)突变体、毒素、条件毒素、抗原、肿瘤抑制蛋白和生长因子、膜蛋白、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶以及它们的衍生物(例如具有相关报道基团)。当包括所述POI或编码其的NOI时，所述POI或NOI可以通常与合适的启动子有效连接，所述启动子可以是在一种或多种特定细胞类型中驱动核酶表达的启动子、或一个或多个不同的启动子。旁观者效应
所述POI和/或编码其的NOI可以是从细胞分泌的蛋白质。或者，所述POI表达产物不是分泌型的，而是在所述细胞内有活性。在任何一种情况下，所述POI表达产物都最好表现出旁观者效应或远距离旁观者效应；也就是说，在一个细胞中产生所述表达产物，导致杀伤具有一种共同表型的其它相关细胞，所述相关细胞或者是相邻的，或者是远离的(例如转移的)。
在本发明中用于治疗或预防癌症的合适POI或编码其的NOI包括以下蛋白质：破坏靶细胞的蛋白质(例如核糖体毒素)，用作：肿瘤抑制物(例如野生型p53)；抗肿瘤免疫机制的激活物(例如细胞因子、共同刺激分子和免疫球蛋白)；血管生成的抑制剂；或提供增强药物敏感性的蛋白质(例如前体药物活化酶)；间接刺激天然效应细胞破坏靶细胞的蛋白质(例如刺激免疫系统的强抗原或将前体物质转化为破坏靶细胞的毒性物质的蛋白质(例如前体药物活化酶)。所编码的蛋白质也可以破坏旁观者肿瘤细胞(例如用分泌型抗肿瘤抗体-核糖体毒素融合蛋白)、间接刺激对旁观者肿瘤细胞的破坏(例如刺激免疫系统的细胞因子或引起局部血管闭合的前凝血素蛋白或将前体物质转化为破坏旁观者肿瘤细胞的毒性物质(例如将前体药物激活为可扩散药物的酶)。
此外，也可传递编码反义转录物或核酶的NOI，而所述反义转录物或核酶是干扰有关肿瘤持续性的细胞基因的表达的反应转录物或核酶(例如针对伯基特氏淋巴瘤中的异常myc转录物或针对慢性髓细胞性白血病中的bcr-abl转录物)。也设计了应用这类POI和/或编码其的NOI的组合。
在PCT/GB95/00322(WO-A-9521927)中可以找到低氧可调节治疗性NOI的实例。ScFv Ab的偶联
可以采用标准方法，将本发明的ScFv Ab与其它分子偶联。ScFvAb的氨基末端和羧基末端可以用许多技术进行同位素标记和非同位素标记，例如用常规技术进行放射性标记(酪氨酸残基-氯胺T、iodogen、乳过氧化物酶；赖氨酸残基-Bolton-Hunter试剂)。这些偶联技术是本领域技术人员众所周知的。根据所述氨基酸上可利用的官能团，包括但不限于氨基、巯基、羧基、酰胺、酚和咪唑，来选择偶联技术。用来实现这些偶联的各种试剂其中包括戊二醛、重氮化联苯胺、碳二亚胺和对苯醌。化学偶联
可以将本发明的ScFv Ab与同位素、酶、载体蛋白、细胞毒性剂、荧光分子、放射性核素(radioactive nucleotides)或用于各种各样应用(包括但不限于成象/预后、诊断和/或治疗)的其它化合物化学偶联。采用适合于特定反应的不同技术，测定偶联反应的效率。例如，用氯胺T和具有高比活的Na125I，完成用125I对ScFv Ab肽进行放射性标记。用焦亚硫酸钠终止反应，混合物在一次性柱上脱盐。从该柱上洗脱标记的肽，收集各流分。从每个流分取出等份样品，并在λ计数器上测量放射性。这样，将未反应的Na125I与标记的ScFv Ab分离开。贮存具有最高比放射性的肽部分，以供随后的应用，例如分析与ScFv Ab结合的能力。成象
用短寿同位素标记的本发明ScFv Ab的应用，使得可以用放射自显影技术或现代放射照相技术或其它膜结合技术(例如正电子发射体层摄影术)来定位具有ScFv Ab结合部位的肿瘤，在体内对DAM结合部位进行目测定量。这种应用提供了重要的诊断和/或预后研究的工具。缀合物
在其它实施方案中，将本发明的ScFv Ab与以下物质偶联：闪烁照相放射性标记、细胞毒性化合物或放射性同位素、将非毒性前体药物转化为细胞毒性药物的酶、激活免疫系统以将所得缀合物靶向患病部位(例如结肠肿瘤)的化合物、或刺激细胞的化合物。这类缀合物具有：一个“结合部分”，该部分由本发明的ScFv Ab组成；和一个“功能部分”，该部分由所述放射性标记、毒素或酶组成。可以合成不同的ScFv Ab，以用于几种应用，包括但不限于将ScFv Ab与细胞毒性剂连接，以定向杀伤结合所述ScFv Ab的细胞。
或者，可以单独使用所述ScFv Ab，以便仅仅阻断所述DAM的活性，特别是通过物理干扰所述DAM与另一化合物的结合。
通过交联多肽的任一常规方法，例如在O’Sullivan等(Anal.Biochem 1979：100，100-108)中全面描述的方法，将所述缀合物(如果也是肽或多肽的话)的结合部分和功能部分连接在一起。例如，一个部分可能富含巯基，而另一个部分与能够与那些巯基反应的双官能剂(例如碘乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHIA)或N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP))反应。例如用间马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯得到的酰胺键和硫醚键，一般在体内比二硫键更稳定。
另一方面，如果所述结合部分含有糖类，例如可能是抗体或某些抗体片段的情况，可以采用EP 0 088 695中的连接技术，将所述功能部分通过所述糖部分连接。
所述缀合物的功能部分可以是非毒性前体药物转化为毒性药物的酶，例如Bagshawe及其同事的缀合物(Bagshawe(1987)Br.J.Cancer56，531；Bagshawe等(Br.J.Cancer 1988：58，700)；WO88/07378)或氰化物释放系统(WO91/11201)。
可能不必整个酶都存在于所述缀合物中，但是当然，催化部分必须存在。可以使用所谓的“抗体酶”，其中针对参与人们所希望催化的反应的化合物(通常为反应性中间体状态)，产生ScFv Ab。然后，所得的抗体可以用作该反应的酶。
所述缀合物可以通过大小排阻层析或亲和层析来纯化，并且测试双重生物学活性。可以运用酶联免疫吸附测定(ELISA)，用固定化抗原，在活细胞放射免疫测定中，测量抗原免疫反应性。对于β-葡糖苷酶而言，可以使用酶测定，使用当葡萄糖残基被水解时改变吸光度的底物，例如oNPG(邻硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷)，被水解时释放2-硝基苯酚，后者在405nm下用分光光度计测量。
通过在血清中于37℃保温，然后通过大小排阻FPLC分析，可以初步体外测试所述缀合物的稳定性。可以通过在注射所述缀合物后不同时间分析血清，以相同的方式在小鼠中测试体内稳定性。另外，在缀合之前，用125I对所述ScFvAb进行放射性标记，而用131I标记所述酶，并且测定小鼠体内所述缀合物、游离ScFv Ab和游离酶的生物分布，这也是可行的。
另一方面，可以通过重组DNA技术，将所述缀合物作为融合化合物产生，从而一段DNA包含编码所述缀合物两个部分的相应区，所述相应的区或者相互邻近，或者被一个编码不破坏所述缀合物的所需特性的接头肽的区隔开。
可以想象，所述化合物的两个功能部分可以完全重叠或部分重叠。然后，用已知方式，使所述DNA在合适的宿主中表达。诊断试剂盒
本发明也包括用于检测和测量生物体液和组织中DAM以及将组织中DAM定位的诊断方法和试剂盒。可以使用具有高结合特异性的本发明ScFv Ab，来建立易于使用的试剂盒，以快速、可靠、灵敏和特异性地测量和定位血浆、尿、组织的提取物中和细胞培养基中的DAM。本发明的ScFv Ab也可以用于诊断方法和试剂盒中，以允许测定循环DAM，而在某些情况下，循环DAM又可以指示疾病状态的发展，例如原位原发性肿瘤的微转移瘤的播散。
这些试剂盒可以包括但不限于以下技术：竞争性测定和非竞争性测定、放射免疫测定、生物发光测定和化学发光测定、荧光测定、夹层测定、免疫放射分析、斑点印迹测定、酶联测定包括ELISA、微量滴定板、用于快速监测尿液或血液的抗体包被纸条或浸棒(dipstick)、以及免疫细胞化学。对于每种试剂盒而言，确定了所述测定的范围、灵敏度、精度、可靠性、特异性和再现性。位移或活性标准曲线上，测定内和测定间差异确定在20％、50％和80％点上。
通常用于研究和临床的测定试剂盒的一个实例是放射免疫测定(RIA)试剂盒。在成功地放射碘化和纯化ScFv Ab后，将几个稀释度的具有最高效价的抗血清加入在合适的缓冲体系中含有相对恒定量的放射性(例如10,000cpm)的试管中。其它试管含有缓冲液或免疫前血清，以测定非特异性结合。在于4℃保温24小时后，加入A蛋白，将试管涡旋混合，于室温保温90分钟，然后于4℃以约2000-2500×g离心，以沉淀与标记ScFv Ab结合的抗血清的复合物。通过吸取取出上清液，在λ计数器中对沉淀中的放射性进行计数。进一步鉴定在减去非特异性结合之后结合约10-40％标记ScFv Ab的抗血清稀释度。免疫组织化学免疫组织化学试剂盒也可以用来对组织和细胞中DAM进行定位。这种免疫组织化学试剂盒提供说明、一种ScFv Ab以及可能的阻断性血清和第二抗血清，所述第二抗血清与荧光分子(例如异硫氰酸荧光素)连接，或与用来显现第一抗血清的某些其它试剂连接。免疫组织化学技术是本领域技术人众所周知的。这种免疫组织化学试剂盒允许用光学显微镜以及电子显微镜，将组织切片和培养的细胞中DAM定位。它即可用于研究又可用于临床。例如，可以对肿瘤进行活组织检查或收集肿瘤，用切片机切组织切片，以检查DAM产生的部位。这种信息对于诊断以及可能的治疗目的而言，可用于检测和治疗诸如癌症的疾病。胎儿细胞分析
本发明的ScFv抗体和/或犬5T4序列也可用于从母体血液中分离胎儿细胞的方法中。已经建议从母体血液中分离胎儿细胞，作为替代aminocentesis的非侵入性方法(参见WO97/30354)。
在本发明的该实施方案中，所述DAM可以是在母体细胞和胎儿细胞上以不同水平表达的任何分子。所述DAM最好是仅在胎儿细胞上表达。已知5T4在滋养层上以非常高的水平表达。因而，抗5T4的抗体可以用来从母体血液中分离滋养层。所述抗体可以是例如按照本发明的ScFv、或是对不同物种的5T4多肽特异性的(例如针对其产生的)抗体。
因此，本发明也提供一种方法，采用本发明的ScFv抗体或来自不同物种的抗5T4抗体，从母体血液中分离胎儿细胞。本发明的犬5T4多肽可用来产生这类交叉反应性抗体。
所述胎儿细胞可以是例如滋养层或红细胞。
母体细胞/胎儿细胞可以来自人类或动物。因而，本发明的方法可以用于医学或兽医学应用。在一个优选实施方案中，母亲和胎儿是非人类的，因而所述分离方法是兽医学应用的一部分。
所述分离方法可以构成诊断方法的一部分。例如，然后可以使胎儿细胞经过生物化学取样或遗传学取样。这样一种方法应该用来测试胎儿异常(例如唐氏综合征)或用来检测胎儿的性别。联合治疗
本发明的ScFv Ab可以与用于治疗疾病的其它组合物和方法联合使用。作为实例，所述ScFv Ab也可以与疾病(诸如癌症)的常规疗法联合使用。作为另一实例，可以用常规外科、放射疗法或化学疗法联合ScFv Ab来治疗肿瘤，或者可以随后将ScFv Ab给予所述患者，以延长微转移瘤休眠时间，并且稳定任何残留的原发性肿瘤。ScFv Ab的传递
可以将所述ScFv Ab与治疗有效药物在同一时间传递至同一部位。或者，可以将所述ScFv Ab与所述治疗有效药物在不同时间传递至不同的部位。所述ScFv Ab和所述治疗有效药物甚至可以在同一传递载体内传递，以预防和/或治疗病症，例如癌症。
基于应用所述ScFv Ab的治疗策略包括：通过运用DAM反应性ScFv Ab片段与细菌超抗原葡萄球菌肠毒素(Dohlsten等1994)的融合体，或通过运用针对DAM和T细胞CD3抗原两者的双特异性抗体(Kroesen等1994)，募集和激活T细胞。抗DAM抗体也可以与不同的细菌毒素缀合，以产生有效的免疫毒素(LeMaistre等1987；Zimmermann等1997)。ScFv Ab可以与细胞毒性药物联合使用，以预防和/或治疗疾病状态，例如血管生成和/或癌症。与ScFvAb连接的细胞毒性药物(例如蓖麻毒蛋白)可以为破坏结合所述ScFv Ab的细胞提供工具。这些细胞可以在许多位置找到，包括但不限于微转移瘤和原发性肿瘤。筛选
本发明的ScFv Ab或其衍生物或同源物和/或表达本发明ScFv Ab或其衍生物或同源物的细胞系，可以用来筛选能够影响所述ScFv Ab结合特异性的因子(例如肽、有机或无机分子)。
在一个实施方案中，本发明的筛选可以鉴定出本发明ScFv Ab的激动剂和/或拮抗剂。
在另一实施方案中，本发明的ScFv Ab可以用于各种各样的药物筛选技术中。用于这种试验的ScFv Ab可以游离于溶液中、固定于固相支持体上、载于细胞表面或位于细胞内。可以测量ScFv Ab结合特异性的消失或所述ScFv Ab和所述待测因子之间结合复合物的形成。
用于筛选的另一技术可供用于对所述ScFv Ab具有适当结合亲和性的药物的高通量筛选(HTS)，并且基于WO84/03564中详细描述的方法。
可以预期，本发明的测定方法将既适合于试验化合物的小规模和大规模筛选，也适合于定量测定噬菌体展示筛选
噬菌体展示可以用于鉴定因子，例如可被本发明ScFv Ab接合的因子，例如DAM。噬菌体展示是一种利用重组噬菌体的分子筛选方案。所述技术涉及用编码能够与靶ScFv Ab反应的合适配体(例如候选DAM)的核苷酸序列(或其衍生物或同源物)转化噬菌体，或用编码靶ScFv Ab的核苷酸序列(或其衍生物或同源物)转化噬菌体。所述转化噬菌体(它最好被束缚于固相支持体)表达所述合适的配体(例如所述候选因子)，并且在其噬菌体外壳上展示所述配体。分离并扩增带有识别所述候选DAM的靶ScFv Ab分子的一种或多种实体(例如细胞)。然后鉴定成功的候选的DAM。
用本发明的ScFv Ab靶向表达DAM的细胞，便于开发ScFv Ab以调节表达所述DAM的细胞的活性。
在本发明的另一个实施方案中，可以用ScFv Ab文库来筛选针对特定DAM的抗体。作为实例，可以用编码能够与靶DAM反应的合适配体(例如候选ScFv Ab)的核苷酸序列(或其衍生物或同源物)，或用编码靶DAM的核苷酸序列(或其衍生物或同源物)，转化噬菌体。所述转化噬菌体(它最好被束缚于固相支持体)表达所述合适的配体(例如所述候选ScFv Ab)，并且在其噬菌体外壳上展示所述配体。分离并扩增带有识别所述候选ScFv Ab的靶DAM分子的一种或多种实体(例如细胞)。然后鉴定成功的候选的ScFv Ab。
作为另一实例，通过将合成的重链和轻链可变区(VH和VL)从lox文库载体重新克隆到噬菌粒载体pHEN2中，已经构建了称为“Griffin-1文库”的人类ScFv片段文库。对于洗脱方法和筛选方法的修改，导致成功地筛选出针对各种各样DAM的ScFv抗体的噬菌体展示文库(参见de Bruin等1999，Nature Biotechnology 17：397-399)。
噬菌体展示优于标准亲和配体筛选技术。噬菌体表面以三维构型展示出所述候选因子，更加非常类似其天然存在的构象。这提供特异性更强且亲和性更高的结合，以用于筛选。用于模拟物的测定
使用噬菌体展示来正鉴定或者DAM或者ScFv Ab，可能便于应用组合文库来鉴定能够以相同或相似方式起作用的模拟物。这类模拟物可以单独给予，或与用于治疗与本发明的DAM相关的疾病的其它治疗剂联合给予。剂量
本发明ScFv Ab的剂量将取决于待治疗的疾病状态或病症以及其它临床因素，例如所述病人或动物的体重和病症以及所述化合物的给药途径。根据所述ScFv Ab在特定动物或人体内的半寿期，可以将所述ScFv Ab每日给予数次至每周给予一次。应该理解，本发明既应用于人类，也应用于兽医学。本发明的方法考虑到一次给药以及多次给药，或者同时给予，或者在延长的时间内给予。制剂
适合于胃肠外给予的制剂包括：水性和非水无菌注射液，所述注射液可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使所述制剂与计划的受体的血液等渗的溶质；和水性和非水无菌悬浮液，所述悬浮液可以包括悬浮剂和增稠剂。所述制剂可以存在于单位剂量容器，或存在于多剂量的容器中，例如密封的安瓿和管形瓶中，并且可以贮存于冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在加入无菌液体载体例如注射用水之后立即使用。临时配制的注射液和悬浮液可以由无菌粉剂、颗粒剂和先前描述过的各种片剂来制备。
本发明的ScFV Ab可以有效地预防和/或治疗疾病，例如癌症相关疾病。本发明包括用有效量的本发明ScFv Ab治疗疾病(例如癌症相关疾病)的方法。本发明的ScFv Ab可以用本领域技术人员已知的配制方法，在药学上可接受的组合物中作为合成肽或者作为经分离并且基本纯化的蛋白质或蛋白片段或者它们的组合来提供。这些组合物可以通过标准途径给予。这些包括但不限于：经口、直肠、眼(包括玻璃体内或眼房内)、鼻、局部(包括颊和舌下)、子宫内、阴道或胃肠外(包括皮下、腹膜内、肌内、静脉内、皮内、颅内、气管内和硬膜外)、经皮、腹膜内、颅内、脑室内、脑内、阴道内、子宫内或胃肠外(例如静脉内、脊柱内、皮下或肌内)途径。
所述ScFv Ab制剂可以方便地以单位剂型存在，可以用常规制药学技术来制备。这类技术包括使所述有效成分与所述药用载体或赋形剂结合的步骤。一般而言，通过使所述有效成分与液体载体或细碎的固体载体或这两者均匀地紧密结合，然后如有必要，使所述制品成型，来制备所述制剂。
另外，可以将本发明的ScFv Ab加入到生物可降解聚合物中，提供所述化合物的持续释放，将所述聚合物植入需要药物传递的部位的附近，例如肿瘤部位，或将其植入，使得系统缓释所述ScFv Ab。所述生物可降解聚合物及其应用详细描述于例如Brem等(J.Neurosurg199174：441-446)。渗透微量泵也可以用来通过插管达到将高浓度ScFvAb控释到感兴趣部位中，例如直接释放到转移瘤生长部位或所述肿瘤的血管供应部位中。
本发明的ScFv Ab可以与细胞毒性剂连接，将其以设计用以将传递到所需位置的传递最大化的方式注入。例如，通过插管将蓖麻毒蛋白连接的高亲和性ScFv Ab传递到供应靶部位的血管中，或直接传递到所述靶中。这类药剂也可以通过与输注插管连接的渗透泵以受控方式传递。
优选的单位剂量制剂是含有如上文引述的一个日剂量或单位、每日分次剂量的所述给予的组分或其合适的部分。应该理解，除所述组分尤其是上述组分外，本发明的制剂可以包括本领域关于上述制剂类型中常规的其它药剂。
所述ScFv Ab缀合物可以以任何合适的方式给予，通常胃肠外给予，例如静脉内或腹膜内给予，以稀释剂和载体的标准无菌无热原制剂例如等渗盐水(当静脉内给予时)给予。一旦所述ScFv Ab缀合物与所述靶细胞结合并且从血流中被清除(如有必要)(这通常需要一天左右)后，立即给予所述前体药物，通常以单次输注剂量给予，或者对所述肿瘤成象。如果需要，由于所述ScFv Ab缀合物可能具有免疫原性，因而可以给予环孢菌素或某些其它免疫抑制剂，以提供较长的治疗时期，但通常这不是必不可少的。
可以以常规方式优化给予所述ScFv Ab缀合物和前体药物之间的时间，因为缀合物的患病组织/正常组织之比(至少在静脉内传递之后)在约4-6天后最高，而此时根据每克注射剂量的百分率而论，与DAM结合的缀合物的绝对量低于较早的时间。
因此，给予所述ScFv Ab缀合物和给予所述前体药物之间的最佳间隔将是患病部位所述酶的峰浓度和患病组织与正常组织之间最佳分布比率之间的折衷。所述ScFv Ab缀合物的剂量将由医师根据通常的标准来选择。至少就使用所靶向的酶(例如β-葡糖苷酶)和利用静脉内苦杏仁苷作为毒性前体药物的方法而论，每平方米机体表面积0.1-10.0克、优选1.0-5.0g/m2的1-50个日剂量可能是合适的。对于口服疗法，每日三剂0.05-10.0g、优选1.0-5.0g、给予1-50天可能是合适的。同样将根据正常的标准，特别是参考疾病的类型、阶段和患病组织的位置以及患者的体重，选择所述ScFv Ab缀合物的剂量。治疗持续时间将部分取决于对所述ScFv Ab缀合物的任何免疫反应的速度和程度。
当将所述ScFv Ab缀合物用于诊断时，所述ScFv Ab缀合物的功能部分通常包含以下原子或标记或可以由其组成：用于闪烁照相研究的放射性原子，例如锝99m(99mTc)或碘-123(123I))；或用于核磁共振(nmr)成象(也称为磁共振成象，mri)的自旋标记物，例如又是碘-123、碘-313、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
当用于选择性破坏例如肿瘤的化合物中时，所述ScFv Ab的功能部分可以包含发射足够能量以破坏相邻细胞的高放射性原子(例如碘-131、铼-186、铼-188、钇-90或铅-212)或细胞毒性化合物(例如氨甲蝶呤、多柔比星、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、柔红霉素或其它嵌入剂)。
可以以已知方式，将放射标记或其它标记掺入所述ScFv Ab缀合物中。例如，可以生物合成所述肽，或者可以通过化学氨基酸合成，采用例如涉及用氟-19取代氢的合适的氨基酸前体合成所肽。例如99mTc、123I、186Rh、188Rh和111In的标记，可以通过所述肽中的半胱氨酸残基连接。钇-90可以通过赖氨酸残基连接。IODOGEN法(Fraker等(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57)可以用来掺入碘-123。“Monoclonal Antibodies in Immunoscinigraphy”(Chatal，CRC Press1989)详细描述了其它方法。药用组合物
一方面，本发明提供药用组合物，所述药用组合物包含一种按照本发明的ScFv Ab和任选的一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂(包括它们的组合)。
所述药用组合物可以在人类医学和兽医学方面用于人类或动物，并且通常包含任何一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。用于治疗应用的可接受的载体或稀释剂是制药领域众所周知的，并且描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.(A.R.Gennaro编著1985)。药用载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据计划的给药途径和标准制药实践来进行。所述药用组合物可以包含作为载体、赋形剂或稀释剂的任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂，或除载体、赋形剂或稀释剂外，还包含上述试剂。
在所述药用组合物中可以提供防腐剂、稳定剂、染料和甚至调味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。也可以使用抗氧化剂和悬浮剂。
根据不同的传递系统，可能有不同的组合物/制剂要求。作为实例，本发明的药用组合物可以配制为采用微量泵传递，或通过粘膜途径传递，例如作为用于吸入的鼻用喷雾剂或气雾剂或可摄入溶液，或通过胃肠外给予，其中所述组合物配制成注射剂形式用于传递，例如通过静脉内、肌内或皮下途径。或者，可以设计所述制剂通过两种途径传递。
在将所述药用组合物通过胃肠粘膜经粘膜传递的情况下，它应该能够在通过胃肠道传递期间保持稳定；例如，它应该抗蛋白水解降解，于酸性pH下稳定，并且抗胆汁的去垢剂效应。
合适时，所述药用组合物可以通过以下途径给予：吸入；以栓剂或阴道栓的形式；局部给药，以洗剂、溶液、乳膏、软膏或扑粉的形式；利用皮肤贴剂；口服，以含有赋形剂(例如淀粉或乳糖或白垩粉)的片剂、或以或者单独或者与赋形剂混合的胶囊或卵状体、或以含有调味剂和着色剂的酏剂、溶液或注射悬浮液的形式；或者所述药用组合物可以胃肠外注射，例如静脉内，肌内或皮下注射。对于胃肠外给予，所述组合物可能最好以无菌水溶液的形式使用，它们可以含有其它物质，例如足够的盐和单糖，以使得所述溶液与血液等渗。对于口腔含化或舌下给药而言，所述组合物可以以用常规方法配制的片剂或锭剂形式给予。给药
通常，医师将确定最适于个别受治疗者的实际剂量，这将随所述特定患者的年龄、体重和反应以及病症的严重程度而变化。以下剂量是一般情况的示例。当然，有剂量范围更高或更低的个别情况。
本发明的组合物(或其组分)可以经口给予。另外或在一个可供选择的方法中，可以通过直接注射，给予本发明的组合物(或其组分)。另外或在一个可供选择的方法中，可以局部给予本发明的组合物(或其组分)。另外或在一个可供选择的方法中，可以通过吸入给予本发明的组合物(或其组分)。另外或在一个可供选择的方法中，也可以通过以下给药方法中的一种或多种给予本发明的组合物(或其组分)：胃肠外、粘膜、肌内、静脉内、皮下、眼内或经皮给药，并且配制用于这种给药。
作为另一实例，本发明的药用组合物可以按照每日1-10次、例如每日一次或每日两次的方案给予。对于任何特定患者的具体的剂量水平和给药频率可以改变，并且将取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时间、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药模式和时间、排泄速率、药物组合、具体病症的严重程度和宿主正经历的治疗。
术语“给予”也包括但不限于通过粘膜途径传递，例如作为用于吸入的鼻用喷雾剂或气雾剂、或作为可摄入溶液传递；经胃肠外途径传递，其中以注射液形式传递，例如静脉内、肌内或皮下途径传递。
因此，本发明的药用组合物可以通过以下的一种或多种途径给予：口服、注射(例如直接注射)、局部、吸入、胃肠外给药、粘膜给药、肌内给药、静脉内给药、皮下给药、眼内给药或经皮给药。疾病
包含有效量的ScFv Ab和/或编码ScFv Ab的NOI的药用组合物，可以用于治疗疾病，例如WO-A-98/09985中列出的那些疾病。为了易于参考，现在提供该表的一部分：巨噬细胞抑制活性和/或T细胞抑制活性和因此产生的抗炎活性；抗免疫活性，即针对细胞免疫应答和/或体液免疫应答(包括与炎症不相关的应答)的抑制效应；与病毒和/或其它细胞内病原体相关的疾病；抑制巨噬细胞和T细胞粘着于胞外基质组分和纤连蛋白以及抑制被正调节的T细胞中fas受体表达的能力；抑制不希望有的免疫反应和炎症，包括：关节炎包括类风湿性关节炎，与过敏反应、变态反应、哮喘、系统性红斑狼疮、胶原病和其它自身免疫病相关的炎症，与动脉粥样硬化、动脉硬化、动脉粥样硬化性心脏病、再灌注损伤、心博停止、心肌梗塞、血管炎症、呼吸窘迫综合征或其它心肺疾病相关的炎症，与以下疾病相关的炎症：消化性溃疡、溃疡性结肠炎和其它胃肠道疾病，肝纤维变性、肝硬化或其它肝病、甲状腺炎或其它腺体疾病、肾小球肾炎或其它肾病和泌尿科疾病、耳炎或其它耳鼻喉疾病、皮炎或其它皮肤病、牙周病或其它牙科疾病、睾丸炎或睾丸附睾炎、不育症、睾丸创伤或其它免疫相关的睾丸疾病、胎盘功能障碍、胎盘机能不全、习惯性流产、子痫、先兆子痫和其它免疫和/或炎症相关妇科疾病、后色素层炎、中间眼色素层炎、前眼色素层炎、结膜炎、脉络膜视网膜病、眼色素层视网膜病、视神经炎、眼内炎症(例如视网膜炎或囊样黄斑水肿)、交感性眼炎、巩膜炎、色素性视网膜炎，抑制变性性fondus疾病的免疫和炎性组分，抑制以下的炎性组分：眼部创伤、由感染所致的眼部炎症、增生性玻璃体视网膜病、急性局部缺血视神经病、过度瘢痕形成(例如在青光眼过滤手术之后)、针对眼移植物和其它免疫和炎症相关眼病的免疫反应和/或炎症反应、与自身免疫病或免疫和/或炎症抑制可能有益的中枢神经系统(CNS)或任何其它器官中的病症或疾病相关的炎症、帕金森病、由于治疗帕金森病引起的并发症和/或副作用、AIDS相关性痴呆、复合HIV相关脑病、德维克病、Sydenham舞蹈病、早老性痴呆和其它变性性疾病、CNS病症或疾病，抑制中风、小儿麻痹症后综合征的炎性组分，抑制以下的疾病的免疫和炎性组分：精神病、脊髓炎、脑炎、亚急性硬化性全脑炎、脑脊髓炎、急性神经病、亚急性神经病、慢性神经病、Guillaim-Barre综合征、Sydenham舞蹈病、重症肌无力、脑假瘤、唐氏综合征、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化，抑制CNS压迫或CNS创伤或CNS感染的炎性组分，抑制以下的炎性组分：肌萎缩和肌营养不良，以及免疫和炎症相关的疾病、中枢神经系统和周围神经系统的病症或疾病、创伤后炎症、败血症性休克、传染病，抑制外科的炎性并发症或副作用、骨髓移植或其它移植并发症和/或副作用、基因治疗的炎性和/或免疫性并发症和副作用(例如由于感染病毒载体所致)或与AIDS相关的炎症的炎性和/或免疫性并发症和副作用，以压抑或抑制体液和/或细胞免疫应答，通过减少单核细胞或淋巴细胞的量，治疗或缓解单核细胞或白细胞增生性疾病(例如白血病)，用于在移植天然或人工细胞、组织和器官(例如角膜、骨髓、器官、晶状体、起搏器、天然或人工皮肤组织)的情况下预防和/或治疗移植排斥。具体的癌症相关疾病包括但不限于：实体瘤、血传肿瘤(例如白血病)；肿瘤转移瘤；良性肿瘤，例如血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼和脓性肉芽肿；类风湿性关节炎；牛皮癣；眼血管生成性疾病，例如糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、黄斑变性、角膜移植排斥、新血管性青光眼、晶状体后纤维组织形成、潮红；Osler-Webber综合征；心肌血管生成；噬斑新血管形成；毛细管扩张；血友病性关节；血管纤维瘤；伤口肉芽形成；冠状动脉侧支(corornay collaterals)；脑动脉侧支(cerebralcollaterals)；动静脉畸形；局部缺血性肢血管生成；新血管性青光眼；晶状体后纤维组织形成、糖尿病性新血管形成；螺杆菌相关的疾病、骨折、血管发生、血细胞生成、排卵、月经和胎盘形成。
附图
现在仅仅通过实施例进一步描述本发明，其中参考以下附图：
图1.显示编码名为5T4ScFv.1的5T4 ScFv的DNA序列(SEQ IDNo 5)。提供成熟的分泌型蛋白质的序列(SEQ ID No 1)。
图2.显示编码B7-1.5T4.1融合蛋白的DNA序列(SEQ ID No 7)。也提供B7-1.5T4.1融合蛋白的推导氨基酸序列(SEQ ID No 3)。
图3a.显示了B7-1.5T4.1构建体的图式说明。
图3b.显示了B7-1.5T4.2构建体的图式说明。
图4.显示编码B7-2.5T4.1融合蛋白的DNA序列(SEQ ID No 9)。也提供B7-2.5T4.1融合蛋白的推导氨基酸序列(SEQ ID No 10)。
图5.显示B7-ScFv的序列(SEQ ID No 11)。
图6.显示编码Ig-5T4融合蛋白的DNA序列(SEQ ID No 8)。也提供Ig-5T4融合蛋白的推导氨基酸序列(SEQ ID No 4)。
图7.显示ScFv-IgE的序列(SEQ ID No 12)。
图8.显示B7-EGF的序列(SEQ ID No 13)。
图9.显示所述ScFvAb在35天期间对Balb/c小鼠体内CT26-neo肿瘤细胞生长的影响。
图10.显示所述ScFv Ab在35天期间对Balb/c小鼠体内CT26-h5T4肿瘤细胞生长的影响。
图11.显示所述ScFv Ab在35天期间对Balb/c小鼠体内B16-neo肿瘤细胞生长的影响。
图12.显示所述ScFv Ab在35天期间对Balb/c小鼠体内B16-h5T4肿瘤细胞生长的影响。
图13.显示ScFv构建体。
图14.显示B7-scFv与5T4靶抗原的结合。
图15.显示B7-scFv与CTLA4的结合。
图16.显示对与单独的scFv蛋白或与scFV-HGl融合蛋白一起孵育后与山羊抗人IgG-FITC标记抗体一起孵育的A9-5T4(A)和A9-neo(5T4阴性)(B)细胞的FACS分析。
图17.显示5T4 scFv-Hλ1 ADCC活性。
图18.显示pONY8.1SM。
图19.显示pONY 8.1SM中的融合蛋白构建体
    a.B7-5T4scFv
    b.L-5T4scFv
图20.显示pKLink
图21.显示pBSII中的scFv和前导序列
图22.显示pONY8.1SM中的前导序列-IL-5 scFv
图23.显示pONY8.1SM中的前导序列HIV-gp120 scFv
图24.显示pAdApt
图25.显示pAdApt中的融合蛋白构建体
    a.B7-5T4scFv
    b.L-5T4scFv
图26.显示犬5T4编码序列
略微更详细地描述：
图14显示将来自模拟转染的293T细胞或用标记的B7-scFv构建体转染的293T细胞的上清液与A9 5T4以及A9neo细胞一起孵育。检测使用FITC缀合的αHis或αMyc抗体。
图15显示A9 5T4和A9neo细胞与单独的所述ScFv、缺乏Myc-HIs标记的B7-scFv构建体或具有所述标记的B7-scFv构建体一起孵育。加入B7.1配体CTLA4-Ig，检测使用FITC缀合的α小鼠IgG。
图20显示pBluesctipt II SK(pBS II)中的pKLink-(Gly4Ser)3接头。该柔性接头作为两种互补寡核苷酸合成，将这两种寡核苷酸退火，产生限制性酶突出端，然后作为双链寡核苷酸克隆到pBSII中。(甘氨酸4丝氨酸)3氨基酸翻译以单字母代码显示于DNA序列之下。
图21显示了PBSII中的scFv(例如IL-5或HIV gp120 scFv)和随后添加所述前导序列。在该实施例中，扩增在5’端具有额外SpeI和MfeI限制性位点并且在3’端具有一个额外的Age I位点的VH。所述SpeI和AgeI位点用于克隆到pKLink中。扩增在5’端具有一个额外Bam HI限制性位点并且在3’端具有一个额外的Eco RI位点的VL，所述Bam HI和Eco RI位点用于克隆到pKLink中。前导信号肽作为两种互补寡核苷酸合成，将这两种寡核苷酸退火产生限制性酶突出端，然后作为双链寡核苷酸克隆到所述scFv cDNA 5’端的SpeI和MfeI位点之间。包括ATG起始密码子(下划线)的Kozak序列以粗体加斜体表示。
图26显示了犬5T4的编码序列。用根据h5T4 cDNA制备的探针，筛选λdash中的杂种基因组文库。鉴定阳性克隆，并进行测序。实施例实施例1-5T4 ScFv Ab的构建和用逆转录病毒载体传递至肿瘤
采用标准技术(Antibody engineering：a practical approach，McCafferty等编著，1996 OUP)，克隆编码鼠5T4单克隆抗体的cDNA，并进行测序。可以用所述抗体可变区的序列来构建ScFv抗体。5T4 ScFv的编码序列称为5T4ScFv.1(SEQ ID No 1)，示于图1中。在这种分子中，所述DNA序列编码来自小鼠5T4单克隆抗体的VH、后接一个15个氨基酸的柔性接头和小鼠5T4抗体的VL区。所述柔性接头编码3个拷贝的氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser，并且所述重复序列之间的DNA序列相似性已被减至最小，以避免含有所述重复序列的质粒在大肠杆菌中生长时在所述重复序列之间重组的危险。DNA盒
盒1-翻译起始信号和信号肽
为了达到正确的翻译起始和从哺乳动物细胞中分泌，使用以下序列：aagcttCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCC
该序列含有一个便利的HindIII限制性位点(用于克隆到表达载体)(小写)、哺乳动物细胞的共有翻译起始信号(ANNATGPu)和免疫球蛋白基因信号肽序列的编码序列。
盒2-scFv
图1显示了5T4ScFv.1的分泌部分的序列。该分子可以以Vh-(gly4-ser)3接头-V1来表示。
5T4 ScFv2 Ab由以顺序V1-柔性接头Vh连接的5T4可变区序列构成。在这种情况下，所述接头编码20个氨基酸的肽(gly4-ser)4。当所述V区区段以这种顺序存在时，较长的接头改善ScFv的装配。(Pluckthun等，Antibody Engineering：a practical approach，McCafferty等编著，1996OUP)。5T4特异性ScFv的表达
为了在人类细胞中表达5T4特异性ScFv，将所述编码序列插入到载体pCIneo(Promega)中，置于强启动子和聚腺苷酸化信号的控制之下。在编码区5’端的来自盒1的翻译起始信号和免疫球蛋白前导(信号肽)序列，确保所述ScFv从哺乳动物细胞有效地分泌。实施例2-用编码ScFv Ab的表达载体转染巨噬细胞/单核细胞
以实验室规模，采用标准技术程序(Sandlie和Michaelsen 1996，载于：Antibody engineering：a practical approach.McCafferty等编著，第9章)，以及以大规模通过淘析法(例如得自CellPro的Ceprate)，从人外周血分离外周血单核细胞。通过过夜粘着至塑料上，富集粘着细胞(基本上是单核细胞)，通过培养粘着细胞达1-3周，可以让细胞沿巨噬细胞分化途径分化。
用能够在人类细胞中表达ScFv Ab的表达载体转染单核细胞和巨噬细胞。对于组成型高水平表达，在利用hCMV-MIE启动子-增强子的载体pCI(Promega)中表达所述ScFv Ab。对于低氧诱导型表达，用含有至少一个HRE的启动子取代hCMV启动子。一种合适的启动子是具有3个拷贝小鼠PGK HRE的截短的HSV TK启动子(Firth等，1994Proc.Natl.Acad.Sci.91：6496-6500)。
可以用各种各样的转染法，将载体导入单核细胞和巨噬细胞中，包括粒子介导的DNA传递(基因枪)、电穿孔、阳离子剂介导的转染(例如采用Superfect，Qiagen)。按照生产商的说明，实施这些方法中的每种，并且考虑改变所述参数，以获得各个生产商具体描述的最佳结果。或者，可以使用病毒载体，例如缺陷型腺病毒载体(Microbix Inc或Quantum Biotechnololes Inc)。实施例3-B7-ScFc融合蛋白的构建
B7-1的胞外结构域由天然人B7-1蛋白的氨基酸残基1-215来限定。该序列与其信号肽编码序列一起，用来构建分泌型融合蛋白，所述融合蛋白也含有来源于所述5T4单克隆抗体的ScFv。在图1中给出了所述5T4 ScFv的序列。
采用标准分子生物学技术，构建一种DNA编码序列，该DNA编码序列编码其中所述5T4 ScFv的N末端融合于人B7-1的氨基酸215之后的融合蛋白。该编码序列B7-1.5T4.1的序列(SEQ ID No 7)示于图2。该融合蛋白在B7-1序列和5T4 ScFv序列之间含有一个柔性(gly-gly-gly-gly-ser)间隔区。在接头插入末端(始于核苷酸733)导入一个便利的BamHl限制性位点，也使得可以筛选其它接头，以供双功能融合蛋白最佳表达用。图3以图式形式显示了该融合蛋白。同样可能的是构建B7-1.5T4.2(图3b)，在B7-1.5T4.2中，所述ScFv是N末端，而B7胞外结构域是C末端。在这种情况下，仅需要成熟B7-1的编码序列(无信号肽)。在这种情况下，将信号肽例如免疫球蛋白的前导序列加至所述ScFv的N末端。
对于使用B7-2的共同刺激胞外结构域(Gerstmayer等1997 JImmunol 158(10)：4584-90)的融合蛋白而言，用B7-2的信号肽和胞外结构域取代B7-1的序列。图4显示了SCM B7-2.5T4.1共同刺激结构域的编码序列。它编码前接其信号肽的人B7-2的前225个氨基酸和一个柔性接头(gly4-ser)。在该序列末端的BamHI位点可以用来将所述结构域插入5T4ScFv.1上游(参见图3)。该序列包括所述B7-2的信号肽，所述信号肽可以用来让该融合蛋白分泌，在所述融合蛋白中，所述B7-2结构域位于融合蛋白的N末端。
将每种工程cDNA插入哺乳动物表达载体pCI中，以允许在哺乳动物组织培养细胞中表达。为此，将一个接头序列加至该编码序列的5’端，该接头序列导入一个用以插入pCI多接头中的便利的限制性位点，并且紧邻第一个ATG密码子加入翻译起始信号CCACC。将pCI中的构建体转染到合适的哺乳动物宿主细胞系(例如COS-1)中，以证实所述SCM的分泌。随后将来自pCI的转录盒或所述转录盒的合适区段亚克隆到该表达载体中，以用作用于治疗应用的基因传递系统。实施例4-用编码含分泌型共同刺激分子(SCM)的ScFv Ab的表达载体转染巨噬细胞/单核细胞
以实验室规模，采用标准技术程序(Sandlie和Michaelsen 1996，载于：Antibody engineering：a practical approach.McCafferty等编著，第9章)，以及以大规模通过淘析法(例如得自CellPro的Ceprate)，从人外周血分离外周血单核细胞。通过过夜粘着至塑料上，富集粘着细胞(基本上是单核细胞)，通过培养粘着细胞达1-3周，可以让细胞沿巨噬细胞分化途径分化。
用能够在人类细胞中表达含SCM的ScFv Ab的表达载体转染单核细胞和巨噬细胞。对于组成型高水平表达，在利用hCMV-MIE启动子-增强子的载体pCI(Promega)中表达所述SCM。对于低氧诱导型表达，用含有至少一个HRE的启动子取代hCMV启动子。一种合适的启动子是具有3个拷贝小鼠PGK HRE的截短的HSV TK启动子(Firth等，1994 Proc.Natl.Acad.Sci.91：6496-6500)。
可以用各种各样的转染法，将载体导入单核细胞和巨噬细胞中，包括粒子介导的DNA传递(基因枪)、电穿孔、阳离子剂介导的转染(例如采用Superfect，Qiagen)。按照生产商的说明，实施这些方法中的每种，并且考虑改变所述参数，以获得各个生产商具体描述的最佳结果。或者，可以使用病毒载体，例如缺陷型腺病毒载体(Microbix Inc或Quantum Biotechnologies Inc)。实施例5-SCM与CTLA-4和5T4抗原表达细胞结合的分析
预期ScFv Ab-SCM融合蛋白的B7-1或B7-2结构域与人T细胞上存在的CD28和CTLA-4特异性地结合。与用人CTLA-4或CD28转染的T细胞或中国仓鼠卵巢细胞的结合，采用FACS分析如下测定。将5×105表达CTLA-4的靶细胞或缺乏CTLA-4的等同细胞(未转染的CHO细胞)与0.1ml得自用SCM基因瞬时转染的COS-1细胞的培养上清液一起于4℃孵育1小时。洗涤所述细胞，并且与1mg后接FITC标记的山羊抗小鼠IgG(Pharmingen)、对所述B7结构域特异性的单克隆抗体(例如Mab 9E10)一起孵育，然后通过FACS分析。
同样采用表达5T4抗原的靶细胞(5T4转染的A9细胞)或对照细胞(A9)，评估ScFv与5T4抗原的结合。实施例6-共同刺激活性的分析
用插入到表达载体pCIneo中的编码人5T4抗原的cDNA(Myers等1994 J.Biol.Chem.269：9319-9324)，转染Balb/c来源的已建立的小鼠细胞系，例如HC11细胞。
通过标准方法(Johnstone和Thorpe 1996载于：Immunochemistry inPractice.Blackwell.第4章)分离来自Balb/c小鼠的脾T细胞。通过在含10ng/ml PMA(Sigma)和100U/ml人IL-2(Boehringer Mannheim)的培养基中培养1-2天，预先刺激T细胞。将HC11-5T4细胞在96孔组织培养板中以104细胞/孔，与至多0.1ml得自用SCM基因转染的COS细胞的上清液一起孵育2小时。每孔中加入至多105预先刺激的T细胞，所述细胞用0.25 mCi/孔的3H-胸苷进行脉冲处理，并且在24小时后用液体闪烁计数器测量3H-胸苷的掺入。实施例7-在动物模型中分析共同刺激
使用人5T4抗原基因转染的HC11细胞在Balb/c小鼠中生长为肿瘤。在植入之前，将SCM基因B7-1.5T4.1或B7-2.5T4.1或这两种基因的组合导入所述肿瘤细胞中，监测所述肿瘤的生长和在体内不表达SCM基因的对照肿瘤的生长。实施例8-对人5T4特异性的B7-1/ScFv融合蛋白的构建
用标准分子生物学技术，构建一种融合蛋白，该融合蛋白由通过一个柔性接头与对人5T4特异性的鼠Mab 5T4的VH和VL融合的B7-1前导序列和胞外结构域构成。
用以下寡核苷酸：上游寡核苷酸5′GGG GGT GGT GGG AGC GGT GGT GGC GGC AGT GGC GGC GGC GGA A3′和下游寡核苷酸5′CTA GTT CCG CCG CCG CCA CTG CCG CCA CCA CCG CTC CCA CCACCC CC3′通过将具有工程5’SmaI和3’SpeI位点两种同源寡核苷酸退火，构建用来连接B7.1的胞外结构域和所述ScFv的柔性接头。
将该接头通过SmaI和SpeI克隆到pBluescript(Stratagene)中，产生pLINK。通过导入5’EcoRI和3’SmaI位点的引物，从pLK444-mB7.1(由R.Germain NIH，USA供应)，通过PCR扩增鼠B7.1的信号肽(sp)和胞外结构域-正向引物5′C TCG AAT TCC ACC  ATG GCT TGC AAT TGT CAG TTG ATG C3′反向引物5′CTC CCC GGG CTT GCTATC AGG AGG GTC TTC 3′将B7.1 PCR产物通过Eco RI和Sma I克隆到pLINK中，形成pBS/B7Link。
通过引入5’Spe I和3’NotI位点的引物，从pHEN1-5T4 ScFv扩增5T4特异性ScFv的VH和VL，正向引物5′CTC ACT AGT GAG GTC CAG CTT CAG CAG TC 3′反向引物5′CTC GCG GCC GCT TAC CGT TTG ATT TCC AGC TTG GTG CCT CCA CC3′用SpeI和NotI消化PBS/B7Link，并与所述ScFv连接，形成由SEQ IDNo 11所示序列构成的OBM233：B7 Link ScFv序列(图5)。
该融合体可以用来构建重组载体，例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、痘病毒、痘苗病毒、杆状病毒。这类载体可以用来直接注射到患者肿瘤中。为了将所述融合蛋白传递至肿瘤细胞，用所述重组载体转导离体的巨噬细胞/单核细胞/CD34+细胞，然后将其注射回患者体内。这些细胞将运输至肿瘤。所述ScFv将结合于肿瘤细胞表面上表达的特定肿瘤抗原(例如5T4)(Myers等1994JBC)上。B7存在于专门的抗原呈递细胞(例如巨噬细胞、树突细胞和B细胞)表面上。它与其配体CD28和位于CD4细胞和CD8细胞上的CTL-A4相互作用。B7-CD28/CTL-A4和MHC-肽/T细胞受体同时相互作用，导致促进CD8(细胞毒性T细胞)扩充的IL-2的显著增加(Linsley PS，Brady W，GrosmaireL，Aruffo A，Damle NK，Ledbetter JA J Exp Med 1991年3月1日；173(3)：721-730B细胞活化抗原B7与CD28的结合共同刺激T细胞增殖和IL-2mRNA的积累)。已经用B7转染的肿瘤细胞在动物模型中显示出阻滞(Townsend SE，Allison JP Science 1993 15；259(5093)：368-370)。实施例9-B7-1/ScFv和前导序列ScFv(LScFv)的瞬时表达和纯化
对于B7-1/ScFv的瞬时表达，使用人CMV表达质粒pCIneo(Promega)。通过用EcoRI/NotI消化，从OBM233上切下B7/ScFv，将其克隆到用EcoRI/NotI预先消化的pCIneo中。通过利用磷酸钙，用相关的质粒转染293T细胞(Profectin，Promega)，进行重组蛋白的瞬时表达。采用的条件与生产商建议的条件相似。为了降低牛血清污染，使用无血清最适培养基(serum feee optimum media)(Gibco BRL)。36-48小时之后，收获转染上清液，通过Centriprep(Amicon，Glos.UK)10滤器(纯化/浓缩大于10kDa的所有蛋白质)和Centricon(Amicon)10滤器离心(spin)。上清液被浓缩大约30倍。
对于具有生物学功能的B7-1而言，它必须能够显示出与特定T细胞群(例如CD4+)表面上存在的其天然配体之一(或者CTLA-4或者CD28)结合。分析B7-1/ScFv融合蛋白与其天然配体CTLA-4(为CTLA4-Ig形式，由Ancell，MN，USA供应)和表达人5T4的A9细胞同时相互作用的生物活性。简而言之，让大约5×105A9-h5T4细胞与100ul或者B7.1/ScFV或者LScFv上清液一起在U形底的96孔板中于4℃孵育1小时。洗涤后，让细胞与CTLA4-Ig(Ancell)一起孵育1小时。洗涤后，用FITC缀合的抗小鼠Ig(Dako)检测结合的CTLA4-Ig。
结果表明，具有CTLA-Ig与通过所述ScFv结合的B7-1胞外结构域明显结合于人5T4阳性A9细胞的表面。缺乏与5T4阴性A9细胞的结合活性，进一步说明B7与CTLA4-Ig以及ScFv与5T4的相互作用是特异性的。实施例10-ScFv-IgG融合体实施例ScFv-IgG的构建
编码一个翻译起始序列和人免疫球蛋白κ轻链信号肽的序列，以两种互补的单链寡核苷酸来合成，这两种寡核苷酸当退火时，在5’端也含有一个内部XhoI位点，并且另外还留下一个XbaI匹配的5’突出端和一个PstI匹配的3’突出端，ctagactcgagCCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTAGCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC GAG GTC CAG ctgca和g CTG GAC CTC GGA GTG GAC ACC TGT AGC TGT TGC TAC CAA GAAGAG GAT GAT ACA GCT CCA TCC CAT GGTGGctcgagt然后，将其克隆到用XbaI和PstI限制的pBluescript II(Stratagene)中，产生pBSII/Leader。
使用在产物的5’端掺入一个PsfI位点和在3’端掺入一个HindIII的寡核苷酸：GTC CAG CTG CAG CAG TCT GG和CG TTT GAT TTC AAG CTT GGT GC通过PCR从pHEN1中扩增5T4 ScFv。将其用那些酶来限制，并插入到用相同的酶限制的pBSII/Leader中，产生pBSII/Leader/ScFv。
使用在5’端掺入一个Hind III位点和在3’端掺入一个XhoI的寡核苷酸：gcgc AAG CTT gaa atc aaa cgg GCC TCC ACC AAG GGC CCA和gcgc ctcgag TCA TTT ACC CGG AGA CAG GG通过PCR从所克隆的基因中扩增HIgG 1恒定区。然后将其用那些酶来限制，并插入到用相同的酶限制的pBSII/Leader/ScFv中，产生pBSII/Leader/ScFv/HG1。该构建体的序列示于图4(SEQ ID No 10)。
该融合体可以用来构建重组载体，例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、痘病毒、痘苗病毒、杆状病毒。这类载体可以用来直接注射到患者肿瘤中。为了将所述融合蛋白传递至肿瘤细胞，用所述重组载体转导离体的巨噬细胞/单核细胞/CD34+细胞，然后将其注射回患者体内。这些细胞将运输至肿瘤。所述ScFv将结合于肿瘤细胞表面上表达的特定肿瘤抗原例如5T4(Myers等1994 JBC)上。结合的IgG将通过统称为依赖于抗体的细胞的细胞毒性的机制的集合，促进特异性的肿瘤破坏(Munn等Can res 1991出处同上，Primus等1993 Cancer Res出处同上)。实施例11-ScFv-IgE1(人IgE1重链恒定区)的构建
制备5T4 ScFv-人IgE重链恒定区的相似的融合构建体，该构建体由示于图7的序列(SEQ ID No.12)构成。
从通过RT从人B细胞RNA获得的cDNA，用在5’端掺入一个HindIII位点和在3’端掺入一个XhoI位点的寡核苷酸：gcgc AAG CTT gaa atc aaa cgg GCC TCC ACA CAG AGC CCA和gcgc ctcgag TCA TTT ACC GGG ATT TAC AGA通过PCR扩增人IgE1重链恒定区，制备该融合构建体。然后将其用那些酶来限制，并插入到用相同的酶限制的pBSII/Leader/ScFv中，产生pBSII/Leader/ScFv/HE1。
如上所述，可以将所述ScFv-IgE构建体加入到重组病毒载体中，用于癌症的基因治疗，例如直接注射到患者组织中，或转导得自患者的离体巨噬细胞/单核细胞/CD34+细胞。该融合蛋白将分泌出来，并且结合于带有所述ScFv对其特异性的抗原的肿瘤细胞上。IgE与肿瘤细胞的结合，应该通过激活肥大细胞，促进强的组胺应答。这将导致强的炎症反应和破坏肿瘤细胞，正如关于IgE对寄生虫例如蠕虫幼虫的细胞毒性破坏所报道的(Capron M 1988疾病中的嗜酸性粒细胞：受体和介质。载于：Progress in allergy and clinical immunology(Proc.13thInt.Congress of Allergy and Clinical Immunology)Hogrefe和Huber Toronto第6页)。这种炎症和肿瘤破坏，应该起动其它免疫效应细胞的募集。过去的报道表明，用MMTV抗原特异性IgEMab治疗，引起抵抗表达MMTV抗原的肿瘤的保护作用(Nagy E Istanvan B，Sehon AH 1991Cancer Immunol.Immunotherapy 34：63-69)。实施例12-B7/EGF的构建B7-EGF合成基因
从编码成熟EGF肽的基因(参见登记号X04571)的区中扩增PCR产物，通过将所述PCR产物插入pBS/B7 Link中，制备B7-EGF的融合构建体。该构建体具有示于图8的序列(SEQ ID No.13)。
通过对从细胞系例如293人肾细胞系(ATCC：CRL1573)分离的RNA进行RT获得cDNA，采用所述cDNA，采用在N末端含有一个SpeI限制性酶切位点和在C末端含有一个终止密码子和一个NotI位点的寡核苷酸：GG ACT AGT AAT AGT GAC TCT GAA TGT CCC和ATT AGC GGC CGC TTA GCG CAG TTC CCA CCA CTT C通过PCR扩增所述DNA。用那些酶消化所产生的产物，连接到已经用相同的酶限制的pBS/B7Link中，产生pBS/B7Link EGF。然后用EcoRI和NotI切下所述B7Link EGF盒，将其插入到不再带有LazZ基因的pHITll1(Soneoka等，1995，Nucl Acid Res 23：628)的衍生物中。
替代使用ScFv的一个方法是使用对其相应受体具有高亲和性的生长因子，例如与几种受体(包括与肿瘤发生高度相关的erb-2)结合的表皮生长因子。
如上所述，可以将所述融合构建体加入到重组病毒载体中，用于基因治疗，例如直接注射到患者组织中，或离体转导患者来源的巨噬细胞/单核细胞/CD34+细胞。所述融合蛋白将分泌出来，并将结合于带有erb-2抗原的肿瘤细胞。
表皮生长因子(EGF)将与其配体erb-2(一种EGF受体)结合，因而消除了对ScFv的需求。erb-2与肿瘤细胞高度相关(Hynes NE SeminCancer Biol 1993年2月；4(1)：19-26，人类肿瘤中erbB-2基因的扩增和超量表达：它涉及肿瘤的发生，作为预后因素的重要性和作为癌症治疗靶的潜力)。B7存在于专门的抗原呈递细胞(例如巨噬细胞、树突细胞和B细胞)表面上。它与其配体CD28和位于CD4细胞和CD8细胞上的CTL-A4相互作用。B7-CD28/CTL-A4和MHC-肽/T细胞受体同时相互作用，导致促进CD8(细胞毒性T细胞)扩充的IL-2的大量增加(Linsley PS，Brady W，Grosmaire L，Aruffo A，Damle NK，Ledbetter JA JExp Med 1991年3月1日；173(3)：721-730 B细胞活化抗原B7与CD28的结合共同刺激T细胞增殖和白介素2mRNA的积累)。已经用B7转染的肿瘤细胞在动物模型中显示出阻滞(Townsend SE，Allison JPScience 1993 15；259(5093)：368-370直接共同刺激CD8+T细胞后B7转染的黑素瘤细胞对肿瘤的排斥)。已经报道，B7将增强对肿瘤细胞特有的肿瘤抗原的CTL应答，从而导致对所有这类细胞的破坏。实施例13-表达融合构建体的细胞系的产生
通过XhoI消化，从pBSII/L/ScFv/hIgGl切下ScFv-IgG基因，通过XhoI位点将其克隆到pLXSN中，产生pLXSN/ScFv-IgG，使得在染色体整合后，它处于LTR的转录控制之下。采用三联质粒HIT系统(Landau和Littman 1992 J Virol 66，5110，Soneoka Y等1995 NAR23：628-633)，通过共同转染含有MLV gap-pol基因的质粒(pCIEGPPD)和包含VSV G包膜的质粒(pRV67)，在人肾细胞系293T中制备病毒。48小时后收获病毒，将其用来转导BHK-21细胞(ATCC#CCL-10)。转导后大约24小时，通过添加1mg/ml G418(Gibco BRL)至培养基中，选择转导的细胞。收获得自阳性菌落的上清液，通过Centriprep(Amicon，Glos，UK)10滤器(纯化/浓缩大于10 kDa的所有蛋白质)和Centricon(Amicon)10滤器离心进行浓缩。上清液被浓缩约30倍。
将其它融合蛋白通过XhoI位点克隆到pLXSN中，采用相似的方案进行表达和浓缩。融合蛋白与表达特异性配体的细胞结合的FACS分析
为了确定所述ScFv-IgG融合蛋白是否对其抗原-人5T4是特异性的，对人膀胱癌肿瘤系(EJ)或表达h5T4的稳定的鼠细胞系A9-h5T4(Myers等1994 JBC)以及5T4阴性系A9-neo进行FACS分析。在圆底96孔板(Falcon)中，将约5×105A9细胞或EJ细胞与100ul经浓缩的上清液(如上所述)的1∶5稀释液一起于4℃温育1小时。洗涤后，用抗人IgG/FITC缀合抗体(Dako)检测结合的蛋白。在Becton DickinsonFACS仪上分析细胞。FACS结果表明，与仅由所述ScFv蛋白构成的阴性对照构建体相比，用所述ScFv-IgG构建体处理的那些5T4阳性细胞中，荧光活性有至少1log的位移。A9 neo FACS表明，没有所述融合蛋白的ScFv组分的非特异性结合。
与上述相似地进行ScFv-IgE的FACS分析，只是用抗人IgE-FITC(Dako)检测所述融合蛋白的结合。
用FACS和HCll-erb-2阳性细胞，分析所述B7/EGF融合蛋白的结合(Hynes等1990)。用CTLA4-Ig(Ancell，USA)来分析结合的融合蛋白的B7组分的生物活性。用抗小鼠IgG-FITC来显示CTLA-4结合。融合蛋白的分析B7-scFv的FACS分析
如下所述，通过从稳定转染的BHK-21细胞系表达，产生重组蛋白(以允许鉴定以及纯化)。在质粒pCIneo(Promega)中scFv的C末端(图13B)。为了证实所述scFv能够与所述5T4抗原结合，将来自这些细胞和来自模拟转染的293T细胞的上清液加至表达h5T4的小鼠A9细胞(具有h5T4/新霉素抗性表达构建体的稳定转染子)。用FITC缀合的αHis或αMyc抗体检测，证实所述scFv与A9-5T4细胞结合，但不与5T4阴性A9 neo细胞结合，表明所述融合构建体能够结合所述靶抗原(图14)。
进行进一步的FACS分析，表明B7-scFv蛋白能够同时结合B7.1配体CTLA4以及表达h 5T4的细胞。将A9 5T4细胞和A9 neo细胞与单独的所述scFv、缺乏Myc-His标记的B7-scFv构建体或具有所述标记的B7-scFv构建体一起孵育。加入B7.1配体CTLA4-Ig，并且用FITC缀合的α小鼠IgG检测(图15)。Myc-His标记的存在与否，对所述蛋白与5T4抗原和CTLA-4的同时结合产生很小的差异。5T4 scFv HIgG1蛋白的分析
通过用含有在CMV立即早期启动子控制之下的或者单独的5T4scFv或者5T4scFv-Hg1融合体(分别为图13A和C)的构建体稳定转染BHK-21细胞，产生重组蛋白。图16显示了小鼠A9 5T4细胞的FACS分析。将所述细胞与来自或者表达单独的scFv或者scFv-HG1的BHK-21细胞的细胞上清液一起孵育，然后与山羊抗人IgG-FITC标记抗体一起孵育。正如可以观察到的，scFv-HG1能够结合表达5T4的细胞，并且可以用山羊抗人IgG-FITC标记抗体检测到。图16b表明，这是由于在细胞表面存在5T4，因为用表达新霉素抗性标记、但不表达h5T4的A9细胞没有观察到结合。
将上述上清液用于依赖于抗体的细胞介导细胞毒性(ADCC)测定中，证明scFv-Hλ1融合蛋白能够指导A9 5T4细胞的裂解。将A9 5T4和neo细胞系用于铬释放测定中。在用51Cr标记后，将细胞或者与无蛋白单独的scFv或者与scFv-Hγ1融合构建体一起孵育。加入新鲜分离的外周血淋巴细胞，并孵育4小时。取1等份上清液进行闪烁计数。裂解百分率计算为： 与单独的scFv比较时，随着效应子：靶比率的增加，获得至多约40％的裂解。5T4阴性细胞系没有表现出裂解增加(图17)。实施例14-在动物模型中的功效分析
按照很好建立的技术(参见例如Strobel等1997 Cancer Res.57：1228-1232；McLeod等1997 Pancreas 14：237-248)，将人类肿瘤来源的细胞系和组织在遗传免疫缺陷型“裸”鼠中进行体内培养。也可以使用其中将同源肿瘤系导入免疫活性小鼠品系的同源小鼠模型。这些用作适合于评估本发明基因传递系统的动物模型。将载体或工程细胞系统给予或直接给予到肿瘤中，在受治疗和未治疗动物体内监测肿瘤的生长。该系统用来确定本发明治疗的有效剂量范围和最合适的给药途径。ScFv融合蛋白的体内抗肿瘤功效的数据
该项研究的目的是测试一系列单链抗体融合蛋白的功效。
小鼠模型基于CT26(一种BALB/c来源的化学诱导性腺癌)(Brittain等(1980)Cancer Res.40：179-184)和基于B16(一种来源于C57 B6小鼠的黑素瘤系)。CT26系和B16系都被稳定转化，表达人和鼠5T4。给小鼠静脉内注射(以诱发肺部小节，CT26)或皮下注射(CT26和B16)，以产生单个的皮下大肿瘤。实验设计表达人5T4的CT26细胞(CT26-h5T4)和CT26-neo
将细胞与以下物质预孵育：PBS、LScFv-1、LScFv-2、B7-ScFv、ScFv-Ig。
LScFv-1和LScFv-2在BHK细胞系中表达。LScFv-1通过其组氨酸标记在镍柱上纯化，而ScFv-2采用过滤系统纯化。B7-ScFv通过His标记从BHK系中纯化，而ScFv-Ig通过过滤柱纯化。用于该实验的每种ScFv的浓度以在FACS测定中CT26-h5T4细胞的饱和结合所需的蛋白量来限定。
将CT26-h5T4和CT26-neo细胞与饱和量的每种ScFv一起预孵育，然后孵育1小时。洗涤细胞后，将5×105细胞皮下注射到同源BALB/c小鼠的胁腹中。
每两天进行肿瘤测量，并计算体积。结果14图9：CT26-neo
除用LScFv-1治疗外，在所研究的各组之间没有显著差异，对于LScFv-1而言，在肿瘤接种后36天，与PBS对照相比，肿瘤大小减至约三分之一。图10：CT26-h5T4
用所有的5T4 ScFv构建体治疗的肿瘤都对肿瘤生长有显著影响。用5T4 ScFv-1治疗的5只小鼠中的4只在第36天时没有肿瘤。第36天时，经ScFv-1治疗的肿瘤细胞是用PBS治疗的肿瘤的60分之一以下。
当用工程改造以表达h5T4的小鼠黑素瘤系(B16)进行相似的实验时，用所用的ScFv构建体发现最小的抗肿瘤效应(参见图11和图12)。CT26看来对ScFv结合所诱发的抗肿瘤免疫应答比B16细胞更为敏感。另外，B16细胞不表达鼠5T4，而CT26细胞具有鼠5T4的mRNA。
总之，看来在CT26和B16鼠模型中，将B7或IgG与5T4特异性ScFv融合没有益处。事实上，我们已经发现，在我们的实验中，单独的ScFv比ScFv融合构建体更为有效，因为其结合亲和性更高(如BIACORE中所示，与B7-ScFv相比)。因此，这些数据表明，在所述5T4模型中，单独的ScFv对肿瘤阻滞有显著的效应，可能不需要与所述ScFv融合的免疫增强分子来显示对肿瘤阻滞的效应。实施例15-表达所述融合构建体的慢病毒载体的产生将B7-5T4 scFv和L-5T4 scFv克隆到pONY 8.1SM中
pONY8.1SM(图18)是一种在CMV启动子下游具有4个单一克隆位点的EIAV载体。它可从WO99/32646的图1中所示的载体衍生。鉴于它含有的EIAV序列(～1.1kb)和它所表达的EIAV蛋白(无)，pONY8.1SM是一种迄今最小的EIAV载体。
为了将B7-5T4 scFv和Leader-5T4 scFv(L-5T4 scFv)克隆到pONY8.1SM中，采用以下所示的引物，通过PCR从先前克隆到pBluescript II的构建体(参见实施例8和10)扩增所述序列，以在所述基因的5’端掺入一个SbfI位点和在终止密码子后掺入一个Eco RI位点。然后将所述产物直接连接至用相同的酶预先消化的pONY 8.1SM。对于B7-5T4 scFv，所述引物如下所示：引物1.B7-Sbf SbfI位点＝下划线Kozak序列＝粗体和斜体，并且用下划线标注ATG起始密码子。引物2.5T4sc-RI
Figure A0081841600772
Eco RI位点＝下划线TAA终止密码子＝粗体和斜体
然后将所得的产物克隆到pONY 8.1SM中，产生图19a中所示的融合蛋白构建体。对于L-5T4 scFv，所述引物如下所示：引物1.L-Sbf
Figure A0081841600781
SbfI位点＝下划线Kozak序列＝粗体和斜体，并且用下划线标注ATG起始密码子。引物2.5T4sc-RI
Figure A0081841600782
Eco RI位点＝下划线TAA终止密码子＝粗体和斜体
然后将所得的产物克隆到pONY 8.1SM中，产生图19b中所示的构建体。IL-5特异性的scFv的装配和克隆
采用由杂交瘤系例如表达抗IL-5的人源化Mab SB 240563(Leckie，MJ，Am.J.Respir.Crit.Care Med.159，A624 1999)的杂交瘤系制备的物质，通过RT-PCR装配抗IL-5 scFv。技术类似于Clackson等描述的技术(遗传工程单克隆抗体。Br.J Rheumatol.1991；30增刊2：36-9)。简而言之，由SB 240563细胞制备总RNA。运用oligo dT引物，采用MMLV逆转录酶进行第一条链的合成。用VH和VL基因特异性引物对，通过PCR扩增模板cDNA，所述引物对例如为如下所示的，包含限制性酶切位点以允许克隆到pKLink中，pKLink是一种pBluescript II SK(pBSII)质粒，含有一个柔性接头序列(Gly4Ser)3(图20)。这构成了单链抗体cDNA(图19)。然后，将与scFv-5T4构建中描述的(参见实施例10)相似的双链寡核苷酸克隆到所述scFv上游，所述双链寡核苷酸编码一个翻译起始序列、Kozak序列和用于分泌的人Igκ轻链信号肽(图21)。
然后，用SbfI和Eco RI切下完整的构建体，将其克隆到pONY8.1SM中(图22)。HIV包膜蛋白gp120特异性的scFv的装配和克隆
由表达抗HIV包膜蛋白gp120的mAb例如mAb 110.3(Conelly等，Virology 295：554-557，1994)的杂交瘤系制备的物质，通过RT-PCR装配抗HIV scFv。或者，利用指导的选择(guided selection)来制备人源化抗体(参见Beiboer SH等，J Mol Biol，2000；296：833-849)，然后由其衍生所述scFv。技术类似于Clackson等描述的技术(遗传工程单克隆抗体。Br J Rheumatol.1991；30增刊2：36-9)。简而言之，由所述杂交瘤细胞制备总RNA。运用oligo dT引物，采用MMLV逆转录酶进行第一条链的合成。用VH和VL基因特异性引物对，通过PCR扩增模板cDNA，所述引物对例如为如下所示的，包含限制性酶切位点以允许克隆到pKLink中，pKLink是一种pBluesc如t II SK(pBSII)质粒，含有一个柔性接头序列(Gly4Ser)3(图20)。这构成了单链抗体cDNA(图21)。然后，将与scFv-5T4构建中描述的(参见实施例10)相似的双链寡核苷酸克隆到所述scFv上游，所述双链寡核苷酸编码一个翻译起始序列、Kozak序列和用于分泌的人Igκ轻链信号肽(图19)。
然后，用Sbf I和Eco RI切下完整的构建体，将其克隆到pONY8.1SM中(图18)，产生图23中所示的构建体。实施例16-表达所述融合构建体的腺病毒载体的产生表达5T4scFv融合构建体IL-5 scFv和HIVgp120scFv的重组腺病毒的产生将B7-5T4 scFv和L-5T4 scFv克隆到pAdApt中
在CMV启动子下游具有8个单一克隆位点的腺病毒转移载体(pAdApt；参见图24)可得自Crucell，Leiden，Netherlands。
为了将B7-5T4 scFv和Leader-5T4 scFv(L-5T4 scFv)克隆到pAdApt中，从先前克隆到pBluescript II中的构建体(参见实施例8和10)切下所述序列，然后如下连接到所述载体中：对于B7-5T4 scFv：
用XhoI切下B7-scFv，补平以产生平端，然后用Eco RI消化。然后将该片段与用HpaI和Eco RI预先消化的pAdApt载体连接(图25A)。对于L-5T4 scFv：
用XbaI消化L-5T4 scFv，补平以产生平端，然后与用HpaI预先消化的pAdApt载体连接。然后对后来的克隆检查L-5T4 scFv插入片段的正确定向(图25B)。将IL-5特异性scFv克隆到pAdApt中
克隆到pBSII中的L-scFv(参见实施例13)用XbaI消化，补平以产生平端，然后用Eco RI消化。pAdApt载体用HindIII消化，补平以产生平端，然后用Eco RI消化。然后将这两种分子连接，产生类似以上图25B的重组转移载体(只是Eco RI限制性位点在融合构建体的3’端，所述基因的5’端邻接补平的HindIII位点)。HIV包膜蛋白gp120特异性scFv的克隆
克隆到pBSII中的L-scFv(参见实施例13)用XbaI消化，补平以产生平端，然后用Eco RI消化。pAdApt载体用HindIII消化，补平以产生平端，然后用Eco RI消化。然后将这两种分子连接，产生类似以上图25B的重组转移载体(只是Eco RI限制性位点在融合构建体的3’端，所述基因的5’端邻接补平的HindIII位点)。表达所述scFv融合构建体的重组腺病毒的产生
为了产生表达所述scFv融合构建体的重组腺病毒，用等摩尔量的含有所述融合构建体的重组转移载体和腺病毒基因组(Genome)载体(AdEasy，得自Quantum Apligene，Harefield UK)转染PerC6细胞。然后按照Crucell方案中的描述，收获重组病毒。总结
因此，本发明提供能够识别疾病相关细胞表面标记(DAM)的抗体。这些抗体可以用于诊断和治疗与DAM相关的疾病。
在以上说明书中提及的所有出版物通过引用结合到本文中。在不偏离本发明范围和精神的情况下对本发明所述方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员是显而易见。虽然结合具体优选实施方案描述了本发明，但应该理解，要求保护的本发明不应该被过分限于这类具体的实施方案。实际上，本发明将包括对分子生物学或相关领域技术人员显而易见的所述实施本发明的模式的各种修改。
                            序列表<110>牛津生物医学(英国)有限公司(Oxford Biomedica(UK)Limited)
Kingsman，Alan<120>抗体<130>P8161WO CTH<140>PCT/GB00/04317<141>2000-11-13<160>37<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>243<212>PRT<213>人工序列<220><223>5T4ScFv.1<400>1Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala1               5                   10                  15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
        20                  25                  30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
    35                  40                  45Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe
50              55                      60Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr65                  70                  75                  80Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
            85                  90                  95Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
        100                 105                 110Val Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
    115                 120                 125Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Thr
130                 135                 140Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala145                 150                 155                 160Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
    165                         170                 175Gln Ser Pro Thr Leu Leu Ile Ser Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly
        180                 185                 190Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe
    195                 200                 205Thr Ile Ser Thr Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln
210                 215                 220Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu225                 230                 235                 240Ile Lys Arg<210>2<211>68<212>DNA<213>人工序列<220><223>Cassette 1-Translation initiation signal and signal peptide<400>2aagcttccac catgggatgg agctgtatca tcctcttctt ggtagcaaca gctacaggtg    60tccactcc                                                   68<210>3<211>488<212>PRT<213>人工序列<220><223>B7-1.5T4ScFv.1<400>3Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr1               5                   10                  15Leu Ash Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys
    20                      25                  30Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu
    35                  40                  45Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile
50                  55                  60Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp65                  70                  75                  80Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr
            85                  90                  95Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly
        100                 105                 110Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg
    115                 120                 125Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Ph Pro Thr
130                 135                 140Pro Ser Ile Ser Asp Phe GIu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile145                 150                 155                 160Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu
            165                 170                 175Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp
         180                185                 190Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met
    195                 200                 205Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg
210                 215                 220Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro225                 230                 235                 240Asp Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp
            245                 250                 255Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly
        260                 265                 270Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly
    275                 280                 285Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr
290                 295                 300Leu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys305                 310                 315                 320Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp
            325                 330                 335Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val
        340                 345                 350Met Asp Tyr Trp Gly Gln Val Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
    355                 360                 365Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ile Val
370                 375                 380Met Thr Gln Thr Pro Thr Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg Val385                 390                 395                 400Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp
            405                 410                 415Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Leu Ile Ser Tyr Thr
        420                 425                 430Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Tyr
    435                 440                 445Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Leu Gln Ala Glu Asp Leu
450                 455                 460Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro Thr Phe Gly465                 470                 475                 480Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            485<210>4<211>592<212>PRT<213>人工序列<220><223>5T4ScFv.1-IgG<400>4Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1               5                   10                  15Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys
        20                  25                  30Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
    35                  40                  45Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu
50                  55                  60Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn65                  70                  75                  80Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr
            85                  90                  95Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
        100                 105                 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr
    115                 120                 125Trp Gly Gln Val Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130                 135                 140Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ile Val Met Thr Gln145                 150                 155                 160Thr Pro Thr Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
            165                 170                 175Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln
        180                 185                 190Lys Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Leu Ile Ser Tyr Thr Ser Ser Arg
    195                 200                 205Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp
210                 215                 220Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr225                 230                 235                 240Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr
            245                 250                 255Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
        260                 265                 270Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
    275                 280                 285Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
290                 295                 300Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln305                 310                 315                 320Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
            325                 330                 335Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
        340                 345                 350Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
    355                 360                 365His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
370                 375                 380Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg385                 390                 395                 400Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
            405                 410                 415Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
        420                 425                 430Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
    435                 440                 445Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
450                 455                 460Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr465                 470                 475                 480Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
            485                 490                 495Pro Pro Ser Arg Asp Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
        500                 505                 510Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
    515                 520                 525Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
530                 535                 540Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser545                 550                 555                 560Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
            565                 570                 575Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        580                 585                 590<210>5<211>729<212>DNA<213>人工序列<220><223>5T4ScFv.1<400>5gaggtccagc ttcagcagtc tggacctgac ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata  60tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctactaca tgcactgggt gaagcagagc  120catggaaaga gccttgagtg gattggacgt attaatccta acaatggtgt tactctctac  180aaccagaaat tcaaggacaa ggccatatta actgtagaca agtcatccac cacagcctac  240atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagatctact  300atgattacga actatgttat ggactactgg ggtcaagtaa cctcagtcac cgtctcctca  360ggtggtggtg ggagcggtgg tggcggcact ggcggcggcg gatctagtat tgtgatgacc  420cagactccca cattcctgct tgtttcagca ggagacaggg ttaccataac ctgcaaggcc  480agtcagagtg tgagtaatga tgtagdttgg taccaacaga agccagggca gtctcctaca  540ctgctcatat cctatacatc cagtcgctac gctggagtcc ctgatcgctt cattggcagt  600ggatatggga cggatttcac tttcaccatc agcactttgc aggctgaaga cctggcagtt  660tatttctgtc agcaagatta taattctcct ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa  720atcaaacgg                                                          729<210>6<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>Flexible linker to join the extracelluar domain of B7.1 and ScFv<400>6gggggtggtg ggagcggtgg tggcggcagt ggcggcggcg gaa                    43<210>7<211>1467<212>DNA<213>人工序列<220><223>B7-1.5T4ScFv.1<400>7atgggccaca cacggaggca gggaacatca ccatccaagt gtccatacct caatttcttt  60cagctcttgg tgctggctgg tctttctcac ttctgttcag gtgttatcca cgtgaccaag  120gaagtgaaag aagtggcaac gctgtcctgt ggtcacaatg tttctgttga agagctggca  180caaactcgca tctactggca aaaggagaag aaaatggtgc tgactatgat gtctggggac  240atgaatatat ggcccgagta caagaaccgg accatctttg atatcactaa taacctctcc  300attgtgatcc tggctctgcg cccatctgac gagggcacat acgagtgtgt tgttctgaag  360tatgaaaaag acgctttcaa gcgggaacac ctggctgaag tgacgttatc agtcaaagct  420gacttcccta cacctagtat atctgacttt gaaattccaa cttctaatat tagaaggata  480atttgctcaa cctctggagg ttttccagag cctcacctct cctggttgga aaatggagaa  540gaattaaatg ccatcaacac aacagtttcc caagatcctg aaactgagct ctatgctgtt  600agcagcaaac tggatttcaa tatgacaacc aaccacagct tcatgtgtct catcaagtat  660ggacatttaa gagtgaatca gaccttcaac tggaatacaa ccaagcaaga gcattttcct  720gatggaggcg ggggatccga ggtccagctt cagcagtctg gacctgacct ggtgaagcct  780ggggcttcag tgaagatatc ctgcaaggct tctggttact cattcactgg ctactacatg  840cactgggtga agcagagcca tggaaagagc cttgagtgga ttggacgtat taatcctaac  900aatggtgtta ctctctacaa ccagaaattc aaggacaagg ccatattaac tgtagacaag  960tcatccacca cagcctacat ggagctccgc agcctgacat ctgaggactc tgcggtctat  1020tactgtgcaa gatctactat gattacgaac tatgttatgg actactgggg tcaagtaacc  1080tcagtcaccg tctcctcagg tggtggtggg agcggtggtg gcggcactgg cggcggcgga  1140tctagtattg tgatgaccca gactcccaca ttcctgcttg tttcagcagg agacagggtt  1200accataacct gcaaggccag tcagagtgtg agtaatgatg tagcttggta ccaacagaag  1260ccagggcagt ctcctacact gctcatatcc tatacatcca gtcgctacgc tggagtccct  1320gatcgcttca ttggcagtgg atatgggacg gatttcactt tcaccatcag cactttgcag  1380gctgaagacc tggcagttta tttctgtcag caagattata attctcctcc gacgttcggt  1440ggaggcacca agctggaaat caaataa                                      1467<210>8<211>1796<212>DNA<213>人工序列<220><223>5T4ScFv.1-IgG<400>8ctcgagccac catgggatgg agctgtatca tcctcttctt ggtagcaaca gctacaggtg    60tccactccga ggtccagctg cagcagtctg gacctgacct ggtgaagcct ggggcttcag    120tgaagatatc ctgcaaggct tctggttact cattcactgg ctactacatg cactgggtga    180agcagagcca tggaaagagc cttgagtgga ttggacgtat taatcctaac aatggtgtta    240ctctctacaa ccagaaattc aaggacaagg ccatattaac tgtagacaag tcatccacca    300cagcctacat ggagctccgc agcctgacat ctgaggactc tgcggtctat tactgtgcaa    360gatctactat gattacgaac tatgttatgg actactgggg tcaagtaact tcagtcaccg    420tctcttcagg tggtggtggg agcggtggtg gcggcactgg cggcggcgga tctagtattg    480tgatgaccca gactcccaca ttcctgcttg tttcagcagg agacagggtt accataacct    540gcaaggccag tcagagtgtg agtaatgatg tagcttggta ccaacagaag ccagggcagt    600ctcctacact gctcatatcc tatacatcca gtcgctacgc tggagtccct gatcgcttca    660ttggcagtgg atatgggacg gatttcactt tcaccatcag cactttgcag gctgaagacc    720tggcagttta tttctgtcag caagattata attctcctcc gacgttcggt ggaggcacca    780agcttgaaat caaacgggcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct    840ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg    900aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg    960ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca    1020gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg    1080acaagaaagt tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac    1140ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca    1200tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg    1260aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc    1320gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg    1380actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca    1440tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc    1500ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct    1560tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca    1620agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg    1680tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc    1740tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtcccc gggtaaatga ctcgag        1796<210>9<211>738<212>DNA<213>人工序列<220><223>B7-2.5T4.1<400>9atgggactga gtaacattct ctttgtgatg gccttcctgc tctctggtgc tgctcctctg    60aagattcaag cttatttcaa tgagactgca gacctgccat gccaatttgc aaactctcaa    120aaccaaagcc tgagtgagct agtagtattt tggcaggacc aggaaaactt ggttctgaat    180gaggtatact taggcaaaga gaaatttgac agtgttcatt ccaagtatat gggccgcaca    240agttttgatt cggacagttg gaccctgaga cttcacaatc ttcagatcaa ggacaagggc    300ttgtatcaat gtatcatcca tcacaaaaag cccacaggaa tgattcgcat ccaccagatg    360aattctgaac tgtcagtgct tgctaacttc agtcaacctg aaatagtacc aatttctaat    420ataacagaaa atgtgtacat aaatttgacc tgctcatcta tacacggtta cccagaacct    480aagaagatga gtgttttgct aagaaccaag aattcaacta tcgagtatga tggtattatg  540cagaaatctc aagataatgt cacagaactg tacgacgttt ccatcagctt gtctgtttca  600ttccctgatg ttacgagcaa tatgaccatc ttctgtattc tggaaactga caagacgcgg  660cttttatctt cacctttctc tatagagctt gaggaccctc agcctccccc agaccacatt  720cctggaggcg ggggatcc                                                738<210>10<211>246<212>PRT<213>人工序列<220><223>B7-2.5T4.1<400>10Met Gly Leu Ser Asn Ile Leu Phe Val Met Ala Phe Leu Leu Ser Gly1               5                   10                  15Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu
        20                  25                  30Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val
    35                  40                  45Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu
50                  55                  60Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr65                  70                  75                  80Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile
            85                  90                  95Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr
        100                 105                 110Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala
    115                 120                 125Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ile Thr Glu Asn
130                 135                 140Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile His Gly Tyr Pro Glu Pro145                 150                 155                 160Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr Ile Glu Tyr
            165                 170                 175Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu Leu Tyr Asp
        180                 185                 190Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Thr Ser Asn Met
    195                 200                 205Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu Leu Ser Ser
210                 215                 220Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln Pro Pro Pro Asp His Ile225                 230                 235                 240Pro Gly Gly Gly Gly Ser
            245<210>11<211>1518<212>DNA<213>人工序列<220><223>B7-ScFv<400>11atggcttgca attgtcagtt gatgcaggat acaccactcc tcaagtttcc atgtccaagg    60ctcattcttc tctttgtgct gctgattcgt ctttcacaag tgtcttcaga tgttgatgaa    120caactgtcca agtcagtgaa agataaggta ttgctgcctt gccgttacaa ctctccgcat    180gaagatgagt ctgaagaccg aatctactgg caaaaacatg acaaagtggt gctgtctgtc    240attgctggga aactaaaagt gtggcccgag tataagaacc ggactttata tgacaacact   300acctactctc ttatcatcct gggcctggtc ctttcagacc ggggcacata cagctgtgtc   360gttcaaaaga aggaaagagg aacgtatgaa gttaaacact tggctttagt aaagttgtcc   420atcaaagctg acttctctac ccccaacata actgagtctg gaaacccatc tgcagacact   480aaaaggatta cctgctttgc ttccgggggt ttcccaaagc ctcgcttctc ttggttggaa   540aatggaagag aattacctgg catcaatacg acaatttccc aggatcctga atctgaattg   600tacaccatta gtagccaact agatttcaat acgactcgca accacaccat taagtgtctc   660attaaatatg gagatgctca cgtgtcagag gacttcacct gggaaaaacc cccagaagac   720cctcctgata gcaagcccgg gggtggtggg agcggtggtg gcggcagtgg cggcggcgga   780actagtgagg tccagcttca gcagtctgga cctgacctgg tgaagcctgg ggcttcagtg   840aagatatcct gcaaggcttc tggttactca ttcactggct actacatgca ctgggtgaag   900cagagccatg gaaagagcct tgagtggatt ggacgtatta atcctaacaa tggtgttact   960ctctacaacc agaaattcaa ggacaaggcc atattaactg tagacaagtc atccaccaca   1020gcctacatgg agctccgcag cctgacatct gaggactctg cggtctatta ctgtgcaaga   1080tctactatga ttacgaacta tgttatggac tactggggtc aagtaacttc agtcaccgtc   1140tcttcaggtg gtggtgggag cggtggtggc ggcactggcg gcggcggatc tagtattgtg   1200atgacccaga ctcccacatt cctgcttgtt tcagcaggag acagggttac cataacctgc   1260aaggccagtc agagtgtgag taatgatgta gcttggtacc aacagaagcc agggcagtct   1320cctacactgc tcatatccta tacatccagt cgctacgctg gagtccctga tcgcttcatt   1380ggcagtggat atgggacgga tttcactttc accatcagca ctttgcaggc tgaagacctg   1440gcagtttatt tctgtcagca agattataat tctcctccga cgttcggtgg aggcaccaag   1500ctggaaatca aacggtaa                                                  1518<210>12<211>2090<212>DNA<213>人工序列<220><223>ScFv-IgE<400>12ctcgagccac catgggatgg agctgtatca tcctcttctt ggtagcaaca gctacaggtg    60tccactccga ggtccagctg cagcagtctg gacctgacct ggtgaagcct ggggcttcag    120tgaagatatc ctgcaaggct tctggttact cattcactgg ctactacatg cactgggtga    180agcagagcca tggaaagagc cttgagtgga ttggacgtat taatcctaac aatggtgtta    240ctctctacaa ccagaaattc aaggacaagg ccatattaac tgtagacaag tcatccacca    300cagcctacat ggagctccgc agcctgacat ctgaggactc tgcggtctat tactgtgcaa    360gatctactat gattacgaac tatgttatgg actactgggg tcaagtaact tcagtcaccg    420tctcttcagg tggtggtggg agcggtggtg gcggcactgg cggcggcgga tctagtattg    480tgatgaccca gactcccaca ttcctgcttg tttcagcagg agacagggtt accataacct    540gcaaggccag tcagagtgtg agtaatgatg tagcttggta ccaacagaag ccagggcagt    600ctcctacact gctcatatcc tatacatcca gtcgctacgc tggagtccct gatcgcttca    660ttggcagtgg atatgggacg gatttcactt tcaccatcag cactttgcag gctgaagacc    720tggcagttta tttctgtcag caagattata attctcctcc gacgttcggt ggaggcacca    780agcttgaaat caaacgggcc tccacacaga gcccatccgt cttccccttg acccgctgct    840gcaaaaacat tccctccaat gccacctccg tgactctggg ctgcctggcc acgggctact    900tcccggagcc ggtgatggtg acctgggaca caggctccct caacgggaca actatgacct    960taccagccac caccctcacg ctctctggtc actatgccac catcagcttg ctgaccgtct    1020cgggtgcgtg ggccaagcag atgttcacct gccgtgtggc acacactcca tcgtccacag    1080actgggtcga caacaaaacc ttcagcgtct gctccaggga cttcaccccg cccaccgtga    1140agatcttaca gtcgtcctgc gacggcggcg ggcacttccc cccgaccatc cagctcctgt    1200gcctcgtctc tgggtacacc ccagggacta tcaacatcac ctggctggag gacgggcagg    1260tcatggacgt ggacttgtcc accgcctcta ccacgcagga gggtgagctg gcctccacac    1320aaagcgagct caccctcagc cagaagcact ggctgtcaga ccgcacctac acctgccagg    1380tcacctatca aggtcacacc tttgaggaca gcaccaagaa gtgtgcagat tccaacccga    1440gaggggtgag cgcctaccta agccggccca gcccgttcga cctgttcatc cgcaagtcgc    1500ccacgatcac ctgtctggtg gtggacctgg cacccagcaa ggggaccgtg aacctgacct    1560ggtcccgggc cagtgggaag cctgtgaacc actccaccag aaaggaggag aagcagcgca    1620atggcacgtt aaccgtcacg tccaccctgc cggtgggcac ccgagactgg atcgaggggg    1680agacctacca gtgcagggtg acccaccccc acctgcccag ggccctcatg cggtccacga    1740ccaagaccag cggcccgcgt gctgccccgg aagtctatgc gtttgcgacg ccggagtggc    1800cggggagccg ggacaagcgc accctcgcct gcctgatcca gaacttcatg cctgaggaca    1860tctcggtgca gtggctgcac aacgaggtgc agctcccgga cgcccggcac agcacgacgc    1920agccccgcaa gaccaagggc tccggcttct tcgtcttcag ccgcctggag gtgaccaggg    1980ccgaatggga gcagaaagat gagttcatct gccgtgcagt ccatgaggca gcgagcccct    2040cacagaccgt ccagcgagcg gtgtctgtaa atcccggtaa atgagagctc               2090<210>13<211>945<212>DNA<213>人工序列<220><223>B7-EGF<400>13atggcttgca attgtcagtt gatgcaggat acaccactcc tcaagtttcc atgtccaagg  60ctcattcttc tctttgtgct gctgattcgt ctttcacaag tgtcttcaga tgttgatgaa  120caactgtcca agtcagtgaa agataaggta ttgctgcctt gccgttacaa ctctccgcat  180gaagatgagt ctgaagaccg aatctactgg caaaaacatg acaaagtggt gctgtctgtc  240attgctggga aactaaaagt gtggcccgag tataagaacc ggactttata tgacaacact  300acctactctc ttatcatcct gggcctggtc ctttcagacc ggggcacata cagctgtgtc  360gttcaaaaga aggaaagagg aacgtatgaa gttaaacact tggctttagt aaagttgtcc  420atcaaagctg acttctctac ccccaacata actgagtctg gaaacccatc tgcagacact  480aaaaggatta cctgctttgc ttccgggggt ttcccaaagc ctcgcttctc ttggttggaa  540aatggaagag aattacctgg catcaatacg acaatttccc aggatcctga atctgaattg  600tacaccatta gtagccaact agatttcaat acgactcgca accacaccat taagtgtctc  660attaaatatg gagatgctca cgtgtcagag gacttcacct gggaaaaacc cccagaagac  720cctcctgata gcaagcccgg gggtggtggg agcggtggtg gcggcagtgg cggcggcgga  780actagtaata gtgactctga atgtcccctg tcccacgatg ggtactgcct ccatgatggt  840gtgtgcatgt atattgaagc attggacaag tatgcatgca actgtgttgt tggctacatc  900ggggagcgat gtcagtaccg agacctgaag tggtgggaac tgcgc                  945<210>14<211>1263<212>DNA<213>人工序列<220><223>5T4<400>14atgcctgggg ggtgctcccg gggccccgcc gccggggacg ggcggttgcg gctggcgcgg    60ctggcgctgg tgctcctggg ctgggtctcc tcgtcctcgc tcacctcctg ggcgccctcc    120gccgccgcct ccacgtcgcc gccggcctcc gcggcgtccg ccccgccccc gctgccgggc    180cagtgccccc agccttgcga gtgctcggag gcggcgcgca cggtcaagtg cgttaaccgc    240aacctgaccg aggtgcccgc ggacctgccc ccctacgtgc gcaacctctt cctcacgggc    300aaccagctgg cggtgctgcc ccccggcgcc ttcgcccgcc ggccgccgct ggccgagctg    360gccgcgctca acctgagcgg cagcagcctg cgggaggtgt gcgccggcgc cttcgagcac    420ctgcccagcc tgcgccagct cgacctcagc cacaacccgc tgggcaacct cagcgccttc    480gccttcgcgg gcagcgacgc cagccgctcg ggccccagcc ccctggtgga gctgatgctg    540aaccacatcg tgccccccga cgaccggcgg cagaaccgga gcttcgaggg catggtggcg    600gctgccctcc gagcgggccg cgcgcttcgc gggctgcagt gcctggagct ggccggcaac    660cgcttcctct acttgcctcg cgacgtcctg gcccagctac ccggcctccg gcacctggac    720ctgcgcaaca actccctggt gagcctcacc tacgtgtcct tccgcaacct gacgcacttg    780gagagcctcc acctggagga caacgccctc aaggtccttc acaacgccac cctggcggag    840ctgcagagcc tgccccacgt ccgggtcttc ctggacaaca acccctgggt ctgcgattgt    900cacatggcag acatggtggc ctggctcaag gagacagagg tggtgccggg caaagccggg    960ctcacctgtg cattcccgga gaaaatgagg aatcgggccc tcttggaact caacagctcc    1020cacctggact gtgaccctat cctccctcca tccctgcaga cttcttatgt cttcctaggt    1080attgtcttag ccctgatagg cgccatcttc ctactggttt tgtatttgaa ccgcaagggg    1140ataaagaagt ggatgcataa catcagagat gcctgcaggg atcacatgga agggtatcac  1200tacagatacg aaatcaatgc agaccccagg ttaacaaacc tcagttccaa ttcggatgtc  1260tga                                                                1263<210>15<211>420<212>PRT<213>人工序列<220><223>5T4<400>15Met Pro Gly Gly Cys Ser Arg Gly Pro Ala Ala Gly Asp Gly Arg Leu1               5                   10                  15Arg Leu Ala Arg Leu Ala Leu Val Leu Leu Gly Trp Val Ser Ser Ser
        20                  25                  30Ser Leu Thr Ser Trp Ala Pro Ser Ala Ala Ala Ser Thr Ser Pro Pro
    35                  40                  45Ala Ser Ala Ala Ser Ala Pro Pro Pro Leu Pro Gly Gln Cys Pro Gln
50                  55                  60Pro Cys Glu Cys Ser Glu Ala Ala Arg Thr Val Lys Cys Val Asn Arg65                  70                  75                  80Asn Leu Thr Glu Val Pro Ala Asp Leu Pro Pro Tyr Val Arg Asn Leu
            85                  90                  95Phe Leu Thr Gly Asn Gln Leu Ala Val Leu Pro Pro Gly Ala Phe Ala
        100                 105                 110Arg Arg Pro Pro Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Asn Leu Ser Gly Ser
    115                 120                 125Ser Leu Arg Glu Val Cys Ala Gly Ala Phe Glu His Leu Pro Ser Leu
130                 135                 140Arg Gln Leu Asp Leu Ser His Asn Pro Leu Gly Asn Leu Ser Ala Phe145                 150                 155                 160Ala Phe Ala Gly Ser Asp Ala Ser Arg Ser Gly Pro Ser Pro Leu Val
            165                 170                 175Glu Leu Met Leu Asn His Ile Val Pro Pro Asp Asp Arg Arg Gln Asn
        180                 185                 190Arg Ser Phe Glu Gly Met Val Ala Ala Ala Leu Arg Ala Gly Arg Ala
    195                 200                 205Leu Arg Gly Leu Gln Cys Leu Glu Leu Ala Gly Asn Arg Phe Leu Tyr
210                 215                 220Leu Pro Arg Asp Val Leu Ala Gln Leu Pro Gly Leu Arg His Leu Asp225                 230                 235                 240Leu Arg Asn Asn Ser Leu Val Ser Leu Thr Tyr Val Ser Phe Arg Asn
            245                 250                 255Leu Thr His Leu Glu Ser Leu His Leu Glu Asp Asn Ala Leu Lys Val
        260                 265                 270Leu His Asn Ala Thr Leu Ala Glu Leu Gln Ser Leu Pro His Val Arg
    275                 280                 285Val Phe Leu Asp Asn Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys His Met Ala Asp
290                 295                 300Met Val Ala Trp Leu Lys Glu Thr Glu Val Val Pro Gly Lys Ala Gly305                 310                 315                 320Leu Thr Cys Ala Phe Pro Glu Lys Met Arg Asn Arg Ala Leu Leu Glu
            325                 330                 335Leu Asn Ser Ser His Leu Asp Cys Asp Pro Ile Leu Pro Pro Ser Leu
        340                 345                 350Gln Thr Ser Tyr Val Phe Leu Gly Ile Val Leu Ala Leu Ile Gly Ala
    355                 360                 365Ile Phe Leu Leu Val Leu Tyr Leu Asn Arg Lys Gly Ile Lys Lys Trp
370                 375                 380Met His Asn Ile Arg Asp Ala Cys Arg Asp His Met Glu Gly Tyr His385                 390                 395                 400Tyr Arg Tyr Glu Ile Asn Ala Asp Pro Arg Leu Thr Asn Leu Ser Ser
            405                 410                 415Asn Ser Asp Val
        420<210>16<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>连接B7.1的胞外结构域和ScFv的柔性接头<400>16ctagttccgc cgccgccact gccgccacca ccgctcccac caccccc                 47<210>17<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>17ctcgaattcc accatggctt gcaattgtca gttgatgc                           38<210>18<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>18ctccccgggc ttgctatcag gagggtcttc                                     30<210>19<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>19ctcactagtg aggtccagct tcagcagtc                                      29<210>20<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>20ctcgcggccg cttaccgttt gatttccagc ttggtgcctc cacc                     44<210>21<211>87<212>DNA<213>人工序列<220><223>翻译起始序列和人免疫球蛋白κ轻链信号肽<400>21ctagactcga gccaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac    60aggtgtccac tccgaggtcc agctgca                                        87<210>22<211>79<212>DNA<213>人工序列<220><223>翻译起始序列和人免疫球蛋白κ轻链信号肽<400>22gctggacctc ggagtggaca cctgtagctg ttgctaccaa gaagaggatg atacagctcc    60atcccatggt ggctcgagt                                                 79<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>23gtccagctgc agcagtctgg                                                20<210>24<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>24cgtttgattt caagcttggt gc                                             22<210>25<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>25gcgcaagctt gaaatcaaac gggcctccac caagggccca                          40<210>26<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>26gcgcctcgag tcatttaccc ggagacaggg                                     30<210>27<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>27gcgcaagctt gaaatcaaac gggcctccac acagagccca                          40<210>28<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>28gcgcctcgag tcatttaccg ggatttacag a                                   31<210>29<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>29ggactagtaa tagtgactct gaatgtccc                                     29<210>30<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>30attagcggcc gcttagcgca gttcccacca cttc                               34<210>31<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>31atcgcctgca ggccaccatg gcttgcaatt gtcag                              35<210>32<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>32gcgcgaattc ttaccgtttg atttccagct tggt                               34<210>33<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>33atcgcctgca ggccaccatg ggatggagct gtat                               34<210>34<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>34gcgcgaattc ttaccgtttg atttccagct tggt                               34<210>35<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>pBS II中的接头序列<400>35ctagtaccgg tggtggtggg agcggtggtg gcggcagtgg cggcggcg                48<210>36<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>pBS II中的接头序列<400>36Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1               5                   10                  15<210>37<211>76<212>DNA<213>人工序列<220><223>pBS II中的前导序列<400>37ctagacctgc aggccaccat gggatggagc tgtatcatcc tcttcttggt agcaacagct    60acaggtgtac actccc                                                    76

Claims (44)

1.能够识别疾病相关分子(DAM)的ScFv抗体(ScFv Ab)的应用，用于生产预防和/或治疗与DAM相关病症的药物。
2.权利要求1的ScFv Ab的应用，其中所述DAM是一种肿瘤相关抗原(TAA)。
3.权利要求1或权利要求2的应用，其中所述ScFv Ab具有SEQID No 1或SEQ ID No 2所示的序列或其变异体、同源物、片段或衍生物。
4.权利要求1或权利要求2的应用，其中所述ScFv Ab具有SEQID No 3所示的序列或其变异体、同源物、片段或衍生物。
5.权利要求1或权利要求2的应用，其中所述ScFv Ab具有SEQID No 4所示的序列或其变异体、同源物、片段或衍生物。
6.一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码权利要求1-5中任一项的ScFv Ab。
7.一种权利要求6的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列具有SEQID No 5或SEQ ID No 6所示的序列或其变异体、同源物、片段或衍生物。
8.一种权利要求6的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列具有SEQID No 7所示的序列或其变异体、同源物、片段或衍生物。
9.一种权利要求6的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列具有SEQID No 8所示的序列或其变异体、同源物、片段或衍生物。
10.一种核苷酸序列或与其互补的序列，所述核苷酸序列能够与权利要求6-9中任一项的核苷酸序列杂交。
11.一种权利要求6-10中任一项的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与启动子有效连接。
12.一种构建体，所述构建体包含权利要求6-11中任一项的核苷酸序列。
13.一种载体，所述载体包含权利要求6-12中任一项的核苷酸序列。
14.一种质粒，所述质粒包含权利要求6-13中任一项的核苷酸序列。
15.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求6-14中任一项的核苷酸序列。
16.一种制备权利要求1-5中任一项的ScFv Ab的方法，所述方法包括表达权利要求6-11中任一项的核苷酸序列，或当存在于权利要求12-15中任一项的表达实体中时表达权利要求6-11中任一项的核苷酸序列，并且任选地分离和/或纯化所述ScFv Ab。
17.一种通过权利要求16的方法产生的ScFv Ab。
18.一种获得任一前述权利要求的ScFv Ab的体外方法，所述方法包括：
(i)制备噬菌体文库，其中每种噬菌体包含一种编码含潜在结合结构域的蛋白的核酸构建体；
(ii)使所述潜在蛋白表达，并且使所述潜在结合结构域展示在所述噬菌体的外表面；
(iii)使所述噬菌体文库与DAM靶接触，其接触条件使得所述潜在结合结构域和所述DAM靶相互作用；
(iv)将展示出结合所述DAM靶的结构域的噬菌体从不结合所述DAM靶的噬菌体中分离出来；
(V)回收至少一种在其外表面展示结合所述DAM靶的蛋白的噬菌体；
(Vi)体外扩增所述结合蛋白，以产生结合结构的第二富集文库；
(vii)重复步骤(iii)至(Vi)至少两次；
(viii)在体外条件下表达编码所述结合蛋白的核酸；和
(ix)通过检测信号存在与否，确定所述结合蛋白是否与所述DAM相互作用。
19.一种权利要求18的体外方法，其中所述体外方法是筛选可用于治疗疾病的ScFv Ab。
20.一种方法，所述方法包括以下步骤：
(a)进行权利要求18或权利要求19的体外方法；
(b)借助可检测信号，鉴定能够识别DAM的一种或多种ScFvAb；和
(c)制备大量的所述一种或多种ScFv Ab。
21.一种方法，所述方法包括以下步骤：
(a)进行权利要求18或权利要求19的方法；
(b)借助可检测信号，鉴定能够识别DAM的一种或多种ScFvAb；和
(c)制备包含所述一种或多种经鉴定的ScFv Ab的药用组合物。
22.一种方法，所述方法包括以下步骤：
(a)进行权利要求18或权利要求19的方法；
(b)鉴定能够识别DAM的一种或多种ScFv Ab；
(c)修饰所述能够识别DAM的一种或多种经鉴定的ScFv Ab；和
(d)制备包含所述一种或多种经修饰的ScFv Ab的药用组合物。
23.一种ScFv Ab，所述ScFv Ab如权利要求1-5中任一项或权利要求17中所限定，或者是通过权利要求18或权利要求19的体外方法鉴定的，其中所述ScFv Ab能够识别一种TAA。
24.一种权利要求23的ScFv Ab，其中所述ScFv Ab能够识别一种5T4抗原。
25.一种用ScFv Ab在体内影响疾病的方法，其中所述ScFv Ab在一种体外方法中识别一种DAM抗原，并且其中所述体外方法是权利要求18或权利要求19中限定的方法。
26.权利要求1-5中任一项或权利要求17或权利要求23或权利要求24中限定的ScFv Ab的应用，用于制备药用组合物。
27.一种权利要求26中限定的药用组合物，所述药用组合物包含一种ScFv Ab和另一种治疗有用的药物。
28.一种权利要求27的药用组合物，其中所述另一种治疗有用的药物是一种前体药物活化酶。
29.一种权利要求28的药用组合物，其中所述另一种治疗有用的药物是一种毒素。
30.一种权利要求26或权利要求27或权利要求28或权利要求29的药用组合物，其中所述ScFv Ab能够识别一种5T4抗原。
31.ScFv Ab的应用，用于制备用于治疗与DAM相关病症的权利要求26-30的一种药用组合物。
32.权利要求1的能够识别DAM的ScFv Ab的应用，所述ScFvAb与权利要求27-30中限定的另一种治疗有用药物或编码所述另一种治疗有用药物的感兴趣的核苷酸序列(NOI)联合，用于与DAM相关的病症的治疗。
33.权利要求31或32的ScFv Ab的应用，用于与DAM相关疾病的体内成像和/或辅助治疗。
34.权利要求31-33的应用，其中所述疾病是癌症。
35.ScFv Ab的应用，用于筛选可以调节ScFv Ab的DAM结合特异性的药物，其中所述ScFv Ab是权利要求1-5或权利要求17或权利要求23-24中限定的ScFv Ab，或由权利要求6-12的核苷酸或其变异体、同源物、片段或衍生物表达。
36.一种用于诊断个体中涉及DAM的表达和/或活性的病症的方法，所述方法包括：
(i)提供编码6-12中限定的ScFv Ab的核苷酸序列或其表达产物；
(ii)分析所述ScFv Ab与得自所述个体的样品中的DAM的结合；其中所述结合指示在所述个体中存在所述DAM。
37.一种在患有与DAM相关病症的哺乳动物中体内诱发治疗反应的方法，所述方法包括给所述哺乳动物接种权利要求1-5或权利要求17或权利要求23-24中限定的ScFv Ab或指导权利要求6-12的核苷酸序列或其变异体、同源物、片段或衍生物表达的载体，以便诱发治疗反应，以保护所述哺乳动物抵抗所述病症。
38.一种权利要求37的方法，其中所述病症是癌症。
39.基本上如本文所述并且参考附图的ScFv Ab的应用。
40.一种用作药物的ScFv。
41.一种犬5T4多肽或其变异体、同源物、片段或衍生物，所述犬5T4多肽具有SEQ ID No 14所示的氨基酸序列。
42.一种核苷酸序列，所述核苷酸序列能够编码权利要求41的犬5T4多肽。
43.一种权利要求42的核苷酸序列或其变异体、同源物、片段或衍生物，所述核苷酸序列具有SEQ ID No 15所示的序列。
44.一种抗体，所述抗体能够与权利要求41的犬5T4多肽特异性地结合。
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