CN1468302A - Gsk3多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供能结晶的截短的GSK3多肽，包括GSK3α和GSK3β多肽，以及这些多肽用于鉴别和优化GSK3抑制剂。本发明还提供具有至少一个与野生型GSK3不同的取代氨基酸的GSK3多肽，其中该取代氨基酸不能被磷酸化。本发明可用于提供鉴别和优化用于治疗GSK3活性介导的疾病如阿尔茨海默氏病、II型糖尿病和炎症的化合物的方法。

Description

GSK3多肽
                         发明背景
发明领域
本发明提供涉及糖原合成激酶3(GSK3)的选择性抑制剂的鉴定和优化的材料和方法，以及治疗GSK3活性介导的病症的方法。这些病症包括阿尔茨海默氏病、II型糖尿病和炎症。
相关领域的描述
糖原合成激酶3(GSK3)是脯氨酸指导的丝氨酸/苏氨酸激酶，最初被鉴别为具有使糖原合成酶磷酸化的活性，如Woodgett在《生物化学科学趋势》((TrendsBiochem Sci)，16：177-181(1991)中所述。最近Summers等详细描述了在葡萄糖代谢中的作用〔《生物化学期刊》(J.Biol.Chem.)， 274：17934-17940 (1999)〕。GSK3由两个同种型α和β组成，它在静止细胞中是组成型活跃的，通过直接磷酸化作用抑制糖原合成酶。在胰岛素激活后，GSK3被灭活，从而使糖原合成酶得以激活，并且可能发生胰岛素依赖性的事件。GSK3被其它通过受体酪氨酸激酶发出信号的生长因子或激素灭活，如胰岛素。这种信号分子的例子包括IGF-1和EGF，如以下文献中所述：Saito等《生物化学杂志》(Biochem.J.)，303：27-31(1994)；Welsh等，《生物化学杂志》，294：625-629(1993)；以及Cross等，《生物化学杂志》，303：21-26(1994)。已显示，GSK3将β-连环蛋白磷酸化，如Peifer等《发育生物学》(Develop.Biol.)，166：543-56(1994)所述。GSK3在生物学方面的其它活性还包括它能在体内〔Mandelkow和Mandelkow，《生物化学科学趋势》(Trendsin Biochem.Sci.)，18：480-83(1993)；Mulot等，Febs Lett，348：359-64(1994)；Lovestone等，《当前生物学》(Curr.Biol.)，4：1077-86(1995)〕和组织培养细胞中〔Latimer等，Febs Lett，365：42-6(1995)〕将Tau蛋白磷酸化的能力。GSK3的选择性抑制对于治疗或抑制GSK3活性介导的疾病可能是有用的。
本领域中仍需要与GSK3结合或相互作用、从而介导其活性的组合物和分子。
本发明通过提供用于GSK3抑制剂的设计和优化的可结晶的GSK3多肽而满足这种需求。
                         发明概要
本发明提供具有N末端和C末端截短的GSK3β分子，其中该分子能结晶。
本发明还提供在R344、R354、R364、A374、和I384氨基酸上截短的GSK3β分子。
本发明提供多肽、编码这些多肽的多核苷酸以及包含这些多核苷酸的载体，该多肽主要由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3组成。
本发明还提供GSK3β分子，其中，该分子的翻译在G34、T39、P44、D49或V54开始。
本发明还提供具有N末端和C末端截短的GSK3α分子，其中该分子能结晶。
本发明还提供从S97开始翻译到S447结束翻译的GSK3α分子、编码这种多肽的多核苷酸以及包含这些多核苷酸的载体。
本发明还提供一种鉴别能结晶的GSK3多肽的方法，该方法包括：(a)提供截短的GSK3多肽；(b)测试该多肽的晶体形成。
本发明还提供能与GSK3的抑制剂相互作用的GSK3多肽。
本发明还提供一种鉴别酶激活的GSK3多肽的方法，该方法包括：(a)提供截短的GSK3多肽；(b)使该多肽与GSK的底物接触；(c)在该多肽与底物接触后测量该多肽的激酶活性；其中，如果激酶活性显示为＞0.01倍全长酶的活性，则该多肽是活性的，较佳是＞0.1倍全长酶的活性。
                 附图和序列标识的简单描述
图1提供人GSK3β的多肽序列(SEQ ID NO：1)。
图2提供截短的GSK3β多肽557的多肽序列(SEQ ID NO：2)。前10个氨基酸表示Glu-标记物，接着在位置1上的Met前有一Gly接头。
图3提供截短的GSK3β多肽580的多肽序列(SEQ ID NO：3)。前10个氨基酸表示Glu-标记物，接着在位置34上的Gly前有一Gly接头。
图4提供人GSK3α的多肽序列(SEQ ID NO：4)。
图5提供在447位上截短的人GSK3α的多肽序列(SEQ ID NO：5)。
图6提供在97位上截短的人GSK3α的多肽序列(SEQ ID NO：6)。
图7提供97位到447位的人GSK3α的多肽序列(SEQ ID NO：7)。
                      发明的详细描述
本发明提供鉴别和优化GSK3(包括GSK3α和GSK3β)的抑制剂的材料和方法。所提供的材料包括C末端和N末端截短的GSK3β分子，这些分子能结晶，并且可能但不需要保留GSK3激酶活性，较佳的是，保留大于0.01倍全长酶的活性，更佳是保留大于0.1倍全长酶的活性。从GSK3在各种疾病和病症(包括阿尔茨海默氏病、II型糖尿病和炎症)中的作用看，本领域仍需要这类抑制剂。可使用本发明的可结晶的GSK3多肽鉴别出这类抑制剂，并可优化鉴别的抑制剂。
本发明提供各种GSK3β多肽，这类多肽在C末端和/或N末端与天然的多肽不同。GSK3β的氨基酸序列显示在图1中(SEQ ID NO：1)。GSK3β多肽的任何和所有截短形式都包括在本发明的范围之内，其中，截短的多肽能结晶，并且可能但不需要保留激酶活性，如采用本文所述的激酶试验所测。本领域熟练的技术人员将认识到蛋白质的有限突变、或者某些翻译后修饰可能足以使该激酶灭活，但仍保留必需的三维结构。这种灭活的但结构上相关的分子还可用于抑制剂的设计和优化。激酶试验在美国专利第6057117号和第6057286号中有描述，本文将其纳入作为参考。所保留的百分比活性如果有的话，也不是关键性的。本文还描述在抑制剂存在和缺乏的情况下检测活性的方法。
本发明提供许多满足这些标准的截短的GSK3β多肽。优选的多肽为BV557，在此多肽中C末端氨基酸是R384。这个分子已成功结晶。其它活性多肽包括在氨基酸R344、R354、A374和I384上截短的多肽。
本发明还提供截短的GSK3α多肽，包括在S97开始和在S447终止的GSK3α多肽。
其它截短的GSK3多肽包括以不同于天然蛋白质的N末端氨基酸开始的多肽，其中，1个或多个氨基酸在N末端被删除。优选的N末端截短包括在G34、T39、P44、D49或V54开始翻译的GSK3β分子。一个例子是BV580(氨基酸34到484)，它已经被结晶。
本发明并不限于这些公开的截短分子。采用本文所述的方法和试验，熟练的技术人员可构建其它的截短分子，如在C末端有36-76个氨基酸被删除和/或在N末端有35-54个氨基酸被删除。这些删除可单独发生，或者多肽可同时具有C末端删除和N末端删除。较佳但不一定的是，如由酶活性检测(如采用本文所述的试验)所反映，激酶功能域保留相对完整。还需要的是(虽然不一定是必需的)，酶活性能被GSK3抑制剂(如锂)所抑制。满足这些要求的截短分子将适合用于测试GSK3抑制剂作为潜在的治疗剂，并用于优选GSK3抑制剂。
本发明截短的GSK3β多肽可由SEQ ID NO：1的长约250-419个的连续氨基酸组成，较佳是由SEQ ID NO：1的长约278-419个的连续氨基酸组成，更佳是由SEQID NO：1的长约285-384个的连续氨基酸组成，最佳是由SEQ ID NO：1的长约351-384个的连续氨基酸组成。较佳的截短的GSK3β多肽包括在SEQ ID NO：1的以下位置开始：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62，并在SEQ ID NO：1的以下氨基酸位置结束的多肽：340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418或419。多肽可在任何一个所列出的起始氨基酸开始，并在任何一个终止氨基酸结束。例子和非限制性实施例为在第34、39、44或54位氨基酸开始并在第420位氨基酸结束。其它特殊的优选实施例在约1位氨基酸开始，在340、344、354、374、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419或420终止。
本发明截短的GSK3α多肽由SEQ ID NO：4的长约182-482个的连续氨基酸组成，较佳是由SEQ ID NO：4的长约182-386个的连续氨基酸组成，更佳是由SEQID NO：4的长约182个到约351个的连续氨基酸组成，更佳是由SEQ ID NO：4的约S97到S447组成。
可采用本领域已知的任何方法制备截短的GSK3多肽。一个方法涉及适当制备的编码具有所需截短的多肽的多核苷酸的表达。例如，通过产生编码在M1起始在I384终止的GSK3β的构建物来制备本发明的优选多肽BV557，如实施例中所述。简言之，用杆状病毒载体(命名为pBlueBac4.5.Glu.GSK3B.DC.I384#28)转染编码BU557的昆虫细胞，然后从裂解的细胞中抽提蛋白质。采用亲和层析，使用固定在Sepharose柱上的抗glu-标记物单克隆抗体纯化蛋白质。采用美国专利第6057286号中描述的体外激酶试验来检测纯化的蛋白质的活性。
本文所述的实施例描述了BV557、BV580和其它截短的GSK3多肽的生产，通过使编码这些多肽的载体表达，然后将这些多肽分离、纯化，从而得到这些多肽。也可采用本领域已知的方法，使用酶裂解天然的GSK3蛋白质也可产生多肽。其它合适的方法包括编码截短的多肽的多核苷酸在各种细胞类型(包括哺乳动物、细菌或酵母细胞)中的表达。但是，用于多肽表达的优选细胞是昆虫细胞，较佳是可被杆状病毒感染的昆虫细胞，如Sf9细胞。
本发明还提供非磷酸化形式的GSK3，其中ATP结合位点与野生型蛋白质的相同。这类形式包括Y216非磷酸化GSK3β和Y279非磷酸化GSK3α。其它形式包括具有至少一个阻止磷酸化的氨基酸变化的构建物，如其Y216变为F216的GSK3β和其Y279变为F279的GSK3α。这些形式适用于抑制剂结合试验，以鉴别GSK3的抑制剂。本发明提供一种216位置上非磷酸化的GSK3β分子。我们已证明Y216突变为F216的GSK3β肽结晶的，并具有ATP结合位点基本上与未突变肽相同的结构。
其它的单氨基酸或多氨基酸变化包括GSK3β中的S9变为A9、GSK3α中的S21变为A21。
可将磷酸化中的这些变化，或者能被磷酸化的能力任选地掺入本文所公开的截短形式的GSK3α和GSK3β中。
因此，本发明提供适用于设计和优化作为药剂的GSK3抑制剂的GSK3分子。
本发明的GSK3构建物能结晶。在纯化形式，这些构建物由于在抑制剂结合位点上保留了正确的折叠构型，而以与结合于天然GSK3多肽的抑制剂可比的方式与抑制剂结合。采用各种试验测量结晶的潜力，包括特殊活性、聚集、微观不均一性(例如参见表1)。这些参数表明了制品的纯度和构建物的溶解度。特殊活性也是检测抑制剂与GSK3构建物的正确结合位点结合的优选试验。另一合适的方法是荧光偏振。简言之，连接有荧光团的假定抑制剂在溶液中自由翻转。因而，当荧光团被偏振光激励时，在有限延迟后产生的发射光现在具有随机的极性，发射光不再被极化。具有完整的抑制剂结合位点的GSK3构建物存在时，翻转的速率缓慢到足以保证即使光发射因激励而被延迟，荧光团也仅仅有非常轻微的移动。因而，激励光维持着偏振。因此，荧光偏振的测量结果表明GSK3构建物适合用于鉴别和优化抑制剂。荧光团可连接于一种化合物上，如星形孢菌素〔ICN药物公司(ICN Pharmaceuticals，Inc.)，Costa Meas，CA〕。GSK3构建物可能没有保留激酶活性，但是仍可使用荧光偏振试验检测它们的抑制剂结合。
术语“截短的糖原合成激酶3”或“截短的GSK3”在本文中指GSK3α或GSK3β。GSK3是如Woodgett等描述的，最初由其糖原合成酶的磷酸化而鉴别得到的蛋白质，《生物化学科学趋势》，16：177-181(1991)所述。GSK3的同义词是tau蛋白激酶I(TPK I)、FA激酶和激酶FA。如Woodgett，EMBO J.，9(8)：2431-2438(1990)所述，已克隆了哺乳动物的GSK3。截短的GSK3多肽的抑制剂可以是任何已知形式的GSK3的抑制剂，包括GSK3α或GSK3β或者两者。本发明的截短的多肽具有GSK蛋白质的一种或多种生物活性，包括激酶活性，如使tau蛋白聚合，或者使糖原合成酶磷酸化。因此，用于设计和优化GSK3的抑制剂的截短的GSK3多肽，其与不论是从人还是非人类来源的天然蛋白质的氨基酸序列同一性至少为40％，较佳为50％，较佳为60％，较佳为70％，更佳为80％，最佳为90％。编码GSK3的多核苷酸可与GSK3的天然多核苷酸序列具有60％、较佳70％、更佳80％、更佳90％、最佳95％的序列同一性。因此，本发明还包括天然多核苷酸序列的等位基因和变体，这样该多核苷酸编码与天然序列相比具有取代、缺失或插入的氨基酸序列。
术语“肽底物”指可在适量ATP或磷酸盐供体的存在下被GSK3活性磷酸化的肽或多肽或合成肽衍生物。通常加入标记磷酸盐(如放射性标记的磷酸盐)来检测磷酸化底物，该标记磷酸盐可采用标记领域中一些常用的方法检测到。肽底物可以是存在于分子中作为一部分较大的多肽的肽，或者是设计用于被GSK3磷酸化的分离肽。
如美国专利第6057117和第6057286号所述，检测GSK3活性的体外方法包括构建肽底物。肽底物可以是被GSK3可磷酸化的任何肽底物，也可以是包括下式的肽底物：锚配体-(X)nSXXXS(X)m(SEQ ID NO：8)〔其中，X是任何氨基酸，n是任何整数，m是任何整数，较佳的是n+m+5＜20，即n+m＜15〕，在C末端丝氨酸磷酸化。测试如下进行：在放射性标记的γ-磷酸盐-ATP、底物锚和一种任选的候选抑制剂的存在下，使预磷酸化的底物与截短的GSK3多肽接触。鉴别GSK3激酶活性的抑制剂的体外方法包括：在放射性标记的γ-磷酸盐-ATP、底物锚和候选抑制剂的存在下，使偶联于锚配体的肽底物与截短的GSK3多肽接触，测量放射性标记物掺入该肽底物中的量；然后，在分离的检测容器中，在放射性标记的γ-磷酸盐-ATP、底物锚的存在下，使一种偶联于一种锚配体的肽底物与截短的GSK3接触，测量该放射性标记物掺入所述肽底物中的量；最后，将具有候选抑制剂的试验中标记物的掺入量与无候选抑制剂的试验的掺入量比较，由前者相对于后者的减少鉴定出截短的GSK3激酶活性的抑制剂。
为了使用微孔进行本发明的体外激酶检测，可使用闪烁体物质预先包涂孔，或者在洗涤步骤中再将其加入，从而在孔中可存在闪烁体，如实施例4所述。可从Packard，Meridian，Conn.获得闪烁体。然后，在包涂了闪烁体的孔中再包涂链霉亲和素作为底物锚，其中的生物素是肽上的锚配体。或者，链霉亲和素可存在于包含闪烁体的琼脂糖珠上，或者可包涂在另一未处理的平板上，闪烁体是随后加在该手板上的。在任何事件中，孔中的链霉亲和素结合于与之接触的生物素。在使用放射性标记的ATP进行检测后，掺入已偶联于生物素的磷酸化底物中的放射性标记物将引起闪烁体发光。对于链霉亲和素连接于包含闪烁体的琼脂糖珠的情况，与偶联了生物素的放射性标记的肽底物的结合将导致这些珠闪烁。在包涂了闪烁体的孔和包含闪烁体的琼脂糖珠的两个例子中，与非抑制条件下测得的闪烁的对照量相比，闪烁的减少表明了GSK3活性的功能性抑制剂的存在。如果肽已经被GSK3用32P标记的或33P标记的磷酸盐磷酸化，放射性衰减将导致存在于微孔中或混合在反应混合物中的琼脂糖珠中的闪烁体发光，所测得的发射光的量将是试验中GSK3活性的测量值。与无抑制剂的GSK3活性相比，存在候选抑制剂的情况下观察到GSK3的活性低，这可能表明该抑制剂是功能性的，并且该抑制剂可抑制GSK3激酶活性。在任何情况下，应将相对于肽过量的链霉亲和素加到各个孔中，或应使其粘附到琼脂糖珠上。
可采用出版物WO99/65897以及本文实施例4所述的无细胞试验测量GSK3抑制活性。还可采用基于细胞的试验测量活性。简言之，用Tau和GSK3多肽转染一个细胞系，如Cos细胞系。使用单克隆抗体监测特殊位点上Tau的磷酸化，因为该位点上的磷酸化依赖于GSK3的活性。
本发明的多肽例子包括SEQ ID NO：1的下述截短的多肽：
                   在R344截短的GSK3β
                   在R354截短的GSK3β
                   在T364截短的GSK3β
                   在A374截短的GSK3β
                   在I384截短的GSK3β
                   在G34开始的GSK3β
                   在T39开始的GSK3β
                   在P44开始的GSK3β
                  在D49开始的GSK3β
                  在V54开始的GSK3β
上述截短可以是组合的，提供在G34、T39、P44、D49或V54中的任一个开始和在R344、R354、T364、A374或I384中的任一个终止的GSK3β多肽。
本发明的其它多肽例子包括SEQ ID NO：4的下述截短的多肽：
            在S447截短的GSK3α
            在S97开始的GSK3α
            始于S97截短于S447的GSK3α。
在一个或多个参数的基础上选择本发明截短的GSK3多肽。多肽较佳是以类似于天然GSK3的结晶方式结晶，在抑制结合位点上和周围具有正确的折叠。可使用Crystal Screen试剂盒(Hampton Research，Laguna Niguel，CA)，或者采用Jancarik，J.等，J.Appl.Cryst.，24：409-411，1991所述的方法进行结晶。可在特殊活性、纯度、均一性、质谱、聚集和动态光散射的基础上评估多肽形成晶体的潜力。优选的截短的肽将满足下述参数：至少90％的纯度；在4℃两周内少于100％的聚集；少于50％的不均一性(50％或以上的所需形式)。最优选的截短的多肽将具有至少98％的纯度，在4℃两周无聚集，少于5％的不均一性(未磷酸化形式)。这些参数表明，多肽制品可能结晶，从而使得它适用于发现和优化GSK3抑制剂。
结晶的前提是获得蛋白质的足够浓的原液。并不是所有的GSK3构建物在所需的浓度维持着可溶状态。优选的浓度是＞1mg/ml，更佳是＞5mg/ml，最佳是＞10mg/ml。
本文所公开的多肽，如557(SEQ ID NO：2)、580(SEQ ID NO：3)、458和524，满足上述标准(参见实施例3)。多肽458由SEQ ID NO：1的1-420个氨基酸加上在其N末端加入的下述氨基酸组成：EFMPTEAMAAPKRVI(SEQ ID NO：8)。多肽524由SEQ ID NO：1的1-420个氨基酸加上在其N末端加入的下述氨基酸组成：EYMPMEGGG(SEQ ID NO：9)。可如本文所述制备和测试其它修饰的或截短的GSK3多肽。
                              实施例
下述实施例仅仅是例子而已，并不限制本发明。实施例1：GSK3β构建物557的制备和纯化
裂解和抽提：将在1升烧瓶中生长的Sf9细胞的昆虫细胞浆液(约10g)与30毫升裂解缓冲液混合，该缓冲液组成如下：20mM Tris，pH8.0；80mM NaCl；1mMMgCl2；1mM砷酸盐；1mM钨酸盐；1mM PMSF；0.5mg亮抑酶肽；0.2mg抑蛋白酶肽(Aprotinin)。使用Dounce均浆器裂解细胞。加入5％甘油和0.2％辛基葡糖苷实现蛋白质的改进抽提。在冰上搅拌混合物30分钟。在4℃以39000g离心总裂解物。所得的上清液含有抽提的GSK3-β#557。
离子交换色谱：使用下述材料和条件：树脂是Fractogel EMD SO3-(M)；柱直径为1.6厘米，柱体积为10毫升。使用20mM磷酸钠/5％甘油(pH7.5)的平衡缓冲液以90厘米/小时的流速过柱。在4℃进行色谱。
用S-fractogel平衡缓冲液以1∶1稀释裂解物上清液，然后将其加到平衡过的柱上。用总共14柱体积的平衡缓冲液洗涤柱。用线性盐梯度洗脱GSK3-β，在20体积柱内的平衡缓冲液中加入1M NaCl。在梯度洗脱中收集到3毫升/馏分。基于收集的馏分的SDS-PAGE和Western印迹结果，将它们合并。合并馏分13-24。
使用下述材料和方法进行亲和层析：树脂是固定在G蛋白琼脂糖凝胶上的抗glu-标记物单克隆抗体，平衡缓冲液是PBS/0.3M NaCl/0.2％辛基葡糖苷/10％甘油。柱直径是1.6厘米，柱体积是13毫升。加料和洗涤过程中的流速是30厘米/小时，洗脱过程中为15厘米/小时。
以30厘米/小时的流速将S-Fractogel合并物加到平衡柱上。用大约6柱体积的平衡缓冲液将柱洗到吸收基线处，用含有2毫克洗脱肽(EYMPTD)的50毫升平衡缓冲液洗脱GSK3β。洗脱过程中的流速低于15厘米/小时。在洗脱过程中收集到2毫升/馏分。基于SDS-PAGE结果，合并洗脱馏分6-17，总共得到24毫升。
最终产率：浓度为0.17毫克/毫升的亲和柱合并物含有4.1毫克的GSK3β#557。这可转换成4.1毫克纯化的557/升生长物的产率。在经过此2柱纯化后，对SDS-PAGE结果的肉眼观察，估计纯度为＞95％。实施例2：GSK3β构建物580的制备和纯化
抽提：用100毫升PBS(10mM NaPi，pH7.5，150mM NaCl)洗涤从10升发酵物中得到的SF9细胞糊状物，然后用300毫升H缓冲液(20mM Tris，pH7.5，1mM钨酸盐，1mM砷酸盐，5mM DTT，10微克/毫升亮抑酶肽，1微克/毫升抑胃酶肽A，10％甘油，0.35％辛基葡糖苷，1mM Mg2+)将其再悬浮。在100毫升Dounce均浆器中均浆细胞(用B研杵撞击20次)。在Ti45转头中以40000rpm离心合并的均浆液35分钟，除去细胞碎屑和核。小心地倾析出离心物的上清液，使其通过0.45μ滤膜过滤。
S-Fractogel：将100毫升S-Fractogel(EM Science，目录号#18882)包装成3.2厘米×12.5厘米的柱，用＞1升的A缓冲液(20mM Tris，pH7.5，10％甘油)平衡。以15毫升/分钟的速率将从先前步骤获得的滤液加到柱上。用1升的A缓冲液洗涤柱，然后用缓冲液洗脱，该缓冲液是在20柱体积内在A缓冲液中含有0-1M NaCl的线性梯度缓冲液。将洗脱物分成每份20毫升。采用Western印迹，使用抗GSK-抗体(Santa Cruz Biotech，目录号#SC-791)检测含有GSK3的馏分。合并Western印迹阳性馏分，并将其与等体积的M缓冲液(20mM Tris，pH7.5，10％甘油，3.1MNaCl)混合，然后使通过0.45μ滤膜过滤。将滤出液保存，用于Phenyl-650M色谱。
Phenyl-650M：将37.5毫升的Phenyl-659 M(Tosohass，目录号#014943)包装成2.2×10厘米的柱，用500毫升C缓冲液(20mM Tris，pH7.5，10％甘油，1.6M NaCl)平衡。以7.5毫升/分钟将从S-Fractogel步骤中得到的滤液加到柱上。在加料结束后，用6.5cv缓冲液C洗涤柱，并在20柱体积内用线性梯度为0-100％的缓冲液D(20mM Tris，pH7.5，10％甘油)洗脱。以15毫升的量收集馏分，进行Western印迹，使用抗-GSK抗体检测含有GSK的馏分。合并Western印迹阳性馏分，然后加到Glu-标记物抗体亲和柱上。
Glu-标记物抗体亲和色谱：如Rubinfeld等，《细胞》(Cell)，65：1033-1042，1991所述使用Glu-标记物，如Grussenmyer等，《美国科学院院报》(PNAS)，82：7952-7954(1985)所述使用表达抗-Glu-标记物抗体的杂交瘤。将50毫克Glu-标记物抗体固定在25毫升的Affi-Gel 10(BioRAD，目录号#153-6046)上，然后包装成2.2×6.5厘米的柱。用200毫升的E缓冲液(20mM Tris，pH7.5，10％甘油，0.3MNaCl，0.2％辛基葡糖苷)平衡柱，以1.0毫升/分钟加入从Phenyl-650M步骤得到的馏分合并物。在加料结束后，用100毫升E缓冲液洗涤柱，然后用60毫升Glu-标记物肽(100微克/毫升)的E缓冲液洗脱，将馏分分成每份5毫升。使用SDS-PAGE和考马斯蓝染色检测含有GSK的馏分。合并这些馏分，使用10k MWCO YM10膜在Amicon浓缩器中将其浓缩成大约6毫克/毫升。然后将浓缩的物质用于结晶。实施例3：截短的GSk3β多肽的活性
在含有所需量的截短GSK3多肽的反应缓冲液(5mM Tris，pH7.5，5mM DTT，1mM MgCl2，0.01％ BSA)中制备含有5.9μM预磷酸化SGSG-连接的CREB肽〔Wang等，《分析生物化学》(Anal.Biochem.)，2202：397-402(1994)〕的反应混合物。加入ATP，使最终浓度为25μM(比活性5.3Ci/mmol)，然后在室温培育该混合物20分钟。通过将30微升转移到P81滤膜盘(Whatman)上中止反应。将此盘放在150ml的75mM H3PO4中洗涤4次，每次5分钟。空气干燥滤膜，并在5毫升闪烁液体下计数。通过测定计数(cpm)与反应中的GSK3的质量(μg)之比，测得比活性。
构建物557的比活性是4.3×107cpm/μg；对于构建物458，其比活性为2.8×107cpm/μg；对于构建物524，比活性为2.2×107cpm/μg。
                                                    表1
构建物 纯度    平均比活性cpm/μg N    浓度mg/ml 在4℃的聚集  在室温的聚集 不均一性(％)
  458   ＞98％     2.8×107     35   11.5   在＞2周为11％   过夜   10-20％未磷酸化
  557   ＞98％     4.3×107     7   12.7   在＞2周为无   过夜   5％未磷酸化
  524   ＞98％     2.2×107     27   10   未测   ＜5％未磷酸化
N＝用于检测“平均比活性”的试验次数。实施例4：采用无细胞试验筛选GSK3抑制活性
将要作为GSK3抑制剂的化合物溶解在DMSO中，然后测试它们对人GSK3α的抑制作用。GSK3β的表达在例如Hughes等，Eur.J.Biochem.，203：305-11(1992)中有描述，本文将它们纳入作为参考。将300μl底物缓冲液(30mM tris-HCl，10mMMgCl2，2mM DTT，3μg/ml GSK3β)和0.5μM生物素化的预磷酸化SGSG-连接的CREB肽(Chiron Technologies PTY Ltd.，Clayton，澳大利亚)的等分试样分散在96孔聚丙烯微滴定板中。加入3.5μl/孔的DMSO，其中含有不同浓度的要检测的各化合物或星形孢菌素(一种已知的激酶抑制剂，用作阳性对照，或者阴性对照)(即，仅有DMSO)，并充分搅拌。然后加入50μl/孔的1μM未标记ATP和1-2×107cpmγ33P-标记的ATP来启动反应，使反应在室温进行约3小时。
当进行反应时，在室温将包涂了链霉亲和素的Labsystem“Combiplate 8”俘获平板(Labsystem，Helsiniki，Finland)与300μl/孔的PBS(含有1％牛血清白蛋白)培育至少1小时，以将平板封阻。然后通过抽吸除去封阻溶液，以100μl/孔的终止剂(50μM ATP/20mM EDTA)填到俘获平板上。
当三小时的酶反应结束时，将各反应混合物的三份100μl的等分试样转移到含有终止溶液的三个孔中，一个孔在各个三个俘获平板上，孔内容物很好地混合。在室温1小时后，采用抽吸方法排空俘获平板的孔，然后用PBS和12道的康宁430474 ELISA平板洗涤器洗涤5次。最后，将200μl Microscient-20闪烁液体加到平板的各个孔中。用平板密封器将平板套上，然后将平板放置于摇动器中30分钟。在Packard TopCount闪烁计数器(Meridian，Connecticut)中给每块俘获平板计数，将结果以化合物浓度的函数作图。
通过测试采用此方法鉴别的化合物结合本发明截短的GSK3多肽的能力，从而将它们进一步优化，可采用荧光偏振试验进行测试，例如截短的GSK3多肽可以是不抑制GSK3激酶活性的截短多肽。或者，可使用本发明截短的GSK3多肽替换天然的GSK3蛋白质。实施例5：筛选Tau蛋白磷酸化的抑制作用
A. 使用编码截短的GSK3的表达质粒和Tau表达质粒构建物对COS细胞 进行的瞬时转染
将COS细胞维持在T25组织培养瓶的高葡萄糖MEM培养基/5％胎牛血清中。收集在T25烧瓶中铺满的细胞，以80,000个细胞/孔接种在康宁6孔组织培养平板上，使最终体积为2毫升/孔的培养基。使细胞在37℃生长48小时。然后在不含有胎牛血清的Opti-MEM中洗涤细胞两次，最后将细胞放置在1毫升的Opti-MEM中。
在早期SV40启动子的控制下，将编码tau蛋白的多核苷酸亚克隆到质粒pSG5中，产生tau表达质粒。编码tau蛋白的cNDA的克隆在Goedert等，EMBO Journal，8(2)：393-399(1989)中有概述，本文将其纳入作为参考。将编码截短的GSK3的多核苷酸亚克隆到pCG中，制得GSK3表达质粒，其中pCG是Giese等，《基因和发展》(Genes & Development)，9：995-1008(1995)和Matthias等，《核酸研究》(Nucleic Acid Research)，17：6418(1989)中所述的ApEVRF衍生物，本文将这两篇文献的内容纳入作为参考。多核苷酸可编码本发明任一截短的GSK3多肽。
在1.5毫升Eppendorf管中配制下述溶液：
溶液A：对于每一个转染，将2μg的DNA(tau表达质粒)和0.7μg的DNA(GSK3表达质粒)稀释到100微升的Opti-MEM(Gibco BRL)中；溶液B：对于每一个转染，将8μl的Lipofectamine试剂稀释到100μl的Opti-MEM中。混合两种溶液，轻微搅拌，在室温培育45分钟，以形成DNA-脂质体复合物。对于每一个转染，将0.8毫升的Opti-MEM加到含有这些复合物的管中。轻微搅拌稀释的溶液，然后将其加到清洗的细胞上。使细胞在CO2培养箱中在37℃与复合DNA/Lipofectamine培育6小时。在培育后，将具有20％ FBS的1毫升生长培养基(高葡萄糖MEM)加到各个孔中，然后在37℃培育过夜。在开始转染18小时后，用新配制的完全培养基替换原培养基，然后使细胞在37℃再生长48小时。
B.  Tau磷酸化抑制试验
在收集前两小时，将2μl溶解在DMSO中的GSK3抑制剂加到各个孔中，然后在37℃培育。2小时后，除去培养基，使细胞在于冰上在平板中快速冷冻，然后保存在-70℃。在200微升裂解缓冲液(1％ TritonX-100，20mM Tris pH7.5，137mM NaCl，15％甘油，25μg/ml亮抑酶肽，1μg/ml抑胃酶肽A，1μM PMSF，21μg/ml抑蛋白酶肽，50mM NaF，50mM β-磷酸甘油，15mM焦磷酸钠，1mM原钒酸钠)的存在下，在冰上将细胞解冻。在4℃，以14,000g离心各个孔的内容物5分钟，将上清液转移到干净的管中。将由此得到的裂解物保存在-20℃。
C. 采用ELISA检测细胞裂解物中的磷酸化tau
用单克隆抗磷酸化tau(AT8，Polymedco，Inc.)包涂4根Immulon条带(Dynatech)，该单克隆抗磷酸化tau的浓度为5μg/ml，存在于含有Ca++和Mg++的PBS中，包涂为每孔100μl。4℃过夜培育后，用洗涤缓冲液(含有0.05％ Tween20的PBS)洗涤条带两次，然后在室温用含有1％ BSA、5％正常小鼠血清和0.05％Tween20的PBS封阻1小时。用洗涤缓冲液洗涤条带5次。以1∶10的比例将裂解液(100μl)稀释在含有1％ BSA的PBS中，将0.1％ NaN3加到各孔中，并在室温培育1小时。洗涤后，将100μl、0.5μg/ml的含于PBS-BSA中的生物素化单克隆抗(未磷酸化)tau(HT7，Polymedco，Inc.)加到各孔中。洗涤条带5次，然后加入偶联了HRP的链霉亲和素，室温培育30分钟，然后用洗涤缓冲液彻底清洗。使用TMB底物(Pierce)进行显色，加入等体积的0.8M硫酸中止反应。在ELISA平板读数器上用450nm滤波器读取条带。通过将S形曲线与绘图数据拟合，测得抑制tau磷酸化达最大水平的50％的化合物的浓度(即，IC50)。
本领域熟练的技术人员采用不多的常规试验，将认识到或能判断本文所述的本发明具体实施例的许多等效形式。这些具体实施例和等效形式都包括在下述权利要求中。
本文所引用的所有专利、出版的专利申请和出版物都被纳入本文作为参考，就像在本文中所述的那样。

Claims (26)

1.一种分离的核酸，其特征在于，该核酸含有一多核苷酸，该多核苷酸编码主要由SEQ ID NO：2组成的多肽，其中所述多肽将结晶，并具有至少一种选自以下的生物学活性：(a)结合GSK3抑制剂，和(b)激酶活性。
2.一种分离的核酸，其特征在于，该核酸含有一多核苷酸，该多核苷酸编码主要由SEQ ID NO：3组成的多肽，其中所述多肽将结晶，并将具有至少一种选自以下的生物学活性：(a)结合GSK3抑制剂，和(b)激酶活性。
3.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1或2所述的多核苷酸。
4.一种多肽，其特征在于，所述多肽含有SEQ ID NO：1的长约250-419个的连续氨基酸，其中所述多肽216位上的酪氨酸被磷酸化，所述多肽将结晶，且所述多肽具有至少一种选自以下的生物学活性：(a)结合GSK3抑制剂，和(b)激酶活性。
5.一种多肽，其特征在于，所述多肽主要由SEQ ID NO：1的长约278-419个的连续氨基酸组成，其中所述多肽具有至少1％的人GSK3β的激酶活性。
6.一种多肽，其特征在于，所述多肽主要由SEQ ID NO：1的长约285-384个的连续氨基酸组成，其中所述多肽具有至少1％的人GSK3β的激酶活性。
7.一种多肽，其特征在于，所述多肽主要由SEQ ID NO：1的长约351-384个的连续氨基酸组成，其中所述多肽具有至少1％的人GSK3β的激酶活性。
8.一种多肽，其特征在于，所述多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。
9.一种多肽，其特征在于，所述多肽由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成。
10.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸含有一多核苷酸，该多核苷酸编码主要由SEQ ID NO：5组成的多肽，其中所述多肽将结晶，并将具有至少一种选自以下的生物学活性：(a)结合GSK3抑制剂，和(b)激酶活性。
11.如权利要求10所述的核酸，其特征在于，所述多肽在酪氨酸279上磷酸化。
12.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求10或11所述的多核苷酸。
13.一种多肽，其特征在于，所述多肽含有SEQ ID NO：4的长约182-482个的连续氨基酸，其中所述多肽将结晶，且所述多肽将具有至少一种选自以下的生物学活性：(a)结合GSK3抑制剂，和(b)激酶活性。
14.一种多肽，其特征在于，所述多肽主要由SEQ ID NO：4的长约182-386个的连续氨基酸组成，其中所述多肽具有至少1％的人GSK3α的激酶活性。
15.一种多肽，其特征在于，所述多肽主要由SEQ ID NO：4的长约182-351个的连续氨基酸组成，其中所述多肽具有至少1％的人GSK3α的激酶活性。
16.一种多肽，其特征在于，所述多肽主要由SEQ ID NO：1的S97到S447之间连续的氨基酸组成。
17.一种多肽，其特征在于，所述多肽主要由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成。
18.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码主要由SEQ ID NO：6组成的多肽。
19.一种多肽，其特征在于，所述多肽主要由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成。
20.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码主要由SEQ ID NO：7组成的多肽。
21.一种多肽，其特征在于，所述多肽主要由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成。
22.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码未磷酸化的人GSK3多肽，其中所述未磷酸化的多肽与天然的GSK3有至少一个但不超过10个氨基酸不同。
23.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，SEQ ID NO：1的216位上的酪氨酸被不可磷酸化的氨基酸取代。
24.如权利要求23所述的多核苷酸，其特征在于，所述不可磷酸化的氨基酸是苯丙氨酸。
25.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，SEQ ID NO：4的279位上的酪氨酸被不可磷酸化的氨基酸取代。
26.如权利要求25所述的多核苷酸，其特征在于，所述不可磷酸化的氨基酸是苯丙氨酸。
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