CN1778902A - 适用于多种动物细胞大规模培养的无血清培养基 - Google Patents

适用于多种动物细胞大规模培养的无血清培养基 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适用于多种动物细胞大规模培养的无血清培养基。其特点是以DMEM/F12作为基础培养基，在其基础上添加了多种生长因子、激素、必需氨基酸和和微量元素，具有(1)能支持多个细胞株或细胞系的生长；(2)在细胞生长、产物表达方面与含血清培养基接近或相当；(3)支持细胞的长期传代培养；(4)含有较低浓度的蛋白质，有利于产物的分离纯化，提高产品的品质；(5)价格低廉，适合于大规模工业化生产等特点。最重要的是，本发明所形成的无血清培养基适用于多个细胞株或细胞系的连续灌注培养，可获得较高的细胞密度和产物浓度，显著提高生产过程效率和产品产率。

Description

适用于多种动物细胞大规模培养的无血清培养基
技术领域
本发明涉及动物细胞大规模高密度培养过程中用于生产抗体、疫苗、基因重组蛋白等生物产品的无血清培养基。
技术背景
动物细胞培养已经被广泛应用于生产各类生物活性物质如单克隆抗体、病毒疫苗、病毒载体、免疫调节因子、生长因子、特定肿瘤抗原以及各种基因重组蛋白质药物等，传统培养过程中通常需要添加一定量(5％-10％)的牛血清，血清中含有细胞生长所需的生长因子、激素、载体蛋白、贴壁因子、微量元素以及其它的营养物质，可以极大地促进细胞的生长和产物的表达。
然而，血清的应用也带来很多缺点：
(1)血清易受病毒、支原体或其它病原体的污染；
(2)不同批号血清间差异造成产品批次间的差异；
(3)大量血清蛋白的存在增加了下游分离纯化的难度，使其成本升高，回收率降低；
(4)部分血清蛋白难以通过分离纯化手段彻底去除，严重影响产品的最终质量。
为了克服血清所带来的各种缺点，八十年代起就有许多研究者从事无血清培养基的研究开发工作，Darfler等开发了CITTL无血清培养基，它以DMEM/F12(1∶1)为基础培养基，添加1.5mg/L的胰岛素，3.0mg/L的转铁蛋白，2nmol/L的睾酮，5mg/L的过氧化氢酶，1.5mg/L的β-甘油磷酸，0.5mg/L的二亚油酰磷脂胆碱，用于杂交瘤细胞的培养；Murakami等开发了DMEM/F12-ITES无血清培养基，它是在DMEM/F12的基础上添加了5mg/L的胰岛素，2-35mg/L的转铁蛋白，20μmol/L乙醇胺，1nmol/L亚硒酸钠，该培养基被广泛应用于培养杂交瘤细胞。
另外，美国专利U.S.P.5,063,157所涉及的无血清培养基用于哺乳动物细胞悬浮培养，在基础培养基中添加了转铁蛋白、胰岛素、蛋白胨、beta-D-xylopyranose derivative、硒和多胺，是一款低蛋白培养基；美国专利U.S.P.4,443,546则是另一款类似的低蛋白培养基；美国专利U.S.P.4,657,866涉及一种全部组分明确(chemical defined medium)的合成培养基用于培养动物和人的一些细胞系；欧洲专利E.P.481,791公开一种用于CHO细胞的无血清培养基，它含有水、渗透压调节剂、缓冲剂、糖、氨基酸、铁、生长因子和其它必需成分。
目前，已有大量的商业化无血清培养基被开发并应用于各类动物细胞培养，如GIBCO公司用于杂交瘤细胞的CD Hybridoma培养基、Hybridoma-SFM培养基、PFHM-IIProtein-free培养基，用于CHO细胞的CD CHO培养基、CHO-s-SFMII培养基；SIGMA公司的Hybri-Max等等。
上述无血清培养基都有各自的优点，大都能很好地支持细胞的生长，但同时它们也存在很多缺点：
(1)因价格昂贵，只适合实验室小规模使用；而不适合大规模生物反应器；
(2)培养基没有针对细胞进行优化，所支持的细胞密度较低，导致生产过程产率不高；
(3)有些培养基虽然能很好地支持细胞生长，但往往会导致细胞表达产物的能力降低，甚至丧失；
(4)培养基对细胞有很高的特异性，通常一种培养基只适合一个细胞株或细胞系，而不适合其它的细胞株或细胞系。
发明内容
本发明需要解决的技术问题在于公开一种适用于多种动物细胞大规模培养的无血清培养基，以克服现有技术存在的上述缺陷。
本发明的适用于多种动物细胞大规模培养的无血清培养基是以重量比为＝1∶1的DMEM和F12的为基础培养基，添加胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、丙酮酸钠白蛋白、β-巯基乙醇、微量元素、激素、必需氨基酸等成分；
培养基DMEM和F12的组分在GIBCO或SIGMA公司产品目录上均已公开，有关人员可参阅，本发明不再赘述，可采用商业化的产品，如GIBCO或SIGMA公司的产品；
本发明最终形成的无血清培养基的组分和含量如下：
  成分   中文化学名称   生产厂商
  无机盐(mg/L)
  CaCl2   氯化钙   SIGMA   116.60
  CuSO4·5H2O   硫酸铜   SIGMA   0.0013
  Fe(NO3)3·9H2O   硝酸铁   SIGMA   0.05
  FeSO4·7H2O   硫酸亚铁   SIGMA   0.417
  KCl   氯化钾   SIGMA   311.80
  MgCl2   氯化镁   SIGMA   28.64
  MgSO4   硫酸镁   SIGMA   48.84
  NaCl   氯化钠   SIGMA   6995.50
  NaHCO3   碳酸氢钠   SIGMA   2440
  NaH2PO4H2O   磷酸二氢钠   SIGMA   62.50
  Na2HPO4   磷酸氢二钠   SIGMA   71.02
  ZnSO4·7H2O   硫酸锌   SIGMA   0.432
  L-氨基酸(mg/L)
  Alanine   丙氨酸   SIGMA   4.45
  Arginine·HCl   精氨酸   SIGMA   147.5-210.5
  Asparagine·H2O   门冬酰氨   SIGMA   7.5-67.5
  Aspartic acid   门冬氨酸   SIGMA   6.65-26.6
  Cysteine·H2O   半胱氨酸   SIGMA   17.56-35.12
  Cystein·2HCl   胱氨酸   SIGMA   31.29-62.58
  Glutamic acid   谷氨酸   SIGMA   7.35-29.4
  Glutamine   谷氨酰胺   SIGMA   584-1168
  Glycine   甘氨酸   SIGMA   18.75-37.5
  Histidine·HCl·H2O   组氨酸   SIGMA   31.48-104.93
  Isoleucine   异亮氨酸   SIGMA   52.4-131.0
  Leucine   亮氨酸   SIGMA   58.95-157.2
  Lysine·HCl   赖氨酸   SIGMA   91.25-182.5
  Methionine   甲硫氨酸   SIGMA   16.39-59.6
  Phenylalanine   苯丙氨酸   SIGMA   33.0-82.5
  Proline   脯氨酸   SIGMA   17.25-34.5
  Serine   丝氨酸   SIGMA   26.25-94.5
  Threonine   苏氨酸   SIGMA   53.55-95.2
  Tryptophan   色氨酸   SIGMA   8.16-51.0
  Trosine·2Na·2H2O   酪氨酸   SIGMA   55.79-139.5
  Valine   缬氨酸   SIGMA   52.65-117.0
  维生素/辅酶(mg/L)
  Biotin   生物素   SIGMA   0.0035
  Pantothenate·Ca   泛酸钙   SIGMA   2.24
  Choline·Cl   胆碱   SIGMA   8.98
  Folic acid   叶酸   SIGMA   2.65
  Inositol   肌醇   SIGMA   12.60
  Niacinamide   烟酰胺   SIGMA   2.02
  Pyridoxine·HCl   维生素B6   SIGMA   2.031
  Riboflavin   核黄素   SIGMA   0.219
  Thiamine·HCl  硫胺   SIGMA   2.17
  Thymidine  胸苷   SIGMA   0.365
  Vitamin B12  维生素B12   SIGMA   0.68
  微量元素(mg/L)
  Na2SeO3  亚硒酸钠   SIGMA   0.0008-0.0035
  MnSO4·4H2O  硫酸锰   SIGMA   0.00008-0.0008
  Na2SiO3·5H2O  硅酸钠   SIGMA   0.002-0.01
  (NH4)6Mo7O24·4H2O  钼酸氨   SIGMA   0.0017-0.017
  NH4VO3  钒酸氨   SIGMA   0.00006-0.0006
  NiCl2·6H2O  氯化镍   SIGMA   0.00002-0.00024
  SnCl2·2H2O  氯化锡   SIGMA   0.00002-0.00023
  其它成分(mg/L)
  Glucose  葡萄糖   SIGMA   1000-7200
  Na Hypoxanthine  次黄嘌呤   SIGMA   2.39
  Linoleic acid  亚油酸   SIGMA   0.042
  Lipoic acid  硫辛酸   SIGMA   0.105
  Phenol red  酚红   SIGMA   8.10
  Sodium Putrescine·2HCl  腐胺   SIGMA   0.081
  Pyruvate·Na  丙酮酸钠   SIGMA   220.00
  胰岛素   SIGMA   5-10
  转铁蛋白   SIGMA   5-10
  白蛋白   SIGMA   0-100
  激素(mg/L)
  氢化可的松   SIGMA   0.036-0.362
  地塞米松   SIGMA   0.039-0.392
  孕酮   SIGMA   0.006-0.031
  雌二醇   SIGMA   0.0027-0.027
  B-巯基乙醇   SIGMA   0.61-1.83
  乙醇胺   SIGMA   1.22-12.2
本发明的培养基的制备方法是十分简单的，可采用常规的方法将上述组分溶解无热源超纯水即可制备而成。
本发明的培养基可用于杂交瘤细胞、rCHO细胞、293细胞等细胞系或细胞株的传代培养和高密度连续灌注培养。它具有以下优点：
1.能支持多个细胞株或细胞系的生长；
2.在细胞生长、产物表达方面与含血清培养基接近或相当；
3.支持细胞的长期传代培养；
4.含有较低浓度的蛋白质，有利于产物的分离纯化，提高产品的品质；
5.价格低廉，适合于大规模工业化生产；
最重要的是，本发明所形成的无血清培养基适用于多个细胞株或细胞系的连续灌注培养，可获得较高的细胞密度和产物浓度，能显著提高生产过程效率和产品产率。
附图说明
图1为HB58杂交瘤细胞连续灌注培养的细胞生长与产物表达曲线。
图2为CHO细胞连续灌注培养的细胞生长与产物表达曲线。
图3为批培养中293细胞的生长曲线。
具体实施方式
                                实施例1
本发明所述的无血清培养基可用于杂交瘤细胞的高密度连续灌注培养，培养基的组成成分如下：
  成分   中文化学名称
  无机盐(mg/L)
  CaCl2   氯化钙   116.60
  CuSO4·5H2O   硫酸铜   0.0013
  Fe(NO3)3·9H2O   硝酸铁   0.05
  FeSO4·7H2O   硫酸亚铁   0.417
  KCl   氯化钾   311.80
  MgCl2   氯化镁   28.64
  MgSO4   硫酸镁   48.84
  NaCl   氯化钠   6995.50
  NaHCO3   碳酸氢钠   2440
  NaH2PO4H2O   磷酸二氢钠   62.50
  Na2HPO4   磷酸氢二钠   71.02
  ZnSO4·7H2O   硫酸锌   0.432
  L-氨基酸(mg/L)
  Alanine   丙氨酸   4.45
  Arginine·HCl   精氨酸   210.5
  Asparagine·H2O   门冬酰氨   7.5
  Aspartic acid   门冬氨酸   26.6
  Cysteine·H2O   半胱氨酸   17.56
  Cystein·2HCl   胱氨酸   31.29
  Glutamic acid   谷氨酸   14.7
  Glutamine   谷氨酰胺   1168
  Glycine   甘氨酸   18.75
  Histidine·HCl·H2O   组氨酸   104.93
  Isoleucine   异亮氨酸   131.0
  Leucine   亮氨酸   157.2
  Lysine·HCl   赖氨酸   182.5
  Methionine   甲硫氨酸   16.39
  Phenylalanine   苯丙氨酸   82.5
  Proline   脯氨酸   34.5
  Serine   丝氨酸   26.25
  Threonine   苏氨酸   53.55
  Tryptophan   色氨酸   51.0
  Tyrosine·2Na·2H2O   酪氨酸   139.5
  Valine   缬氨酸   117.0
  Vitamins/cofactors(mg/L)
  Biotin   生物素   0.0035
  Pantothenate·Ca   泛酸钙   2.24
  Choline·Cl   胆碱   8.98
  Folic acid   叶酸   2.65
  Inositol   肌醇   12.60
  Niacinamide   烟酰胺   2.02
  Pyridoxine·HCl   维生素B6   2.03l
  Riboflavin   核黄素   0.219
  Thiamine·HCl   硫胺   2.17
  Thymidine   胸苷   0.365
  Vitamin B12   维生素B12   0.68
  微量元素(mg/L)
  Na2SeO3   亚硒酸钠   0.0016
  MnSO4·4H2O   硫酸锰   0.00016
  Na2SiO3·5H2O   硅酸钠   0.005
  (NH4)6Mo7O24·4H2O   钼酸氨   0.0034
  NH4VO3   钒酸氨   0.00012
  NiCl2·6H2O   氯化镍   0.0001
  SnCl2·2H2O   氯化锡   0.0001
  其它成分(mg/L)
  Glucose   葡萄糖   6300
  Na Hypoxanthine   次黄嘌呤   2.39
  Linoleic acid   亚油酸   0.042
  Lipoic acid   硫辛酸   0.105
  Phenol red   酚红   8.10
  Sodium Putrescine·2HCl   腐胺   0.081
  Pymvate·Na   丙酮酸钠   220.00
  胰岛素   5
  转铁蛋白   10
  白蛋白   100
  激素(mg/L)
  氢化可的松   0.036
  地塞米松   0.039
  孕酮   0.006
  雌二醇   0.0027
  B-巯基乙醇   0.61
  乙醇胺   12.2
将上述组分混合并溶解无热源超纯水，即可获得培养基。
将HB58杂交瘤细胞(从ATCC获得)在本发明所述的无血清培养基中传代适应后，在BF-2(德国B.BRAUN公司)2升生物反应器中接种，接种密度2.0×105cells/ml，培养56小时后开始灌注，灌注速率为0.5(1/day)，灌注培养基即为本发明所述的无血清培养基，培养至200小时后细胞密度维持在1.2×107cells/ml左右，单克隆抗体浓度维持在500mg/L左右(见图1)，与普通培养基批培养的结果相比，细胞密度和单抗浓度均提高8倍以上。图中，曲线1为活细胞密度，曲线2为总细胞密度，曲线3为单抗表达量。
                               实施例2
本发明所述的无血清培养基可用于rCHO细胞的高密度连续灌注培养，培养基的组成成分如下：
  成分   中文化学名称
  无机盐(mg/L)
  CaCl2   氯化钙   116.60
  CuSO4·5H2O   硫酸铜   0.0013
  Fe(NO3)3·9H2O   硝酸铁   0.05
  FeSO4·7H2O   硫酸亚铁   0.417
  KCl   氯化钾   311.80
  MgCl2   氯化镁   28.64
  MgSO4   硫酸镁   48.84
  NaCl   氯化钠   6995.50
  NaHCO3   碳酸氢钠   2440
  NaH2PO4H2O   磷酸二氢钠   62.50
  Na2HPO4   磷酸氢二钠   71.02
  ZnSO4·7H2O   硫酸锌   0.432
  L-氨基酸(mg/L)
  Alanine   丙氨酸   4.45
  Arginine·HCl   精氨酸   168.4
  Asparagine·H2O   门冬酰氨   67.5
  Aspartic acid   门冬氨酸   6.65
  Cysteine·H2O   半胱氨酸   17.56
  Cystein·2HCl   胱氨酸   62.58
  Glutamic acid   谷氨酸   7.35
  Glutamine   谷氨酰胺   1168
  Glycine   甘氨酸   37.5
  Histidine·HCl·H2O   组氨酸   47.22
  Isoleucine   异亮氨酸   131.0
  Leucine   亮氨酸   157.2
  Lysine·HCl   赖氨酸   127.7
  Methionine   甲硫氨酸   29.8
  Phenylalanine   苯丙氨酸   33.0
  Proline   脯氨酸   34.5
  Serine   丝氨酸   94.5
  Threonine   苏氨酸   95.2
  Tryptophan   色氨酸   20.4
  Tyrosine·2Na·2H2O   酪氨酸   105.2
  Valine   缬氨酸   93.6
  Vitamins/cofactors(mg/L)
  Biotin   生物素   0.0035
  Pantothenate·Ca   泛酸钙   2.24
  Choline·Cl   胆碱   8.98
  Folic acid   叶酸   2.65
  Inositol   肌醇   12.60
  Niacinamide   烟酰胺   2.02
  Pyridoxine·HCl   维生素B6   2.031
  Riboflavin   核黄素   0.219
  Thiamine·HCl   硫胺   2.17
  Thymidine   胸苷   0.365
  Vitamin B12   维生素B12   0.68
  微量元素(mg/L)
  Na2SeO3   亚硒酸钠   0.0016
  MnSO4·4H2O   硫酸锰   0.00016
  Na2SiO3·5H2O   硅酸钠   0.005
  (NH4)6Mo7O24·4H2O   钼酸氨   0.0034
  NH4VO3   钒酸氨   0.00012
  NiCl2·6H2O   氯化镍   0.00004
  SnCl2·2H2O   氯化锡   0.00004
  其它成分(mg/L)
  Glucose   葡萄糖   7200
  Na Hypoxanthine   次黄嘌呤   2.39
  Linoleic acid   亚油酸   0.042
  Lipoic acid   硫辛酸   0.105
  Phenol red   酚红   8.10
  Sodium Putrescine·2HCl   腐胺   0.081
  Pyruvate·Na   丙酮酸钠   220.00
  胰岛素   10
  转铁蛋白   10
  白蛋白   100
  激素(mg/L)
  氢化可的松   0.036
  地塞米松   0.039
  孕酮   0.006
  雌二醇   0.0027
  B-巯基乙醇   0.61
  乙醇胺   12.2
将rCHO细胞(rCHO SS3 A2，表达人抗凝血因子III)在本发明所述的无血清培养基中传代适应后，在B.BRAUN 2升生物反应器中接种，接种密度2.0×105cells/ml，培养40小时后开始灌注，灌注速率为0.58(1/day)，灌注培养基即为本发明所述的无血清培养基，培养至255小时后细胞密度维持在0.9-1.0×107cells/ml左右，产物浓度维持在350-380U/L左右(见图2)，与普通培养基批培养的结果相比，细胞密度和单抗浓度分别提高6倍和5倍。图中，曲线4为活细胞密度，曲线总细胞密度，曲线6为产物表达量。
                               实施例3
本发明所述的无血清培养基可用于293细胞的培养，培养基的组成成分如下：
  成分   中文化学名称
  无机盐(mg/L)
  CaCl2   氯化钙   116.60
  CuSO4·5H2O   硫酸铜   0.0013
  Fe(NO3)3·9H2O   硝酸铁   0.05
  FeSO4·7H2O   硫酸亚铁   0.417
  KCl   氯化钾   311.80
  MgCl2   氯化镁   28.64
  MgSO4   硫酸镁   48.84
  NaCl   氯化钠   6995.50
  NaHCO3   碳酸氢钠   2440
  NaH2PO4H2O   磷酸二氢钠   62.50
  Na2HPO4   磷酸氢二钠   71.02
  ZnSO4·7H2O   硫酸锌   0.432
  L-氨基酸(mg/L)
  Alanine   丙氨酸   4.45
  Arginine·HCl   精氨酸   168.4
  Asparagine·H2O   门冬酰氨   7.5
  Aspartic acid   门冬氨酸   6.65
  Cysteine·H2O   半胱氨酸   17.56
  Cystein·2HCl   胱氨酸   31.29
  Glutamic acid   谷氨酸   7.35
  Glutamine   谷氨酰胺   584
  Glycine   甘氨酸   18.75
  Histidine·HCl·H2O   组氨酸   31.48
  Isoleucine   异亮氨酸   54.47
  Leucine   亮氨酸   59.05
  Lysine·HCl   赖氨酸   91.25
  Methionine   甲硫氨酸   29.8
  Phenylalanine   苯丙氨酸   33.0
  Proline   脯氨酸   34.5
  Serine   丝氨酸   26.25
  Threonine   苏氨酸   53.45
  Tryptophan   色氨酸   20.4
  Tyrosine·2Na·2H2O   酪氨酸   55.79
  Valine   缬氨酸   52.8
  Vitamins/cofactors(mg/L)
  Biotin   生物素   0.0035
  Pantothenate·Ca   泛酸钙   2.24
  Choline·Cl   胆碱   8.98
  Folic acid   叶酸   2.65
  Inositol   肌醇   12.60
  Niacinamide   烟酰胺   2.02
  Pyridoxine·HCl   维生素B6   2.031
  Riboflavin   核黄素   0.219
  Thiamine·HCl  硫胺   2.17
  Thymidine  胸苷   0.365
  Vitamin B12  维生素B12   0.68
  微量元素(mg/L)
  Na2SeO3  亚硒酸钠   0.0016
  MnSO4·4H2O  硫酸锰   0.00016
  Na2SiO3·25H2O  硅酸钠   0.005
  (NH4)6Mo7O24·4H2O  钼酸氨   0.0034
  NH4VO3  钒酸氨   0.00012
  NiCl2·6H2O  氯化镍   0.00004
  SnCl2·2H2O  氯化锡   0.00004
  其它成分(mg/L)
  Glucose  葡萄糖   3150
  Na Hypoxanthine  次黄嘌呤   2.39
  Linoleic acid  亚油酸   0.042
  Lipoic acid  硫辛酸   0.105
  Phenol red  酚红   8.10
  Sodium Putrescine·2HCl  腐胺   0.081
  Pyruvate·Na  丙酮酸钠   220.00
  胰岛素   10
  转铁蛋白   10
  白蛋白   100
  激素(mg/L)
  氢化可的松   0.036
  地塞米松   0.039
  孕酮   0.006
  雌二醇   0.0027
  B-巯基乙醇   0.61
  乙醇胺   12.2
将293细胞在本发明所述的无血清培养基中传代适应后，在B.BRAUN 2升生物反应器中接种进行批培养，接种密度为2.45×105cells/ml，由图3可以看出细胞的生长几乎看不到迟滞期，接种后即进入指数生长期，平均比生长速率为0.46day-1，最大活细胞密度为11.0×105cells/ml。图中，曲线7为活细胞密度，曲线8为活细胞比例。

Claims (7)

1.一种适用于多种动物细胞大规模培养的无血清培养基，其特征在于，是以重量比为1∶1的DMEM和F12的为基础培养基，添加胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、丙酮酸钠、白蛋白、β-巯基乙醇、微量元素、激素和必需氨基酸等成分组成。
2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所说的基础培养基为标准的商业培养基，培养基中所含的组分和含量参照SIGMA公司产品目录中公布的配方。
3.根据权利要求2所述的无血清培养基，其特征在于，微量元素选自Mn和/或Mo和/或Ni和/或Se和/或Si和/或Sn和/或V。
4.根据权利要求2或3所述的无血清培养基，其特征在于，激素选自氢化可的松、地塞米松、雌二醇或孕酮。
5.根据权利要求2或3所述的无血清培养基，其特征在于，所添加的必需氨基酸包括精氨酸、门冬氨酸、门冬酰氨、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
6.根据权利要求5所述的无血清培养基，其特征在于，最终形成的培养基组分和含量如下：   成分   中文化学名称   无机盐(mg/L)   CaCl2   氯化钙   116.60   CuSO4·5H2O   硫酸铜   0.0013   Fe(NO3)3·9H2O   硝酸铁   0.05   FeSO4·7H2O   硫酸亚铁   0.417   KCl   氯化钾   311.80   MgCl2   氯化镁   28.64   MgSO4   硫酸镁   48.84   NaCl   氯化钠   6995.50   NaHCO3   碳酸氢钠   2440   NaH2PO4H2O   磷酸二氢钠   62.50   Na2HPO4   磷酸氢二钠   71.02
  ZnSO4·7H2O   硫酸锌   0.432   L-氨基酸(mg/L)   Alanine   丙氨酸   4.45   Arginine·HCl   精氨酸   147.5-210.5   Asparagine·H2O   门冬酰氨   7.5-67.5   Aspartic acid   门冬氨酸   6.65-26.6   Cysteine·H2O   半胱氨酸   17.56-35.12   Cystein·2HCl   胱氨酸   31.29-62.58   Glutamic acid   谷氨酸   7.35-29.4   Glutamine   谷氨酰胺   584-1168   Glycine   甘氨酸   18.75-37.5   Histidine·HCl·H2O   组氨酸   31.48-104.93   Isoleucine   异亮氨酸   52.4-131.0   Leucine   亮氨酸   58.95-157.2   Lysine·HCl   赖氨酸   91.25-182.5   Methionine   甲硫氨酸   16.39-59.6   Phenylalanine   苯丙氨酸   33.0-82.5   Proline   脯氨酸   17.25-34.5   Serine   丝氨酸   26.25-94.5   Threonine   苏氨酸   53.55-95.2   Tryptophan   色氨酸   8.16-51.0   Tyrosine·2Na·2H2O   酪氨酸   55.79-139.5   Valine   缬氨酸   52.65-117.0   Vitamins/cofactors(mg/L)   Biotin   生物素   0.0035   Pantothenate·Ca   泛酸钙   2.24   Choline·Cl   胆碱   8.98   Folic acid   叶酸   2.65   Inositol   肌醇   12.60   Niacinamide   烟酰胺   2.02   Pyridoxine·HCl   维生素B6   2.031   Riboflavin   核黄素   0.219   Thiamine·HCl   硫胺   2.17   Thymidine   胸苷   0.365   Vitamin B12   维生素B12   0.68   微量元素(mg/L)   Na2SeO3   亚硒酸钠   0.0008-0.0035   MnSO4·4H2O   硫酸锰   0.00008-0.0008   Na2SiO3·5H2O   硅酸钠   0.002-0.01   (NH4)6Mo7O24·4H2O   钼酸氨   0.0017-0.017
  NH4VO3   钒酸氨   0.00006-0.0006   NiCl2·6H2O   氯化镍   0.00002-0.00024   SnCl2·2H2O   氯化锡   0.00002-0.00023   其它成分(mg/L)   Glucose   葡萄糖   1000-7200   Na Hypoxanthine   次黄嘌呤   2.39   Linoleic acid   亚油酸   0.042   Lipoic acid   硫辛酸   0.105   Phenol red   酚红   8.10   Sodium Putrescine·2HCl   腐胺   0.081   Pyruvate·Na   丙酮酸钠   220.00   胰岛素   5-10   转铁蛋白   5-10   白蛋白   0-100   激素(mg/L)   氢化可的松   0.036-0.362   地塞米松   0.039-0.392   孕酮   0.006-0.031   雌二醇   0.0027-0.027   B-巯基乙醇   0.61-1.83   乙醇胺   1.22-12.2
7.根据权利要求1～5任一项所述的无血清培养基的应用，其特征在于，用于杂交瘤细胞、rCHO细胞或293细胞的传代培养和高密度连续灌注培养。
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