CN1880480A - 检测等位基因特异引物－pcr方法及其在检测克老素基因多态性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测等位基因特异引物－PCR方法及其在检测克老素基因多态性中的应用。该方法根据所检测基因序列及其相应位点的SNP信息设计等位基因特异引物对，设计PCR反应体系，PCR条件和产物，对反应产物进行电泳后分析检测结果。该方法特别可用于对克老素(KLOTHO)基因SNP的等位基因的检测，其有益效果是不用内切酶，不用测序，节省经费，节省时间，操作简便，且产生的产物的bp数可由设计者控制，检测的准确度可得到进一步提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物基因的检测方法，特别涉及检测等位基因特异引物-PCR方法及其在检测克老素基因多态性中的应用
背景技术
当前广泛使用的检测生物基因SNP的方法(包括克老素基因的检测)有两大类：经典的酶切方法和直接测序方法。经典的酶切方法由于某些SNP位点尚未发现内切酶而受到限制，且酶切法产生的产物长度不可控制，有时产生很短的产物(几个bp)，难于观察和分析(谢正祥，等.Beta肾上腺能受体3种亚型基因的5位点SNP基因型的组合分布.生物医学工程杂志。2005；22(1)：99-103.)，因而近期多采用直接测序方法(Arking DE，et al.Association of Human aging with a functional variant of klotho.PNAS，2002，99(2)：856-861)。直接测序方法不但仍需PCR技术，而且仪器复杂、昂贵，操作工序繁琐，难于普遍采用且不适用于大规模筛选。
发明内容
本发明的目的是提供一种不用内切酶，不用测序，节省经费，节省时间，操作简便，且产生的产物的bp数可由设计者控制的检测等位基因特异引物-PCR方法及该方法在检测克老素基因SNP的等位基因中的应用。
具体技术方案如下：
一种检测等位基因特异引物-PCR方法(ASP-PCR方法)，其特征是按以下步骤进行：
(1)、根据所检测基因序列及其相应位点的SNP信息设计等位基因特异引物对；
(2)、设计PCR反应体系；
(3)、设计PCR条件预变性、循环、延长和PCR产物；
(4)、PCR反应产物结果分析 制备2％琼脂糖凝胶，取PCR产物10μl上样，在电压为100V，功率5W条件下电泳1小时，电泳结束后，凝胶置于0.5μg/L溴乙锭溶液中染色15分钟，将已染色凝胶置于紫外成像系统下照像，然后进行结果分析。
检测生物基因SNP的ASP-PCR方法的核心是步骤(1)中等位基因特异引物对的设计。根据步骤(1)等位基因特异引物对的设计方法不同可分为两大类：SASP-PCR(单一式ASP-PCR：Single Allele-Specific Primer-Polymerase ChainReaction)和NASP-PCR(嵌套式ASP-PCR：Nested Allele-SpecificPrimer-Polymerase Chain Reaction)。
SASP-PCR(单一式ASP-PCR：Single Allele-Specific Primer-Polymerase ChainReaction)设计方法是：从5’到3’方向为模板DNA的方向，P-C(Primer-Common)为公共引物，该公共引物为下游引物，对模板DNA的反义链按核苷酸匹配规律设计；P-W(Primer-Wild)为野生型等位基因引物，该引物设计为上游引物，对模板DNA的正义链按核苷酸匹配规律设计；P-M(Primer-Mutant)为变异型等位基因引物，该引物也设计为上游引物对模板的正义链按核苷酸匹配规律设计；P-W、P-M分别与下游引物P-C构成两对等位基因特异引物。当用SASP-PCR(单一式ASP-PCR)检测Klotho基因G-395A SNP时，其PCR反应条件和产物是：
G等位基因
(i)预变性：94℃3min预变性；
(ii)循环：共进行35个循环的94℃30s变性，63℃30s退火，72℃30s延伸；
(iii)稳定：72℃10min；
(iv)产物：147bp
A等位基因
(i)预变性：94℃min预变性；
(ii)循环：共进行35个循环的94℃30s变性，65℃30s退火，72℃30s延伸；
(iii)稳定：72℃10min；
(iv)产物：148bp。
NASP-PCR(嵌套式ASP-PCR：Nested Allele-Specific Primer-PolymeraseChain Reaction)的设计方法是：从5’到3’方向为模板DNA的方向，SSDNA为正义序列DNA；外侧上游引物OSP(Outer Sense Primer)与下游反义等位基因特异引物DASP(Downstream Allele Specific Primer)形成第一内引物对IPP-1(Inner Primer Pair-1)，即OSP-DASP引物对；外侧下游反义引物OAP(Outer Anti-sense Primer)与上游正义等位基因特异引物UASP(UPstream Allele Specific Primer)形成第二内引物对IPP-2(InnerPrimer Pair-2)，即UASP-OAP引物对；外侧下游引物OAP与外侧上游引物OSP形成第三对引物OPP(外侧引物对：Outer Primer Pair)；其中所述UASP的起点在SNP的左侧；DASP的起点在SNP的右侧，皆以SNP的特异碱基为3’末端。选用NASP-PCR的设计方法检测NOS2 C-1173T SNP时，PCR反应条件和产物是：
(i)预变性：95℃5min预变性；
(ii)循环：共进行40个循环的94℃30s变性，57℃30s退火，72℃30s延伸；
(iii)稳定：72℃10min；
(iv)产物：外引物对产生的产物长度：331bp；两内引物对产生的产物为：268bp和102bp；
两类ASP-PCR方法都可以用于生物基因的检测，其主要差异在于：对于SASP-PCR方法，要用不同的等位基因特异引物对作两次PCR；而NASP-PCR则是在同一个反应体系中同时有两种不同的等位基因特异引物及外侧引物对作一次PCR。两种方法的PCR反应条件和产物要作相应的调整。
Klotho(KL)基因是Kuro-o等在1997年研究原发性高血压时发现的与衰老有关的新基因。研究发现：KL基因是一种与寿命和各种老年性疾病表型相关的基因。人和小鼠的KL基因定位于染色体13q12区域。KL基因全长约50kb，其外显子1及旁侧2000bp序列中，G+C的平均含量为66.75％，最高达到了89％，提示在这一区域有CPG岛的形成，而距KL基因转录起始点上游大约6kb处，有一个8kb片段的缺失，这可能就是KL基因表达缺失的原因(Matsumura Y，et al.Identification of the human klothogene and its two transcripts encoding membrane and secreted klothoprotein.Biochem Biophys Res Commun.1998 Jan 26；242(3)：626-30.)。有报道KL的Exon2的F352V及C370S两个SNPs与冠心病有关系，KL-VS突变型是冠心病的独立危险因素(Arking et al.Association of humanaging with a functional variant of klotho.Proc Natl Acad Sci U SA.2002 Jan 22；99(2)：856-61；Arking et al.Association between afunctional variant of the KLOTHO gene and high-density lipoproteincholesterol，blood pressure，stroke，and longevity.Circ Res.2005Mar 4；96(4)：412-8.)。启动区的G-395A SNP影响DNA与蛋白质的结合，从而影响KL的表达，进而影响代谢特别是骨代谢(Saito Y，Kuroo M，Nabeshima Y，et al.The protective role of Klotho gene on vascularendothelium.Nippon Rinsho，1999，57(7)；1514-1518.)。因此认为KL蛋白可能是一种循环体液因子或膜结合受体成份，对衰老及衰老相关性疾病进行着相应的调节。深入研究KL基因功能，将会为揭示人类衰老、与衰老相关疾病和抗衰老的分子机理提供重要的新线索，但目前研究较少。应用本发明所述方法，不仅可以适用于任何生物基因的检测，特别可以检测KLOTHO基因的3个位点的SNP：G-395A，F352V，C370S。发现G-395A与糖尿病有关(P＜0.002)，其中GG野生型纯合子携带者的糖尿病的患病率最低，是AG杂合子的0.277倍，AA变异型纯合子的0.277倍。F352V与高血压有关(P＝0.0120)，其中杂合子FV携带者具有最低的高血压患病率，是野生型纯合子FF的0.438倍，是变异型纯合子VV的0.429倍；还与冠心病有关(P＜0.0001)，其中杂合子FV携带者是野生型纯合子FF的0.024倍，是变异型纯合子VV的0.023倍。C370S也与冠心病有关(P＜0.0001)，其中杂合子CS携带者是野生型纯合子SS的0.111倍，是变异型纯合子CC的0.110倍。
本发明所述方法可用于研究基因(单核苷酸多态性)及其与疾病的联系，制定基因水平的(疾病的)个体化治疗方案。
本发明所述方法的有益效果是：
1.普适性强：不需内切酶，可克服某些SNP位点尚未发现内切酶的障碍。
2.经济意义大：不需昂贵的测序，不需昂贵内切酶。
3.操作简便：省去PCR产物的酶切步骤，因而简化了操作，更易于掌握。
4.适合国情：不需内切酶，不受制于人，也不必用测序技术，因而十分适合当前中国国情。
5.易于推广：该技术经济、实用、操作简便，易于掌握。
6.产生的产物的bp数可由设计者控制，易于观察和分析。
附图说明
图1是SASP-PCR方法的ASP设计原理图
图2是NASP-PCR方法的ASP设计原理图
图3是KLOTHO的G-395A位点SNP电泳图
图4是KLOTHO的F352V(T1062G)位点SNP电泳图
图5是NOS的NOS2C-1173T位点SNP电泳图
具体实施例(共3例)
实施例1 用SASP-PCR方法检测KLOTHO的G-395A位点SNP所用的引物对及PCR反应条件如下：
(1)引物对：公用上游引物设计方法
上游引物：5’-AAT
GGCTCC AGCAATGTCC AG-3’，Tm 60.0，GC％54.5
下游引物
G等位基因：5’-AGAAAAG
CG CCGACCAACT TTC-3’，Tm 58.4，GC％47.8；
A等位基因：5’-G AGAAAAGGCG ACGACCA
CT TT
-3’，Tm 58.7，GC％45.8。
(2)模板与引物匹配设计
1561 tAATTGGCTC CAGCAATGTC CAGccggagc ttctttgggc ctccgagtgg gagaaaagtg(AAT
GGCTC CAGCAATGTC CAG，Tm 68.0，GC％54.5)上游引物与反义模板互补5’→3’22nt(上游引物长度，nt为核苷酸单位，下同)
对G等位基因
1681 tcggg
AAAG TTGGTCGGCG CCTTTTCTcc ccgacgaagc cgctccaggg ctgctctcag(
TTTC AACCAGCCGC
GAAAAGA Tm 66，GC％47.8)下游引物与正义模板互补3’←5’23nt
对A等位基因
1681 tcggg
AAAG TTGGTCGGCG CCTTTTCTCc ccgacgaagc cgctccaggg(
TTTC
ACCAGCCGC GGAAAAGAG Tm 66，GC％47.8)下游引物与正义模板互补3’←5’24nt
注：引物中的加框灰底色核苷酸为人工错配，以改善引物性能；灰底色核苷酸为SNP特异等位基因。
(3)PCR反应体系
| PCR反应体系 | ||||||||
| Allele | Buffer(μl) | MgCl2(mM/L) | dNTP(μM/L) | P1(μM/L) | P2(μM/L) | Taq(U) | TemplateDNA(ng) | ddH2O(μl) |
| GA | 22 | 1.51.5 | 125125 | 0.410.41 | 0.4150.41 | 0.50.5 | 100100 | ** |
注：*：加至20微升
(4)PCR条件和产物
G等位基因
(i)预变性：94℃3min预变性；
(ii)循环：共进行35个循环的94℃30s变性，63℃30s退火，72℃30s延伸；
(iii)保温：72℃10min；
(iv)产物：147bp
A等位基因
(i)预变性：94℃min预变性；
(ii)循环：共进行35个循环的94℃30s变性，65℃30s退火，72℃30s延伸；
(iii)保温：72℃10min；
(iv)产物：148bp
(5)反应产物结果分析 制备2％琼脂糖凝胶，取PCR产物10μl上样，
在电压为100V，功率5W条件下电泳1小时，电泳结束后，凝胶置于0.5μg/L溴乙锭溶液中染色15分钟，将已染色凝胶置于紫外成像系统下照像。其电泳图如附图3所示：
M代表DNA电泳产物bp值的标准品，G/G为野生型纯合子，G/A为杂合子，A/A为突变型纯合子。
实施例2 SASP-PCR方法检测KLOTHO的F352V(T1062G)位点SNP
1.引物对：公用上游引物设计方法
上游引物：5’-TACAATACT TCTTTCCGTC CC-3’Tm 53.9GC％42.9
下游引物：
T等位基因：5’-
CTTTTTCGC AGATTCAGTA AA-3’Tm50.7，GC％32；
G等位基因：5’-
TTTTTCGCA GATTCAGTAA C-3’Tm51.9，GC％38
注：引物中的灰底色核苷酸为SNP特异等位基因。
2.PCR反应体系
| PCR Reaction System | ||||||||
| Allele | Buffer(μl) | MgCl2(mM/L) | dNTP(μM/L) | P1(μM/L) | P2(μM/L) | Taq(U) | TemplateDNA(ng) | ddH2O(μl) |
| FV | 22 | 1.51.5 | 125125 | 0.4750.475 | 0.410.41 | 0.50.5 | 100100 | ** |
注：*意为加至20微升
3.PCR条件和产物
(1)预变性：94℃3min预变性；
(2)循环：共进行35个循环的94℃30s变性，54℃30s退火，72℃30s延伸；
(3)保温：72℃10min延长；
(4)产物：G等位基因为230bp，T等位基因为231bp。
4.PCR反应产物分析方法
制备2％琼脂糖凝胶，取PCR产物10μl上样，在电压为100V，功率5W条件下电泳1小时，电泳结束后，凝胶置于0.5μg/L溴乙锭溶液中染色15分钟，将已染色凝胶置于紫外成像系统下照像。其电泳图如附图4：
M代表DNA电泳产物bp值的标准品，T/T为野生型纯合子，
T/G为杂合子，G/G为突变型纯合子
实施例3 NASP-PCR方法检测NOS的NOS2C-1173T位点SNP
(1)设计引物对
外侧引物对(OSP-OAP)、等位基因特异引物对(UASP-DASP)、引物长度(LP)、GC值(GC)及AT值(AT)如下表。单位nt为核苷酸个数。
*内的核苷酸为SNP特异等位基因。
(2)检测NOS2C-1173T位点SNP的PCR反应体系
检测NOS2C-1173T位点SNP的PCR反应体系，反应体系如下表，反应体系体积为20μl。
NOS2C-1173T位点SNP的反应体系表
| SNP | ddH2O(uL) | Buffer(μl) | MgCl2(mM) | dNTP(μM) | P1(μmol/L) | P2(μmol/L) | P-wild(μmol/L) | P-mutated(μmol/L) | Taqpolymerase(U) | TemplateDNA(ng) |
| NOS2C-1173T | * | 2 | 1.5 | 200 | 0.125 | 0.125 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 100 |
注：*意为加至20微升
(3)检测NOS2C-1173T位点SNP的PCR反应条件
PCR反应条件如下表：
NOS2C-1173T位点SNP的PCR反应条件表
| Genotype | Predenaturation | Denaturation | Annealing | Extension | Cycle numbe |
| NOS2C-1173T | 95℃5min | 94℃30s | 57℃30s | 72℃30s | 40 |
注：Genotype：基因型，Predenaturation：预变性，Denaturation：变性，Annealing)：退火，Extension：延伸，Cycle number：循环数。
(4)产物长度和电泳结果
产物长度：
外引物对产生的产物长度：331bp；两内引物对产生的产物为：268bp和102bp；
电泳结果见附图5：图中Marker为标记DNA电泳产物bp值的标准品，商品名为DL2000；CT表示NOS2 C-1173T为杂合子，以有三个电泳带为特征；CC表示NOS2C-1173T为野生型纯合子，以距离较近(63bp)的两个电泳带为特征；TT表示NOS2C-1173T的变异型纯合子，以距离较远(229bp)的两个电泳带为特征。
Claims (5)
1.一种检测等位基因特异引物-PCR方法，其特征是按以下步骤进行：
(1)、根据所检测基因序列及其相应位点的SNP信息设计等位基因特异引物对；
(2)、设计PCR反应体系；
(3)、设计PCR条件预变性、循环、延长和PCR产物；
(4)、PCR反应产物结果分析 制备2％琼脂糖凝胶，取PCR产物10μl上样，在电压为100V，功率5W条件下电泳1小时，电泳结束后，凝胶置于0.5μg/L溴乙锭溶液中染色15分钟，将已染色凝胶置于紫外成像系统下照像，然后进行结果分析。
2.如权利要求1所述的检测等位基因特异引物-PCR方法，其特征是步骤(1)按以下方法设计等位基因特异引物对：从5’到3’方向为模板DNA的方向，P-C为公共引物，该公共引物为下游引物，对模板DNA的反义链按核苷酸匹配规律设计；P-W为野生型等位基因引物，该引物设计为上游引物，对模板DNA的正义链按核苷酸匹配规律设计；P-M为变异型等位基因引物，该引物也设计为上游引物对模板的正义链按核苷酸匹配规律设计；P-W、P-M分别与下游引物P-C构成两对等位基因特异引物。
3.如权利要求1所述的检测等位基因特异引物-PCR方法，其特征是步骤(1)按以下方法设计等位基因特异引物对：从5’到3’方向为模板DNA的方向，SSDNA为正义序列DNA；外侧上游引物OSP与下游反义等位基因特异引物DASP形成第一内引物对IPP-1，即OSP-DASP引物对；外侧下游反义引物OAP与上游正义等位基因特异引物UASP形成第二内引物对IPP-2，即UASP-OAP引物对；外侧下游引物OAP与外侧上游引物OSP形成第三对引物OPP；其中所述UASP的起点在SNP的左侧；DASP的起点在SNP的右侧，皆以SNP的特异碱基为3’末端。
4.检测等位基因特异引物-PCR方法在克老素基因G-395A SNP的等位基因检测中的应用。
5.检测等位基因特异引物-PCR方法在检测NOS的NOS2 C-1173T位点SNP的等位基因中的应用。
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|---|---|---|---|
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20061220 |