CN1961027A - 新的水溶性富勒烯、其生产方法和含有该富勒烯的活性氧发生器 - Google Patents

新的水溶性富勒烯、其生产方法和含有该富勒烯的活性氧发生器 Download PDF

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Abstract

可以通过使水溶性聚合物与分子上带有官能基的富勒烯通过该官能基偶联而获得结合的水溶性聚合物的数量已经得到调节的水溶性富勒烯。这种水溶性富勒烯可以通过将其用作活性氧发生器而用于癌症的光动力疗法或超声疗法。

Description

新的水溶性富勒烯、其生产方法和 含有该富勒烯的活性氧发生器
技术领域
本发明涉及新的水溶性富勒烯、其生产方法和含有该富勒烯的活性氧发生器。更具体的说，本发明涉及通过使水溶性聚合物与在分子中带有官能基的富勒烯通过该官能基连接而获得新的水溶性富勒烯、其生产方法和含有该富勒烯的活性氧发生器。
背景技术
活性氧，诸如单线态氧或超氧负离子可以通过可见光等照射各种活性氧发生器，诸如富勒烯类和卟啉衍生物而产生。这种活性氧为高度反应性的并且表现出细胞毒性，诸如裂解细胞中的DNA，抑制细胞生长，抑制蛋白水解酶活性，且由此，例如可预计它对各种疾病的作用，诸如癌、病毒感染、胞内寄生虫感染、肺纤维化、肝硬化、慢性肾炎、动脉硬化、糖尿病性视网膜病、老年性黄斑变性和血管收缩损害。
就作为活性氧发生器之一的富勒烯而言，已知存在诸如纯碳物质这类化合物，诸如C60和C70，这取决于n的数量和含有金属或金属氧化物的碳群(非专利对比文件1)。由于富勒烯自身为水不溶性的，所以难以将其给药入活体。同时，大分子物质更易于迁移并且与在正常组织中相比因组织结构差异而趋向于在癌组织中停留延长的时间(非专利对比文件2)。由于这些原因，已经研究了将各种水溶性聚合物与富勒烯连接以便获得水溶性以及特别迁移至癌组织并且保留在那里和由此缓解因活性氧对正常组织的细胞毒性而产生的副作用的特性。就这类水溶性聚合物而言，已经提示了聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖、支链淀粉、淀粉和这些聚合物的衍生物(非专利对比文件3，专利对比文件1)。
此外，已知与富勒烯连接的取代基的数量确实对产生的活性氧的量起显著作用(非专利对比文件4)。
在癌组织中蓄积的光增敏剂因光照射而产生具有高度反应性的单线态氧并且仅选择性破坏其周围的癌组织。这类合并光增敏剂与光照射的癌症疗法称作光动力疗法。作为用于这种光动力疗法的光增敏剂，已知与在一端上带有甲基，而在另一端上带有氨基的多个聚乙二醇直接连接的富勒烯(专利对比文件1)。
此外，当用超声波照射液体时，液体中产生气泡(空泡形成)，并且在这些气泡塌陷时，在局部产生热量和压力。这就会产生基团(·OH等)，并且在它们重新组合或从激发态转换成基态时，这些基团主要发射波长在300-600nm范围的光。这种现象称作声致发光(非专利对比文件5)。已知用于超声间动电流(Sonodynamic)疗法的活性氧发生器含有使用它与在一端上带有甲基，而在另一端上带有氨基的多个聚乙二醇直接连接的富勒烯(专利对比文件2)。
专利对比文件1：JP-A-9-235235
专利对比文件2：JP-A-2002-241307
非专利对比文件1：Kagaku(Chemistry)，50(6)，1995
非专利对比文件2：Matsumura等，Gan-Kagakuryohou(JapaneseJournal of Cancer and Chemotherapy)，Vol.14，No.3，p821-829，1987
非专利对比文件3：BIOINDUSTRY，Vol.14，No.7，p30-37，1997
非专利对比文件4：Toxicology in vitro，Vol.16，p41-46，2002
非专利对比文件5：Science，Vol.247，p1439-1445，1990
本发明的公开内容
尽管已经获得了如上所述与诸如聚乙二醇这类多个水溶性聚合物连接的富勒烯类，但是所连接的聚乙二醇的数量并不恒定。即所连接的水溶性聚合物的数量不能得到控制并且由此在产生的活性氧的量方面发生变化，这取决于结合的数量，并且在应用于医疗应用时产品的标准化是困难的。
本发明的一个目的在于提供在所连接的水溶性聚合物的数量方面受到控制的水溶性富勒烯，即与修饰分子的数量受控制的水溶性聚合物连接的水溶性富勒烯。除此之外，本发明的另一个目的还在于提供生产这类水溶性富勒烯的方法和含有它的活性氧发生器。
本发明涉及水溶性富勒烯，其中该富勒烯在其分子上带有官能基并且通过该官能基连接水溶性聚合物。
此外，本发明涉及生产水溶性富勒烯的方法，其特征在于使水溶性聚合物与在分子上带有官能基的富勒烯的官能基反应。
此外，本发明涉及含有上述水溶性富勒烯或通过上述生产方法生产的水溶性富勒烯的活性氧发生器。
本发明可以获得在连接的水溶性聚合物的数量方面受到控制的水溶性富勒烯。当用光照射本发明的水溶性富勒烯时，产生从220nm-可见光区(380-780nm)范围的宽波长的O2 -(超氧负离子)。特别地，它在260-450nm波长范围内表现出高O2 -产生能力并且由此可以应用于癌症的光动力疗法。此外，由于因超声照射导致的声致发光而产生的光主要具有300-600nm范围的波长，所以本发明的水溶性富勒烯产生由它产生的O2 -。本发明的水溶性富勒烯适合于光动力疗法。
附图简述
附图1表示通过使实施例1中获得的一种分子PEG-连接的富勒烯进行高效液相色谱而测定分子量的结果；
附图2表示通过使按照JP-A-9-235235的实施例1中所述方法合成的富勒烯-水溶性聚合物共轭物进行高效液相色谱而测定分子量的结果；
附图3表示通过光散射法测定实施例1和实施例2中获得的本发明水溶性富勒烯类的粒子直径的结果；
附图4表示通过对实施例2中获得的本发明水溶性富勒烯进行光照射产生的活性氧的量的测定结果；
附图5表示通过对实施例2中获得的本发明水溶性富勒烯进行光照射测定体外癌细胞生长抑制活性的结果；
附图6表示通过对实施例1中获得的本发明水溶性富勒烯进行光照射测定体内抗癌活性的结果；
附图7表示通过对实施例2中获得的本发明水溶性富勒烯进行超声照射测定活性氧丰度的结果；和
附图8表示通过对实施例1中获得的本发明水溶性富勒烯进行超声照射测定体外癌细胞生长抑制活性的结果。
本发明的最佳实施方式
本发明的水溶性富勒烯的特征在于水溶性聚合物与在其分子上带有官能基的富勒烯通过该官能基连接。
对用于本发明的富勒烯的类型没有特别地限定并且产生活性氧的任意类型的富勒烯均可以使用。特别可以使用：C60富勒烯，它是一种带有60个碳原子的纯碳；C70富勒烯，即为纯碳物质的纳米管富勒烯类；各种高级富勒烯类。这些不同的富勒烯类为商购的，并且例如可以获自Honjo Chemical Co.，Ltd.；Mitsubishi Corporation，TokyoKasei Kogyo Co.，Ltd.等(产品名：C60富勒烯、C70富勒烯、多壁纳米管、单壁纳米管等)。从供给和易于操作的观点来看，尤其优选使用C60富勒烯。
与富勒烯连接的官能基的实例包括羧基、氨基、羟基、氰基和硫氢基。结合的数量优选为1-5并且更优选1。特别优选在分子上带有一个羧基的富勒烯。这类在分子上带有一个羧基的富勒烯可商购，并且例如可以获自诸如Science Laboratories Co.，Ltd.这类试剂公司。此外，它可以通过对比文件“Tetrahedron Letters vol.36，No.38，p.6,843,1995”中所述的方法合成。
对用于本发明的水溶性聚合物没有特别地限定，但可以使用具有1,000-1,000,000,优选4,000-50,000分子量的那些水溶性聚合物。
对用于本发明的水溶性聚合物没有特别地限定，并且可以使用各种商购的水溶性聚合物。尤其是可以使用：非离子水溶性合成聚合物，诸如聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；葡聚糖；支链淀粉；离子或非离子多糖类，诸如淀粉、羟乙基化淀粉和羟丙基淀粉；其改性的物质；这些水溶性聚合物中的两种或三种组分的共聚物或复合物；透明质酸、脱乙酰壳多糖、甲壳质衍生物等。尤其可以优选使用具有通常用于富勒烯的溶剂、仅在分子末端上的参与与富勒烯的连接反应的官能基和单一化学结合类型的聚乙二醇。特别优选使用4,000-15,000的聚乙二醇。
作为用于本发明的水溶性聚合物，通常可以使用那些带有可以与富勒烯的官能基反应的反应基团的水溶性聚合物。反应基团的实例包括羧基、氨基、羟基、氰基和硫醇基。尤其优选具有脱水缩合反应性的反应基团，诸如氨基、羟基，并且更优选氨基。在本文中，反应基团可以通过C1-C6烷基与水溶性聚合物连接。这类反应基团可以位于水溶性聚合物分子中的任意位置上，只要该位置适合于连接富勒烯，而在考虑连接便利性时优选位于水溶性聚合物的末端。当使用不带有这类反应基团的水溶性聚合物时，有必要在连接富勒烯前首先引入反应基团。
作为用于本发明的水溶性聚合物，优选那些在一端上带有非活性基团，而在另一端上带有反应基团的水溶性聚合物。非活性基团的实例包括C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、苄基和其它通常用作保护基的基团。当将聚乙二醇用作水溶性聚合物时，优选C1-C6烷基。C1-C6烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基，并且从可用性来看，优选甲基。
作为用于本发明的水溶性聚合物，优选在一端上带有非活性基团，而在另一端上带有反应基团的聚乙二醇，并且特别地，优选在一端上带有C1-C6烷基，而在另一端上带有氨基并且具有4000-15000分子量的聚乙二醇。另外优选在一端上带有非活性基团并且具有4000-15000分子量的聚乙二醇和带有可以与富勒烯的官能基反应的反应基团的化合物的复合物，并且特别优选在一端上带有C1-C6烷基，而在另一端上带有氨基并且具有4000-15000分子量的聚乙二醇与诸如天冬氨酸这类氨基酸的反应产物。
本发明的水溶性富勒烯仅必须具备能够对活体给药的水溶性。考虑到转移至组织，诸如癌并且在其中蓄积和转移至正常细胞的便利性来看，与水溶性聚合物连接的富勒烯优选形成聚集物并且该聚集物的大小优选在20-400nm左右并且更优选在30-200nm左右。形成这类聚集物所需的水溶性聚合物的分子量随所用水溶性聚合物的类型和它们连接富勒烯的数量的不同而改变。例如，就每个分子带有一个氨基的聚乙二醇而言，优选2,000-30,000的分子量，并且优选4,000-15,000的范围。
用于生产本发明水溶性富勒烯的方法的特征在于使水溶性聚合物与在分子上带有官能基的富勒烯的官能基反应。可以通过使用在分子上带有官能基的富勒烯控制所连接的水溶性聚合物的数量。例如，当使用在分子上带有一个官能基的富勒烯时，获得了带有一个水溶性聚合物的富勒烯，而当使用在分子上带有两个官能基的富勒烯时，获得了带有两个水溶性聚合物的富勒烯。例如，就在分子上带有羧基的富勒烯与在一端上带有C1-C6烷基，而在另一端上带有反应基团的水溶性聚合物进行缩合反应的情况而言，所用的在分子上带有羧基的富勒烯与在一端上带有C1-C6烷基，而在另一端上带有反应基团的水溶性聚合物之比在后者的约0.1-10mol：前者的1mol，优选后者的约2mol：前者的0.5mol，并且更优选后者的约1-1.1mol：前者的1mol。
反应的实例包括产生化学键的众所周知的反应，诸如缩合反应、加成反应、取代反应。例如，就缩合反应而言，当水溶性聚合物的反应基团为氨基时，该反应通过常规的肽缩合反应来进行。就肽缩合反应而言，与富勒烯连接的官能基为羧基，并且该反应在有脱水缩合试剂存在下进行。所述的脱水缩合试剂包括：碳二亚胺类，诸如二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、1-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺、鏻盐，诸如苯并三唑-1-基-三(二甲氨基)磷鎓六氟磷酸盐、二苯基磷酰基氮化物，并且优选为二异丙基碳二亚胺。所用脱水缩合试剂的量就富勒烯的羧基而言为0.5-10mol当量，并且优选其为1-2mol当量。该反应在有或没有加成试剂存在下进行，并且所述的加成试剂包括N-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基苯并三唑、4-硝基苯酚、五氟苯酚，并且优选其为1-羟基苯并三唑。所用的加成试剂的量就富勒烯的羧基而言为0.5-10mol当量，并且优选其为1-2mol当量。
有机溶剂用于该反应。对所述的有机溶剂没有特别地限定，只要反应能够进行，且其实例包括：芳族烃类，诸如苯、甲苯、二甲苯；卤代烃，诸如二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷、氯苯、溴苯、1，2-二氯苯；醚类，诸如乙醚、二异丙醚、四氢呋喃、二噁烷、二甲氧基乙烷、二甘醇二甲醚；腈类，诸如乙腈、丙腈；酰胺类，诸如二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、六甲基磷酸三酰胺；脲，诸如N，N-二甲基咪唑烷酮；和这些溶剂的混合溶剂，并且优选其为甲苯、氯苯、溴苯、1，2-二氯苯以及二噁烷与二氯甲烷的1∶1混合溶剂，并且更优选其为溴苯。反应温度在-20-100℃，优选0-50℃，且更优选室温-37℃，并且反应时间为1-72小时且优选3-24小时。优选在光屏蔽下进行该反应。可以分离获得的反应产物并且通过本身公知的分离方式，例如通过真空浓缩、溶剂提取、结晶、色谱、透析、冻干等进行纯化。
对水溶性聚合物没有特别地限定，并且可以使用上述各种商购的水溶性聚合物。在本文中，就水溶性聚合物而言，通常使用那些带有反应基团，诸如如上所述的氨基的水溶性聚合物以便能够使它与富勒烯连接。当使用不带有反应基团的水溶性聚合物时，必须在连接富勒烯前首先引入反应基团。例如，在带有羧基的水溶性聚合物中，通过使用N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺、碳二亚胺或氯碳酸乙酯进行羧基与氨基化合物的结合反应将氨基引入聚合物链。例如，为了将氨基引入聚乙二醇，将在一端上带有羧基的聚乙二醇溶于pH5.0的磷酸盐缓冲液(10％重量)，并且对一个羧基加入3-倍摩尔量的水溶性碳二亚胺，且在室温下通过进行搅拌1小时活化羧基。然后对一个羧基加入10-倍摩尔量的乙二胺并且使其在室温下反应6小时。可以通过将获得的反应液体对水透析而获得在一端上引入了氨基的聚乙二醇。一端为氨基丙基，而另一端为甲基的聚乙二醇，即CH3(OCH2CH2)nO(CH2)3NH2(n代表约90-300的整数)也购自Nippon Oil & Fats Co.，Ltd。
如上所述，所述的水溶性聚合物还可以为在一端上带有非活性基团的聚乙二醇，和带有与富勒烯的官能基反应的反应基团的化合物的复合物，并且带有与富勒烯的官能基反应的反应基团的化合物包括氨基酸，并且优选酸性氨基酸，诸如天冬氨酸和谷氨酸。例如，如下生产该复合物。使带有被保护氨基的酸性氨基酸与在一端上带有C1-C6烷基，而在另一端上带有被氨基取代的C1-C6烷基的聚乙二醇在有脱水缩合试剂存在下的有机溶剂中反应。反应条件可以与肽缩合反应(其中上述水溶性聚合物的反应基团为氨基且富勒烯的官能基为羧基)的情况相似。可以通过使所得的反应剂根据保护基进行反应基的脱保护反应获得水溶性聚合物，其为与在一端上带有C1-C6烷基的聚乙二醇连接的氨基酸衍生物。特别地，如下述实施例3中所示。
本发明的活性氧发生器含有如上所述获得的与水溶性聚合物连接的水溶性富勒烯，并且将其作为水溶性或含水溶剂的溶液使用。当用光照射这种水溶性富勒烯时，O2 -产生220nm-可见光区(380-780nm)范围的宽波长。特别地，它在260-450nm范围波长内表现出高O2 -产生能力。因此，它可以应用于通过光照射的癌症的光动力疗法。此外，由于因超声照射导致的声致发光而产生的光主要具有300-600nm范围的波长，所以本发明的活性氧发生器适合于超声间动电流疗法。
在本发明的活性氧发生器产生的活性氧中包括单线态氧(1O2)、超氧负离子(O2 -)、过氧化氢(H2O2)、羟基(·OH)。
本发明的水溶性富勒烯在含水溶剂中形成一定大小的聚集物。含水溶剂的实例包括水和水-乙腈。由于本发明的活性氧发生器为与水溶性聚合物连接的富勒烯，所以它具有足够的水溶性以便对活体给药，且此外，由于它形成一定大小的聚集物，所以推定它具有高的迁移至癌组织和炎症组织和在其中保留的特性。推定这种聚集物为保持连接的水溶性聚合物数量并且采取聚合物胶束结构的富勒烯聚集物。
由于本发明活性氧发生器中包含的富勒烯通过经超声照射导致的声致发光产生的光产生活性氧，诸如单线态氧或在含水溶剂中的超氧负离子而表现出细胞毒性，所以它可以由于治疗包括癌症的如下所述的各种疾病。作为照射的超声波，可以优选使用约100KHz-20MHz，特别是约1-3MHz的频率。照射优选在约0.1-5瓦/cm2，优选约2瓦/cm2的输出下进行。照射时间随所用频率、照射输出的不同而改变，并且约为5-300秒，且优选约为30-120秒，且就脉冲照射而言，其工作期约为1-100％，优选约10％。
本发明的活性氧发生器可有效治疗任意类型的活性氧表现出细胞毒性所针对的癌症、病毒感染、胞内寄生虫感染、肺纤维化、肝硬化、慢性肾炎、动脉硬化、糖尿病性视网膜病、老年性黄斑变性和血管收缩损害等。癌症的实例包括在器官表面和内部出现的各种实体癌，诸如肺癌、肝癌、胰腺癌、胃肠癌、膀胱癌、肾癌和脑瘤。尤其是当本发明的活性氧发生器用于光动力学治疗时，它可有效地用于这类光照射不能并且癌的光动力疗法通常不能达到的体内深度癌症的治疗。就其它疾病而言，由于损害或感染的细胞或受侵害的细胞位于器官的内部，所以可以通过用适合于所述部位的方法且然后用来自外部的光或超声蓄积活性氧发生器来治疗它们。
可以将本发明的活性氧发生器制成任意的药物剂型，诸如注射剂、分散剂、液体剂、固体粉末。例如，当将其制成注射剂时，可以将本发明的活性氧发生器与各种添加剂，诸如缓冲剂、生理盐水、防腐剂、常用于注射剂的蒸馏水合并，以便形成注射剂。可以通过静脉内、动脉内、肌内、皮下或皮内给予本发明的活性氧发生器，并且剂量取决于给药途径、患者的年龄和性别、疾病的类型和情况，但对每个成年人而言，每天给予1次-分成几次给予约1-10mg/kg的本发明水溶性富勒烯。
如上所述，与正常组织相比，聚合物材料易于迁移至癌组织和炎症组织并且在其中蓄积。因此，当对活体给予含有与水溶性聚合物连接的富勒烯的本发明活性氧发生器时，与正常组织相比，它蓄积在癌组织和炎症组织中，并且与正常组织相比，它长期以高浓度保留在癌组织和炎症组织中。另一方面，由于本发明的活性氧发生器从正常组织比从癌组织和炎症组织中排泄更快，所以在将它对活体给药后一定长时间内，本发明活性氧发生器的浓度显著高于它在正常组织中的浓度，并且本发明的活性氧发生器特别以高浓度分布在癌症和炎症组织中。因此，如果用光或超声照射活体，那么在对活体给予本发明的活性氧发生器后，活性氧发生器即刻因光或超声照射导致的声致发光产生的光产生活性氧，诸如单线态氧，并且特别在癌组织和炎症组织中表现出抗癌活性和抗炎活性。另一方面，由于本发明活性氧发生器的浓度在正常组织中低，所以在正常组织中的细胞毒性不会比在癌组织和炎症组织中高，且由此预计在正常组织中的副作用可以降低。
对人体给药后，在本发明活性氧发生器于癌组织和炎症组织中的浓度变得显著高于正常组织中这一时间过程的长度、以及光或超声照射，变得可能随所治疗个体患者的部位中的代谢情况和活性氧发生器分布的时程变化而改变，而一般优选在给药后在约0.1-48小时，特别是约24小时内进行光或超声照射。当对人进行超声波照射时，具有上述频率的超声波以如上所述的输出和时间长度照射。因此，为了使用本发明的活性氧发生器治疗患者，例如，以注射剂的药物剂型的形式给予本发明的活性氧发生器，并且使用光照射设备或超声产生设备在约0.1-48小时内进行照射。可以根据患者的年龄、体重、性别、疾病的类型和情况确定给药/照射的剂量和频率、给药时间。
本发明的活性氧发生器不会特别迁移至癌组织和炎症组织并且在其中蓄积，但能够通过使用将本发明活性氧发生器递送至靶组织或细胞的任意方法，例如通过使用应用递药系统的具体递送方法使其在靶组织或细胞中具有展现出的细胞毒性。这类方法包括将本发明的活性氧发生器直接注入靶组织或细胞的方法(例如，通过使用内窥镜能够递送至体内的大部分区域)和将与细胞识别因子，诸如抗体、凝集素、细胞粘着因子和糖链连接的本发明的活性氧发生器递送至靶组织或细胞的方法。此外，还能够仅在所需点上产生活性氧以展现出细胞毒性，这可通过在对活体给予本发明的活性氧发生器后仅需要产生活性氧的点上进行照射光或超声来进行。此外，可以通过聚焦光或超声波改善展现出细胞毒性区域的选择性。
下面参照实施例、参比例和试验例更详细地描述本发明，但本发明的范围并不限于它们。
参比例1
(1，2-亚甲基[60]富勒烯)-61-羧酸的合成
将通过“Tetrahedron Letters vol.36，No.38，p.6843，1995”中所述的方法获得的(1，2-亚甲基[60]富勒烯)-61-羧酸的叔丁酯(540mg，0.65mmol)溶于甲苯(380mL)，加入4-甲苯磺酸一水合物(222mg，1.17mmol)并且在回流状态下加热10小时。过滤沉积的棕色沉淀并且依次用甲苯、蒸馏水和乙醇洗涤并且在减压下干燥且得到(1，2-亚甲基[60]富勒烯)-61-羧酸(338mg，产率67％)，为棕色结晶。
FAB-MS(正模式)：m/z779(M+H)+；
1H-NMR(CDCl3/DMSO-d6(1∶1)，ppm)：5.15(1H，s)。
实施例1
与一个PEG分子(分子量5000)连接的富勒烯的合成
将14.7mL 0.33mM(1，2-亚甲基[60]富勒烯)-61-羧酸的溴苯溶液加入到含有1摩尔当量(a molar equralent)聚乙二醇的2mL溴苯溶液中，所述的聚乙二醇在一端上带有甲基，而在另一端上带有氨基丙基(PEG，分子量：5000，Nippon Oil & Fats的产品)，加入2摩尔当量的1-羟基苯并三唑和N，N’-二异丙基碳二亚胺并且在室温和光屏蔽条件下搅拌24小时。用相同量的蒸馏水提取反应液体。使水层通过阳离子交换树脂柱(SP-Toyopearl 650M，H+-型)且然后冷冻干燥流出液并且获得与1个分子的PEG连接的富勒烯(分子量5000)(24.4mg)。
薄层色谱法(洗脱液：20％甲醇-二氯甲烷)相对迁移率(Rf)：0.75。
实施例2
与一个PEG分子(分子量12000)连接的富勒烯的合成
使用在一端上带有甲基，而在另一端上带有氨基丙基并且具有12000分子量而不是5000分子量的PEG(Nippon Oil & Fats的产品)并且以与实施例1中的存在步骤相同，获得与1个分子的PEG(分子量12000)连接的富勒烯(47.4mg)。
薄层色谱法(洗脱液：20％甲醇-二氯甲烷)相对迁移率(Rf)：0.73。
试验例1
实施例1中合成的与1个分子的PEG(分子量5000)连接的富勒烯的分子量分析
使用高效液相色谱系统8020(Tosoh Co.，Ltd.)与TSKgelG3000PWXL(Tosoh Co.，Ltd.)对通过用等量蒸馏水提取实施例1中的反应液体获得的级分和使水层通过阳离子交换树脂柱后的级分的分子量进行测定。将含有20％乙腈和0.3M氯化钠的50mM磷酸盐缓冲液(pH6.9)用作流动相，其中流动相的流速为0.5mL/分钟，并且在富勒烯的紫外吸收下进行检测。结果如附图1中所示。将具有已知分子量的聚乙二醇类(分子量94,000和5,000)用作分子量标记且保留时间如附图1中所示。
作为比较对照，使用在一端上带有甲基，而在另一端上带有氨基丙基并且具有5000分子量的PEG，并且按照JP-A-09-235235实施例1中所述的方法对按照1∶10摩尔比合成的富勒烯-水溶性聚合物共轭物的分子量进行测定。将含有0.3M氯化钠的50mM磷酸盐缓冲液(pH6.9)用作流动相，其中流动相的流速为1mL/分钟，并且在富勒烯的紫外吸收下进行检测。结果如附图2中所示。将具有已知分子量的聚乙二醇类(分子量94,000、46,000和5,000)用作分子量标记且保留时间如附图2中所示。
从这些结果中可以看出，具有约5,800分子量的实施例1的化合物通过自装配形成了具有约100,000分子量的聚集物，并且证实尺寸变大。此外，甚至在溶液组合物不同的条件下也形成了具有良好再现性的聚集物，并且因为所连接的水溶性聚合物的数量恒定而显示出分子量分布的小单峰。另一方面，按照JP-A-9-235235的实施例1中所述的方法合成的富勒烯-水溶性聚合物共轭物具有低于46,000分子量的主要成分，且分子量分布较宽，且观察到了多个峰，并且由此已经证实可以通过控制所连接的水溶性聚合物的数量而获得均匀的聚集物。
已知与富勒烯连接的取代基的数量显著影响活性氧产生的量(对比文件：Toxicology in vitro，Vol.16，p41-46，2002)，并且从递药系统靶向和活性氧的产生量来看，带有1个取代基的衍生物，如实施例1的化合物比常规的富勒烯水溶性聚合物共轭物有用。
试验例2
实施例1中合成的与1个分子的PEG(分子量5000)连接的富勒烯的粒子大小的测定
通过光散射法对本发明的水溶性富勒烯进行粒子大小测定。将实施例1合成的水溶性富勒烯溶于蒸馏水，使得终浓度可以为1mg/mL和100μg/mL。使用光散射测定设备DLS-7000(Otsuka Electronics Co.，Ltd.)测定该溶液。测定结果如附图3中所示。
测定结果表明实施例1的化合物为具有约50nm粒子直径的聚集物，该粒子直径相对均匀，并且实施例2的化合物为具有约100nm粒子直径的聚集物，该粒子直径相应地分布稍宽。认为这些粒子直径大至足以表现出EPR作用(增强的渗透和保留作用)，与正常组织相比，这些聚合物材料易于迁移至癌组织并且趋向于在癌组织中长期保留。
试验例3
实施例2中合成的与1个分子的PEG(分子量12000)连接的富勒烯产生的活性氧的量的测定
通过细胞色素法测定活性氧产生的量(超氧负离子O2 -)。将细胞色素c(Nacalai Tesque Corporation)溶于Hanks’平衡盐溶液(HBSS，pH7.4，Lifetech Oriental Company)，使得终浓度可以为50μM，取200μL该溶液；将实施例2中制备的与1个分子PEG(分子量12000)连接的富勒烯的溶于HBSS，使得终浓度可以为200μM，取200μL该溶液，将上述两种溶液混合。在30℃下使用荧光分光光度计F-2000(Hitachi，Ltd.)用不同波长(220-800nm)的光将该混合溶液照射20分钟。在照射后，使用分光光度计DU-650(Beckmann Company)测定溶液在550nm处的吸光度。每分钟产生的O2 -的量如附图4中所示，推定在30℃和光屏蔽条件下20分钟的溶液为对照品。
当用光照射实施例2的水溶性富勒烯时，在从紫外光到可见光区的宽波长范围内观察到产生了O2 -，并且在260-450nm的宽波长范围内看到了特别显著的产生。因此，已经证实能够通过光照射应用于癌症的光动力疗法。此外，由于因超声照射导致的声致发光而产生的光主要具有300-600nm的波长范围，所以已经证实本发明的化合物适合于超声间动电流疗法。
实施例3
富勒烯与水溶性聚合物连接的水溶性富勒烯的合成，在所述的水溶性聚合物中，两个PEG(分子量5000)与L-天冬氨酸的羧基发生酰胺连接
实施与实施例1中相同的操作步骤并且获得水溶性富勒烯，其中富勒烯的羧基与水溶性聚合物相连，所述水溶性聚合物各自在一端上带有甲基，而在另一端上带有氨基丙基的两个PEG分子(分子量5000)与L-天冬氨酸的两个羧基发生酰胺连接。
将50mM Boc-L-天冬氨酸(Wako Pure Chemical的产品)的5mL N，N-二甲基甲酰胺溶液加入到含有3-倍摩尔量的聚乙二醇(PEG，分子量：5000，Nippon Oil & Fats的产品)的10mL N，N-二甲基甲酰胺溶液，其中所述的聚乙二醇在一端上带有甲基，而在另一端上带有氨基丙基，加入3-倍摩尔量的1-羟基苯并三唑和N，N’-二异丙基碳二亚胺，并且在室温和光屏蔽条件下搅拌24小时。将二异丙醚加入到反应液体中并且获得沉淀。在将沉淀溶于蒸馏水后，使其通过阴离子交换树脂柱(DEAE-TOYOPEARL 650M，Cl--型)和阳离子交换树脂柱(SP-TOYOPEARL650m，H+-type)，并且冷冻干燥流出液且获得与两个PEG分子(分子量5000)在羧基上发生酰胺连接的Boc-L-天冬氨酸。将1g获得的化合物溶于5mL三氟乙酸并且在室温下进行脱保护1小时。向反应液体中加入二异丙醚，并且通过在减压下干燥沉淀获得与两个PEG分子(分子量5000)在羧基上发生酰胺连接的L-天冬氨酸。
使用与两个PEG分子(分子量5000)在羧基上发生酰胺连接的L-天冬氨酸而不是实施例1中的在一端上带有甲基，而在另一端上带有氨基丙基并且具有5000分子量的聚乙二醇，且进行与实施例1中相同的操作步骤并且获得与2个PEG(分子量5000)分子连接的富勒烯。
试验例4
用光照射实施例2的水溶性富勒烯时对癌细胞生长的抑制活性的测定
测定通过光照射在体外的癌细胞生长抑制活性。将Rlmale1细胞(由Kyoto Pasteur Laboratory提供)用作癌细胞并且使用100mm平皿将这些细胞在37℃和5％CO2，95％空气培养条件下的RPMI 1640培养基(Sigma Company，含有10％胎牛血清)中温育，直到它们达到80％的融合。在光屏蔽下将实施例2的水溶性富勒烯溶于与癌细胞培养物中使用相同组成的培养基中并且在将浓度调整至250μM后，将其灭菌并且过滤。用培养基将250μM的灭菌溶液依次稀释以便制备125μM和62.5μM的溶液。将由此制备的各类溶液10μL分配入96-孔平板中的每个孔中并且仅将不含实施例2的化合物的10μL培养基分配入对照孔。将上述变成80％融合的细胞制成5×104个细胞/mL的细胞混悬液并且取100μL配入上述各孔中。在用振荡器轻度搅拌96孔平板后，将其保留在8W看片灯(Fuji Coor Sales)下20分钟或40分钟并且用光照射。在光照射后，用铝箔遮蔽平板并且在保温箱(37℃，5％CO2)中培养3天。就不用光照射的对照组而言，在搅拌后立即用铝箔遮蔽平板并且保温3天。在培养3天后，将10μL每种活细胞计数测定试剂SF(Nacalai Tesque Corporation)各自加入到各孔中，并且在保温箱中保持温热80分钟后，使用微量平板读出器VERSAmax(JapaneseMolecular Device Company)测定450nm处的吸光度。测定癌细胞存活率，将不添加实施例2的化合物情况下450nm处的吸光度推定为100％并且结果如附图5中所示。
已经证实当用光照射40分钟时，实施例2的水溶性富勒烯在其添加量增加时显著降低了癌细胞的存活率。
试验例5
用光照射时实施例1的水溶性富勒烯的抗癌活性的测定
改变给药途径并且比较通过光照射体内的抗癌活性。通过以下步骤准备患有癌的小鼠：取出肿瘤块，并且将条片移植在CDF1小鼠(雌性，Charles River Laboratories Japan，Inc.)背部皮下组织上，所述的肿瘤块已经从通过皮下植入BALA/c-nn(雌性，Charles RiverLaboratories Japan，Inc.)的小鼠结肠癌Colon26细胞(由CancerChemotherapy Center of Cancer Research Society提供)传代。在植入后5天内将患有癌的小鼠用于本实验，其中在皮下组织中形成具有约5mm直径的癌。将实施例1的化合物溶于磷酸缓冲生理盐水溶液，使得它可以为6mg/mL并且在给药后5分钟内使用蓝相(VivadentCompany)用光在肿瘤部位上照射皮下区肿瘤或肿瘤内给予100μL所述溶液的组。照射条件为使用具有8mm直径的探头与650w/cm的输出功率进行4分钟照射。将该操作连续进行3天。就静脉内给药组而言，将实施例1的化合物溶于磷酸缓冲生理盐水溶液，使得它可以为6mg/mL并且对小鼠尾静脉给予100μL所述溶液且在给药后24小鼠内使用蓝相用光照射肿瘤部位。照射条件与皮下组织肿瘤内给药组的条件相同并且将该操作连续进行3天。
将不给予水溶性富勒烯并且不用光照射的患有癌的小鼠用作对照组并且对每只小鼠测量随时间变化的皮下区肿瘤大小。通过用滑动测径器实际测量癌的长轴和短轴来测量癌的大小并且使用Winn报导的计算公式计算(Nalt.Cancer Inst Monogr.，Vol.2，p113-138(1960))。结果如附图6中所示。
当给予实施例1的水溶性富勒烯并且合并光照射时，肿瘤体积的增加受到抑制，并且这种抑制作用增加的顺序为皮下给药<肿瘤内给药<静脉内给药。由于静脉内给药组尽管在24小时后用光照射仍然表现出最有效的结果，所以已经证实就本发明的水溶性富勒烯而言，通过血管给予是最佳注射方法，这提示了EPR作用产生的可能性。
试验例6
用超声波照射实施例2的水溶性富勒烯时对癌细胞生长的抑制活性的测定
使用活细胞计数测定试剂SF，参照Ukeda的报告(DOJIN NEWS，No.96，pl-6，2000)测定超声照射产生的活性氧的量(超氧负离子O2 -)。将实施例2的水溶性富勒烯溶于Hanks’平衡盐溶液，使得它可以为200μM，取750μL该溶液配入35mm平皿。将该溶液与600μL Hanks’平衡盐溶液和150μL活细胞计数测定试剂SF混合，并且在搅拌的同时使用超声间动电流疗法装置US-700(Ito Ultrashort Wave Company)用具有1MHz频率、输出模式(工作期)30％的不同输出(1.5、2.0、2.5和3.0W/cm2)的超声波从液体表面照射5分钟。照射后，使用分光光度计DU-60测定450nm处的吸光度。将使用超声波照射，但不添加化合物的溶液的在450nm处的吸光度推定为对照组并且每分钟产生的O2 -的量如附图7中所示。
已经证实当用超声波照射实施例2的水溶性富勒烯时，活性氧的量随输出的增加而增加。
试验例7
用超声波照射实施例1的水溶性富勒烯时对癌细胞生长的抑制活性的测定
测定超声波照射的体外抗癌活性。将RLmale1细胞按照与试验例4中类似的方式使用。在光屏蔽条件下将实施例1的水溶性富勒烯溶于与癌细胞培养中使用相同组成的培养基中，并且在将浓度调整至500μM后，将其灭菌并且过滤。由无菌的500μM溶液制备250μM溶液。取由此制备的溶液200μL配入6孔平板的各孔，并且仅将不含实施例1的水溶性富勒烯的200μL培养基配入对照孔。将RLmalel细胞调整至1×105个细胞/mL并且获得细胞混悬液且取2mL配入上述各孔。在使用移液管将孔中的细胞轻度混合后，使用超声间动电流疗法仪US-700在2.0W/cm2输出功率，20％的输出模式下通过导电膏从平板的基底部开始用具有1MHz或3MHz频率的超声波照射2分钟。在超声照射后，用铝箔遮蔽平板并且在保温箱(37℃，5％CO2)中培养3天。就不使用超声波照射的对照组而言，在混合后立即用铝箔遮蔽平板并且按照相同方式培养3天。在培养3天后，将来自各孔的100μL细胞混悬液各自配入96-孔平板并且将10μL活细胞计数测定试剂SF各自加入到各孔中，在保温箱中保持温热45分钟后，使用全自动定量绘图酶标仪VERAmax测定450nm处的吸光度。测定癌细胞存活率，将不添加实施例1的化合物情况下450nm处的吸光度推定为100％存活率并且结果如附图8中所示。
已经在超声照射中证实，在与试验例4中相同的方式中，癌细胞的存活率随着本发明化合物的添加量增加而下降。就这种作用而言，1MHz比3MHz频率更为显著。因此，已经证实本发明的水溶性富勒烯可以用于使用超声照射的超声间动电流疗法和使用光照射的癌症的光动力疗法。
工业实用性
正如上文详细描述的，可以按照本发明获得所连接的水溶性聚合物数量受控的水溶性富勒烯。当用光照射本发明的水溶性富勒烯时，O2 -在从220nm-可见光区(380-780nm)的宽波长范围内产生。它特别在260-450nm波长范围内表现出了高O2 -产生能力。此外，因超声照射导致的声致发光而产生的光主要具有300-600nm范围的波长，并且当用超声波照射本发明的水溶性富勒烯时，O2 -也会产生。除此之外，本发明的水溶性富勒烯高度蓄积在癌组织和炎症组织中。因此，本发明的水溶性富勒烯可以用作活性氧发生器并且可以应用于癌症的光动力疗法或超声间动电流疗法。

Claims (23)

1.水溶性富勒烯，其中该富勒烯在其分子上带有官能基并且通过所述的官能基连接水溶性聚合物。
2.权利要求1所述的水溶性富勒烯，带有1-5个官能基。
3.权利要求1或2所述的水溶性富勒烯，带有1个官能基。
4.权利要求1-3中任一项所述的水溶性富勒烯，其中所述的官能基为羧基。
5.权利要求1-4中任一项所述的水溶性富勒烯，其中该富勒烯为C60富勒烯。
6.权利要求1-5中任一项所述的水溶性富勒烯，其中所述的水溶性聚合物的分子量为1,000-1,000,000。
7.权利要求1-6中任一项所述的水溶性富勒烯，其中所述的水溶性聚合物为选自非离子水溶性合成聚合物、非离子或离子多糖类、其改性物质、这些水溶性聚合物中的两种或三种组分的共聚物或复合物、透明质酸、脱乙酰壳多糖和甲壳质衍生物的水溶性聚合物。
8.权利要求1-7中任一项所述的水溶性富勒烯，其中所述的水溶性聚合物为在一端上带有非活性基团，而在另一端上带有与富勒烯的官能基反应的反应基团的水溶性聚合物。
9.权利要求8所述的水溶性富勒烯，其中所述的水溶性聚合物为在一端上带有非活性基团，而在另一端上带有与富勒烯的官能基反应的反应基团并且具有4000-15000分子量的聚乙二醇。
10.权利要求9中所述的水溶性富勒烯，其中所述的水溶性聚合物为在一端上带有C1-C6烷基，而在另一端上带有被氨基取代的C1-C6烷基并且具有4000-15000分子量的聚乙二醇。
11.权利要求8所述的水溶性富勒烯，其中所述的水溶性聚合物为聚乙二醇与化合物的复合物，所述的聚乙二醇在一端上带有非活性基团并且具有4000-15000分子量，所述的化合物带有与富勒烯的官能基反应的反应基团。
12.权利要求11所述的水溶性富勒烯，其中所述的水溶性聚合物为在一端上带有C1-C6烷基，而在另一端上带有被氨基取代的C1-C6烷基的聚乙二醇与氨基酸的反应产物。
13.权利要求1-12中任一项所述的水溶性富勒烯，其中该水溶性富勒烯为聚集物形式。
14.权利要求13所述的水溶性富勒烯，其中所述的聚集物具有20-400nm大小。
15.权利要求1-14中任一项所述的水溶性富勒烯，其中该水溶性富勒烯或其聚集物为水溶液形式。
16.生产水溶性富勒烯的方法，其特征在于使水溶性聚合物与在分子上带有官能基的富勒烯的官能基反应。
17.权利要求16所述的生产水溶性富勒烯的方法，其中所述的水溶性聚合物为权利要求6-12中任一项所述的水溶性聚合物。
18.权利要求16或17所述的生产水溶性富勒烯的方法，其中所述的富勒烯的官能基为一个羧基。
19.活性氧发生器，含有权利要求1-15中任一项的水溶性富勒烯或通过权利要求16-18中任一项的生产方法生产的水溶性富勒烯。
20.权利要求19所述的活性氧发生器，用于光动力疗法或超声疗法。
21.权利要求19所述的活性氧发生器，用于抑制细胞增殖。
22.权利要求21所述的活性氧发生器，其中所述的细胞为癌细胞。
23.权利要求19-22中任一项所述的活性氧发生器，用于治疗癌症。
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