CN1521182A - 一种桉属植物提取物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种桉属植物提取物及其在制备治疗肿瘤药物中的应用，动物体内实验证明，从桉属植物中提取出来的总三萜类化合物(ETA)可提高肿瘤小鼠体内IL－2和TNF水平、增强小鼠自身机体免疫力，对小鼠接种肿瘤具有一定的抑制作用。
Description
技术领域：
本发明涉及一种桉属植物，具体来说是一种桉属植物提取物及其用途。
背景技术：
桉属植物为桃金娘科植物的一个主要属种，原产澳州，从1890年开始引入国内，目前在我国已有大规模种植，成为我国三大造林树种之一。蓝桉是桉属植物中的一个主要成员，又名灰杨柳、玉树、小球桉树、蓝油木、杨草果树。桉属植物原有主要用途如下：其茎、枝可用于做木材、枕木、包装材料和造纸，从其叶中提取出的桉叶油可用于香料生产和医药用途中，用于医药用途中的桉叶油多为蓝桉叶油。
已有报道表明蓝桉叶油具有抗多种细菌的作用，能抑制金黄色葡萄球菌及副伤寒杆菌的氧消耗及其琥珀脱氢酶活性，其浓度在6％以上时还具有抗结核杆菌的作用。临床上通过抑菌实验，发现蓝桉叶油有抑菌能力，其对呼吸道感染，特别是对上呼吸道感染、慢性支气管炎，具有较好疗效，可有效祛痰。通过吸入和气管滴入两法应用时，对治疗肺结核病人有令人满意的效果。在消除常见症状，尤其是空洞闭合上似较其它抗痨药物为佳。蓝桉叶油也可用于某些皮肤病，并作为创伤面、溃疡、瘘管的冲洗剂、除臭剂及神经病患者的镇痛药。此外蓝桉叶油也常用于十滴水、清凉油、风油精、驱蚊油、止咳药等。另民间也有用蓝桉果实(俗名：一口钟)煎服治疗感冒、哮喘、跌打损伤及真菌引起的皮肤病等疾病的治疗，效果不错。但至今为止尚未见到有对蓝桉果实抗肿瘤作用进行系统研究的文献和报道。
发明内容：
本发明所要解决的问题是：由于现实社会中人们认为桉属植物只可用于造纸、木材和提取桉叶油，本发明的目的在于提供一种桉属植物提取物及其用途，所述的提取物从桉属植物中提取，所述的提取物包括熊果酸、2-羟基熊果酸、白桦脂酸、白桦脂酮，所述的熊果酸、2-羟基熊果酸、白桦脂酸、白桦脂酮占所述的提取物的重量百分比在50-95％之间，所述的桉属植物包括蓝桉、大叶桉、柠檬桉、斑皮桉、窿缘桉、大叶桉、柳叶桉、毛叶桉、尾叶桉、布氏桉、广叶桉、粗皮桉、细叶桉和刚果桉，所述的桉属植物中的提取部位为枝、叶或果实，优选的，所述的桉属植物中的提取部位为蓝桉果实，本发明的另一个目的为所述的提取物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。本发明还提供了一种药物组合物，所述的组合物含有桉属植物提取物中的总三萜类化合物，以及药学上可接受的其他组分。本发明还提供了一种用于治疗肿瘤的药物组合物，所述的药物组合物含有所述的桉属植物提取物的有效成分即熊果酸、白桦脂酸、2-羟基熊果酸、白桦脂酮中的一种或者几种，以及药学上可接受的其他组分。
桉属植物的提取物中含有抗肿瘤活性较好的总三萜类化合物(ETA)，并将其用于制备治疗肿瘤的药物。本发明中对提取出的ETA对接种人黑色素瘤B16细胞的小鼠的抑瘤作用进行了考察，结果表明ETA对小鼠黑色素瘤B16有明显抑制作用。本发明中对14种桉属植物的果实及其部分枝、叶中ETA的含量进行了考察，结果表明以上所考察对象中皆或多或少含有ETA。其中果实中的ETA含量要高于枝和叶中的ETA含量，而所有考察对象中ETA含量最多的为蓝桉果实，其次为大叶桉、柠檬桉、斑皮桉的果实。
本发明中所提取出的ETA的主要成份有四种，其分别为：熊果酸、白桦脂酸、白桦脂酮和2-羟基熊果酸。这四种主要成份在桉属植物提取物ETA中所含的含量在50-95％之间，而这四种成分中又以熊果酸和白桦脂酸的含量最高、抗肿瘤活性最好。
附图说明：
图1是熊果酸、羟基熊果酸、自桦脂酸、白桦脂酮和ETA五种化合物对肿瘤的抑制率的对照图。
具体实施方式：
实施例1
对14种桉属植物果实及部分枝、叶中ETA含量的考察。
取14种桉属植物果实及部分枝、叶于60℃干燥12小时，粉碎。分别精密称取10g置入100ml二氯甲烷中，超声20分钟，过滤。残渣再用70ml二氯甲烷超声提取，共提取3次。合并提取液，减压浓缩至浸膏状。在超声振荡条件下用适量甲醇使浸膏充分溶解，将溶解液转移至离心管中，于3000r/min条件下离心10分钟。将上清液转移至10ml容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，使每ml甲醇中含有1g生药。再精密量取该溶液8.0ml，内标溶液2.0ml混匀，采用高效毛细管电泳法(HPCE)对各样品溶液中的4种主要三萜类成分的含量进行测定，并将测定值与原生药量进行相比，求得4种主要三萜类成分在各种桉属果实及部分枝叶中的相对含量。结果如下表所示：
14种桉属植物果实及部分枝、叶中总三萜类化合物(ETA)含量测定结果(‰)
样品 熊果酸 白桦脂酮 白桦脂酸 2-羟基熊果酸
窿缘桉果实 0.21 0.68 0.11 0.63
柠檬桉果实 0.57 0.84 1.02 0.55
斑叶桉果实 0.72 0.62 0.63 0.60
大叶桉果实 0.64 0.56 0.97 0.88
大叶桉叶 0.04 0.65 0.21 0.52
斑皮桉果实 0.82 0 0.15 1.06
柳叶桉果实 0.70 0 0.22 0.67
毛叶桉果实 0.64 0.28 0.75 0.88
尾叶桉枝条 0.02 0 0.06 0.01
布氏桉果实 0.55 0.27 0.56 1.08
广叶桉果实 0.08 0.24 0.29 1.13
尾叶桉叶 0.02 0.71 0.19 0.17
尾叶桉果实 0.35 0.75 0.84 0.84
粗皮桉果实 0.24 0.21 0.31 0.53
细叶桉果实 0.31 0.25 0.34 0.52
细叶桉叶 0.51 0.09 0.13 0.68
蓝桉果实 0.97 1.26 1.28 0.56
刚果桉果实 0.47 0.52 0.43 0.35
实施例2
总三萜类化合物(ETA)及其内各组分体外抗肿瘤作用的研究
将蓝桉果实晾干，称取20.0kg，粉碎，用95％乙醇于室温渗漉提取，滤液减压浓缩得乙醇浸膏A。将浸膏混悬于水中，用乙酸乙酯反复萃取，于不同洗脱时间可收集到相应分离组分，如熊果酸、羟基熊果酸、白桦脂酸、白桦脂酮等。将相应组分浓缩后再经进一步纯化处理，即可得到各单组分纯品。在一段时间内收集含以上组分的溶液，经浓缩后即可得到总三萜类化合物(ETA)。
选用SK-Hep 1人肝癌细胞株进行药物体外抗肿瘤实验。将此株细胞在培养瓶中培养至细胞数达1×107个。将细胞消化后，用DMEM培养液(GIBCO公司)将细胞稀释至3×104/ml。取96孔板，每孔加入200ul稀释好的细胞液，于37℃ 5％CO2孵箱中温孵。24小时后，弃去原有细胞培养液，在相应孔中分别加入用DMEM培养液配制好的含不同浓度各种受试药物的溶液200ul后，继续将细胞培养板置于37℃ 5％CO2孵箱中温孵。48小时后，各孔中分别加入10mg/ml MTT(Sigma公司)20ul，在同样条件下再温孵4小时后，每孔加入200ul的二甲基亚砜，混匀，室温下放置半小时后测定吸光值。将96孔板置酶标仪上测定各孔在570nm处的吸光值(OD)。肿瘤抑制率＝(1--OD用药组/OD对照组)×100％，试验所得结果如下图所示。
受试药物有：熊果酸、羟基熊果酸、白桦脂酸、白桦脂酮和ETA。各受试药物皆分低、中、高三个剂量组，每组的药物浓度分别为4ug/ml、20ug/ml、100ug/ml。对照组和各受试药物各浓度组在96孔板上皆重复12孔。
实施例3.总三萜类化合物(ETA)体内抗肿瘤作用的研究
将人黑色素瘤B16细胞(上海第二军医大学基础免疫教研室提供)置于RPMI-1640培养液(GIBCO)中进行常规培养。取增殖期活性好的细胞，以体积为0.2ml、浓度为1×106细胞/只的剂量接种于C57BL/6J小鼠(购自中科院上海实验动物中心)右大腿外侧皮下。接种后次日将小鼠随机分成6组，每组7只(具体分组见表2)。给受试药组每只小鼠每天灌胃给予各相应浓度药物溶液0.5ml；阴性对照组每只小鼠每天给予等体积的生理盐水；阳性药对照组每只小鼠每天给予相当剂量的氮烯米胺0.5ml。各组小鼠每天皆给药1次，连续给药10天。于停药24小时后，将各组小鼠皆放血处死，进行尸体解剖，取出瘤块称重，计算肿瘤抑制率。实验结果皆以均值±标准差表示，显著性分析用Ts检验。
肿瘤抑制率＝(C-T)×100/C
式中T为给药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重。
表2：ETA对小鼠黑色素瘤的抑制作用
组别 给药剂量 体重(g) 瘤重 抑制率 P值
(mg/kg) 开始 最后 (x±s)g (％)
生理盐水 0 19.2 22.3 2.41±0.30
氮烯米胺 40 19.8 22.6 0.74±0.51 69.3 ＜0.01
ETA 1 125 19.6 22.8 1.07±0.37 55.6 ＜0.01
ETA 2 250 18.6 21.7 1.10±0.10 54.5 ＜0.01
ETA 3 500 20.2 23.2 0.93±0.23 61.4 ＜0.01
实施例4.总三萜类化合物(ETA)体内免疫指标的影响
按实施例3中的方法给C57BL/6J小鼠(购自中科院上海实验动物中心)接种肿瘤细胞，并分组、给药。于停药24小时后，将各组小鼠皆放血处死。将小鼠用75％的乙醇浸泡消毒后，打开腹腔，分别取出腹腔巨噬细胞和脾脏进行处理。
将腹腔巨噬细胞离心、洗涤2次后，用RPMI 1640培养液调细胞浓度为5×105/ml。加入终浓度为10ug/ml的刀球蛋白A(ConA)后，将细胞悬液加入到细胞培养板上，于37℃ 5％CO2孵箱中温孵24小时后吸出培养液，离心取上清。配制一系列标准浓度的TNG-α溶液，用双抗夹心ELISA法测定其相应吸光值(OD)，并绘制成标准曲线。测定标本溶液中TGN-α的吸光值(OD)，并从标准曲线中求出其相应的浓度。结果如表3所示。
用取出的小鼠脾脏制成脾细胞浓度为5×106/ml的悬液，加入终浓度为10ug/ml的刀球蛋白A(ConA)后，将细胞悬液加入到细胞培养板上，于37℃ 5％CO2孵箱中温孵48小时后吸出培养液，离心取上清。配制一系列标准浓度的IL-2溶液，用双抗夹心ELISA法测定其相应吸光值(OD)，并绘制成标准曲线。测定标本溶液中IL-2的吸光值(OD)，并从标准曲线中求出其相应的浓度。结果如表3所示。
表3：ETA对C57小鼠TNF、IL-2产生的影响。
组别 给药剂量 TNF 含量 P值 IL-2 含量 P值
(mg/kg) (pg/ml) (pg/ml)生理盐水 0 119.6±53.0 / 97.1±41.5 /氮烯米胺 40 103.8±43.7 ＞0.05 92.5 ±41.5 ＞0.05ETA 1 125 135.2±37.5 ＜0.05 119.5±42.0 ＜0.01ETA 2 250 144.1±16.7 ＜0.01 112.7±43.5 ＜0.01ETA 3 500 156.2±82.1 ＜0.01 138.2±34.8 ＜0.01
实施例5
桉属植物的提取物的提取工艺
将蓝桉果实粉碎后，以等体积量的70％ 醇先浸润15-30小时，然后再用其5-10倍体积量的70％乙醇煎煮3-5小时，共重复进行2次。合并2次所得煎煮液，回收乙醇至无醇味，此时以蓝桉果实的生药量进行计算，所得醇提取物的得率约为30-85％。
实施例6
总三萜类化合物的生产提取工艺
将实施例5所获得的提取物静置8-16小时后过滤，得沉淀及滤液。将滤液上大孔吸附树脂柱，先后以水、40％乙醇和95％的乙醇液进行洗脱，收集95％乙醇洗脱液并将其回收至干，可得浸膏。合并浸膏及沉淀，用10％的NaOH溶液溶解后过滤，得滤液。将滤液用10％HCl溶液调PH值至3-4后静置12小时，滤出析出的灰白色沉淀即为总三萜类化合物(ETA)。按蓝桉果实生药量进行计算，最终提取出的总三萜类化合物的得率介于20-70％之间。
Claims (10)
1，一种桉属植物提取物，所述的提取物从桉属植物中提取，其中，所述的提取物中含有总三萜类化合物，所述的总三萜类化合物包括熊果酸、2-羟基熊果酸、白桦脂酸、白桦脂酮组分的全部或部分。
2，如权利要求1所述的一种桉属植物提取物，其中，所述的桉属植物是蓝桉、大叶桉、柠檬桉、斑皮桉、窿缘桉、大叶桉、柳叶桉、毛叶桉、尾叶桉、布氏桉、广叶桉、粗皮桉、细叶桉或刚果桉中的一种或几种。
3，如权利要求1所述的一种桉属植物提取物，其中，所述的提取物在桉属植物中的提取部位为植物的枝、叶或果实部位。
4，如权利要求1或2所述的一种桉属植物提取物，其中，所述的桉属植物是蓝桉。
5，如权利要求4所述的一种桉属植物提取物，其中，所述的提取物在蓝桉中的提取部位为果实部位。
6，如权利要求1或2所述的一种桉属植物提取物，其中，所述的桉属植物是大叶桉、柠檬桉或斑皮桉中的一种或几种。
7，如权利要求1所述的一种桉属植物提取物，其中，所述的提取物是有机溶媒的提取物或者水提取物。
8，权利要求1所述的桉属植物提取物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
9，一种药物组合物，含有权利要求1所述的桉属植物提取物中的总三萜类化合物，以及药学上可接受的其他组分。
10，一种用于治疗肿瘤的药物组合物，含有权利要求1所述的桉属植物提取物的有效成分即熊果酸、白桦脂酸、2-羟基熊果酸、白桦脂酮中的一种或者几种，以及药学上可接受的其他组分。
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