CN1459635A - 酶底物芯片及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶底物芯片及其制备方法和应用，它是将超大量特定的各类酶的底物，高密度有序地固化在探针载体上。用其可以方便、高效、高通量的进行各种酶活性的定性定量分析测定；用于体外筛选各类药物；用于对生物组织检测鉴定。
Description
本发明属于生物学领域，涉及一种酶底物芯片及制备方法和应用。
酶是一种生物催化剂，在科学研究、工农业生产和医学实践中经常要进行酶的活力测定。酶的活性水平可通过测定特定系统的酶(促)反应速度而检知。在进行这种测定时可采用两种方式：一种是终点法；另一种是动力学法。终点法，也称消色点法，它是指在确定条件下，让酶作用一定量的底物，然后检测反应系统达到某一指标所需要的时间，并根据时间的长短来估计酶活力的一种方法。例如，工业生产α-淀粉酶就常采用这种方法进行测定。终点法的一个发展就是采用检测器对反应进行连续跟踪，并在反应达到某一程度时，精确地自动记录所需要的时间，这就是酶分析自动化中的所谓固定浓度法。终点法的另一发展是做成简便的“酶检测纸片”。动力学法是酶活力测定最常用的方法。动力学法测定的原理是：在一定的条件下，酶反应速度和酶浓度成正比，因此，测定酶反应速度就可求得酶浓度。但是，上述方法存在以下一些缺点和不足：如终点法的主要缺点是不精确，近于半定量，而且不能观察全过程，因此，很少应用。动力学法中的化学法存在着工作量大，本身包含一定的误差。另外还有：光学法的光吸收测定法要求反应产物与底物在某一波长或某一波段上，有明显的特征吸收差别；电化学测定法要求一定的仪器设备等(陈石根，周润琦编著，复旦大学出版社出版的《酶学》，221-231页)。
本发明的目的是克服现有技术中的不足而提供一种酶底物芯片，通过其制备方法产生的酶底物芯片，能用于大规模高通量地进行酶的活力测定，方法简单，耗时短，系统误差小。
本发明的酶底物芯片是通过微加工工艺在微小的芯片上集成有成千上万个与生命相关的信息分子，将超大量特定的各类酶的底物，高密度有序地固化在探针载体上。各类酶可以为氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类；底物可以为蛋白、多肽、氨基酸、核酸、脂类、糖类及各种有机化合物；探针载体可以为金属、玻璃或有机材料，其外形可以是各种形状，载体的探针固化面可以是平面及其他异形面。
制备酶底物芯片的方法，包括下述顺序的步骤：(1)依据各类生物酶及每类中各种酶与特异性反应底物反应的特性，设计制备带有荧光标记的各种特异性酶底物探针；(2)利用所选定的载体特性，将各种酶底物探针高密度有序地点样、干燥、固化在载体上，依据不同的用途，形成不同型号的酶底物芯片；(3)依据不同检测对象，选用不同型号的芯片，制备芯片反应液与芯片反应，反应后的芯片再经芯片扫描仪扫描，通过特定软件数据分析处理，就可得出待测样中相关酶的活性的定性定量的结果。
本发明酶底物芯片的应用有三个方面：(1)直接用于各种酶活性的定性定量分析测定。(2)用于体外筛选各类药物。(3)取生物组织进行检测鉴定的应用。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1.酶底物芯片可以克服现有测定酶活性技术的不足，利用酶与底物的高灵敏、高特异亲和反应检测对应的酶的活性，从而实现高通量、高灵敏、耗时短检测各类酶的活性。
2.酶底物芯片利用各种疾病皆与体内某些特异相关的酶的活性高低有关，用将人或动物的血液或组织中提取的样本进行上述测定分析，可以方便、灵敏的运用于各种相关疾病的检测。
3.酶底物芯片可以方便、高效的筛选各类药物。疾病是一系例体内生化反应的最终显现，而几乎所有生化反应皆在各种特异相关的酶的催化作用下才能进行。如果特异性抑制了其中某种酶的活性，从而阻断了上述病理生化反应，则该病也得到了控制或治疗与疾病相关的酶的特异性抑制剂的筛选被称为药物筛选，所以利用上述酶底物芯片与各种疾病的相关酶结合，可以建立各种疾病的药物筛选系统，方便、高效的筛选各类药物。
本发明以下将结合实施例作进一步详述：
实施例1.一种酶底物芯片及其制备：用于连接、吸附或包埋各种酶底物探针，使其以水不溶性状态行使功能的固相材料统称为载体，其固化面上经表面活化处理，也就是通过化学反应用各种不同的活化试剂在载体表面(固化面)键合上各种各样的活性基团，以便与各种酶底物探针分子连接。因此，在微小的芯片上集成有成千上万个与生命相关的信息分子，是将超大量特定的各类酶的底物，高密度有序地点样、干燥、固化在载体上。选载体材料为玻璃，可以是钠玻璃，钾玻璃，锂玻璃或其他无机玻璃，因为，这些载体上皆有硅酸盐羟基，其表面羟基作表面活化处理，然后能偶联核酸、多肽、蛋白和其他生物及有机分子。
酶底物探针的制备：在选定的某个酶的特异性底物分子上作氨基、肼基或巯基修饰，如酶底物分子自身已有上述基团可不作修饰如核酸、多肽、蛋白质等，其目的在于可以使底物分子能偶联在载体上。修饰或无需修饰的酶底物分子再做铀3+(Eu3+)标记，其标记方法是用双功能基团螯合剂。(1)多羧基酸螯和剂，包括硫氰酸苯基-EDTA，异硫氰酸苯基-DTTA、DTPA酐；(2)β-二酮类螯合剂，包括β-NTA，PTA.(3)W-1174.(4)BCPDA。Eu3+标记的探针，经紫外光激发，便能产生特征性的荧光，其主要特征是：(1)荧光衰变半衰期长(～1ms)，为传统荧光的103-106倍。(2)激发光(340nm)与发射光(613nm)的stokes移位大。(3)激发光波长范围宽，而发射光波峰范围宽。(4)荧光强度高。
酶底物分子即探针的标记：不同类底物及不同官能团底物可选用不同的双功能基团螯合剂标记，如L-谷氨酸，丙酮的可用β-二酮类螯合剂，多肽类可选用W-1174，蛋白、脂类、糖类、寡聚核苷酸类可选用DTPA酐等。
酶底物芯片的制作：在处理好的载体片用XYZ3000型三维芯片点样仪，采用点接触法，将制备好的多种酶底物探针，点样在载体片上偶联。这种方法可以在3.6cm2的载体面上点10000个探针点阵，芯片点样完成后，将其在恒温(45-50℃)干燥器中，偶联，固化(干燥)1.5小时，即可完成。
酶及特异性底物的选择：本实施例选择氧化还原酶类，如：乳酸脱氢酶，L-谷氨酸脱氢酶，其特异性底物分别为丙酮酸(有机物)，L-谷氨酸(氨基酸)。
实施例2.一种酶底物芯片及其制备：原理与方法与实施例1相似。选用的载体材料为金属。可以用镀金技术在石英玻璃片或其他金属(银、铜、铝等)的表面镀2μm厚的金膜。该金膜面无需活化处理，而可以直接将(HS-探针)探针含HS-基的酶底物探针固化在金膜上，因为HS-与金膜特异性结合。酶及特异性底物的选择：本实施例选择转移酶类，如：己糖激酶，天冬氨酸氨基转移酶，其特异性底物分别为葡萄糖(糖)，L-天冬氨酸(氨基酸)。
实施例3.一种酶底物芯片及其制备：原理与方法与实施例1相似。选用的载体材料为有机高分子聚合物，可以用聚氯乙稀制成的片的表面进行羧酸纤维素树脂膜化，形成的膜化面上有大量羧基，用EDC和NHS把表面变成活泼酯，然后再同各种不同的酶底物探针分子偶联。
酶及特异性底物的选择：本实施例选择水解酶类，如：α-淀粉酶，脂肪酶，弹性蛋白酶，胰脏核酸酶，其特异性底物分别为可溶性淀粉，甘油三酯，含有丝氨酸的多肽，含有嘧啶核苷酸的寡聚核苷酸。
实施例4.一种酶底物芯片及其制备：原理与方法与实施例1相似。选用的载体材料为有机高分子聚合物，可以用有机玻璃制成的片的表面进行羧酸纤维素树脂膜化，形成的膜化面上有大量羟基，用EDC和NHS把表面变成活泼酯，然后再同各种不同的酶底物探针分子偶联。
酶及特异性底物的选择：本实施例选择裂解类酶，如：柠檬酸合酶，果糖二磷酸醛缩酶，其特异性底物分别为乙酰CoA，D-果糖1，6-二磷酸。
实施例5.一种酶底物芯片及其制备：原理与方法与实施例1相似。选用的载体材料为有机高分子聚合物可以用聚四氟乙烯制成的片的表面进行羧酸纤维素树脂膜化，形成的膜化面上有大量羧基，用EDC和NHS把表面变成活泼酯，然后再同各种不同的酶底物探针分子偶联。
酶及特异性底物的选择：本实施例选择异构酶类，如：磷酸丙糖异构酶，磷酸葡萄糖异构酶，其特异性底物分别为L-丙糖3-磷酸，D-葡萄糖G-磷酸。
实施例6.一种酶底物芯片的应用：直接用于各种酶活性的定性定量分析测定。如测定脂肪酶，柠檬酸合酶等。选用该芯片有上述酶的特异性底物探针的芯片。取待测样品3ml，加5ml BaffII(0.4M MgSO4∶0.3M邻苯二胺∶pH5.0柠檬酸缓冲液；2∶4∶6)，摇匀备用。将备用液1ml用滴液管取出，滴在芯片反应室中。再将加有样品的芯片放进30-35℃的恒温箱中反应2-3小时后取出，取下反应室，用pH5.0柠檬酸缓冲液冲洗芯片反应面2次，再用Millipore水冲洗3次，用N2吹干。检测：将吹干后的芯片，放入AFFYMETT438型酶底物芯片扫描仪进行扫描，扫描的图象使用Phargentech Inc的Lmagene图象分析软件对扫描图像的每一点的信息进行数字化转换。扫描判断：可依据上述待测样品中某种酶所对应的点，如A5.15点(脂肪酶)，A4.17点(柠檬酸合成酶)的CPS值的大小即可判断待测液中是否含有或含有脂肪酶和柠檬酸合酶的量。
实施例7.一种酶底物芯片的应用：用于对生物体液检测鉴定。人体中酪氨酸酶缺乏引起白化病，苯丙氨酸羟化酶缺乏导致精神幼稚化。如：精神幼稚化病的检测：取被检测人血液3ml，加入抗凝剂，离心，分离，取血清，加入BafflI1.5ml，选用含有苯丙氨酸羟化酶底物探针的芯片，加样、检测同实施例6。结果判断：如芯片的B6.17点(苯丙氨酸羟化酶)的CPS值≥3.6，则被测人患有精神幼稚化病的可能性≥85％。实施例8.一种酶底物芯片的应用：用于体外筛选各类药物。如：抗癌药物的筛选，(1)原理恶性肿瘤是因人体细胞大量恶性增殖所致，在恶性增殖的S期(DNA合成期)，需在核苷酸还原酶、二氢叶酸还原酶等多种酶的催化下合成DNA，如果待测化合物能明显且特异性抑制上述两种酶之一，则可抑制癌细胞中DNA合成，进而抑制恶性增殖，那么，该种化合物就有可能成为一种新的抗癌药物。(2)方法将一定浓度的待筛化合物液与Baffl III-5混合，Baffl III-5中含有特定浓度的核苷酸还原酶及二氢叶酸还原酶，选用含有核苷酸还原酶及二氢叶酸还原酶底物探针的芯片，反应检测同实施例6，结果判断：芯片中的A4.1点(核苷酸还原酶对应点)A6.12点(二氢叶酸还原酶对应点)的CPS值：当CPS值≥0.26，对酶无抑制作用。当CPS值0.27-0.56，有弱抑制作用。当CPS值0.57-1.5，有抑制作用。当CPS值1.6-2.6，有较强抑制作用。当CPS值≥2.6，有强抑制作用。
Claims (5)
1.一种酶底物芯片，是通过微加工工艺在微小的芯片上集成有成千上万个与生命相关的信息分子，其特征是：它是将超大量特定的各类酶的底物，高密度有序地固化在探针载体上：
1.1各类酶可以为氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类；
1.2底物可以为蛋白、多肽、氨基酸、核酸、脂类、糖类及各种有机化合物；
1.3探针载体可以为金属、玻璃或有机材料，其外形可以是各种形状，载体的探针固化面可以是平面及其他异形面；
2.一种制备酶底物芯片的方法，包括下述顺序的步骤：
2.1依据各类生物酶及每类中各种酶与特异性反应底物反应的特性，设计制备带有荧光标记的各种特异性酶底物探针；
2.2利用所选定的载体特性，将各种酶底物探针，高密度有序地点样、干燥、固化在载体上，依据不同的用途，形成不同型号的酶底物芯片；
2.3依据不同的测定对象，选用不同型号的芯片，制备芯片反应液与芯片反应，芯片扫描，数据处理，结果判定。
3.一种酶底物芯片的应用：其特征在于：直接用于各种酶活性的定性定量分析测定。
4.一种酶底物芯片的应用：其特征在于：用于体外筛选各类药物。
5.一种酶底物芯片的应用：其特征在于：用于生物组织的检测鉴定。
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