CN1483473A - 重组水蛭素的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了重组水蛭素的一种新用途，具体说是在制备预防和治疗白内障疾病的药物中的应用。

Description

重组水蛭素的新用途

技术领域

本发明涉及重组水蛭素的新用途，尤其涉及在制药领域中的用途。

背景技术

水蛭素是从医用水蛭唾液腺提取的含65-66个氨基酸的蛋白，为单链多肽，分子质量为7000u，分子中含3对二硫键，在1-49位形成了高度折叠、致密的三级结构，使此结构域稳固，而线形的C端序列用以结合凝血酶。作为凝血酶的特异性抑制剂，它有很强的抗凝活性，能有效预防和治疗弥散性血管内凝结，在心血栓及脑血栓等疾病方面均有显著作用。由于天然水蛭素来源有限，目前广泛利用生物工程技术制备重组水蛭素，最广泛的两类细胞表达体系分别为大肠杆菌(E.coli)和釀酒酵母(S.cerevisiae)。CN1319671A中公开了重组水蛭素的制备方法。临床上，重组水蛭素多用于治疗不稳定性心绞痛(USA)、急性心肌梗死(AMI)、血管成形术、术后血栓形成、血液透析、体外循环、弥散性血管内凝血(DIC)等(MarkwardtF.Hirudin as an inhibitor of thrombin[J].Methods in Enzymelogy，1970，19：924)。临床实验表明重组水蛭素不引起过敏、免疫反应，并且不会造成循环功能障碍。但未见有预防和治疗白内障疾病的药理报道及临床应用。

发明内容

本发明公开了重组水蛭素的一种新用途，特别是重组水蛭素在制备预防和治疗白内障疾病的药物中的应用。

在白内障的发生过程中，均伴有晶体内的种种生化代谢改变：如脂质过氧化加速，醛糖还原酶活性增高、超氧化物歧化酶及谷胱甘肽还原酶等活性降低，ATP浓度下降，一些氨基酸、维生素及还原性物质减少，电解质平衡失调以及晶体蛋白聚合和结构性质改变等。因此，防治白内障的途径也是多方面的：如利用抗氧化剂或抗氧化激活剂以清除或中和紫外线、电离辐射、化学物质以及代谢产物等对晶体的有害损伤，通过补充维生素、辅酶(NADP)、谷胱甘肽以及ATP等，以减少晶体内的生化代谢改变，通过封闭蛋白质的一些活泼基团，以保护蛋白质免受有盐害化学物质形成加合物而造成损伤。在药理学试验中，检测一个药物是否对改善白内障有益，通常看待测药物是否能使晶体内SOD活力升高、MDA含量下降。

我们的试验发现重组水蛭素对眼无刺激，可显著推迟白内障发生时间，减轻晶状体浑浊程度，降低MDA含量，增大SOD活力。对白内障有显著的防治作用。

为了更好地发挥疗效，将重组水蛭素制备成药学上常用制剂，优选的制剂为滴眼液、眼膏剂、注射剂。滴眼液的制备中，除加入缓冲溶液，还可加入对眼无刺激的促吸收剂、增稠剂、等渗剂、抑菌剂等。局部用眼药的剂量一般为0.001～0.01g/日，也可根据不同情况超出该剂量范围。

以下是本发明的部分药理学试验及数据，所用重组水蛭素依据CN1319671A方法制备得到：

一、多次眼刺激试验试验动物：家兔1.8-2.3Kg，4只。南京安立默科技有限公司，许可证号：SCXK(苏)20020-0002试验方法：按《临床前研究指导原则汇编》中华人民共和国卫生部药政局标准进行，将重组水蛭素滴眼液(0.5g/100ml)滴入眼结膜囊内。然后轻合眼睑约10秒，以确保受试物与局部的接触充分。另外一只眼将溶剂滴入眼结膜囊内，作为对照。

观察期与观察指标：在1、24、48、72hr进行眼部检查，连续观察7天。除了应观察结膜、角膜、虹膜外，其他所观察到的损伤也应记录和报告。每次检查，都应记录眼部的反应的分值。试验结果：将每一动物的眼角膜、虹膜和结膜的刺激性反应分值相加得总积分，将一组的总积分除以动物数，即得最后分值，见下表.

              各个观察时间各组眼睛最后得分

试验动物组      1h   24h  48h  72h  4d  5d  6d  7d

给药一侧眼睛    0    0    0    0    0   0   0   0

对照一侧眼睛    0    0    0    0    0   0   0   0试验结论：重组水蛭素滴眼剂对给药一侧眼睛眼角膜、虹膜和结膜未出现刺激性，与对照一侧眼睛一样；重组水蛭素滴眼剂无眼刺激性。

二、防治大鼠白内障试验试验动物：28日龄SD大鼠60只，体重53.5-68g，雌雄各半。由中国药科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(苏)2001-001。试验方法：28日龄SD大鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，每组10只：正常对照组(生理盐水)，模型对照组(只造模不给药)，阳性对照组(白内停Pir：0.4mg/kg)，结膜囊内点滴高、中、低剂量组(重组水蛭素1.68mg/kg，0.84mg/kg，0.42mg/kg)。各组给药容积均为0.25ml/50g。除正常对照组，其他组腹腔注射0.08％的D-半乳糖溶液，相当于20mg/kg，1次/日，连续腹腔注射14天，给药容积为25ml/kg，并饮用10％D-半乳糖溶液。在诱发半乳糖性白内障的第4天，分别点双眼高剂量(1.68mg/kg)，中剂量(0.84mg/kg)及低剂量(0.42mg/kg)重组水蛭素(5次/日)。第3天开始用检眼仪观察大鼠晶状体的浑浊度，并记录第8，14天晶状体的变化，于实验结束后取大鼠晶状体，测定晶状体中MDA含量和SOD活力。

晶状体观察结果以Ridit法进行统计分析；MDA及SOD测定结果中各组均与白内障模型组进行组间t检验。

试验结果：

1、重组水蛭素对D-半乳糖所致的大鼠晶状体变化的影响。结果见表1、表2。

         表1、  重组水蛭素对白内障大鼠晶状体浑浊度的影响(第8日)(n＝10)

组别        剂量(mg/kg)      /           +       ++           +++         合计

阴性组      ----            10           0       0            0^**         10

模型组      ----            0            0       2            8            10

Pir         0.4             8            2       0            0^**         10

高剂量r-H   1.68            7            3       0            0^**         10

中剂量r-H   0.84            8            2       0            0^**         10

低剂量r-H   0.42            8            1       1            0^**         10

合计                        41           8       3            8            60/：无浑浊 +：轻微浑浊 ++：中等浑浊 +++：严重浑浊^**表示u＞2.58，与模型组比较

         表2、重组水蛭素对白内障大鼠晶状体浑浊度的影响(第14日)(n＝10)

组别        剂量(mg/kg)     /          +        ++         +++          合计

阴性组      ----           10          0        0          0^**          10

模型组      ----           0           0        1          9             10

Pir         0.4            9           1        0          0^**          10

高剂量r-H   1.68           8           2        0          0^**          10

中剂量r-H   0.84           7           3        0          0^**          10

低剂量r-H   0.42           8           1        1          0^**          10

合计                       42          7        2          9             60/：无浑浊 +：轻微浑浊 ++：中等浑浊 +++：严重浑浊^**表示u＞2.58，与模型组比较

结果表明：各给药组晶状体浑浊度较模型组而言均有非常显著差异。2、各组大鼠晶状体中SOD活力比较：结果见表3

        表3重组水蛭素对白内障大鼠晶状体中SOD活力的影响( x±S)(n＝10)

组别                             剂量(mg/kg)          SOD(NU/mgprot)

阴性组                              ----              137.2±13.7^**

模型组                              ----              37.5±19.0

pir                                 0.4               133.5±31.3^**

高剂量r-H                           1.68              130.4±24.9^**

中剂量r-H                             0.84                123.6±18.8^**

低剂量r-H                             0.42                122.2±19.2^{** **}P＜0.01，与模型组比较

结果表明：重组水蛭素高剂量组及阳性药白内停均能明显升高SOD活力，与模型对照组比较有极显著差异(p＜0.01)，且与剂量呈正相关性。

3、各组大鼠晶状体中MDA含量比较：见表4

       表4重组水蛭素对白内障大鼠晶状体中MDA含量的影响( x±S)(n＝10)

组别                            剂量(mg/kg)          MDA(nmol/mgprot)

阴性组                             ----                 6.34±1.19^**

模型组                             ----                 24.29±4.72

pir                                0.4                  14.81±2.91^**

高剂量r-H                          1.68                 15.14±3.32^**

中剂量r-H                          0.84                 16.19±3.27^**

低剂量r-H                          0.42                 16.87±4.24^**

^**P＜0.01，与模型组比较

结果表明：重组水蛭素高、中、低剂量组及阳性药白内停均能明显降低MDA含量，与模型对照组比较有极显著差异(p＜0.01)，且与剂量呈正相关性。试验结论：重组水蛭素可显著推迟白内障发生时间，减轻晶状体浑浊程度，降低MDA含量，增大SOD活力。重组水蛭素对半乳糖诱导的大鼠白内障有显著的防治作用。

具体实施方式重组水蛭素滴眼液配方及其制备方法：

重组水蛭素                     0.25g

硼酸                           1.116g

硼砂                           0.191g

氯化钠                         0.22g

EDTA                           0.5g

壳聚糖                         0.5g

对羟基苯甲酸乙酯               0.03g

蒸馏水                         加至100ml

硼酸、硼砂加水制备成pH7.4的缓冲溶液，用缓冲溶液溶解重组水蛭素、EDTA、壳聚糖、氯化钠、对羟基苯甲酸己酯，混匀、过滤、除菌分装，即得本发明的重组水蛭素滴眼液。

Claims (1)

1. 重组水蛭素在制备预防和治疗白内障疾病的药物中的应用。