CN1890366A - 分离的噬菌体和它们作为食品中消毒剂或用于工厂环境卫生的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对阪崎肠杆菌菌株具有强裂解活性的噬菌体分离物和它们作为食品，特别是婴儿配方中和用于工厂环境卫生的抗微生物剂的用途。本发明还涉及用其制备的食品组合物和抗微生物剂。

Description

分离的噬菌体和它们作为食品中消毒剂 或用于工厂环境卫生的用途
发明领域
本发明涉及对阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)菌株具有强裂解活性的噬菌体分离物和它们作为抗微生物剂在食品，特别是婴儿配方和用于工厂环境卫生的用途。
发明背景
肠杆菌代表从巴氏灭菌乳制备的乳产品的“再污染菌群”的主要部分。它们的存在常常表明卫生处理不充分和/或加工设备建设有缺点。在干燥产品诸如奶粉中常常发现肠杆菌属的成员。
在肠杆细菌中，阪崎肠杆菌可以引起严重感染，特别是在非常幼小的儿童中引起严重感染。在新生儿和婴儿中它牵涉稀少但非常严重形式的新生儿脑膜炎，干燥婴儿配方为所涉及的传播方式。
由于生产成本太高，无菌生产干燥婴儿配方是不可行的。因此，在加工期间生产商依赖于使用消毒剂和特定卫生工作区以提供安全产品。然而，当重构的婴儿配方没有快速消费并在室温存放时，少量的细菌可以生长到相当大的数量。这可使该产品对消费该产品的婴儿具有潜在危险。
考虑到现有技术的缺陷，本发明的问题在于提供食物，特别是基于乳的产品，诸如婴儿配方，其甚至在有利于阪崎肠杆菌生长的条件下保存后也可以是安全的。而且，本发明的目的是开发可以在任意食品中用于阪崎肠杆菌的去污和用于工厂环境卫生的安全活性剂。
通过提供对阪崎肠杆菌具有实质裂解潜力的安全并且无毒的噬菌体制剂解决了此问题。
发明概述
本发明的一个目的是开发新的并且有用的对阪崎肠杆菌具有实质裂解潜力的噬菌体分离物，所述噬菌体分离物可以单独使用或混合使用以防止或处理食品特别是婴儿配方和工厂环境来免于或者消除阪崎肠杆菌引起的污染。
因此本发明的另一目的是提供含有选择性裂解阪崎肠杆菌的噬菌体分离物的食品，特别是基于乳的配方、营养组合物、宠物食品、饮食添加剂或处于阪崎肠杆菌污染危险的食物。
本发明的又一目的是提供用于净化食品和工厂环境卫生的活性剂，所述活性剂包含有效量的如以上描述的至少一种噬菌体分离物或混合物。
本发明的另一实施方案涉及如以上描述的至少一种噬菌体分离物或混合物的用途，用于净化食品和工厂环境卫生或制备用于防止或治疗人或动物中阪崎肠杆菌引起的感染的组合物。
本发明的另一目的是提供消毒食品或工厂环境卫生的方法，所述方法包括使用如以上描述的对阪崎肠杆菌具有实质裂解潜力的至少一种噬菌体制剂。
还涉及用于选择如以上描述的对阪崎肠杆菌具有实质裂解潜力的噬菌体分离物的方法。
本发明的主要优点是它提供了对阪崎肠杆菌具有高度特异性的净化剂。它可以防止任意食品中阪崎肠杆菌的污染和过度生长，特别用于基于乳的产品，诸如婴儿配方。它对于治疗或预防人或动物中阪崎肠杆菌引起的感染也是有效的。
本发明的另一优点是提供了有助于消毒、清洁和净化工厂中工作表面或加工设备以及地面、墙壁等等的活性剂。
本发明的另一优点是提供了环境安全和对人无毒性的活性剂。
发明详述
以下描述中，术语“FSM噬菌体”表示食物安全微生物噬菌体保藏中心(Food Safety Microbiology bacteriophage collection)(NestléResearchCentre，Vers-chez-les-Blanc，Lausanne，瑞士)。
根据第一方面，与用于消毒食物和工厂环境卫生的活性剂有关，所述活性剂包含对阪崎肠杆菌具有实质裂解潜力的至少一种噬菌体分离物。
用斑点测定试验(Pelczar，M.J.，E.C.S.Chan和N.R.Krieg.Microbiology concepts and applications，Chapter 16 Viruses：cultivationmethods，pathogencity p.436-452，McGraw-Hill，Inc.New York 1993)或在液体培养物中(H.W.Ackermann和M.S.DuBow.Viruses of Prokaryotesvolume 1.Chapter 6.Description and identification of new phages p.103-142.CRC Press Inc，Boca Raton，Florida，美国)通过筛选感染阪崎肠杆菌菌株的候选噬菌体可以获得根据本发明的噬菌体。在实施例1中详细描述了用于选择根据本发明的噬菌体的方法。优选地，选择：
i)在固体培养基上能够感染选自FSM-16、FSM-33、FSM-261、FSM-265、FSM-266、FSM-269、FSM-270、FSM-271、FSM-272、FSM-273、FSM-274、FSM-280、FSM-281、FSM-284、FSM-286、FSM-288、FSM-290、FSM-292、FSM-297、FSM-298、FSM-300、FSM-303、FSM-305、FSM-308、FSM-309、FSM-311、FSM-313、FSM-314、FSM-316、FSM-318、FSM-322、FSM-323、FSM-1360、FSM-1387-2NL、FSM-MC7、FSM-MC8、FSM-MC9、FSM-MM10和FSM-MM11的阪崎肠杆菌的至少9种细菌菌株，和
ii)在液体培养基中能够感染选自FSM-16、FSM-33、FSM-261、FSM-265、FSM-266、FSM-269、FSM-270、FSM-271、FSM-272、FSM-273、FSM-274、FSM-280、FSM-281、FSM-284、FSM-286、FSM-288、FSM-290、FSM-292、FSM-297、FSM-298、FSM-300、FSM-303、FSM-305、FSM-308、FSM-309、FSM-311、FSM-313、FSM-314、FSM-316、FSM-318、FSM-322、FSM-323、FSM-1360、FSM-1387-2NL、FSM-MC7、FSM-MC8、FSM-MC9、FSM-MM10和FSM-MM11的阪崎肠杆菌的至少9种细菌菌株的噬菌体分离物。
在优选的实施方案中，噬菌体分离物为FSM-噬菌体67/33/1、FSM-噬菌体F、FSM-噬菌体9/261、FSM-噬菌体F/316和FSM-噬菌体73/311/2、FSM-噬菌体73/261、FSM-噬菌体33/33/1、FSM-噬菌体28/145/2和FSM-噬菌体10/261/1。
在最优选的实施方案中，噬菌体FSM-噬菌体10/261/1、FSM-噬菌体73/261、FSM-噬菌体33/33/1、FSM-噬菌体67/33/1、FSM-噬菌体F/316、FSM-噬菌体9/261和FSM-噬菌体73/311/2与它们对应的繁殖株一起例如在2003年11月14日保藏在巴斯德研究所(Institut Pasteur，28rue duDocteur Roux，F-75024Paris CEDEX 15，法国)，保藏号分别为CNCMI-3127、CNCM I-3128、CNCM I-3129、CNCM I-3130、CNCM I-3131、CNCM I-3132和CNCM I-3133。
有利地，保藏的噬菌体能裂解来自NestléResearch Centre保藏中心的39株阪崎肠杆菌的至少80％。此保藏中心代表可以在食品，特别是婴儿配方中发现的阪崎肠杆菌。用根据本发明的噬菌体材料，通过用至少两种噬菌体的噬菌体混合物可以获得大约97％的覆盖率。优选地，所述噬菌体不能识别不相关的细菌，诸如革兰氏阴性乳酸细菌。
因此，根据又一方面，本发明涉及如以上描述的至少一种噬菌体分离物在任意食品或营养添加剂中的用途，用于防止阪崎肠杆菌的污染和过度生长。食品或药品的实例为乳、酸乳酪、凝乳、乳酪、发酵乳、基于乳的发酵产品、冰淇淋、发酵的基于谷类的产品、基于乳的粉剂、婴儿配方或片剂、液体混悬剂、干的经口添加剂、湿润的经口添加剂、干管食品。用于制备它们的方法是普通知识。
根据本发明的组合物也可以包含常用赋形剂，特别是增甜剂、调味剂或防腐剂。它还可以包含益生微生物。根据本领域公知的许多技术中的任意一种可以配制本发明的组合物。
在另一实施方案中，制备了含有根据本发明的至少一种噬菌体分离物的食物组合物。此组合物可以是营养完全配方、婴儿配方、乳产品、冷冻或耐贮存饮料、水、汤、食品添加剂、膳食替代物、营养条或甜食。在最优选实施方案中，可以将噬菌体加入干粉状婴儿配方中。
在另一实施方案中，普通食品中可以富集根据本发明的至少一种噬菌体分离物。所述食品为例如，发酵乳、酸乳酪、新鲜乳酪、凝乳(rennetedmilk)、甜食，例如糖或甜饮料、甜食条、早餐谷片或条、饮料、奶粉、基于大豆的产品、非乳发酵产品或用于临床营养的营养添加剂。
一旦根据本发明选择了噬菌体分离物，在如以上谈及的产品中就可以以至少大约104pfu(噬斑形成单位/ml或克(取决于噬菌体以干燥或湿润状态加入)的量，更优选大约106至大约1011pfu/ml或每克的量单独或以噬菌体混合物包括所述噬菌体分离物。用产品，例如婴儿配方奶粉作为支持材料通过喷雾干燥、冷冻干燥或在液体样品容器中可以制备噬菌体分离物。它也可以作为额外包装(例如小袋)前用作与产品混合的添加剂。
而且，进行根据本发明的噬菌体的应用或在工厂环境中喷雾或其他应用的目的是抑制靶细菌的生长。通过常规方法可以制备此类组合物。对于此种应用，噬菌体的量优选至少大约106pfu(噬斑形成单位)/ml或克，更优选大约106至大约1011pfu/ml或克。
给出以下实施例仅仅用于阐明并且绝不应理解成限制本申请的主题。实施例之前是附图简述。
图1是曲线图，显示了在接种了108pfu/ml噬菌体混合物(FSMCC-噬菌体#67/33/1、F/316、9/261、73/311/2)(●)或无噬菌体混合物(▲)的BHI培养液中阪崎肠杆菌菌株混合物(FSMCC#145、286、290、305、1987/2NL)的生长。
图2是曲线图，显示了在接种了108pfu/ml噬菌体混合物(FSMCC-噬菌体#67/33/1、F/316、9/261、73/311/2)(●)或无噬菌体混合物(▲)的重构的婴儿配方中阪崎肠杆菌菌株混合物(FSMCC#145、286、290、305、1987/2NL)的生长。
图3是曲线图，显示了在用噬菌体混合物(FSMCC-噬菌体#67/33/1、F/316、9/261、73/311/2)以108pfu/ml噬菌体处理(●)或不用噬菌体混合物(▲)处理的不锈钢盘表面阪崎肠杆菌菌株混合物(FSMCC#145、286、290、305、1987/2NL)的生长。
实施例
实施例1：根据本发明的噬菌体的筛选
用来自NestléFood Safety Microbiology噬菌体保藏中心的一组114种噬菌体分离物对来自食品安全培养物培养物保藏中心(Food SafetyMicrobiology culture collection)(FSMCC)的39种阪崎肠杆菌菌株进行检测。这些菌株分别在表1和表2中给出。
  来源   FSMCCn°   来源   FSMCCn°
  1   工厂环境   9/145/1   58   污水(主要是泥)   64/33/2
  2   “   9/145/2   59   “   64/311
  3   “   9/145/3   60   污水(湖中的通道排斥)   66/311/1
  4   “   9/145/4   61   “   66/311/2
  5   “   9/145/5   62   “   67/33/1
  6   “   9/261   63   “   67/33/2
  7   “   9/261/2   64   “   67/300/1
  8   “   10/145/1   65   “   67/300/2
  9   “   10/145/2   66   “   67/311/1
  10   “   10/145/3   67   “   67/311/2
  11   “   10/145/4   68   污水(沙上过滤前水到达)   61/MC9/1
  12   “   10/261/1   69   “   61/MC9/2
  13   “   10/261/2   70   “   61/MC9/3
  14   “   10/261/3   71   污水(主要是泥)   64/MC9/1
  15   “   10/261/4   72   “   64/MC9/2
  16   “   10/261/5   73   污水(湖中的通道排斥)   66/MC9/1
  17   废水   16/145   74   “   66/MC9/2
  18   工厂环境   22/145/1   75   “   67/MC9/1
  19   “   22/145/2   76   “   67/MC9/2
  20   “   22/145/3   77   污水(水入口)   73/33/1
  21   “   22/145/4   78   “   73/33/2
  22   “   22/145/4   79   “   73/261/1
  23   “   23/16   80   “   73/261/2
  24   “   23/145/1   81   “   73/300/1
  25   “   23/145/2   82   “   73/300/2
  26   “   23/145/3   83   “   73/311/1
  27   “   23/145/4   84   “   73/311/2
  28   “   23/145/5   85   “   73/MC9/1
  29   “   23/1387   86   “   73/MC9/2
  30   “   28/16   87   污水(水出口)   74/MC9/1
  31   “   28/145/1   88   “   74/MC9/2
  32   “   28/145/2   89   污水(生物水)   75/311/1
  33   “   33/33/1   90   “   75/311/2
  34   “   33/33/2   91   “   75/MC9/1
  35   “   33/33/3   92   “   75/MC9/2
  36   “   33/33/4   93   污水(水入口)   76/33/1
  37   “   33/33/5   94   “   76/33/2
  38   “   46/MC9/1   95   “   76/311/1
  39   “   46/MC9/2   96   “   76/311/2
  40   “   58/MC9/1   97   “   76/311/3
  41   “   58/MC9/2   98   “   76/311/4
  42   “   58/MC9/3   99   “   76/311/5
  43   污水   61/33/5   100   “   76/MC9/1
  44   “   61/33/6   101   “   76/MC9/2
  45   “   61/33/7   102   污水(水出口)   77/33/1
  46   “   61/33/8   103   “   77/33/2
  47   “   61/300   104   “   77/311/1
  48   “   61/300/1   105   “   77/311/2
  49   “   61/300/2   106   “   77/MC9/1
  50   “   61/311/1   107   “   77/MC9/2
  51   “   61/311/2   108   污水(生物水)   78/33/1
  52   “   61/311/3   109   “   78/33/2
  53   “   61/311/4   110   “   78/311/1
  54   “   61/311/5   111   “   78/311/2
  55   “   62/300/1   112   “   78/MC9/1
  56   “   62/300/2   113   “   78/MC9/2
  57   污水(主要是泥)   64/33/1   114   工厂环境   F/316
表1.研究的噬菌体分离物
  FSM-编号   来源   FSM-编号   来源
  Mal-16(16)   成品：谷类   300   奶工厂环境
  33   婴儿配方   303   奶工厂环境
  261   Munich University   305   奶工厂环境
  265   未知   308   奶工厂环境
  266   未知   309   奶工厂环境
  269   奶工厂环境   311   奶工厂环境
  270   奶工厂环境   313   奶工厂环境
  271   奶工厂环境   314   奶工厂环境
  272   奶工厂环境   316   奶工厂环境
  273   奶工厂环境   318   奶工厂环境
  274   奶工厂环境   322   奶工厂环境
  280   奶工厂环境   323   奶工厂环境
  281   奶工厂环境   1360   奶工厂环境
  284   奶工厂环境   1387-2NL   奶工厂环境
  286   奶工厂环境   MC7   Wageningen University
  288   奶工厂环境   MC8   Wageningen University
  290   奶工厂环境   MC9   Wageningen University
  292   奶工厂环境   MM10   Wageningen University
  297   奶工厂环境   MM11   Wageningen University
  298   奶工厂环境
表2.阪崎肠杆菌菌株
在固体培养基上筛选
噬斑的分离和噬菌体扩增
采样：
取污水样品(大约50ml)用于噬菌体的研究。用pH试纸条测定每个样品的pH(如果pH低于5，用1N NaOH调节到7)。
然后将样品进行以下步骤：
1.2500g离心10分钟(以除去大的残余物)。
2.用0.20μm过滤器过滤上清液(以除去细菌)。
3.如以下进行检测或4℃保存样品最长1或2天。
对于噬菌体的分离，将以上预处理的样品进行或不进行预扩增后平行地检测。一旦检测到存在噬菌体，将它们扩增并保存。
无预扩增的筛选：
步骤1：细菌培养物的制备
制备在脑心浸液(BHI，Oxoid CM225)中30℃过夜生长的阪崎肠杆菌培养物，然后将0.5ml此培养物转移到4ml新鲜BHI中，40℃孵育1小时。
步骤2：向细菌中加入样品：
向维持在45±1℃的含有3ml软BHI琼脂(BHI培养液+0.6％琼脂)的试管中加入100μl阪崎肠杆菌培养物(如以上制备)+100μl待检测的处理样品。
步骤3：接种培养皿
用Vortex混合试管内容物(±2秒)。然后将全部试管内容物倒在含有薄层BHI琼脂的培养皿表面，使它在实验台上固化。将培养皿倒置30℃过夜孵育。
步骤4.结果的解释
注意每个培养皿上裂解噬斑的存在或不存在。
步骤5：对照
准备阳性对照(阪崎肠杆菌菌株n°261+浓度为2-3log pfu/ml的针对此种菌株的活性噬菌体)：应用步骤1至4。
准备不加入噬菌体的阴性对照：应用步骤1至4，不加入噬菌体或待检测样品。
预扩增的筛选：
步骤1-第1天：制备细菌培养物：
制备在脑心浸液(BHI，Oxoid CM225)中30℃过夜生长的阪崎肠杆菌培养物，然后将0.5ml此培养物转移到4ml新鲜BHI中，40℃孵育1小时。
步骤2-第1天：样品中噬菌体的扩增
在含有4ml BHI培养液的试管中，加入100μl阪崎肠杆菌培养物(如步骤1中制备)+1ml待检测的处理样品，在150-200转/分钟搅拌下于30℃孵育3-5小时。将它们留在实验台上过夜。
步骤3-第2天：2500转/分钟离心10分钟
步骤4-第2天：制备细菌培养物：
制备在脑心浸液(BHI，Oxoid CM225)中30℃过夜生长的阪崎肠杆菌培养物，然后将0.5ml此培养物转移到4ml新鲜BHI中并在40℃孵育1小时。
步骤5-第2天：向细菌中加入样品
向维持在45±1℃的含有3ml软BHI琼脂(BHI培养液+0.6％琼脂)的试管中加入100μl阪崎肠杆菌培养物(如以上制备)+100μl步骤3中获得的样品。
步骤6-第2天：培养皿的孵育：
用Vortex混合试管内容物(±2秒)。然后将全部试管内容物倒在含有薄层BHI琼脂的培养皿表面，使它在实验台上固化。将培养皿倒置30℃过夜孵育。
步骤7-第3天：结果解释：
注意每个培养皿上裂解噬斑的存在或不存在。
当检测到存在噬菌体时，将它们扩增并保存。
裂解噬斑的扩增
步骤1：细菌培养物的制备：
制备在脑心浸液(BHI，Oxoid CM225)中30℃过夜生长的阪崎肠杆菌培养物，然后将0.5ml此培养物转移到4ml新鲜BHI中，40℃孵育1小时。
步骤2：pfu的扩增：
在含有4ml BHI培养液的试管中，加入100μl阪崎肠杆菌培养物(如步骤1中制备)+1个分离pfu(自琼脂切下)，在150-200转/分钟搅拌下，30℃孵育3-5小时。将试管留在实验台上过夜。
步骤3：2500转/分钟离心10分钟。
步骤4：用0.20μm过滤器过滤上清液(以除去细菌)。
噬菌体的计数
步骤5：细菌培养物的制备：
制备在脑心浸液(BHI，Oxoid CM225)中30℃过夜生长的阪崎肠杆菌培养物，然后将0.5ml此培养物转移到4ml新鲜BHI中，40℃孵育1小时。
步骤6：向细菌加入噬菌体
向维持在45±1℃的含有3ml软BHI琼脂(BHI培养液+0.6％琼脂)的试管中加入100μl阪崎肠杆菌培养物(如以上制备)+100μl连续稀释的步骤4中获得的样品。
步骤7：培养皿的接种：
用Vortex混合试管内容物(±2秒)，并将全部试管内容物倒在含有薄层BHI琼脂的培养皿表面。然后让它在实验台上固化。将培养皿倒置30℃过夜孵育。
步骤8：结果的解释：
计数每个培养皿上的裂解噬斑。
扩增后的保存
步骤1：等分试样的制备：
将大约1.5ml过滤的扩增噬菌体溶液(在段落“一个裂解噬斑的扩增”的步骤4中获得)分装到冻存管(cryo-tube)中。
步骤2：加入甘油
在每个试管中加入15％的无菌甘油，用Vortex快速混合。
步骤3：在液氮中快速冷冻冻存管
步骤4：将冻存管在冰柜中-20℃保存。
液体培养基中的筛选
步骤1，第0天：细菌培养物的制备
制备在脑心浸液(BHI，Oxoid CM225)中30℃过夜生长的阪崎肠杆菌培养物。
步骤2，第1天：细菌培养物的制备
将0.1ml此培养物转移到4ml新鲜BHI中，40℃孵育6小时(细胞的稳定生长期)。用Tryptone Salt(TS，Oxoid L42)将细胞稀释至3 log cfu/ml。步骤3，第1天：微量滴定板测定
在微量滴定板测定中研究了噬菌体对阪崎肠杆菌的有效性。具有每种检测微生物的的每个板设置如下：外部孔，200μl无菌BHI(空白对照)，其它孔，200μl经稀释的步骤2中制备的阪崎肠杆菌。将微量滴定板4℃过夜保存。
步骤4，第2天：微量滴定板测定
自冰箱中取出微量滴定板。向阴性对照孔中加入180μl BHI，向检测孔中加入160μl BHI和20μl噬菌体悬浮液(终浓度为8log pfu/ml)。通过用微量培养板读数仪Multiskan MCC340在620nm对微量滴定板的光密度(零时间)读数。然后将板子在周围空气中37℃孵育，在孵育6小时30分钟和8小时30分钟后读出OD620nm。
步骤5，第3天：微量滴定板测定
最后读数后，将板子置于室温中总共持续时间24小时。然后最后一次读出OD620nm。
结果
在固体培养基上检测后，选择对选自FSM-16、33、261、265、266、269、270、271、272、273、274、280、281、284、286、288、290、292、297、298、300、303、305、308、309、311、313、314、316、318、322、323、1360、1387/2NL、MC7、MC8、MC9、MM10和MM11的39种阪崎肠杆菌菌株中的至少9种有活性的噬菌体分离物。因此，表3中给出了11种噬菌体分离物(包括噬菌体FSM-噬菌体67/33/1、FSM-噬菌体F/316、FSM-噬菌体9/261和FSM-噬菌体73/311/2)。证明一些噬菌体分离物对39种细菌菌株中的至少20种有效。
  噬菌体数(FSM-噬菌体)
 F/316  73/261/1  9/261   28/145/2  23/16   10/261/1   22/145/3  28/16  33/33/1  67/33/1  73/311/2
  阪崎肠杆菌菌株数   16  2  2  2   2  2   2  2  0  0  0
  33  2  0  2   2  0   0   0  0  2  2  2
  261  2  2  2   2  2   2   2  2  2  2  0
  265  2  2  2  2  0  0
  266  2  2  2  2  2  0
  269  2  2  2  0  0  0
  270  2  0  2  0  2  0
  271  2  2  2  2  0  0
  272  2  2  2   2  2   2   2  2  2  2  0
  273  2  2  2  2  0  0
  274  2  2  2   0  0   2   0  0  0  2  2
  280  2  2  2  2  0  0
  281  2  2  2  2  0  0
  284  2  2  2   2  2   2   2  2  2  2  0
  286  2  2  2   2  2   2   2  2  2  0  0
  288  2  2  2  0  0  0
  290  2  2  2   2  2   2   2  2  2  0  0
  292  2  2  2   2  2   2   2  2  2  2  0
  297  2  2  2  0  0  0
  298  2  0   0  0   0   0  0  2  0  0
  300  2  2  0   0  0   0   0  0  0  2  2
  303  2  2  2   2  2   0   2  2  2  0  0
  305  2  2  2   2  2   2   2  2  0  0  0
  308  2  ？  2  2
  309  2  2   0  0   0   0  0  0  2  2
  311  2  2  2   0  0   0   0  0  0  2  2
  313  2  2  2   2  2   2   2  2  2  0  0
  314  2  2  2  2  2  0
  316  2  2  2   2  2   2   2  2  2  2  0
  318  2  2  2   2  2   2   2  2  2  2  0
  322  2  2  2  2  2  0
  323  2  2  2   2  2   2   2  2  2  2  0
  1360  2  2  2   0  0   0   0  0  0  0  2
  1387/2NL  2  2  2   2  2   2   2  2  0  0  2
  MC7  0  0   2  2   0  0  0
  MC8  2  2   2  2   2  0  0
  MC9  2  2   2  2   2  2  2
  MM10  2  2   2  2   2  0  0
  MM11  2  0   2  2   2  2  0
表3：根据固体培养基中获得的结果的噬菌体选择
说明：0无活性；2有活性。
为了选择根据本发明的噬菌体分离物，还在液体培养基上检测了所述噬菌体。结果在表4中给出。
  噬菌体数(FSM-噬菌体)
 67/33/1 10/261/1   F/316   9/261  33/33/1   73/311/2   28/145/2 73/261/1  23/16   28/16 22/145/3
  阪崎肠杆菌菌株数   16  2 2   2   2  0   0   2 2  2   0 0
  33  2 2   2   2  2   2   0 0  0   0 0
  261  2 2   2   2  2   2   0 2  0   0 0
  265  2 2   0   0  2   0   2 2  2   0 0
  266  2 2   2   2  2   2   2 0  2   0 2
  269  2 2   2   2  0   2   0 0  0   0 0
  270  2 0   0   2  0   2   0 2  0   0 0
  271  2 2   2   0  2   0   2 0  0   0 0
  272  2 2   2   2  2   2   0 0  0   0 0
  273  2 2   2   2  2   0   0 0  0   0 0
  274  2 2   2   0  2   2   ？ 0  0   2 2
  280  2 0   2   2  2   0   0 0  0   0 0
  281  2 2   2   2  2   0   2 0  0   0 0
  284  2 2   2   2  2   0   0 0  0   0 0
  286  2 2   2   2  2   2   2 0  2   0 0
  288  2 2   2   0  0   0   0 0  0   0 0
  290  2 2   2   2  2   0   0 0  0   0 0
  292  2 2   2   2  2   2   0 0  0   0 0
  297  2 ？   2   2  ？   2   0 0  0   0 0
  298  0 2   2   2  2   0   0 0  0   0 0
  300  0 2   2   2  2   2   0 2  0   0 0
  303  2 2   0   0  2   0   2 2  2   0 0
  305  2 2   2   2  0   2   0 0  0   0 0
  308  2 2   ？   ？  0   2   0 0  0   0 0
  309  2 2   ？   ？  0   2   0 0  0   0 0
  311  2 2   0   0  0   2   0 0  0   2 0
  313  2 2   2   2  2   2   0 0  0   0 0
  314  0 ？   2   2  ？   0   2 0  0   0 0
  316  0 2   2   2  0   0   0 0  0   0 0
  318  2 2   2   2  2   0   0 0  0   0 0
  322  2 2   2   2  2   0   0 0  0   0 0
  323  2 2   2   2  2   0   0 0  0   0 0
  1360  0 0   2   2  2   0   0 2  0   0 0
  1387/2NL  2 2   2   2  2   2   2 0  2   2 0
  MC7  2 0   0   0  0   2   0 2  0   0 0
  MC8  2 2   0   0  0   2   0 0  0   0 0
  MC9  2 2   0   0  0   2   2 0  0   0 0
  MM10  2 0   0   0  0   2   0 2  0   0 0
  MM11  2 2   2   2  2   2   0 0  0   2 0
表4：根据液体培养基中获得的结果的噬菌体选择
说明：0无活性；2有活性。
如可以自表4得到的，一些噬菌体分离物识别39种阪崎肠杆菌菌株的80％以上。然而，其它分离物甚至识别检测菌株的不到10％。在液体培养基中还对39种阪崎肠杆菌菌株的至少9种有活性的噬菌体分离物为可以在本发明中使用的所选择的噬菌体分离物，所述39种阪崎肠杆菌菌株为：FSM-16、FSM-33、FSM-261、FSM-265、FSM-266、FSM-269、FSM-270、FSM-271、FSM-272、FSM-273、FSM-274、FSM-280、FSM-281、FSM-284、FSM-286、FSM-288、FSM-290、FSM-292、FSM-297、FSM-298、FSM-300、FSM-303、FSM-305、FSM-308、FSM-309、FSM-311、FSM-313、FSM-314、FSM-316、FSM-318、FSM-322、FSM-323、FSM-1360、FSM-1387-2NL、FSM-MC7、FSM-MC8、FSM-MC9、FSM-MM10和FSM-MM11。优选地为以下8种噬菌体分离物：FSM-噬菌体67/33/1(CNCM I-3130)、FSM-噬菌体F/316(CNCM I-3131)、FSM-噬菌体9/261(CNCM I-3132)和FSM-噬菌体73/311/2(CNCM I-3133)、FSM-噬菌体73/261(CNCM I-3128)、FMS33/33/1(CNCM I-3129)、FSM-噬菌体28/145/2、FSM-噬菌体10/261/1(CNCM I-3127)。
应当理解本领域技术人员可以通过将其他噬菌体进行如以上详细描述的固体和液体培养基上的筛选试验来检查和选择根据本发明的其它噬菌体分离物。
实施例2：评估BHI和重构的婴儿配方(RIF)中噬菌体混合物对多种阪崎肠杆菌菌株混合物的效力
为了评估噬菌体混合物对阪崎肠杆菌菌株混合物的效力，进行了以下实验。
使用了如实施例1和在P.Breeuwer等人，2003，Journal of AppliedMicrobiology 95：967-973中描述的阪崎肠杆菌菌株FSM-145、286、290、305和1387/2NL的混合物。这些菌株的单独过夜培养物(30℃18小时)用新鲜BHI以1∶1稀释并在30℃孵育2小时。通过混合等量的每种原液进行这些菌株的混合。然后，用100μl阪崎肠杆菌混合物(如以上描述的制备)接种BHI培养液或RIF，使终浓度为大约10cfu/ml。
检测含有FSM_噬菌体67/33/1(CNCM I-3130)、FSM_噬菌体F/316(CNCM I-3131)、FSM_噬菌体9/261(CNCM I-3132)和FSM_噬菌体73/311/2(CNCM I-3133)的噬菌体分离物混合物。对于此种噬菌体分离物混合物，将不同量的每种噬菌体加入含有阪崎肠杆菌混合物的试管中以达到终浓度大约8log pfu/ml。也包括不加噬菌体(9.9ml BHI或RIF+100μl阪崎肠杆菌混合物)的阴性对照。
所有接种物在30℃孵育，在不同时间间隔：0-2-4-6小时取样。对于每种样品，通过标准平板计数方法确定培养基中存在的细菌数。
结果：
结果在图1和2中给出。它表明在最低6小时到长达24小时期间，不存在噬菌体混合物时细菌混合物将生长到很高数目，而存在噬菌体混合物时没有观察到细菌生长。
总之，这些实验证实向重构的婴儿配方(RIF)中加入根据本发明的针对阪崎肠杆菌的噬菌体制剂将防止阪崎肠杆菌的生长达至少6小时。
实施例3：噬菌体制剂对环境卫生的作用
为了评估噬菌体混合物对阪崎肠杆菌菌株混合物人工污染的表面的作用，进行了以下实验。
步骤1：细菌培养物的制备
使用阪崎肠杆菌菌株混合物(FSM-145、286、290、305和1387/2NL(参见实施例1和2))。这些菌株的单独过夜培养物(30℃18小时)在4℃以3000转/分钟离心10分钟。收获细胞沉淀物，将其在BHI中稀释以达到大约8logcfu/ml的细胞浓度。通过混合等量的每种原液进行这些菌株的混合。
步骤2：粘附
将1cm2的不锈钢盘投入到如步骤1制备的细菌溶液中。在室温温和摇动1小时。
步骤3：清洗和干燥
为除去未附着的细胞，取出不锈钢盘，在磷酸盐缓冲溶液(PBS：pH 7.0，Merck)中清洗3次。用Watman滤纸吸收过量的液体，然后将盘在层流下干燥30分钟。为确定附着的细胞的水平，在一些盘上应用步骤6。
步骤4：加入噬菌体混合物
将一半不锈钢盘投入8log pfu/ml的噬菌体混合溶液中，所述噬菌体混合溶液含有以下噬菌体：FSM_噬菌体67/33/1(CNCM I-3130)、FSM噬菌体F/316(CNCM I-3131)、FSM_噬菌体9/261(CNCM I-3132)和FSM_噬菌体73/311/2(CNCM I-3133)。将容器在室温温和摇动6小时。在不同间隔取一些盘用于细菌计数。平行地进行不加入噬菌体的对照。
步骤5：清洗
在确定的时间间隔取出一些盘，将其在无菌PBS中清洗3次并在无菌吸水纸上快速干燥。
步骤6：细胞脱离和计数
步骤5后，将每个盘放入含有9ml TS的试管中。然后将试管置于50KHz的超声浴(充满水和冰混合物)中1分钟；之后用Vortex将试管搅动10秒。用标准平板方法进行细胞计数。
结果：
图3中给出的结果证实在菌株混合物(FSMCC#145、286、290、305、1987/2NL)中的阪崎肠杆菌细菌不能再从用噬菌体混合物(FSMCC-噬菌体#67/33/1、F/316、9/261、73/311/2)以108pfu/ml噬菌体处理的不锈钢盘表面回收，而没有噬菌体混合物时细菌保持存活并且甚至可以轻微生长。总之，用每毫升至少108个噬菌体处理不锈钢表面导致杀死阪崎肠杆菌细菌。

Claims (27)

1.噬菌体分离物，其对阪崎肠杆菌具有实质裂解潜力。
2.根据权利要求1的噬菌体分离物，所述噬菌体分离物：
i)在固体培养基上使用斑点测定试验的试验中具有感染选自FSM-16、FSM-33、FSM-261、FSM-265、FSM-266、FSM-269、FSM-270、FSM-271、FSM-272、FSM-273、FSM-274、FSM-280、FSM-281、FSM-284、FSM-286、FSM-288、FSM-290、FSM-292、FSM-297、FSM-298、FSM-300、FSM-303、FSM-305、FSM-308、FSM-309、FSM-311、FSM-313、FSM-314、FSM-316、FSM-318、FSM-322、FSM-323、FSM-1360、FSM-1387-2NL、FSM-MC7、FSM-MC8、FSM-MC9、FSM-MM10和FSM-MM11的阪崎肠杆菌的至少9种细菌菌株和，
ii)在液体培养基中具有感染选自FSM-16、FSM-33、FSM-261、FSM-265、FSM-266、FSM-269、FSM-270、FSM-271、FSM-272、FSM-273、FSM-274、FSM-280、FSM-281、FSM-284、FSM-286、FSM-288、FSM-290、FSM-292、FSM-297、FSM-298、FSM-300、FSM-303、FSM-305、FSM-308、FSM-309、FSM-311、FSM-313、FSM-314、FSM-316、FSM-318、FSM-322、FSM-323、FSM-1360、FSM-1387-2NL、FSM-MC7、FSM-MC8、FSM-MC9、FSM-MM10和FSM-MM11的阪崎肠杆菌的至少9种细菌菌株的能力。
3.根据权利要求1或2的噬菌体分离物，其以保藏号CNCM I-3127保藏。
4.根据权利要求1或2的噬菌体分离物，其以保藏号CNCM I-3128保藏。
5.根据权利要求1或2的噬菌体分离物，其以保藏号CNCM I-3129保藏。
6.根据权利要求1或2的噬菌体分离物，其以保藏号CNCM I-3130保藏。
7.根据权利要求1或2的噬菌体分离物，其以保藏号CNCM I-3131保藏。
8.根据权利要求1或2的噬菌体分离物，其以保藏号CNCM I-3132保藏。
9.根据权利要求1或2的噬菌体分离物，其以保藏号CNCM I-3133保藏。
10.噬菌体混合物，其含有根据权利要求1至9之一的至少一种噬菌体分离物，所述噬菌体分离物感染来自FSM-16、FSM-33、FSM-261、FSM-265、FSM-266、FSM-269、FSM-270、FSM-271、FSM-272、FSM-273、FSM-274、FSM-280、FSM-281、FSM-284、FSM-286、FSM-288、FSM-290、FSM-292、FSM-297、FSM-298、FSM-300、FSM-303、FSM-305、FSM-308、FSM-309、FSM-311、FSM-313、FSM-314、FSM-316、FSM-318、FSM-322、FSM-323、FSM-1360、FSM-1387-2NL、FSM-MC7、FSM-MC8、FSM-MC9、FSM-MM10和FSM-MM11的阪崎肠杆菌菌株的至少80％。
11.食品，其含有对阪崎肠杆菌具有实质裂解潜力的至少一种噬菌体分离物或混合物。
12.根据权利要求11的食品，其中噬菌体分离物或混合物为根据权利要求1至10的噬菌体分离物或混合物。
13.根据权利要求11或12的食品，所述食品是基于乳的产品、营养组合物、宠物食品、饮食添加剂或处于受到阪崎肠杆菌污染危险中的任意食品的形式。
14.根据权利要求13的食品，其中所述基于乳的产品为发酵乳、酸乳酪、凝乳、乳酪、新鲜乳酪、发酵产品、凝乳(renneted milk)、饮料、基于乳的粉剂、婴儿配方或干粉状婴儿配方。
15.根据权利要求11至14之一的食品，其中噬菌体分离物或混合物为有效防止所述产品中阪崎肠杆菌污染和过度生长的量。
16.根据权利要求15的食品，其中噬菌体分离物以至少每ml食品1×104pfu或如果是固体，每克食品1×104pfu的量存在。
17.通过防止阪崎肠杆菌污染和过度生长用于食品净化和工厂环境卫生的活性剂，所述活性剂包含有效量的根据权利要求1至10中一项的至少一种噬菌体分离物或混合物。
18.根据权利要求17的活性剂，其中噬菌体分离物以至少每ml 1×104pfu或如果是固体，每克1×104pfu的量存在。
19.根据权利要求17或18的活性剂，其中食品为基于乳的产品，诸如发酵乳、酸乳酪、凝乳、乳酪、新鲜乳酪、基于乳的发酵产品、凝乳(renneted milk)、饮料、基于乳的粉剂、婴儿配方、干粉状婴儿配方；非乳发酵产品；基于大豆的产品、营养配方、乳产品、冷冻或耐贮存的饮料、水、汤、食品添加剂、膳食替代物、营养条或甜食、宠物食品、糖或甜饮料、冰淇淋、甜食条、早餐谷片或早餐谷条或用于临床营养的营养添加剂或处于阪崎肠杆菌污染危险中的任意食物。
20.根据权利要求1至10中一项的至少一种噬菌体分离物或混合物的用途，用于食品的净化和工厂环境的卫生。
21.根据权利要求20的用途，其中食品为基于乳的产品，诸如发酵乳、酸乳酪、凝乳、乳酪、新鲜乳酪、基于乳的发酵产品、凝乳(rennetedmilk)、饮料、基于乳的粉剂、婴儿配方、干粉状婴儿配方；非乳发酵产品；基于大豆的产品、营养配方、乳产品、冷冻或耐贮存的饮料、水、汤、食品添加剂、膳食替代物、营养条或甜食、宠物食品、糖或甜饮料、冰淇淋、甜食条、早餐谷片或早餐谷条或用于临床营养的营养添加剂或处于阪崎肠杆菌污染危险中的任意食物。
22.根据权利要求1至10中一项的至少一种噬菌体分离物的用途，用于制备用以防止或治疗人或动物中阪崎肠杆菌引起的感染的组合物。
23.根据权利要求20至22中一项的用途，其中噬菌体分离物以有效防止阪崎肠杆菌污染和过度生长的量存在。
24.根据权利要求20至23中一项的用途，其中噬菌体分离物或混合物以每ml至少1×104pfu的量使用。
25.用于食品净化或工厂环境卫生的方法，其包括使用对阪崎肠杆菌具有实质裂解潜力的至少一种噬菌体分离物或混合物。
26.根据权利要求25的方法，其中噬菌体分离物是根据权利要求1至10的一项的噬菌体分离物。
27.选择对阪崎肠杆菌具有实质裂解潜力的噬菌体分离物的方法，其由筛选：
i)在固体培养基上使用斑点测定试验的试验中具有感染选自FSM-16、FSM-33、FSM-261、FSM-265、FSM-266、FSM-269、FSM-270、FSM-271、FSM-272、FSM-273、FSM-274、FSM-280、FSM-281、FSM-284、FSM-286、FSM-288、FSM-290、FSM-292、FSM-297、FSM-298、FSM-300、FSM-303、FSM-305、FSM-308、FSM-309、FSM-311、FSM-313、FSM-314、FSM-316、FSM-318、FSM-322、FSM-323、FSM-1360、FSM-1387-2NL、FSM-MC7、FSM-MC8、FSM-MC9、FSM-MM10和FSM-MM11的阪崎肠杆菌的至少9种细菌菌株和，
ii)在液体培养基中具有感染选自FSM-16、FSM-33、FSM-261、FSM-265、FSM-266、FSM-269、FSM-270、FSM-271、FSM-272、FSM-273、FSM-274、FSM-280、FSM-281、FSM-284、FSM-286、FSM-288、FSM-290、FSM-292、FSM-297、FSM-298、FSM-300、FSM-303、FSM-305、FSM-308、FSM-309、FSM-311、FSM-313、FSM-314、FSM-316、FSM-318、FSM-322、FSM-323、FSM-1360、FSM-1387-2NL、FSM-MC7、FSM-MC8、FSM-MC9、FSM-MM10和FSM-MM11的阪崎肠杆菌的至少9种细菌菌株的能力的噬菌体分离物组成。
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