CN1904041A

CN1904041A - 人重组磷脂酶d2及其制备方法和在药物制备中的应用

Info

Publication number: CN1904041A
Application number: CNA2005100191724A
Authority: CN
Inventors: 朱玲
Original assignee: Fujian Medical University
Current assignee: Fujian Medical University
Priority date: 2005-07-25
Filing date: 2005-07-25
Publication date: 2007-01-31
Anticipated expiration: 2025-07-25
Also published as: CN1904041B

Abstract

本发明公开了一种人重组磷脂酶D2及其制备方法和在药物制备中的应用，本发明描述了人重组磷脂酶D2(recombinant human phosphol ipase D2，rhPLD2)，一种人磷脂酶D2变构体极其编码该蛋白多肽的多核苷酸序列。同时阐明了该蛋白多肽和多核苷酸的制备方法：并就其抗炎、抗哮喘、抗白血病细胞(HL－60)凋亡等功能的研究做了科学的表述。尤为重要的是指明了该蛋白多肽和多核苷酸的临床应用价值和巨大的开发前景。

Description

人重组磷脂酶D2及其制备方法和在药物制备中的应用

本发明描述了人重组磷脂酶D2(recombinant human phospholipase D2，rhPLD2)，一种人磷脂酶D2变构体极其编码该蛋白多肽的多核苷酸序列。同时阐明了该蛋白多肽和多核苷酸的制备方法；并就其抗炎、抗哮喘、抗白血病细胞(HL-60)凋亡等功能的研究做了科学的表述。尤为重要的是指明了该蛋白多肽和多核苷酸的临床应用价值和巨大的开发前景。

一、技术领域本发明所属领域包括以下内容。

(一)分子生物学范畴。

(二)蛋白分子研究领域。

(三)免疫学功能研究领域。

(四)疾病治疗医学研究领域。

二、背景技术

(一)分子生物学：本申请的主体是人重组磷脂酶D2(rhPLD2)。而该蛋白质产物是从Daudi细胞中提取mRNA，经剪切、拼接变构，克隆获得了不含膜结合部位及信号肽的，可编码631个氨基酸的PLD2 cDNA序列。

(二)蛋白分子研究：通过上述PLD2 cDNA序列的基因表达、蛋白的分离和纯化，获得了具有一定生物学活性的rhPLD2蛋白产品。

(三)免疫学功能研究。

1.与细胞分化的关系

PLD广泛存在于哺乳动物细胞中，并与各类细胞的分化有关。最近，俩种相关的PLD同工酶：PLD1和PLD2被克隆。PLD1的活性在体外被蛋白激酶C和小分子量三磷酸腺甘(GTP)结合蛋白(Arf，Rho家族)调节。相比之下，PLD2的活性高，且对这些催化剂无应答。在各种细胞的分化和凋亡中，细胞的PLD活性和这些同工酶的mRNA水平有很大的改变。有实验观察了在Jurkat T细胞的凋亡过程中这类PLD的活性急剧增高。在某些情况下PLD活性被控制在翻译水平，在哺乳动物细胞的分化，存活和凋亡中PLD发挥作用。细胞外的信号分子与细胞表面受体的相互作用经常活化PLD-介导卵磷脂和其它的磷脂，产生磷脂酸。PLD的活化被认定在细胞功能和命运的调节中发挥着重要作用。

2.与受体的关系

FcgammaRI，人类高亲和性IgG受体负责免疫复合物的内在化及继发溶酶体的降解。我们在此证明在干扰素γ前体细胞U937上合了免疫复合物的FcgammaRI聚合，引起暂时的肿胀小泡结构。可能肿胀的晚期内含体在免疫复合物被降解后消失。Wortmannin and LY294002是PI3-kinases的特异性抑制剂，可延迟这些结构的消失，相应地抑制由FcgammaRI介导的免疫复合物降解。另外这些抑制剂亦可延迟由FcgammaRI介导的免疫复合物内吞作用，并阻止由FcgammaRI介导的PLD活性-PLD是一种与膜运输有关的酶。这说明PLD与免疫复合物内吞作用密切相关。免疫复合物的内吞作用和人高亲和性IgG受体活化PLD需要明显的phosphoinositide-3激酶活性。

3.与细胞因子的关系

已发现EGF可引起细胞PLD2活化，但值得探讨的是EGF-R的活性丝毫不受影响。另外两种能以ARF-依赖方式激活PLD的是受体-酪氨酸激酶激动剂：如胰岛素、PDGF。这种可与胰岛素相互作用的磷脂酶可能为PLD2，因为胰岛素的作用可被静止的无酶活性的PLD2阻断，而静止的PLD1却不能阻断胰岛素引起的效应。通常认为趋化性细胞因子在炎症状态的功能可能是由不同的信号机制介导，其中重要的是小GTP酶调节细胞骨架重排，参与细胞粘附和趋化作用，并介导磷脂酶D(PLD)活化及过氧化物氧化酶的生成。

(四)疾病治疗医学研究：

PLD可被多种炎症介质(血小板活化因子、IL-1、IL-4、IL-8、IFN-γ、趋化肽等)、激素、细胞因子、神经递质、氧化剂、内毒素(lipopolysaccharide，LPS)以及生长因子等诸多细胞外信号激活而发挥该酶在炎症反应过程中的作用。有学者发现磷脂酰肌醇二磷酸和磷脂酰三肌醇可直接激活PLD，而磷脂酰肌醇则不具备该生物学功能。该酶激活后可通过以下途径发挥生物学效应，①PLD的直接或间接产物PA、DG、LPA均为第二信使；②PLD水解细胞膜上的重要的成分磷脂酰胆碱后将改变膜的生物学性质。目前，有研究认为PLD水解PC这一过程在诸如炎症反应、细胞分裂以及细胞凋亡等生理、病理过程中具有非常重要的生物学作用。1.与炎症的关系

PLD通过卵磷脂在信号传导和通过趋化多肽fMet-Leu-Phe刺激分叶核白细胞产生超氧化物(呼吸爆发中)的过程中发挥重要作用。EOS的磷酸酯酶D有灭活PAF的作用。而PAF是目前已知的在变态反应中致炎作用最强的炎症因子，其作用约相当于其它炎症介质的1000倍。

2.与疾病的关系

1)卵缫卵泡闭塞

尽管已证明卵缫卵泡闭塞是由粒层细胞的凋亡所致，但涉及凋亡细胞死亡的细胞内传导信号途径仍然很少被描述。用Western blot检测粒细胞溶解物及免疫标记培养的粒细胞证实Fas抗原的表达。粒细胞与anti-Fas mAb混合引起重要的鞘磷脂水解，并伴随内源性神经酰胺水平的增高。研究结果表明Fas/神经酰胺信号途径也许在粒细胞凋亡中发挥作用；并认为PLD/DAG途径可能在粒细胞凋亡中连接Fas/神经酰胺途径。

2)结核病

ATP诱导的人类肥大细胞殺伤毒性结核杆菌要PLD的参与。有证明ATPe促进患者巨噬细胞对毒性结核杆菌的吞殺，并强调PLD的活化在此过程中发挥这关键作用。用基因脱毒PLD制备的疫苗已被证明可有抗假结核病棒状杆菌-引起绵羊干酪样林巴结炎，至少部分有效。在抗原提呈细胞(APC)上，CTLA-4与B7结合从而直接融合免疫感应位点的抗原。已证明与DNA编码的DeltaPLD比较，靶向DeltaPLD(以CTLA-4作为靶抗原)作为一种融合蛋白明显地增加抗体应答的速度、数量及时间。所有的用DNA编码的DeltaPLD绵羊疫苗，与那些用无关质粒免疫或未免疫的组比较均能较好地起到保护作用。因此，APC细胞上的靶抗原为增强DNA疫苗的功效提供了基因的策略。

3)高血压

近来证明，PLD催化卵磷脂水解的产物磷脂酸在MAPK级联的调节作用中发挥着关键作用。在A10细胞，一种平滑肌细胞系；如果无PLD活性存在时，激发MAPK途径所需的血管收缩素-Ang II的磷酸化作用被抑制。因此，通过血管活性多肽改变PLD活性的调节作用也许在高血压的发展过程中起重要作用。

4)肿瘤

在喜树碱及TNF诱导HL-60细胞凋亡的过程中伴有PLD2活性的增高，抑制PLD2的活性能抑制HL-60细胞的凋亡。这就表明在诱导HL-60细胞分化及凋亡过程中PLD2具有重要的生物学功能。也有报道在其它的细胞株例如PC-12，在凋亡诱导剂诱导细胞凋亡的过程中，PLD2的活性增加具有抗凋亡作用。

目前国内外文献均未报道或描述人重组磷脂酶D2，英文名称recombinant humanphospholipase D2，简称rhPLD2，以及人重组磷脂酶D2的变构体及其编码该蛋白多肽的多核苷酸序列。也没有报道或描述该蛋白多肽和多核苷酸的制备方法，尤其是无其抗炎、抗哮喘、抗白血病细胞(HL-60)凋亡等功能的研究报道。更没有报道或叙述该蛋白多肽和多核苷酸的临床应用价值和巨大的开发前景。

三、发明内容

(一)rhPLD2的来源：本申请的主体是人重组磷脂酶D2(rhPLD2)。而该蛋白质产物是从Daudi细胞中提取PLD2的mRNA，经剪切、拼接变构，克隆获得了不含膜结合部位及信号肽的，可编码631个氨基酸的PLD2 cDNA序列；通过上述PLD2 cDNA序列的基因表达、蛋白的分离和纯化，获得了具有一定生物学活性的rhPLD2蛋白产品。

(二)发明的特征

1、rhPLD2的特征：

1)本研究室已纯化干燥的rhPLD2蛋白产品是一种无味的白色或淡黄色的粉末。较易溶于水，其溶解度在常温下为88-100％。rhPLD2蛋白分子量为71.6KD。

2)1mg的rhPLD2的活性大约相当于65mu PLD。1mg的rhPLD2的活性大约相当于65muPLD。其生物学活性有效范围约在0.5μg/ml-150mg/ml。最佳范围：0.5μg/ml-150μg/ml。其编码基因序列为不含膜结合部位及信号肽的，可编码631个氨基酸的PLD2 cDNA序列，全长1893bp。详见序列表<210>1。

3)rhPLD2的氨基酸多肽序列，全长631个氨基酸。详见序列表<210>2。

4)将rhPLD2蛋白质产品rhPLD2进行动物过敏实验和毒性实验。表明：经腹腔注射浓度为0.4537-2mg/mL的rhPLD2，对动物无致敏及任何毒性作用。

2、rhPLD2的应用特点

1)抗哮喘

哮喘发病率的上升使得该疾病近年来备受关注，现今全球约有1亿6千万患者，并有上升趋势。目前，已有大量的生长因子在支气管平滑肌中被鉴定出来，包括血小板源性生长因子，表皮生长因子等。因而抑制支气管平滑肌增殖的信号传导通路将是治疗哮喘的一个新视点。PLD的产物PA及DAG可使PKC活化，同时伴随细胞内游离Ca²⁺的上升，而Ca²⁺浓度的变化是细胞分泌的必要信号。另外，PLD2可以调节PKC，进而通过影响核转录因子的活性而调节某些参与哮喘发病的炎症因子的表达；并通过调节MAPK等信号转导途径而调节支气管平滑肌的增生。因此，我们选择PLD2作为控制信号转导的靶点，从而抑制支气管平滑肌的增殖。通过改变PLD2的活性可能是治疗哮喘/或者缓解哮喘症状的一种方法。为此，我们应用本实验室制备的人重组磷脂酶D2即rhPLD2(该rhPLD2是一种掐头PLD2，即去除了N-末端的某些肽段，同时亦对PLD2基因某些位点进行点突变，从而改变其基础活性)作为治疗因素干预哮喘豚鼠模型。因此，我们可以选择PLD2作为控制信号转导的靶点，从而抑制支气管平滑肌的增殖及细胞因子的分泌。这不失为治疗哮喘的一种方法。

利用超敏反应(哮喘)的动物模型，在体外抗炎实验的基础上进一步研究用rhPLD2干预前后，实验动物临床症状的表现及动物循环血液、肺组织及肺泡灌洗液等标本中嗜酸性粒细胞(Eos)、血小板活化因子(PAF)、白细胞介素5(IL-5)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)的水平。

2)抗炎症

小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)的单核-吞噬细胞，具有重要的免疫监视和免疫防御功能。当CNS发生炎症时，小胶质细胞最先出现应激反应，由静止状态转变为活化状态，参与炎症反应。我们在mRNA水平和蛋白水平，发现rhPLD2均可抑制活化的小鼠小胶质细胞表达IL-1β、TNF-α，这为中枢性炎症的防治提供了新的思路。

3)诱导白血病细胞(HL-60)凋亡

白血病是造血系统的恶性肿瘤，俗称“血癌”，是国内十大高发恶性肿瘤之一，在小儿的恶性肿瘤中以白血病的发病率最高。目前，白血病的主要治疗手段为化学疗法和造血干细胞移植。但是化疗药物的毒副作用也是一个不容忽视的问题，这就在一定程度上限制了化疗药物在治疗过程中的使用剂量。并且在化疗药物治疗白血病的过程中，白血病细胞对化疗药物产生抗药性也是化疗失败的主要原因。如何提高化疗药物对白血病细胞的敏感性，增加化疗药物的治疗效果，降低化疗药物的毒副作用是一个亟需解决的问题。而在喜树碱诱导HL-60细胞凋亡的过程中，通过激活核内PLD而导致核内DAG水平升高，进而使核内PKCα发生活化，PKCα磷酸化核纤层蛋白B(lamin B)而导致细胞凋亡。

(三)已获rhPLD2克隆4个，它们分别是：

克隆1号：1片段(600bp)；

克隆2号：2片段(600bp)；

克隆3号：3片段(677bp)；

克隆4号：1+2+3片段(1893bp)。

四、发明目的：

1.提供分离的新的人重组磷脂酶D2多肽，它包含：具有序列表<210>2氨基酸序列的多肽、或其保守性变体、生物活性片段、类似物或衍生物。

2.提供编码该多肽的多核苷酸。它包含选自下组的一种核苷酸序列或其变体：

(a)编码具有序列表<210>2氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸；

(c)与(a)或(b)的多核苷酸序列具有至少88％相同性的多核苷酸。

更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有序列表<210>1中414-504位的序列；和(b)具有序列表<210>1中615-789位的序列；和(c)具有序列表<210>1中912-1407位的序列；和(d)具有序列表<210>1中1353-1455位的序列。

即本发明提供了分离的核酸(多核苷酸)，基本由编码具有序列表<210>2氨基酸序列的多肽的多核苷酸组成。本发明的多核苷酸序列包括序列表<210>1的核苷酸序列。

3.本发明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与序列表<210>1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。编码序列表<210>2的成熟多肽的多核苷酸包括：只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

4.本发明还涉及上述描述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片断、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

5.本发明提供了一种新的多肽一一人重组磷脂酶D2，其基本上是由序列表<210>2所示的氨基酸序列组成的。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

6.提供含有编码人重组磷脂酶D2的多核苷酸的重组载体。特别是表达载体；本发明中，编码人重组磷脂酶D2的多核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体。包括本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体/转录调控元件(如启动子、增强子等)和选择性标记基因。

7.提供含有编码人重组磷脂酶D2的多核苷酸的基因工程化宿主细胞。本发明中，人重组磷脂酶D2的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该多核苷酸或重组载体的基因工程化宿主细胞。术语“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。

8.提供生产人重组磷脂酶D2的方法。用本发明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，或者常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

通过常规的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的人重组磷脂酶D2。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的编码人重组磷脂酶D2的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

在步骤(2)中，根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在步骤(3)中，重组多肽可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法包括但并不限于：常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

9.本发明的编码人重组磷脂酶D2的特异的多核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离多核苷酸。这些技术包括但不局限于：1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源的多核苷酸序列，和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的多核苷酸片段。

10.提供针对本发明的人重组磷脂酶D2的抗体，及涉及一种能与本发明多肽特异性结合的抗体。

11.本发明还涉及本发明的多肽或多核苷酸在制备抗炎、抗哮喘、抗肿瘤等药物中的应用。

12.本发明的多肽以及该多肽的拮抗剂、激动剂和抑制剂可直接用于疾病治疗，例如，可治疗恶性肿瘤、各类炎症、哮喘等。

可以将本发明的多肽、多核苷酸及其模拟物、激动剂、拮抗剂和抑制剂与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。

13.本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒，容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起，可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外，本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。

药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、雾化、鼻内或皮内的给药途径。人重组磷脂酶D2以有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的人重组磷脂酶D2的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

五、附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1是本发明人重组磷脂酶D2的PCR产物凝胶电泳图。

图2为分离的人重组磷脂酶D2的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)。71.6kDa为蛋白质的分子量。箭头所指为分离出的蛋白条带。

图1.PCR产物凝胶电泳图图2.rhPLD2的复性

M：DNA分子量标准DL 15000； 1.蛋白分子量标准

1：1片段(600bp)； 2.rhPLD2的复性后上清71.6kD)

2：2片段(600bp)； 3.rhPLD2的复性后沉淀(71.6kD)

3：3片段(677bp)；

4：1+2+3片段(1893bp)..

图3是本发明人重组磷脂酶D2和人磷脂酶的氨基酸序列同源性比较图。FROM NET是人重组磷脂酶D2。

图4是原技术路线。

图5是改变后的技术路线。即PCR法定点突变示意图。Step1，2：用含有突变位点的引物P3(PLDm3)和P4(PLDm5)分别与P1(1+2片段)和P2(2+3片段)扩增出两个片段；Step3：将两个片段混合后变性、退火，形成杂合分子；Step4：加入pfuDNA高温聚合酶延伸成模板；Step5：加入P1，P2模板扩增得到目的产物：不含氨基端的hPLD2的cDNA。

图6是人重组磷脂酶D2蛋白质的纯化与鉴定的基本流程图。

六、具体实施方式

(一)实施案例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sanlbrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：人重组磷脂酶D2的克隆

根据GenBank公布的已知的hPLD2的cDNA序列(登录号：AF035483)，按照每600bp为一个片段，将其2802bp的基因全长从第909bp起，分为三个片段。即600bp，600bp，677bp。并设计了5’和3’端寡核苷酸引物，在第一片段的5’端引入EcoRI限制性酶切位点，并加上保护性碱基。在第二片段的第466个碱基(原序列的第1991个碱基)：将A突变为G。即，在1+2片段的3’端引物和2+3片段的5’端引物均引入BamH I限制性酶切位点。在第三片段的3’端引物的5’末端引入KpnI限制性酶切位点。各片段的5’和3’端引物序列分别为：见表1.。将Daudi细胞(10¹²个·ml^-1)经5％CO₂，37℃条件下，以20％小牛血清、100μg·ml^-1链霉素、100U·ml^-1青霉素的DMEM培养基培养。经离心，收集沉淀细胞，然后从中提取mRNA，并根据所设计的5’和3’端寡核苷酸引物及突变引物进行RT-PCR。扩增条件：94℃变性1min；加入Taq酶/LA酶(5U/μl)；然后以94℃30s，55℃40s，72℃45s(全长2.5min)的程序循环30次(全长35次)；最后72℃延伸7min。PCR产物采用基因内引物PCR扩增和基因内限制性内切酶酶切方法进行分析鉴定正确后，克隆到载体pUCm-Tvector/pSK上。酶切，PCR及测序鉴定其正确性。DNA片段回收采用玻璃粉法，质粒抽提采用碱法，大肠杆菌转化采用氯化钙法。具体步骤参照《分子克隆》。DNA序列测定表明：PCR产物的DNA序列与序列表<210>1所示的1-1893bp完全相同。(见图1.)

表1.RT-PCR的引物序列

M3：为1+2片段的下游(3′末端)引物；M5：为2+3片段的上游(5′末端)引物。

Primer1：5′-GGAATTCGGTCCTTGATTCTCAAGTGC-3′(序列表<210>3)

Primer2：5′-CCTTGGTGATCAGATTGCTG-3′ (序列表<210>4)

Primer3：5′-CAGCAATCTTATCACCAAGG-3′ (序列表<210>5)

Primer4：5′-CACGACACAGTGTCCTGTAAG-3′ (序列表<210>6)

Primer5：5′-CTTCAGGATCCTGTCCATAATC-3′ (序列表<210>7)

Primer6：5′-GACTGTGGACAGGATCCTGAAG-3′ (序列表<210>8)

Primer7：5′-CTTACAGCACCCTGTGTCGTG-3′ (序列表<210>9)

Primer8：5′-GGGGTACCCTATGTCCTCACTTCTAGGG-3′(序列表<210>10)

1.原技术路线是：分别获得hPLD2羧基端的三个片段，然后连接1+2，2+3片段或直接用PCR扩增获得1+2，2+3片段。最后用SmaI切除1+2片段和2+3片段的共有序列。

但通过原技术路线无法将SmaI切点处连接。分析其原因可能是由于2号片段本身的酶切位点SmaI是平头连接，连接效率不高。所以无法将1+2和2+3片段的克隆连接成全长。为此，改变技术路线如下：

在hPLD2原序列的第1991bp(第二片段的第466个碱基)处进行了一个点突变：使A突变为G。即，在1+2片段的3’端引物和2+3片段的5’端引物均引入BamH I限制性酶切位点。因为BamH I是粘头连接，其连接效率高。为此，重新合成全长片段的中间引物：PLDm3(上游片段的3’末端引物)和PLDm5(下游片段的5’末端引物)。

2.改变后的技术路线详请见说明书附图5。

实施例2：人重组磷脂酶D2表达载体的构建

PCR产物采用基因内引物PCR扩增和基因内限制性内切酶酶切方法进行分析鉴定正确后，克隆到载体pUCm-Tvector/pSK上。分别采用酶切、PCR及测序鉴定其正确性。继而获得了不含膜结合部位及信号肽的，可编码631个氨基酸的PLD2 cDNA序列。

将rhPLD2的DNA全长片段克隆至原核表达载体pET30a(+)和真核表达载体COS-7中，构建出能表达出带有6×His纯化标记的pET30a-rhPLD2的融合蛋白的原核表达载体系统及COS-7的表达质粒载体pCI-rhPLD2。

实施例3：人重组磷脂酶D2的体外表达、分离和纯化

构建的不含信号肽及氨基端的rhPLD2的E.coli工程菌株的表达载体，在细菌细胞的包涵体中成功获得了膜蛋白的表达产物：rhPLD2的变构蛋白质。所获重组蛋白经分离、纯化，SDS-PAGE，Western Blot鉴定其分子量和纯度。并采用BCA Protein Assay Reagent Kit测定其蛋白含量。同时，参照Amplex Red Phospholipase D Assay Kit提供的Protocol进行人重组磷脂酶D2蛋白质的活性测定。

将低温保存的E.coli BL21-Condonplus(DE3)-RP pET30a-rhPLD2工程菌接种于LB固体培养基中(含卡那霉素浓度为15mg/L)，37℃过夜，挑取单个菌落接种于2mL LB液体培养基中(含卡那霉素浓度为15mg/L)，37℃，270r/min培养12-16h。再以1∶100(体积比)接种率接种于250mL LB液体培养基中(含卡那霉素浓度为15mg/L)，37℃，200r/min培养12-16hr，过夜。次日，利用15升发酵系统进行10L发酵。发酵条件：PH：8.0；转速：500rpm.温度：37℃，气流速度：10L/M，压力：3.0PSIG；当培养至A_600nm0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，继续培养到A_600nm1.50(总培养时间6小时)。收集发酵菌液，4,000rpm×20min，4℃离心，收集菌体沉淀，用PBS(PH：7.4)悬浮，菌液浓度为：10¹³-10¹⁵个/mL。控制循环水-4℃，在冰浴条件下，用超声匀浆机破壁，9,000rpm×20min，4℃离心，收集包涵体沉淀。往包涵体沉淀中加入少量Buffer B(Tris 20mM，Nacl 0.5M，EDTA 1mM，Tween 20 0.5％)，用匀浆器輾磨成乳状，9,000rpm×20min，4℃离心，收集包涵体沉淀，按1.5∶1000比例加入Denaturing Buffer(Tris 10mM，Urea 8M，βme 10mM)，充分混匀，4℃过夜。将变性蛋白液倒入滴瓶中，并将其缓慢滴加至Renaturing Buffer(Tris 10mM，Nacl 150mM，GSH 0.1Mm，Tween 20 0.05％)中，在4℃搅拌过夜以复性，直至溶液混浊即为蛋白的饱和状态。5,000rpm×20min，4℃离心，收集上清待进一步纯化。重复多次，直至离心后几乎看不到沉淀为止。收集复性上清，进行蛋白分离的初步鉴定，宿主菌包涵体中有71.6kD的外源蛋白表达(图2.)。其氨基酸序列见序列表<210>2.薄层扫描显示，蛋白表达量占菌体总蛋白的68-72％。用含去污剂的缓冲液洗涤菌体裂解液，离心获得的沉淀，除去一部分杂蛋白，收获的包涵体经SDS-PAGE和辉度扫描分析，rhPLD2的纯度达76％。

实施例4：人重组磷脂酶D2蛋白的鉴定及活性分析

复性上清上Ni²⁺亲和层析胶，Elute Buffer(250mM咪唑、2mol/L Nacl、80mmol/LTis-HCl PH7.9)特异性洗脱。洗脱液再经浓缩、透析。所获重组蛋白经SDS-PAGE鉴定分子量和纯度。收集的目的蛋白用6X His monoclonal Antibody Albumin Free和PLD(Carboxy terminus)goatPolyclonal IgG进行Western鉴定。蛋白含量测定采用BCA Protein Assay Reagent Kit。人重组磷脂酶D2蛋白质的纯化与鉴定的基本流程详请见说明书附图6。

经与提取的天然膜蛋白及纯化的PLD标准(Sigma)比较，rhPLD2具有较好的生物活性。1mg的rhPLD2的活性大约相当于65mu PLD。其生物学活性有效范围约在0.5μg/ml-150mg/ml。最佳范围：0.5μg/ml-150μg/ml。

将蛋白质产品rhPLD2进行动物过敏实验和毒性实验。表明：经腹腔注射浓度为0.4537-1.815mg/mL的rhPLD2，对动物无致敏及任何毒性作用。

实施例5：人重组磷脂酶D2蛋白的应用研究

人磷脂酶D(Phospholipase D PLD)的活化作用与许多重要的细胞功能和细胞命运密切相关，包括吞噬活性、呼吸爆发、有丝分裂、和调节分泌作用。其中，很多功能在疾病状态，包括炎症和肿瘤中具有重要作用。所以研究rhPLD2的免疫学功能将为今后的临床应用提供重要的理论依据。

详见(二)rhPLD2的作用机理和功效

(二)rhPLD2的作用机理和功效

1、rhPLD2的抗哮喘功能

1)rhPLD2降低豚鼠慢性哮喘模型血标本、支气管肺泡灌洗液中的嗜酸性粒细胞水平给豚鼠慢性哮喘模型腹腔注射rhPLD2 1.5mg/kg、3mg/kg、6mg/kg后，分别于豚鼠致敏前3～4天、哮喘诱发成功后9～12小时、第3次干预后6小时、9～12小时以及18～24小时取血各1ml进行Eos计数。结果显示：rhPLD2在浓度为3.0mg/kg以上时可减少豚鼠慢性哮喘模型血液中的Eos的水平。但支气管肺泡灌洗液中的Eos计数结果表明：rhPLD2在浓度为1.2mg/kg-10mg/kg时具有抑制Eos在肺部的浸润能力。最佳有效浓度为6mg/kg rhPLD2。

2)rhPLD₂降低豚鼠慢性哮喘状态时血液中PAF的含量

使用血小板聚集法研究rhPLD₂对豚鼠慢性哮喘状态时血液中PAF的影响。发现：①腹腔注射rhPLD2 3.0mg/kg组和rhPLD2 6.0mg/kg组均可减少豚鼠慢性哮喘状态时血液中PAF的含量(与NS组想比较p值均小于0.01)；但该两组之间无明显差异(p＝0.593)。说明：腹腔注射rhPLD2 3.0mg/kg以上的剂量可降低PAF在血液中的含量，但作用强度并不随着剂量的加大而加强。

3)rhPLD₂干预下豚鼠肺组织IL-5基因的表达受到抑制

为研究豚鼠慢性哮喘状态IL-5的基因表达与rhPLD₂关系，提取各药物干预组肺组织的总RNA，行半定量RT-PCR。获得目的基因(IL-5)和相对应的看家基因(β-actin)PCR产物，在1.5％琼脂糖凝胶上观察电泳条带。用凝胶图象对获取的扩增条带的荧光强度值进行成像分析，即进行mRNA半定量分析。结果显示：腹腔注射高浓度(2.0mg/kg-6mg/kg)的rhPLD2可抑制IL-5在慢性哮喘豚鼠肺组织的表达。

4)rhPLD₂对豚鼠慢性哮喘状态时支气管肺泡灌洗液MMP-9蛋白表达的影响

使用ELISA法检测rhPLD₂对豚鼠慢性哮喘状态时支气管肺泡灌洗液MMP-9的表达。发现腹腔注射rhPLD2 2.0mg/kg以上可抑制MMP-9在肺组织的表达。

5)rhPLD₂降低慢性哮喘豚鼠血清中GPI-PLD的酶活性

通过TX-114分相法检测血清中GPI-PLD酶活性，我们分别检测了rhPLD2、地塞米松、生理盐水干预哮喘豚鼠后血清GPI-PLD酶活性的变化以及哮喘前后、各干预组作用后不同时间段(干预后6h、12h、18h)酶活性的变化。并且用3个不同剂量的rhPLD2干预哮喘豚鼠，观察不同剂量rhPLD2对哮喘豚鼠血清中GPI-PLD酶活性的影响。

实验表明，各干预组哮喘前后血清GPI-PLD酶活性均有显著性变化。各干预组哮喘前后GPI-PLD酶活性配对t检验，其p值介于0.001至0.027之间，说明GPI-PLD可能在哮喘发病过程中有一定的意义。

哮喘后用不同干预因素干预，发现地塞米松及rhPLD2组均可使血清中GPI-PLD的酶活性显著降低，并以地塞米松组最为明显，下降至哮喘状态的39.4％，而rhPLD2约可降至50.7％；与哮喘状态时豚鼠血清GPI-PLD水平比较，二者P值均小于0.01。而生理盐水干预组干预前后没有显著差异(P＝0.249)，说明rhPLD2对豚鼠血清中的GPI-PLD活性有一定的下调作用。通过对三个时间点(6h、12h、18h)的GPI-PLD酶活性的检测，发现rhPLD2对GPI-PLD活性的下调作用未随时间变化而有显著性改变，而1.5mg/kg rhPLD2干预组及3.0mg/kg rhPLD2干预组在干预后18h后对血清GPI-PLD的调节作用已不明显(P值分别为0.113及0.055)。提示rhPLD2对GPI-PLD活性的调节具有剂量依赖性，随着所用剂量的增高，其对血清中GPI-PLD调节作用愈持久。

6)rhPLD2对豚鼠慢性哮喘状态时肺组织核转录因子P65活性的影响

通过试剂盒检测的原理(通过提取物中的核转录因子与包被在酶标板上的特异性寡核苷酸结合来检测其活性)，按下面的公式检测豚鼠肺组织核转录因子P65活性：

Oda＝Odt-Odc

不同处理组豚鼠肺组织核转录因子P65活性见表4及图6，实验表明：哮喘豚鼠肺组织P65活性显著升高(p值小于0.001)，用rhPLD2及DXM干预后，P65的转录活性显著降低，但两者之间的疗效无差别(p＝0.736)。实验结果发现哮喘后NS组其肺组织P65活性亦显著低于哮喘状态组(p＜0.01)，但其降低水平有限(哮喘状态组OD值(x±SD)为0.87500±0.096670，生理盐水治疗组为0.72863±0.090955，而正常豚鼠其肺组织P65活性为0.36213±0.066714)。rhPLD2及DXM组与生理盐水组比较，发现前二者疗效显著优于生理盐水组(两者p值均小于0.001)，提示生理盐水组P65活性的降低乃是由于哮喘豚鼠有自然缓解；而rhPLD2及DXM对哮喘豚鼠肺组织核转录因子P65的表达水平有明显的抑制作用。

总之：

1)rhPLD2对豚鼠无致敏作用；2mg/ml的rhPLD2 0.5ml对体重为20g的小白鼠无急性毒性作用。

2)rhPLD2可抑制豚鼠慢性哮喘的Eos浸润、血液中PAF的含量、血清中GPI-PLD水平、肺组织IL-5 mRNA的表达和核转录因子P65的活性、支气管肺泡灌洗液中MMP-9的蛋白含量。

3)rhPLD2可抑制豚鼠慢性哮喘模型相关炎症介质的释放。

2、rhPLD2的抗中枢炎症的功能

1)rhPLD2下调小胶质细胞(N9细胞)IL-1β、TNF-α基因的表达和蛋白水平

小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)的单核-吞噬细胞，具有重要的免疫监视和免疫防御功能。当CNS发生炎症时，小胶质细胞最先出现应激反应，由静止状态转变为活化状态，参与炎症反应。为研究小胶质细胞炎症因子的表达与rhPLD₂关系，采用LPS刺激N9细胞，并按前述方案干预细胞，提取各组不同时间点的总RNA，对IL-1β和TNF-α进行半定量RT-PCR。获得目的基因和相对应的看家基因PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上的电泳条带。

对凝胶图象进行半定量分析，发现rhPLD₂可显著抑制活化的N9细胞表达IL-1β和TNF-α。①在各时间点，10μg/ml-120μg/ml的rhPLD₂均可抑制IL-1β的表达(与生理盐水组比较p＜0.05)。其作用在4小时点显著不同于24小时(p＝0.047)，但其余各组之间未表现出差异。

2)rhPLD2下调小胶质细胞(N9细胞)IL-1β、TNF-α蛋白的水平

ELISA法检测各组N9细胞IL-1β、TNF-α的蛋白表达量，我们发现rhPLD₂可抑制IL-1β和TNF-α蛋白的表达。①除24h时间点，3μg/3ml LPS组与33μg/3ml PLD+0.4μg/3ml anti-PLD实验组无明显统计学差异外(p＝0.062)，余各组均与相对应阳性组差异显著。②在1h时间点，rhPLD₂对目的蛋白的抑制能力与浓度正相关。在4h时间点，rhPLD₂对目的蛋白的抑制能力加强。

综上所述：

1)rhPLD2可在mRNA水平抑制活化的小鼠小胶质细胞表达IL-1β和TNF-α。

2)rhPLD2可在蛋白水平抑制活化的小鼠小胶质细胞表达IL-1β和TNF-α。

3)rhPLD2对活化的小鼠小胶质细胞表达IL-1β和TNF-α的抑制呈一定的浓度依赖性和时间相关性。

在mRNA水平和蛋白水平，rhPLD2均可抑制活化的小鼠小胶质细胞表达IL-1β、TNF-α，这为中枢性炎症的防治提供了新的思路。

3、rhPLD2的诱导白血病细胞HL-60凋亡的功能

细胞增殖抑制实验：观察不同浓度的rhPLD2单用或者合用喜树碱对HL-60细胞增殖的影响，并利用该实验筛选出rhPLD2作用于HL-60细胞的最佳浓度梯度。实验分组：①rhPLD2组(通过预实验观察rhPLD2对HL-60细胞增殖的影响，筛选出五个合适的浓度梯度)，每个剂量三复孔。②喜树碱阳性对照组，按照文献及预实验的结果，筛选出一个最佳的喜树碱作用浓度作为阳性对照(作用于HL-60细胞48小时后对细胞的增殖抑制率大约为50％)，三复孔。③标准PLD组，浓度为250U/ml，三复孔。④rhPLD2(五个浓度梯度同前)及标准PLD(250U/ml)与喜树碱联合作用组。⑤阴性对照组，细胞的接种密度与各处理组相同，但细胞不经任何处理因素干预。HL-60细胞在上述干预因素处理后，于不同的时点(24h，48h，72h)观察各处理因素对HL-60细胞生长的影响。

实验的结果表明：rhPLD2对HL-60的生长具有明显的抑制作用。当rhPLD2的浓度在80ug/ml以上时，对HL-60细胞的生长表现出极大的抑制作用。与对照组比较，P＜0.01。

Hoechst 33258及PI双染法能对这一现象进行定性(区分凋亡与坏死)。

序列表

<110>福建医科大学朱玲

<120>人重组磷脂酶D2及其编码序列

<140>2005100191724

<141>2005-7-25

<160>10

<210>1

<211>1893

<212>DNA

<213>人B细胞骨髓瘤(Daudi细胞株)

<400>1

1 caagagatca ctgagctggc gcagggccca ggcagagact tcctacagct gcaccggcat

61 gacagctacg ccccaccccg gcctgggacc ttggcccggt ggtttgtgaa tggggcaggt

121 tactttgctg ctgtggcaga tgccatcctt cgagctcaag aggagatttt catcacagac

181 tggtggttga gtcctgaggt ttacctgaag cgtccggccc attcagatga ctggagactg

241 gacattatgc tcaaraggaa ggcggaggag ggtgtccgtg tgtctattct gctgtttaaa

301 gaagtggaat tggccttggg catcaacagt ggctatagca agagggcgct gatgctgctg

361 caccccaaca taaaggtgat gcgtcaccca gaccaagtga cgttgtgggc ccatcatgag

421 aagctcctgg tggtggacca agtggtagca ttcctggggg gactggacct tgcctatggc

481 cgctgggatg acctgcacta ccgactgact gaccttggag actcctctga atcagctgcc

541 ttccagcctc ccaccccgcg cccagactca ccagccaccc cagacctctc tcacaaccaa

601 ttcttctggc tgggcaagga ctacagcaat cttatcacca aggactgggt gcagctggac

661 cggcctttcg aagatttcat tgacagggag acgacccctc ggatgccatg gcgggacgtt

721 ggggtggtcg tccatggcct accggcccgg gaccttaccc ggcacttcat ccagcgctgg

781 aacttcacca agaccaccaa ggccaagtac aagactccca cataccccta cctgcttccc

841 aagtctacca gcacggccaa tcagctcccc ttcacacttc caggagggca gtgcaccacc

901 gtacaggtct tgcgatcagt ggaccgctgg tcagcaggga ctctggagaa ctccatcctc

961 aatgcctacc tgcacaccat cagggagagc cagcacttcc tctacattga gaatcagttc

1021 ttcattagct gctcagatgg gcggacggtt ctgaacaagg tgggcgatga gattgtggac

1081 agaatcctga aggcccacaa acaggggtgg agttaccgag tctacgtgct tttgccctta

1141 ctccctggct tcgagggtga catctccacg ggcggtggca actccatcca ggccattctg

1201 cactttactt acaggaccct gtgtcgtggg gagtattcaa tcctgcatcg ccttaaagca

1261 gccatgggga cagcatggcg ggactatatt tccatctgcg ggcttcgtac acacggagag

1321 ctgggcgagc accccgtctc ggagctcatc tacatccaca gcaaggtgct catcgcagat

1381 gaccggacag tcatcattgg ttctgcaaac atcaatgacc ggagcttgct ggggaagcgg

1441 gacagtgagt tggccgtgct ggtcgaggac acagagacgg aaccatccct catgaatggg

1501 gcagagtatc aggcgggcag gtttgccttg agtctgcgga agcactgctt cagtgtgatt

1561 cttggagcaa atacccggcc agacttggat ctccgagacc ccatctgtga tgacttcttc

1621 cagttgtggc aagacatggc tgagagcaac gccaatatct atgagcagat cttccgctgc

1681 ctgccatcca atgccacgcg ttccctgcgg actctccggg agtacgtggc cgtggagccc

1741 ttggccacgg tcagtccccc cttggctcgg tctgagctca cccaggtcca gggccacctg

1801 gtccacttcc ccctcaagtt cctagaggat gagtctttgc tgcccccgct gggtagcaag

1861 gagggcatga tccccccaga agtgtggaca tag

<210>2

<211>631

<212>PRT

<213>人B细胞骨髓瘤(Daudi细胞株)

<400>2

1 Glu Ile Thr Glu Leu Ala Gln Gly Pro Gly Arg Asp Phe Leu Gln Leu

17 His Arg His Asp Ser Tyr Ala Pro Pro Arg Pro Gly Thr Leu Ala Arg

33 Trp phe Val Asn Gly Ala Gly Tyr Phe Ala Ala Val Ala Asp Ala Ile

49 Leu Arg Ala Gln Glu Glu Ile Phe Ile Thr Asp Trp Trp Leu Ser Pro

65 Glu Val Tyr Leu Lys Arg Pro Ala His Ser Asp Asp Trp Arg Leu Asp

81 Ile Met Leu Lys Arg Lys Ala Glu Glu Gly Val Arg Val Ser Ile Leu

97 Leu Phe Lys Glu Val Glu Leu Ala Leu Gly Ile Asn Ser Gly Tyr Ser

113 Lys Arg Ala Leu Met Leu Leu His Pro Asn Ile Lys Val Met Arg His

129 Pro Asp Gln Val Thr Leu Trp Ala His His Glu Lys Leu Leu Val Val

145 Asp Gln Val Val Ala Phe Leu Gly Gly Leu Asp Leu Ala Tyr Gly Arg

161 Trp Asp Asp Leu His Tyr Arg Leu Thr Asp Leu Gly Asp Ser Ser Glu

177 Ser Ala Ala Phe Gln Pro Pro Thr Pro Arg Pro Asp Ser Pro Ala Thr

193 Pro Asp Leu Ser His Asn Gln Phe Phe Trp Leu Gly Lys Asp Tyr Ser

209 Asn Leu Ile Thr Lys Asp Trp Val Gln Leu Asp Arg Pro Phe Glu Asp

225 Phe Ile Asp Arg Glu Thr Thr Pro Arg Met Pro Trp Arg Asp Val Gly

241 Val Val Val His Gly Leu Pro Ala Arg Asp Leu Thr Arg His Phe Ile

257 Gln Arg Trp Asn Phe Thr Lys Thr Thr Lys Ala Lys Tyr Lys Thr Pro

273 Thr Tyr Pro Tyr Leu Leu Pro Lys Ser Thr Ser Thr Ala Asn Gln Leu

289 Pro Phe Thr Leu Pro Gly Gly Gln Cys Thr Thr Val Gln Val Leu Arg

305 Ser Val Asp Arg Trp Ser Ala Gly Thr Leu Glu Asn Ser Ile Leu Asn

321 Ala Tyr Leu His Thr Ile Arg Glu Ser Gln His Phe Leu Tyr Ile Glu

337 Asn Gln Phe Phe Ile Se Cys Ser Asp Gly Arg Thr Val Leu Asn Lys

353 Val Gly Asp Glu Ile Val Asp Arg Ile Leu Lys Ala His Lys Gln Gly

369 Trp Ser Tyr Arg Val Tyr Val Leu Leu Pro Leu Leu Pro Gly Phe Glu

385 Gly Asp Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Ser Ile Gln Ala Ile Leu His

401 Phe Thr Tyr Arg Thr Leu Cys Arg Gly Glu Tyr Ser Ile Leu His Arg

417 Leu Lys Ala Ala Met Gly Thr Ala Trp Arg Asp Tyr Ile Ser Ile Cys

433 Gly Gle Arg Thr His Gly Glu Leu Gly Glu His Pro Val Ser Glu Leu

449 Ile Tyr Ile His Ser Lys Val Leu Ile Ala Asp Asp Arg Thr Val Ile

465 Ile Gly Ser Ala Asn Ile Asn Asp Arg Ser Leu Leu Gly Lys Arg Asp

481 Ser Glu Leu Ala Val Leu Val Glu Asp Thr Glu Thr Glu Pro Ser Leu

497 Met Asn Gly Ala Glu Tyr Gln Ala Gly Arg Phe Ala Leu Ser Leu Arg

513 Lys His Cys Phe Ser Val Ile Leu Gly Ala Asn Thr Arg Pro Asp Leu

529 Asp Leu Arg Asp Pro Ile Cys Asp Asp Phe Phe Gln Leu Trp Gln Asp

545 Met Ala Glu Ser Asn Ala Asn Ile Tyr Glu Gln Ile Phe Arg Cys Leu

561 Pro Ser Asn Ala Thr Arg Ser Leu Arg Thr Leu Arg Glu Tyr Val Ala

577 Val Glu Pro Leu Ala Thr Val Ser Pro Pro Leu Ala Arg Ser Glu Leu

593 Thr Gln Val Gln Gly His Leu Val His Phe Pro Leu Lys Phe Leu Glu

609 Asp Glu Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Ser Lys Glu Gly Met Ile Pro

625 Pro Glu Val Trp Thr ***

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

GGAATTCGGTCCTTGATTCTCAAGTGC

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

CCTTGGTGATCAGATTGCTG

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

CAGCAATCTTATCACCAAGG

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

CACGACACAGTGTCCTGTAAG

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

CTTCAGGATCCTGTCCATAATC

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

GACTGTGGACAGGATCCTGAAG

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

CTTACAGCACCCTGTGTCGTG

<210>10

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

GGGGTACCCTATGTCCTCACTTCTAGGG

Claims

1.一种新的人重组磷脂酶D2(rhPLD2)多肽，它包含：具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变体、生物活性片段、类似物或衍生物。

2.能编码该多肽的多核苷酸，它包含选自下组的一种核苷酸序列或其变体：

(a)编码具有序列表<210>2氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸；(c)与(a)或(b)的多核苷酸序列具有至少88％相同性的多核苷酸；更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有序列表<210>1中414-504位的序列；和(b)具有序列表<210>1中615-789位的序列；和(c)具有序列表<210>1中912-1407位的序列；和(d)具有序列表<210>1中1353-1455位的序列。

3.如权利要求1或2所述的多核苷酸的变异体，其编码与该有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片断、类似物和衍生物；此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体；这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体；如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

4.一种新的多肽一人重组磷脂酶D2，其基本上是由序列表<210>2所示的氨基酸序列组成的；该多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生；根据重组生产方案所用的宿主，该的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的；该多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

5.含有编码人重组磷脂酶D2的多核苷酸的重组载体，特别是表达载体；含有编码人重组磷脂酶D2的多核苷酸的基因工程化宿主细胞；该中，编码人重组磷脂酶D2的多核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有该所述多核苷酸的重组载体；包括本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体；人重组磷脂酶D2的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该多核苷酸或重组载体的基因工程化宿主细胞；术语“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞；代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。

6.权利要求1、2、4或5所述的人重组磷脂酶D2的生产方法，用该所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行；当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知；可供选择的是用MgCl₂；如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行；当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，或者常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等；通过常规的重组DNA技术，利用该的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的人重组磷脂酶D2；一般来说有以下步骤：

(1)用该的编码人重组磷脂酶D2的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质；在步骤(2)中，根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基；在适于宿主细胞生长的条件下进行培养；当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间；

在步骤(3)中，重组多肽可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外；如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白；这些方法是本领域技术人员所熟知的；这些方法包括但并不限于：常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

7.一种人重组磷脂酶D2的抗体，及涉及一种能与该多肽特异性结合的抗体。

8.一种人重组磷脂酶D2的多肽或多核苷酸在制备抗炎、抗哮喘、抗肿瘤等药物中的应用。

9.一种人重组磷脂酶D2，其特征在于：1mg的rhPLD2的活性大约相当于65mu PLD；其生物学活性有效范围约在0.5μg/ml-150mg/ml；最佳范围：0.5μg/ml-150μg/ml；人重组磷脂酶D2的多肽以及该多肽的拮抗剂、激动剂和抑制剂可直接用于疾病治疗，例如，可治疗恶性肿瘤、各类炎症、哮喘等；包括将该的多肽、多核苷酸及其模拟物、激动剂、拮抗剂和抑制剂与合适的药物载体组合后使用；这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合；组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。

10.含有一种或多种容器的药盒或试剂盒，其特征在于：容器中装有一种或多种该的药用组合物成分；与这些容器一起，可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用；此外，该的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用；药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、雾化、鼻内或皮内的给药途径；人重组磷脂酶D2以有效地治疗或预防具体的适应症的量来给药；其中所述的药物为雾化剂、片剂、胶囊或混悬剂。