CS121192A3 - Super-active analog of a growth-hormone releasing factor, process forpreparing thereof and a pharmaceutical composition which contains said analog - Google Patents

Description

Superaktivní analog X3RF, způsob jeho přípravy a farmaceutickýprostředek, který ho obsahujeOblast techniky

Vynález se týká superaktivního analogu faktoru uvolňujícíhorůstový hormon (GRF - growth hormone releasing factor).

Dosavadní stav techniky Růstový hormon je sekreční bílkovina hypofýzy živočichů seznačným vlivem na vývin organismu. Umělé řízeni koncentracerůstového hormonu má značný terapeutický význam. Náhrada lidskéhorůstového hormonu se jeví jakožto účinné opatření při nedostatkurůstového hormonu a při ošetřováni chorobných stavů v případělidi. Nezávisle na tomto vynálezu byly nalezeny nové a významnévlastnosti růstového hormonu, které dále podpořily význam řízenirůstového hormonu. Například z nejnovějších klinických studiivyplývá, že doplněni růstového hormonu může být užitečné při bojiproti nemocem, které sebou přináší stárnutí lidí. Zvýšené hladinyrůstového hormonu u živočichů vedou ke zvyšováni netučné svalovéhmoty. Tohoto poznatku by se mohlo využit ke zvýšeni produkce li-bového masa nebo pro produkci větších a/nebo robustnějších zvířat.

Jakkoliv je růstový hormon produkován hypofýzou, řidlsekreci růstového hormonu do krve druhá bílkovina, označovanájakožto faktor uvolňováni růstového hormonu (GRF). Tento hormonje rovněž obecně znám jakožto somatocrinin, hormon, uvolňujícírůstový hormon (GHRH - growth hormone realeasing hormone) a hor-mon, uvolňující růst (GRH - growth releasing hormone). Existujíproto dva způsoby řešení problému zvýšení cirkulace růstovéhohormonu: (1) přímé zvýšeni koncentrace lidského růstového hormonuv organismu nebo (2) zvýšeni přirozeného sklonu organismu produ-kovat růstový hormon. Tohoto druhého způsobu se může dosahovatdodáváním GRF. Zjistilo se, že GRF zvyšuje cirkulaci růstovéhohormonu in vivo (Rivier a kol., 1982, Nátuře, 300, str, 276).VlivGRF (a jeho různých strukturálních analogů) na produkci růs-tového hormonu byl studován v široké míře. První překážkou připoužiti GRF při přímém podávání je jeho krátká žiovotnost in vi- 2 vo (Frohman L.A. a kol., 1986, J. Clin.Invest. 78, str. 906. Jeproto žádoucí vyvinout účinnější a/nebo déle působící molekulyGRF pro účinné ošetřováni lidi a zvířat. četnými způsoby, což vedlos větším účinkem. Ukázalood koncového dusíku je

Struktura GRF byla modifikovának analogům s delší životnosti a/nebose, že prvních 29 aminokyselin dostatečných k udrženi plné účinnosti GRF (Speiss a kol., 1982,Biochemistry 21, str. 6037). Jednou strategii je včleňovat novéD-aminokyselinové zbytky v různém množství do molekuly GRF (LaňceV.A. a kol., 1984, Biochem. Biophys. Res. Commun. 119, str. 265,Coy D.H. a kol., 1986, Peptides, 8(suppl.l), 49). Jiným přístupemje modifikace peptidového skeletu GRF včleněním peptidovýchvazebných isoter do N-koncové oblasti (Tourwe D., 1985, Janssen.Chim. Acta 3, str. 3, S.J. a kol., 1990, J. Med. Chem. 33, str.1954 až 1958.

Vynález se týká analogů GRF se zvýšenou účinnosti a s další-mi charakteristikami, které představuji technické přednosti vesrovnáni s analogy GRF, známými ze stavu techniky. Sloučeninypodle vynálezu jsou vhodné pro veterinárnmi účely, zvláště prohovězí dobytek, vepře, ovce, drůbež a ryby.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je superaktivni syntetický analog GRFpeptidu (GRF peptidy) vzorce I XI-AIa-Asp-Ala-I1e-Phe-Thr-Asn-A9-Tyr-Arg-A12-Val-Leu-Al5-Gln-LeuSer-Ala-Arg-A21-A22-Leu-Gln-A25-I1e-A27-A28-Arg-Y-Z-Tkde znamená A9 Ser, Ala, Leu, Thr, nebo Asn, A12 Arg nebo Lys, A15 Gly, Ala, Thr nebo Leu A21 Arg nebo Lys, A22 Ala nebo Leu, A25 Asp nebo Glu, A27 Met, Ser, Arg, Leu nebo norleucin, A28 Ser nebo Asn, 3 Υ Ο nebo peptid s 1 až 15 aminokyselinami, Z O nebo peptid s 1 až 32 aminokyselinami, T karboxylovou koncovou skupinu obecného vzorce -COORa, -CRaO, -CONHNHRa, -CON(Ra)(Rb) nebo CH2ORakde znamená

Ra a Rb na sobě nezávisle nižší alkylovou skupinu, atomvodiku, Hse(lakton), HseOH nebo HSeN(Rc )(Rd), kdeznamená Rc a Rd na sobě nezávisle atom vodíku ne-bo nižší alkylovou skupinu, XI acylovou skupinu obecného vzorce

O R1-A-(CH2)d-(NH)c-B-(NH)b-(CH2)a-CH-C- R2 kde znamená

Ri atom vodiku, skupinu methylovou, ethylovou, hydroxyethy-lovou, fenylovou, nebo fenylovou substituovanou popřípaděatomem halogenu, nižší alkylovou skupinou, nižší alkoxy-skupinou, hydroxyskupinou, nitroskupinou nebo aminoskupi-nou, acetamidoskupinu, trif1uormethylovou skupinu,skupinuvzorce -CH2-OH nebo sulfamidoskupinu, nebo pětičlennounebo šestičlennou heterocyklickou skupinu obsahujícíjeden nebo několik heteroatomů. ze souboru zahrnujícíhoatom dusíku, kyslíku a siry, a nulu, 1, 2 nebo 3, b nulu nebo 1, c nulu nebo 1, d nulu až 12 A nulu, atom kyslíku nebo síry, B skupinu karbonylovou, sulfonylovou nebo sulfinylovou, R2 atom vodiku, methylovou skupinu, skupinu -CH2OH,

p-hydroxybenzylovou skupinu nebo skupinu obecného vzorceO -(CH2)e-C-R3 4 kde znamenáe nulu až 5 R3 skupinu methylovou, ethylovou, hydroxyethylovou,amino-skupinu, hydroxylovou skupinu, fenylovou skupinu nebofenylovou skupinu substituovanou atomem halogenu,alky-lovou skupinou, alkoxyskupinou, hydroxyskupinou,nitro-skupinou nebo aminoskupinou, acetamidoskupinu nebo sulf-amidoskupinu nebo pětičlennou nebo šestičlennou hetero-cyklickou skupinu obsahující jeden nebo několik atomůze souboru zahrnujícího atom dusíku, kyslíku a siry a jeho farmaceuticky vhodné netoxické soli.

Vynález se tedy týká analogů GRF, které mají vyšší účinnost a jiné vlastnosti, které poskytují technické přednosti ve srov-nání se shora uvedenými analogy GRF. Sloučeniny podle vynálezujsou výhodné pro veterinární účely, zvláště pro chov skotu,vepřů, ovci, drůbeže a ryb.

Nadále se používá následujících zkratek a výrazů:

Ala aminokyselina alanin analog: sloučenina, která je strukturálně podobná jiné sloučenině, v souvislosti s peptidy se týká primární, sekundární nebo ter-ciární struktury

Arg: aminokyselina arginin

Asn: aminokyselina asparagin

Asp: aminokyselina kyselina asparagová pár bází (bp): se týká DNA nebo RNA.

Zkratky A, C, G a T se týkají 5'-monofosfátových forem nukleotidů(deoxy)adenin, (deoxy)cytidin, (deoxy)guanin a (deoxy)thymin,pokud se vyskytuji v DNA molekulách. Zkratky U, C, G a T setýkají 5'-monofosfátových forem nukleotidů uráčil, cystidin,guanin a thymin, pokud se vyskytuji v RNA molekulách. Vedvouřetězcové DNA se může pár bázi týkat vztahu A s T nebo C s G. V DNA/RNA heteroduplexni pár bázi se může týkat partnerskéhovztahu T s U nebo C s G.

Cys: aminokyselina cystein nebo polovina cysteinového zbytku kovalentně vázaného prostřednictvím disulfidického můstku na ji-nou polovinu cysteinového zbytku. 5 DNA: deoxyribonukleová kyselina EDTA: zkratka kyseliny ethylendiamintetraoctové

Funkční analog: molekula mající podobné funkční vlastnosti avšakmodifikovanou strukturu se zřetelem na přírodně se vyskytujícíformu takové molekuly nebo sloučeniny. Funkční analog zahrnujefragmenty (nebo adice) mateřské molekuly, který má podobné funk-ční vlastnosti a reaktivity jako mateřská molekula.

Gin: aminokyselina glutamin

Glu: aminokyselina kyselina glutamová

Gly: aminokyselina glycin GRF PEPTID: polypeptid obsahující 27 až 76 aminokyselinových zbyt-ků, které promotují uvolňování a syntézu růstového hormonu z hy-pofýzy. GRF PEPTIDY zahrnují přírodní nebo syntetické funkčníanalogy, jak se uvádí v amerických patentových spisech číslo4 517181, 4 518586, 4 528190, 4 529595, 4 563352, 4 585756, 4 595676 4 605643, 4 620976, 4 626523, 4 628043 a 4 689318. VýrazGRF PEPTID zahrnuje také své netoxické soli.

His: aminokyselina histidin

Hse: aminokyselina homoserin

Ile: aminokyselina isoleucin

Leu: aminokyselina leucin

Lys: aminokyselina lysin

Met: aminokyselina methionin nebo její deformylováný analog

mRNA: mediátorová RNA MWCO: zkratka odříznuté molekulové hmotnosti ("cut-off")

Orn: ornithin

Phe: aminokyselina fenylalanin

Plasmid: extrachromosomálni spontánně replikační genetický elementPMSF: zkratka fenylmethylsulfonylfluoridu

Pro: aminokyselina prolin Čtecí rámec: nukleotidová sekvence, ze které dochází ke "Čtení"translace v tripletech translační aparaturou tRNA a ribosomůa asociovaných faktorů, přičemž každý triplet odpovídá zvláštníaminokyselině. Jelikož je každý triplet zřetelný a téže délky,musí být kódovací sekvence násobkem tří, včleněni nebo vypuštěnípáru bází (ukončeni posunové mutace) může vést ke dvěma různým 6 bílkovinám, které se zakodovávají stejným DNA segmentem. Aby setomu předešlo tripletové kodony, odpovídající žádanémupolypeptidu, musí být vázány na násobky tři počátečních kodonů,to znamená, že se musí dodržovat správný "čtecí rámec".

Rekombinantní DNA clonovaci vektor: jakékoliv autonomní replikační činidlo zahrnující, avšak bez jakéhokoliv omezeni, plasmidya fágy, obsahující DNA molekulu, na kterou se může adovat nebo nakterou je adován jeden nebo několik DNA segmentů.

Rekombinantní DNA expresní vektor: jakýkoliv rekombinantní DNAklonovaci vektor, do kterého je včleněn promotor.

Replikon: DNA sekvence, která řídi a umožňuje automoní replikaciplasmidu nebo jiného vektoru. RNA: kyselina ribonukleová RP-HPLC: zkratka reverzní fázové vysoce účinné kapalinové chromá- tografie

Ser: aminokyselina serin

Thr: aminokyselina threonin

Transkripce: proces, kterým se informace obsažená v nukleotidovésekvenci DNA přenáší na komplementární RNA sekvenci.

Translace: proces, při kterém se genetická informace mediátorovéRNA používá ke specifikaci a přímo k syntéze polypeptidovéhořetězce.

Tris: zkratka pro tris(hydroxymethylJaminomethan

Trp: aminokyselina tryptofan

Tyr: aminokyselina tyrosin

Val: aminokyselina valin

Vektor: replikon, používaný pro transformaci buněk v gelové manipulaci, nesoucí polynukleotidové sekvence, odpovídající vhod-nému řízení sekvenci, dodává specifické vlastnostitransformované hostující buňce. Plasmidy, viry a bakteriofágy jsou vhodnými vektory, jelikožsmyslu. Umělé vektory jsou jsou replikony v pravém slovakontruovány odřezáváním nebo připojováním DNA molekul z různých zdrojů za použiti restrikčnichenzymů a ligáz. Používaný výraz "vektor" zahrnuje rekombinantníDNA klonovaci vektory a rekombinantní DNA expresnívektory.Restrikčni místo a funkční mapy na připojených výkresech přibližně znázorňuji popisované rekombinantni DNA vektory.Informace restrikčního místa není vyčerpávající: proto může býtvíce restrikčnich míst daného typu na vektoru, než je navýkresech znázorněno.

Na obr. 1 je restrikčni místo a funkční mapa plasmidu pHS19O.

Na obr. 2 je restrikčni místo a funkční mapa plasmidu pHS5OO.

Na obr. 3 je restrikčni místo a funkční mapa plasmidu pHS452.

Na obr. 4 je graf, ukazující zvýšení hladiny růstového faktoru u kastrovaného kance při podání p-methylhippuroylpGRF(2—76)OH.

Na obr.5 je graf, ukazující vliv na exkrecí koncentrace močovi-nového dusíku v moči v případě kastrovaného kance jakoodezvy na podáni p-methylhippuroyl pGRF(2-76)OH.

Vynález se tedy týká syntetických GRF peptidových analogů (GRF PEPTIDU) shora uvedeného vzorce I, kde jednotlivé symbolya zkratky mají shora uvedený význam, a jejich farmaceutickyvhodných netoxických soli. V obecném vzorci I znamená výraz "nižší alkylová skupina"vždy alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, jako je napříkladskupina methylová, ethylová, n-propylová, iso-propylová, n-buty-lová, sek.-butylová, isobutylová a terč.-butylová skupina. Výrazem "nižší aikoxyskupina" se zde vždy mini skupiny, jako jepříkladně methoxyskupina, ethoxyskupina, n-propoxyskupina, terc.-butoxyskupina. Výrazem "atom halogenu" se zde vždy mini atomfluoru, chloru, bromu a jodu. Výrazem "substituovaná fenylováskupina" se zde vždy mini fenylová skupina substituovaná jednounebo dvěma stejnými nebo odlišnými skupinami, volenými ze souboruzahrnujícího atom halogenu, nižší alkylovou skupinu, nižšíalkoxyskupinu, hydroxyskupinu, nitroskupinu, aminoskupinu,acetamidoskupinu nebo sulfonamidoskupinu. Jakožto příkladytakových skupin se uvádějí skupina 4-chlorfenylová, 3-jodfenylo-vó, 2-f1uorfenylová, 4-methylfenylová, 3-chlor-4-methy1 feny1ová,3-bromfenylová, 4-ethylfenylová, 3-ethoxyfenylová, 2-methoxyfeny-lová, 4-isopropoxyfenylová, 4-hydroxyfenylová, 3,4-dihydroxyfeny-lová, 2,4—dihydroxyfeny1ová, 4-nitrofenylová, 3-aminofenylová,3-chlor- 4-hydroxyfenylová, 2-acetamidofenylová, 4-sulfonamídofe- - 8 - zbytky sloučeninyaminokyseliny, kdyžbílkoviny, jak se nylová, 3,4-dimethoxyfeny1ová a 2-fluor-4-aminofenylová skupina."Pětičlennou nebo šestičlennou heterocyklickou skupinou" se zdevždy mini skupina obsahujici jeden nebo několik atomů ze souboruzahrnujicího atom dusíku, kysliku a siry. Jakožto příkladypětičlenné heterocyklické skupiny se uvádějí skupina pyrrolová,thiofenová, furanová, imidazolová, oxazolová, oxadiazolové, thia-zolová, 1,3,4-thiodiazolová, asoxazolová skupina a jakožto přík-lady šestičlenné heterocyklické skupiny se uváději skupina pyri-dinová, pyrimidinová, pyranová, dihydropyranová, thiazinová,thiapyramová a triazinová skupina. Takové pětičlenné nebošestičlenné heterocyklické skupiny mohou mít také substituenty zesouboru zahrnujícího nižší alkylovou skupinu, nižší alkoxyskupinu,hydroxyskupinu, aminoskupinu a atom halogenu.

Jakožto příklady aoylových skupin symbolu XI ve vzorci I seuváději skupina p-chlorhippuroylová, p-methylhippuroylová, p-nit-rohippuroylová. hippuroylová, p-hydroxyhippuroylová, 3-benzoyl-propionylová, n-fthaloylglycylová, N-fenylmalonamidoylová, p-met-hyl-N-fenylmalonamidoylová a p-fluorhippuroylová skupina.

Jak shora uvedeno, výhodnými sloučeninami podle vynálezujsou deriváty a modifikace živočišných GRF peptidů.

Označeni "A2O", "A21" atd. v souvislosti s aminokyselinovýmivzorce I odpovídají číslu zvláštníse čísluje po sobě od koncové aminokyselinyvyskytuji v přírodě a jak jsou popsány v literatuře. Takové číslováni aminokyselinových zbytků jakožtaké charakterizace bílkovin jsou pracovníkům v oboru známy.Označeni například "des-Tyrl-GRF" je v oboru dokonalesrozumitelné, přičem se mini přírodní GRF molekula prostákoncového aminotyrosinového zbytku. Přečíslováni zbylýchaminokyselinových zbytků bílkoviny není nutné a může vést kezmatku. Podle shora uvedeného přikladu aminokyselinou,zaujímajíoi druhou polohu, v přírodně bude koncový aminozbytek, přičemž si

Ala2. Označeni podle dobře známého přijatého označovániaminokyselin různých typů GRF bude dále uvedeno. Výhodný peptid podle vynálezu zahrnuje modifikaci vepřového se vyskytující bílkoviny například udržuje označeni 9 GRF (pGRF) vzorce I, kde: A9 = Asn, A12 = Arg, A15 = Thr, A21 =Arg, A22 = Leu, A25 = Asp, A27= Leu a A28=Ser .

Další výhodný peptid podle vynálezu zahrnuje modifikaci hovězího GRF (bGRF) vzorce I, kde: A9 = Asn, A12 = Arg, A15 =

Thr, A21 - Arg, A22 Leu, A25 = Asp, A27 Leu a A28 - Asn.

Další výhodný peptid podle vynálezu zahrnuje modifikaci lidského GRF (hGRF) vzorce I, kde: A9 = Ser, A12 = · Lys, A15 =

Gly, A21 = Lys, A22 = Leu, A25 = Asp, A27 = Met a A28 = Ser.

Výhodnými peptidy podle vynálezu jsou sloučeniny vzorce I,kde znamená Y 30 - 43 aminokyselinovou sekvenci zralého GRF PEPTIDU. Výhodnými podle vynálezu jsou sloučeniny vzorce I, kde Yznamená 30 - 43 aminokyselinovou sekvenci přírodně se vykytujicí30-43 aminokyselinové sekvence určitých druhů GRF, přicházejícíchv úvahu, například pGRF, bGRF, hGRF. Obzvláště výhodně znamená Yaminokyselinovou sekvenci: G1n-Gln-Gly-GlU-A34-A35-G1n-Glu-A38-A39-A4O-Arg-A42-Arg-Leukde znamená A34 Asp nebo Ser, A38 Arg nebo Gin, A39 Gly nebo Arg, A40 Ala nebo Ser, A42 Ala, Val nebo Phe. Déle obzvláště výhodně znamená Y aminokyselinovou sekvenci:Glu Gin Gly Glu Ser Asn Gin Glu ArgGly Ala Arg Ala Arg Leu Dále obzvláště výhodně znamená Y aminokyselinovou sekvenci:Gin Gin Gly Glu Arg Asn Gin Glu GinGly Ala Arg Val Arg Leu pokud je zvláštní, v úvahu přicházející GRF formou vepřový GRF. Dále obzvláště výhodně znamená Y aminokyselinovou sekvenci:Glu Gin Gly Glu Ser Asn Gin Glu Arg GlyAla Arg Ala Arg Leu pokud je zvláštní, v úvahu přicházející formou GRF lidský GRF. Výhodnými jsou peptidy podle vynálezu vzorce I, kde znamenáZ 44-76 aminokyselinovou sekvenci GRF prekursorových PEPTIDŮ.Obzvláště výhodná je 44-76 aminokyselinová sekvence přírodně se 10 vyskytující 44-76 aminokyselinové sekvence GRF zvlášnlho výzkumu.

Nejvýhodněji peptidový podlí Z zahrnuje přírodně sevyskytujíc! 44-76 aminokyselinovou GRF sekvenci zvláštního druhu, jsou nahrazeny argininovými jsou nahrazeny leucinovými

aminokyselinová sekvence GRF

zbytkyzbytky.PEPTIDU jestliže Z zahrnuje aminokyselinovou sekvence GRF PEPTIDU seaminokyselinovou sekvenci: jejiž lysinové zbytkya methioninové zbytkyNapříklad nejvýhodnějšlpřichází v úvahu tehdy,sekvenci G1y-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Asp-Gln-Arg-Gln-Leu-Ala-Leu-G1u-Ser-11 e-Leu-Ala-Thr-Leu-Leu-Gln-Glu-Hi s-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly,který je modifikace vepřového GRF a je výhodné, když v úvahupřicházející GRF druhy jsou vepřové.

Nejvýhodnějšl aminokyselinové dosahuje, jestliže Z zahrnuje G1y-Arg-Gln-Val-Asp-Gly-Val-Trp-Thr-Asp-Gln-Gln-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-Thr-Leu-Val-Ser-Lue-Leu-Gln-Glu-Arg-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly,který je takovou modifikaci hovězího GRF a je výhodné, kdyžv úvahu přicházející druhy GRF jsou hovězí. Dále nejvýhodněji Z sekvence ve vzorci I je nulová, což jevýhodné, jestliže GRF druhy přicházející v úvahu jsou lidské. Výhodnými jsou sloučeniny podle vynálezu vzorce I, kde Aa/nebo Z peptidy máji dostatečnou délku, takže se dosahuje vysokéexprese E. Coli. Výhodnými jsou dále sloučeniny podle vynálezu vzorce I,kterými jsou GRF PEPTIDY, jejichž žádná, jedna nebo vlče nežjedna aminokyselina, majici volnou aminoskupinu, jemodifikována. Výrazem "chemicky modifikována" se zde vždy miniderivatizace volné aminoskupiny aminokyselin alkylovou nebohydroxyalkyovou skupinou. Míra modifikace se řidl délkou dobyreakce nebo množstvím reakčniho Činidla. Je výhodnmé, aby všechnyaminokyseliny měly volnou aminoskupinu chemicky modifikovanou.Obzvláště je výhodný GRF PEPTID, který má pouze jednu aminoskupinu, která se může chemicky modifikovat. Takovásloučenina je prosta lysinových a methioninových zbytků. obsahující lysin a/nebo methionin, se převádějí nas volnou aminoskupinou pouze na N-terminu náhradou

Sloučeniny, sloučeniny 11 lysinů argininy a methioninů leuciny.

Konstrukce GRF sloučenin podle vynálezu vzorce I vycházínejdříve ze syntetizování GRF PEPTIDU majícího volnou aminosku-pinu na N-terminu a pak acylací N-terminu žádanou XI kyselinounebo jejím aktivním derivátem. GRF PEPTIDY se mohou také připra-vovat způsobem s pevnou fázi nebo rekombinantnimi způsoby. Obazpůsoby jsou popsány v americkém patentovém spise číslo 4 617149.Rekombinantnl způsoby jsou vhodné v případech, kdy jsou žádoucívysoké výtěžky.

Principy chemické přípravy polypeptidů s pevnou fázi jsouv oboru dobře známy a popsal je například Dugas H. a Penney C.,Bioorganic Chemistry, 1981, Springer Verlag, New York, str. 54 až92. Popis způsobu a metodologie syntézy v pevné fázi GRF analogůje také v evropské přihlášce vynálezu číslo 85302975.9,publikované pod číslem O 161852 21. listopadu 1985.

Podle výhpodného provedeni vynálezu se GRF PEPTIDsyntetizuje rekombinantnl DNA technologii. V oboru je dobře známokonstruovat totálně syntetickou nebo polosyntetickou DNA sekvencizakodujíci danou aminokyselinovou sekvenci (Brown a kol., Methodsin Enzymology 68, str. 109, 1979). K dosaženi translace žádanéhopolypeptidů se vnáší konstruovaná syntetická DNA sekvence do ja-kéhokoliv nadbytečného množství rekombinantnlch DNA expresníchvektorů použitím vhodných restrikčnlch endonukleáz. Použiti urči-tých endonukleáz je dáno restrikčnim endonukleázovým vzorcemštěpení používaného mateřského expresního vektoru. GRF PEPTIDzakodujíci sekvenci se musí umístit tak, aby byl ve vhodnémčtecím rámci s promotorem a s ribosomovým vazným místemexpresního vektoru, kteréžto oba jsou funkční v hostujíc! buňce,ve které má dojit k expresi GRF PEPTIDU. V oboru jsou dále dobřeznámy zvláštní kodony, kterých se může používat k dosaženi vysokémíry exprese v určitém rekombinantnim prostředí (W. Fiers a kol.,1976, Nátuře 260, str. 500 a americký patentový spis číslo4 356270. Výhodným vektorem pro expresi je E.coli hostujíc! buňka, odvozená od E. coli plasmidu pHS190, která zahrnuje TcR gen, lambda cl857 repressor a lambda pL promotor. Restrikční místo - 12 - dosahování fúzovaného a funkční mapa pHS19O je na obr. 1. Plasmid pHS190 je uloženorgar^nizací Northern Regional Research Laboratories pod číslemNRRL B-18410 (datum uloženi : 9. záři 1988).

Syntéza genových sekvenci podle vynálezu zakodovává vepřový,hovězí a lidské GRF analogy sktruktury Meti-Ala2-pGRF(3-76)OH,Meti-AI a2~bGRF(3-76)0H a Met i-AI a2-hGRF(3-76)0H. GRF analogy použitelné v nejrůznějšich jiných druzich, jako například koňském,kachním, krysím, morčat, činčil a kuřat se mohou získat sesyntetickými geny zakodujicími odpovídající GRF PEPTID ze zná-mých aminokyselinových sekvnci v takových molekulách a jejich mo-difikaci analogickým způsobem k hovězímu a vepřovému GRF PEPTIDU,jab se zde příkladně uvádí. Působení methionylové aminopeptidázy (MAP), bílkoviny vlast-ni E.coli, se odstraní N-koncový methionin ze shora uvedenýchsloučenin za získáni žádaných peptidů pGRF(2-76)0H, bGRF(2-76)0Ha hGRF(2—76)OH. Tyto (2-76)OH GRF PEPTIDY se pak převádějí nasloučeniny podle vynálezu (vzorce I) acylaci aminokoncovéaminoskupiny kyselinou XI nebo jejím aktivovaným derivátem. V o-boru molekulární biologie je však možná exprese peptidů jakožtofúzovaných bílkovin. V takových případech, kdy se má GRF PEPTIDprodukovat jakožto fúzovaná bílkovina a GRF PEPTID se pakodštěpuje od konstruktu, musí se konstruovat zakódování sekvencetak, aby docházelo k proteazovému (například karboxypeptidazové-mu) nebo chemickému (například bromkyanovému) štěpeni meziGRF PEPTIDEM a hetero1ogovým peptidem ve výsledném fúzovanémkonstruktu. Technika produkce fúzovaných bílkovin způsoby proštěpení exogenního heterologového peptidů odbilkovinového konstruktu je v oboru známa (viz například americký patentový spis číslo 4-366246 a 4 425437). Přistanovováni vhodného proteolytického enzymu je výhodné, abyaminokyselinové kostra fúzované bílkoviny neměla žádná přídavnáštěpná místa v žádaném polypeptidu (to je GRF PEPTIDU) s výjimkoustyčné plochy mezi žádaným peptidem a exogennim peptidem. Tím sepředchází možné degradaci žádaného GRF peptidů. Specificita ami-nokyselinové sekvence nejrůznějšich enzymatických a chemickýchčinidel je v oboru dobře známa (viz například Proteolytic 13

Enzymes: A Practical Approach - "Proteolytické enzymy: praktickýpřistup" - Benyon R.J. a Bond J.S., vyd. 1989 Oxford UniversityPress, Oxford, Anglie, UK). Při výhodném prováděni vynálezu, jak příkladně doloženo, sežádaná syntetická DNA sekvence, zakodujici příslušný GRF PEPTID,konstruuje tak, aby měla misto Xbal na konci 5' kodujíci větvea misto BamHI na konci 3' kódujici větve. Ke generaci vektoruDNA, se eliminuje misto EcoRI pHS19O. Vektor pHS19O se digerujes EcoRI, vystupující konce se zaplní a plasmid se religuje.Následující digesce s BamHI a Xbal poskytuje vektor DNA.Syntetická GRF PEPTID zakodujici sekvence se pak vnese do vektoruDNA a vektor se religuje.

Transformace ligovaného expresního vektoru do bakteriální(například E. coli) nebo savčí hostující buňky umožňuje pro urči-tý, používaný expresní vektor vznik rekombinantnl buňky, schopnéexprese GRF PEPTIDU vhodné pro použiti podle vynálezu. Vhodnéexpresní vektory pro bakteriální a savčí expresní prostředí semohou nalézt v příručkách pro tento obor (například CurrentProtocols in Molecular Biology - "Současné protokoly v molekulárníbiologii", 1989 a doplňky, Ausubel a kol., vyd. John Wiley andSons, NY).

Podle výhodného provedeni vynálezu, příkladně doloženého, seplasmid pHS 452 připravuje, jak shora popsáno, včleňovánímkódující sekvence pro Meti~Ala2-pGRF(3-76)OH GRF PEPTID. DNA se-kvence zakodujici Meti-Ala-pGRF(3-76)OH GRF PEPTID a odpovídajícíaminokyselinová sekvence odpovídají: 14 ATG Met GCT GATAla Asp GCT Ala ATT TTT ACT AAT Ile Phe Thr Asn AAT TAT CGA CGC GTT CTG ACT CAG CTG TCT Asn Tyr Arg Arg Val Leu Thr Gin Leu Ser GCT CGT CGT CTG CTG CAG GAT ATT CTG TCT Ala Arg Arg Leu Leu Gin Asp Ile Leu Ser CGT CAG CAG GGT GAA CGT AAC CAG GAA CAA Arg Gin Gin Gly Glu Arg Asn Gin Glu Gin GGA GCC CGT GTT CGT CTT GGT CGT CAG GTT Gly Ala Arg Val Arg Leu Gly Arg Gin Val GAT TCT CTG TGG GCT GAT CAA CGT CAG CTT Asp Ser Leu Trp Ala Asp Gin Arg Gin Leu GCT CTC GAG TCT ATC CTG GCT ACT CTG CTG Ala Leu Glu Ser Ile Leu Ala Thr Leu Leu CAG GAA CAT CGT AAT TCT CAG GGT TAA TAG Gin Glu His Arg Asn Ser Gin Gly StopStop

Jestliže se včlení DNA sekvence, zakodovává Meti-Ala2-bGRF-(3-76)OH GRF PEPTID a vzniklý plasmid se označuje jako pHSSOO.Zakodujici DNA sekvence a aminokyselinová sekvence odpovídajícíMeti-Ala2-bGRF(3-76)OH GRF PEPTIDU, odpovídá: ATG GCT GAT GCT ATT TTT ACT AAT TCT TAT Met Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr CGT CGT GTC CTT ACT CAG CTG TCT GCG CGC Arg Arg Val Leu Thr Gin Leu Ser Ala Arg CGT CTG CTG CAG GAT ATC CTG AAT CGT CAG Arg Leu Leu Gin Asp Ile Leu Asn Arg Gin - 15 - CAA GGT GAA CGT AAT CAG GAA CAA GGT GCT Gin Gly Glu Arg Asn Gin Glu Gin Gly Ala CGT GTA CGT CTG GGT CGC CAA GTT GAT GGT Arg Val Arg Leu Gly Arg Gin Val Asp Gly GGT TGG ACT GAT CAA CAG CAG CTT GCT CTC Val Trp Thr Asp Gin Gin Gin Leu Ala Leu GAG TCT ACA CTA GTT TCT CTG CTG CAG GAA Glu Ser Thr Leu Val Ser Leu Leu Gin Glu CTG CGG AAT TCT CAA GGT TAA TAG Arg Arg Asn Ser Gin Gly StopStop Může se včlenit DNA sekvence, která zakodovává Meti-Ala2-hGRF(3-44)OH GRF PEPTID. Zakodovávajici sekvence DNA a aminokyse-linová sekvence odpovídající Meti~Ala2-hGRF(3-44)OH GRF PEPTIDUje ATG GCT GAC GCT ATC TTC Met Ala Asp Ala Ile Phe AAA GTT CTG GGT CAG CTG Lys Val Leu Gly Gin Leu CAG GAC ATC ATG TCT CGT Gin' Asp Ile Met Ser Arg AAC CAG GAA CGT GGT GCT Asn Gin Glu Arg Gly Ala ACT AAC TCT TAC CGT Thr Asn Ser Tyr Arg TCT GCT CGT AAA CTG Ser Ala Arg Lys Leu GAG CAG GGT GAA TCT Glu Gin Gly Glu Ser CGT GCT CGT CTG TAA Arg Ala Arg Leu Stop

Cravador A. a kol., 1985, Biochimie 67, str. 829 až 834. Při výhodném provedeni vynálezu, jak příklady doloženo, kde expresní vektor používá pHS19O skeletu, roste hostující buňka přiteplotě 32 ‘C, pokud je žádoucí exprese polypeptidové sloučeniny.Represor cI857 se stane inaktivnim po posunuti teploty růstu napřibližně 42 °C a po derepresi proýorfitrttj pL. Velké množství poly-peptidu s aktivitou GRF se pak produkuje v množství až do 16 přibližně 15 % celkové buněčné bílkoviny. Aktivní polypeptid se může čistit způsoby, dobře známými pracovníkům v oboru a jak budeukázáno v příkladové části. Jak shora uvedeno, působeni MAPodstraňuje N-koncový methioninový zbytek za vzniku GRF(2-76)OHGRF peptidu. Avšak po čištěni bílkoviny se může odstranit jakýko-liv zbylý N-koncový zbytek o sobě známými enzymatickými způso-by, například působením vhodné aminopeptidazy nebo chemickým způ-sobem například bromkyanem.

Sloučeniny podle vynálezu vzorce I se připravuji N-acylaciaminoterminu (2-76)OH GRF PEPTIDŮ aktivním esterem XI žádané kar-boxylové kyseliny. Acylace aminokoncového dusíku (2-76)OH GRFPEPTIDU se s výhodou provádí sukcinimidylestery XI kyseliny. Nuk-leofilní atakováni aminokoncovým dusíkem (2-76)OH GRF PEPTIDU nakarbonylovém uhlíku esterové vazby sukcinimidylesteru vede k acy-laci. Uvedené reakčni schéma objasňuje acylaci, vedoucí k syn-téze hippuroyl-GRF(2-76)OH. Při acylaci se mohou používat také jiné estery XI karboxy-lové kyseliny. Například se mohou používat aktivní estery,vytvářené s chlorformáty, jako jsou například ethylchlorformáta isobutylchlorformát, nebo s H-hydroxyheterocykly,jako jenapříklad HoBT(hydroxybenzotriazo1). Může se také používat jinýchaktivních derivátů, běžně používaných pro acylaci aminokyselinnebo pro kopulaci aminokyselin. Tato činidla mohou zahrnovatsymetrické nebo N-karboxy anhydridy.

Acylace se provádí ve vodném prostředí při hodnotě pH 7,5 až9,5 a při teplotě 15 až 35 ’C. Nebo se může použít aprotickéhorozpouštědla, jako například dimethylsulfoxidu.

Jakožto příklady XI kyselin, používaných pro přípravu GRFsloučenin vzorce I acylaci (2-29,44 nebo 76)GRF PEPTIDU se uvádě-jí kyselina hippurová, p-methylhippurová, p-chlorhippurová,p-nitrohippurová, p-hydroxyhippurová, fenylaminokarboxylová, 4-hydroxyfenylvinná, p-fluorhippurová kyselina, amid kyseliny N-fenylmalonové, amid kyseliny p-methyl-N-fenylmalonové, N-(2-thie-nyl)glycin, N-(2-furoyl)glycin, kyselina N-(2-furoyl)-b-aminopro-pionová, kyselina N-(3-thienoyl)-a-aminopropionová, N-(3-pyridi-noyl)glycin, N-(4-pyridinyl)malonamidkyselina, N-(1,3-thiazinyl)- 17 malonamidkyselina, N-(l,3—thiazinyl)sukcinamid, N-fenylglutaramid-kyselina, N-/(2-methoxyethyl)aminosulfonyl/glycin a sulfinyl, N-/(2-ethylthioethyl)aminosulfonyl/glycin a sulfinyl a N-(2-hydro-xyethyl)malonamid kyseliny.

Benzoyl lycin✓=\ η

-N -CH2 -C -OHH N-hydroxy sukcinimid —- ho n" DCC/DMF θ'

Sukcinimidyl-N-Zbenzoyl xy.lycinat •7 H- NH2

I c— ch3 o=c GRF(2-76)OHGRF PEPTID, (3-76)-OH GRF PEPTID.

v "CH* -N -C H - GRF(2-76)OHΗ H CH3

hippuroyl GRF(2-76)OH - 18 - s?íasiSixaiiia»wz;a κΐ·. ;.··-·'.

Pracovníkům v oboru je jasné, že se sloučeniny podle vyná-zu mohou také připravovat začínaje například od (3-29,44 nebo76)GRF PEPTIDU nebo od GRF(4-29,44 nebo 76)GRF PEPTIDU, volnéhonebo vázaného na nosiči s podobným N-koncovým blokovaným peptidemnebo derivátem substituované karboxylové kyseliny.

Vynález zahrnuje také farmaceuticky vhodné, netoxické soliacylovaných GRF PEPTIDU. Výrazem "farmaceuticky vhodné, netoxickésoli" se vždy mini organické nebo anorganické adični soli.Příkladně se uváděj! soli, připravené z kyselin, jako jsou ky-selina chlorovodíková, fluorovodíková, sírová, sulfonová, vinná,fumarová, bromovodiková, glykolová, citrónová, maleinová, fosfo-rečná, jantarová, octová, dusičná, benzoová, askorbová, p-toluen-sulfonová, benzensulfonová, naftalensulfonová a propionovákyselina. Výhodnými jsou adični soli s kyselinou, které sepřipravuji za použiti kyseliny chlorovodíkové, octové nebo janta-rové. Všechny shora uvedené soli se připravuji o sobě známýmizpůsoby.Pojem "soli karboxylových kyselin" zahrnuje také napřík-lad amin, amoniové, kvarterni amoniové soli, soli alkalickýchkovů a kovů alkalických zemin, například soli vápenaté,hořečnaté, sodné, draselné a lithné, vytvářené s kteroukolivobsaženou karboxylovou skupinou. Následující tabulky I, II a III objasňuji zvýšenou účinnostsloučenin vzorce I podle vynálezu:

Tabula I dokládá zvýšenou účinnost uvolňováni růstového hormonubGRF (1-77)OH substitucemi pro Tyr 1+

Tabulka II dokládá zvýšenou účinnost uvolňováni růstového hormonubGRF (1—77)OH substitucemi pro Tyr +

Tabulka III dokládá in vitro potenci p-methylhippuroyl-1 pGRF analogů různé délky +

Vysvětleni poznámek v tabulkách + růstový hormon uvolněný do prostředí z krysích primárních buněk hypofýzy měřen po vystaveni 7 dávkám sekretagogu po 3 19 hodiny ++ ECso je vypočítaná střední účinná dávka

Tabulka Z

Pe.pt id ._EC50 (nM)** bGRF (1-77)OH 0.59Hippuroyl-1 bGRF(2-77)OH 0.86p-Hydroxy Hippuroyl bGRF(2-77)OH 0.33p-Chloro Hippuroyl bGRF(2-77)OH 0.19p-Fluoro Hippuroyl bGRF(2-77)OH 0.14p-Nitro hippuroyl bGRF (2-77)OH 0.51p-Methyl Hippuroyl bGRF(2-77)OH 0.05n- penylmalonamindoyl bGRF(2-77)OH 0.19

Tabulka II

Peotid_ EG5.Q- (nM.)** des Tyr-1 pGRF(2-76)0H 95.0

Hippuroyl-1 pGRF(2-76)OH 0.28 p-Methyl Hippuroyl pGRF(2-76)OH 0.06 p-Methyl f.enylmalonamindoyl pGRF(2-76)OH 0.06

Tabulka III

Peotid ._- _EC50 (nM)** p-Methyl hippuroyl pGRF(2-295NH2 0.02p-Methyl Hippuroyl pGRF(2-44)OH 0.07p-Methyl Hippuroyl pGRF(2-76)OH 0.06 20

Vynález se rovněž týká farmaceutických prostředků, kteréobsahují jakožto účinnou látku polypeptidovou sloučeninu vzorce Inebo její farmaceuticky vhodnou netoxickou sůl a farmaceutickyvhodný pevný nebo kapalný nosič.

Pro podáváni po 1ypeptidových sloučenin podle vynálezu parenterálně jsou vhodnými farmaceutickými formami pro vstřiková-ni sterilní vodné roztoky nebo disperze a sterilní prášky prozpracování na sterilní vstřikovate1 né roztoky nebo disperze.Nosičem může být rozpouštědlo nebo disperzní prostředí, jako jsounapříklad voda, ethanol, polyol (například glycerol, propylengly-kol, a kapalný polyethylenglykol), jejich vhodné vzájemné směsia rostlinné oleje. Vhodná tekutost se může udržovat napříkladpoužitím povlaku, jako lecithinu, udržováním požadované velikostičástic v případě disperze a použitím povrchově aktivních činidel.Prevence působeni mikroorganismů se může zajistit použitímrůzných antibakteriálnich a protihoubových činidel, jako jsou na-příklad parabeny, chlorbutanol, fenol a kyselina sorbová. V mnohapřípadech je .žádoucí včleňovat isotonická činidla, jako jsounapříklad cukry a chlorid sodný. Prodloužené absorpce vstřikova-telných forem se může dosáhnout použitím činidel prodlužujícíchabsorpci, jako jsou například monostearát hlinitý a želatina.

Sterilní vsřikovatelné roztoky se mohou připravovatvčleňováním sloučenin podle vynálezu v požadovaném množství dovhodného rozpouštědla popřípadě s jinými složkami. Popřípaděa pro účinnější rozděleni se sloučeniny mohou vnášet do systémůzpomalujících uvolňováni nebo do štítových uvolňovacích systémů,jako jsou polymerni matrice, liposomy a mikrokuličky. Sloučeninyse mohou uvolňovat z mechanických dávkovačích zařízeni, z osmo-tických pump nebo z jiného zařízeni nebo ze systémů, kterézajišťují nepřetržité dávkováni nebo pulzační dávkování.

Pro intravenozní podáváni (IV) se ve vodě rozpustná forma sloučeniny podle vynálezu může rozpouštět v některé kapalině 21 běžně používané pro intravenozní účely a může se podávat ve forměinfuze. Takovými kapalinami jsou například fysiologický roztok,Ringerův roztok nebo 5¾ roztok glukózy. Může se připravovatvhodná nerozpustná forma sloučeniny podle vynálezu a může sepodávat jakožto vodná báze nebo farmaceuticky vhodná olejová bázenapříklad ester mastné kyseliny s dlouhým řetězcem, jakoethyloleát.

Jednotkovou dávkovači formou sloučeniny podle vynálezu můžebýt roztok sloučeniny, s výhodou ve formě její soli, ve vhodnémředidle ve sterilní, hermeticky uzavřené ampuli. Koncentracesloučeniny se může měnit, například od 1 do 50 %, v závislosti napříslušné formě sloučeniny, na její rozpustnosti a na žádanépodávané dávce.

Vynález se také týká způsobu navozováni uvolňováni růstovéhohormonu, při kterém se podává účinné množství polypeptidovésloučeniny vzorce 1 nebo její farmaceuticky vhodné netoxické solispolu s farmaceuticky vhodným pevným nebo kapalným nosičem.

Sloučenina podle vynálezu se podává ošetřovanému jedinci podobu, po kterou je žádoucí stimulace uvolňování růstovéhohormonu. Hmotnost ošetřovaného jedince a způsob podáváni mají vlivna velikost dávky, nutnou pro navozeni žádané odezvy. Výhodnoudávkou v případě ovci je 0,01 až 3,0 mg/kg/den, nejvýhodnějši jedávka 0,5 mg/kg/den. Výhodnou dávkou v případě vepřů je přibližně3 až 10 pg/kg/den, nejvýhodnějši je dávka 3 pg/kg/den. Pro kachnyje výhodnou dávka přibližně 0,5 až 12 mg/kg/den, nejvýhodnější jedávka 3 mg/kg/den. Výhodná dávka u lidi je přibližně 0,03 až 1,0mg/kg/den, nejvýhodnějši je dávka 0,3 mg/kg/den.

Je obzvláště výhodné formulovat sloučeniny podle vynálezuvzorce I na jednotkovou dávkovači formu pro snadné podávánia rovnoměrnost dávky. Jednotkovou dávkovači formou se zde minifyzikálně oddělené jednotky vhodné pro jednotné dávkováníošetřovanému jedinci . Každá dávkovači jednotka obsahuje předemstanovené množství sloučeniny podle vynálezu, vypočtené prodosaženi žádaného terapeutického účinku, spolu s farmaceutickyvhodným nosičem. Specifická jednotková dávkovači forma se řídív přímé závislosti na /a/ charakteristikách jednotky daného 22 složení a /b/ na žádaném dosahovaném -terapeutickém působení. GRF a zvláště GRF sloučeniny podle vynálezu při vhodnémpodáváni ve formě terapeutického prostředku, vedou ke zvýšeníprodukce růstového hormonu v případě savců. Proto se podávánímsloučenin podle vynálezu může podobně dosahovat léčebnýcha zemědělsky vhodných výsledků. Jakožto příklady chorobnýchstavů, vhodných pro ošetřováni podáváním růstového hormonu, seuvádějí dwarfism) a osteoporosa. Jakožto jiná příznivá působenirůstového hormonu se uvádějí zvyšování libového masa, urychleniléčeni ran a boj proti vlivu stárnutí, kterých se může dosáhnoutpodáváním sloučenin podle vynálezu.

Polypeptidové sloučeniny podle vynálezu se mohou testovatnejrůznějšimi způsoby. Jedna zkouška in vivo se provádí zapoužiti krys, anestetizovaných pentobarbitalem (Wehrenberga kol., Biochem. Biophys. Res. Commun. 109, str. 382, 1982).

Uvolňováni růstového hormonu se měří in vitro za použiti buněkkrysí hypofýzy (Heimen a kol., Edocrinol., 116, str. 410, 1985). Následující příklady praktického provedení vynálezobjasňuji, nijak jej však neomezuji. Příklady provedeni vynálezu Přiklad 1

Příprava s pevnou fázi bGRF(2-77)0H GRF peptidy se syntetizuji metodikou pevné fáze za použitipeptidového syntetizéru Applied Biosystems 43OA (obchodnědostupné zařízení společnosti Applied Biosystems, Foster CityKalifornie) a syntezních cyklů, dodávaných společnosti AppliedBiosystems. Boc aminokyseliny a jiné reagencie jsou dostupnéu společnosti Applied Biosystems a u jiných dodavatelů. Sekvenc)aJkopulačních protokolů

Boc chemie, používající se používá pro dvojích výchozí p-methylbenzhydrylové aminopryskyřice pro produkci C-koncových karboxamidů. Pro produkci C-koncových kyselin se používá odpovídající PAM pryskyřice. Asparagin, glutamin, arginin, /a-(p-hydroxyfenyl)octové kyseliny/, /p-(p-hydroxyfenyl)propiono- 23 vé kyseliny/, p-hydroxypropionové kyseliny, p-hydroxyskořicovékyseliny a p-hydroxyfenoxyoctové kyseliny se kopuluji za použitipředem připravených hydroxybenzotriazolových esterů. VšechnyN-koncové adice se provádějí za použití HOBT aktivovanýchaminokyselin v syntéze s pevnou fázi.

PouŽivá se následující chráněni vedlejšího řetězce:

Arg, tosyl

Asp, cyklohexyl

Glu, cyklohexyl

Ser, benzyl

Thr, benzyl

Tyr, 4-bromkarbobenzoxy

Odstraňováni Boc chránící skupiny se provádí kyselinoutrifluoroctovou (TFA) v methylenchloridu. Po ukončení syntézypeptidů se odstraňuji chránící skupiny a produkt se odštěpí odpryskyřice bezvodým fluorovodíkem, obsahujícím 10 % meta-kresolu. Oštěpeni skupiny nebo skupin, chránících vedlejší řetězeca peptidu od pryskyřice y se provádí při teplotě O °C nebo přinižší teplotě, s výhodou při teplotě -20 ‘C. Po odstraněni fluorovodíku se systém peptid/pryskyřice promyje etherem a peptidse extrahuje ledovou kyselinou octovou a lyofilizuje se. Čištěnise provádí "size-exclusion" chromatografi i na sloupci SephadexuG-10 (Pharmacia) v 10¾ kyselině octové. Přiklad 2

Rekombinantní příprava GRF PEPTIDŮ

2.A. Rekombinantní exprese GRF(2-76)0H 2.A.I. Syntéza plasmidu pHS452

Zakódování Meti-pGRF(2-76)OH

Plasmid pHS452 je rekombinantní DNA expresní vektor, kterýprodukuje velké množství výhodné pGRF(2-76)0H polypeptidovésloučeniny podle vynálezu při kultivaci hostujících buněk zavhodných podmínek.

Lyofil E. coli K12 RV3O8/pHS19O je dostupný v organizaciNorthern Regional Research Laboratories (NRRL) Peoria, IL 61604,je uložený pod číslem NRRL B-18410 (datum uloženi: 9. záři 1988) i 24 js^ssEBsassa^wi' ϊ.’/,ύ a používá se ho přímo jakožto "kultury" při dále popsaném způsobu.Restrikčnl místo a funkce map plasmidu pHS19O jsou na obr. 1. 10 ml TY živné půdy (10 g tryptofanu, 5 g chloridu sodného a 5g kvasnicového extraktu na litr), obsahující 5 mg/ml tetracykli-nu, se naočkuje kulturou E. coli K12 RV3O8/pHS19O a inkubuje seza provzdušňovénl při teplotě 30 "C přes noc (po dobu 15 až 18hodin). Získané kultury se použije jakožto zdroje plasmidupHS190.

Naočkovává se 1 litr TY živné půdy, obsahující 5 mg/mltetracyklinu, kulturou E.coli K12 RV3O8/pHS19O a inkubuje se zaprovzdušňovénl při teplotě 32 ’C přes noc /15 až 18 hodin/.Kultura se pak odstředuje při otáčkách 5200/min v jednotceSorvall /DUPont Co., Instrument Products, Biomedical Division,Newtown, CT 06470) GSA rotor po dobu 10 minut při teplotě 4 ’C zazískáni pelet buněk. Vzniklý supernatant se vyhodí. Pelety buněkse resuspendujl ve 28 ml roztoku 25% sacharozy a 50 mMethylendiamintetraoctové kyseliny. Do buněčné suspenze se přidápřibližně 1 ml roztoku 20 mg/ml lysozynu v 0,25 M Tris-HCl /tris-(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid/, hodnota pH 8,0, a při-bližně 1,5 ml 0,5 M kyseliny ethylendiamintetraoctové, hodnotapH 8,0 a promísi se. Získaná směs se inkubuje na ledu po dobu15 minut. Přidají se 3 ml roztoku (připraveného smíšením 3 ml 10%Tritonu X—100 společnosti Rohm & Haa^, 75 ml 0,25 M kyselinyethylendiamintetraoctové, hodnota pH 8,0, a 7 ml vody) do buněkošetřených lysozymem za mírného mícháni. Získaný roztok seinkubuje na ledu po dobu dalších 15 minut.

Buněčné zbytky se odstraní z roztoku odstředěním přiotáčkách 17000/min v jednotce Sorvall SS34 rotor v průběhu 45minut při teplotě 4 “C. Přidá se přibližně 28,6 g chloridu česného a přibližně 1 ml roztoku 5 mg/ml ethidiumbromidu dopřibližně 30 ml supernatantu. Pak se objem upraví na 40 ml vodoua roztok se dekantuje do ultracentrifugové zkumavky. Zkumavka seutěsni a roztok se odstředuje při otáčkách 495OO/min v Ti70rotoru (Beckman, 7360 N. Lincoln Avenue, Lincolnwood, IL 60646)po dobu přibližně 18 hodin. Získaný plasmidový pás, zviditelněnýultrafialovým světlem, se izoluje, extrahuje se isopropano1em 25 ethidiumbromiduobjemů TE pufru1 mM kyselina nasyceným chloridem česným k odstranění a dialyzuje se proti třem změnám přibližně 20 (10 mM Tris-HCl), hodnota pH 7,5 a ethylendiamintetra- octová - EDTA). Dialyzát se shromáždí. Pak sepřidají dva objemy ethanolu a 0,05 objemů 3 M roztoku octanusodného. Ethanolová směs se ochladí na teplotu -20 "C a plasmidDNA se peletizuje odstředěním při otáčkách 10000 v průběhu 30minut v SS34 rotoru při teplotě -10 *C. Získaná peleta se resuspenduje v přibližně 1 ml TE pufru a pak se extrahuje stejnýmobjemem směsi feno 1:chloroform (1 : 1, objem/objem).DNA ve vodnéfázi se získá přidáním O,1 objemu 3M octanu sodného a dvou objemůethanolu, následnou inkubací při teplotě -20 ’C po dobu přibližně30 minut a odstředěním při otáčkách 15000/min v SS34 rotoruv průběhu 20 minut. Získaná DNA peleta se promyje nejdříve 70¾ethanolem a pak 100¾ ethanolem a vysuší se.

Shora uvedeným způsobem získaný přibližně 1 mg plasmidupHS190 DNA se suspenduje v 1,5 ml O,IX TE pufru a uloží se přiteplotě -20 ’C.Přibližně 10 mg plasmidu pHS190 DNA se digerujes restrikčnim enzymem EcoRI (přibližně 10 jednotek) v reakčni směsiobsahující DNA v EcoRI pufru (100 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,5, 5mM chloridu hořečnatého, 50 mM chloridu sodného). Reakčni směs seinkubuje po dobu dvou hodin při teplotě 37 "C.

Pro převedeni 5' převislých konců na vázané konce se přidá0,5 mM každé dNTP (dATP, dCTP, dGTP a TTP) spolu s 1 až 5jednotkami Klenowa fragmentu (Boehringer Mnnheim Biochemicals,7941 Castleway Dr., P.O. Box 50816, Indianopolis, IN 46250).Reakčni směs se inkubuje při teplotě 30 "C po dobu 15 minut, pakse enzym inaktivuje působením teploty 75 °C po dobu 10 minut. Re-akčni směs se extrahuje fenolem, systémem fenol/chloroform,chloroformem a pak se vysráží ethanolem.

Plasmid se resuspenduje v 50 ml roztoku, obsahujícího 40 mMTris-HCl, hodnota pH 7,5, 1O mM chloridu hořečnatého, 10 mMdithiotreitolu (DTT), 0,5 mM adenosintrifosfátu a 1 jednotku T4 DNA ligazy (Boehringer-Mannheim Biochemicals, 7941 CastlewayDrive, Indianopo1is, IN 46250). Reakčni směs se inkubuje přes nocpři teplotě 14 °C. 26

Ligatovaná směs se převede do E. co li K12 RV3O8 (dostupnáu organizace NRRL jakožto NRRL B-15624) způsobem, který popsalManiatis a kol., Molecular Cloning, str. 250 až 251 (Cold SpringHarbor Press, 1982). Naočkovává se 100 ml TY živné půdy v baňceo obsahu 500 ml 1 ml kultury RV3O8 přes noc. Buňky se nechávajírůst za intenzivního protřepáváni při teplotě 37 °C až na hustotupřibližně 5 x 10 buněk/ml. Kultura se vnese na led na dobu 1Ominut, pak se odstředuje při 4000 x g po dobu 5 minut při teplotě4 °C. Buňky se resuspendují v 50 ml ledově chladného 50 mMchloridu vápenatého v 10 mM Tris-HCl, hodnota pH 8,0. Buňky seopět inkubují na ledu po dobu 15 minut a znova se odstředí. Buňkyse resuspendují v 3,3 ml roztoku chloridu vápenatého.Ligačni směsse přidá do 200 ml buněk a inkubuje se na ledu po dobu 30 minut.Buňky se převedou do vodní lázně o teplotě 42 cC na dobu dvouminut. Přidá se 1 ml TY živné půdy do zkumavky a buňky seinkubují po dobu jedné hodiny při teplotě 30 °C. Na TY agarovédestičky (TY živná půda + 1,5 % agaru), obsahující 5 mg/1tetracyklinu se vnesou dva 100 mikrolitrové podíly a ponechají serůst přes noc při teplotě 30 °C.

Plasmid se pak resuspenduje v 10 ml vody. Vektor segeneruje digerováním plasmidu s Xbal a BamHI. Přidá se přibližně1 ml Xbal (přibližně 10 jednotek) do 10 ml plasmidu DNA(přibližně 10 jednotek) a 5 ml Xbal pufru (500 mM Tris-HCl,hodnota pH 8,0, ÍOO mM chloridu hořečnatého a 500 mM chloridusodného). Po inkubaci při teplotě 37 °C po dobu 90 minut se přidá0,5 ml 5 M chloridu sodného a 1 ml BamHI (10 jednotek)a v inkubaci se pokračuje při teplotě 37 °C po dobu dalších 90minut. Reakčni směs se pak podrobuje agarosové gelovéelektroforeze a při přibližně 5,75 kb Xbal-BamHI vektorovýfragment se izoluje elektroeluci s následným vysráženimethanolem. Následující DNA sekvence se syntetizuje na syntetizeru

Applied Biosystems Model 38OB způsobem dobře známým pracovníkům v oboru. Proces, při kterém se konstrukce syntetického genu dosahuje dělením sekvence na oligonukleotidy a následnou ligaci těchto oligonukleotidů, je v podstatě stejný, jak ho popsal Brown 3® - 27 - akol., Methods in Enzymology 68, str. 109, 1979. Následující DNAsekvence zakodovává výhodný polypeptid podle vynálezu, přičemž A9 = Asn, A12 = Arg, Al5 = Thr, A21 = Arg, A22 =

Leu, A25 = Asp, A27 = Leu, A28 - Ser, A38 = Gin, A39 = Gly, A40 = Ala, A42 =.Val, a: Z = Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Asp-Gln-Arg-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Al*a-Thr-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly, pozitivní kmen této sekvence zahrnuje:

ATG GCT GAT GCT ATT TTT ACT AAT AAT TAT CGA CGC GTT CTT ACT CAG CTG TCT GCT CGT CGT CTG CTG CAG GAT ATT CTG TCT CGT CAG CAG GGT GAA CGT AAC CAG GAA CAA GGA GCT CGT GTT CGT CTT GGT CGT CAG GTT GAT TCT CTG TGG GCT GAT CAA CGT CAG CTT GCT CTC GAG TCT ATC CTG GCT ACT CTG CTG CAG GAA CAT CGT AAT TCT CAG GGT TAA TAG DNA, obsahující kódovací sekvenci, se pak misi s Xbal- BamHIshora konstruovaným vektrovým fragmentem a váže se na něj. Směsse pak transformuje v E. coli, jak shora popsáno. Plasmid DNAtransformátu, odolného tetracyklinu, se analyzuje restrikčni enzy-movou digesci k ověřeni, že plasmidem je pHS4562. 2.A.2 Syntéza plasmidu pHS500

Zakódování Metj-bGRF(2-76)0H

Hovězí odvozené rekombinantni GRF PEPTIDY se produkuji v pod-statě způsobem podle přikladu 2.A.1. Avšak při produkci rekombi-nantniho hovězího GRF PEPTIDU sekvence DNA zakodovává výhodný po-pyleptid podle vynálezu, přičemž A9 = Ser, A12 =

Arg, A15 = Thr, A21 = Arg, A22 = Leu, A25 = Asp, A27 = Leu, A28 = Asn, A38 = Gin, A39 = Gly, A40 = Ala, A42 = Val, a - 28 - Z = Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Gly-Val-Trp-Thr-Asp-Gln-Gln-Gln-

Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-Thr-Leu-Val-Ser-Leu-Leu-Gln-Glu-Arg-

Arg-Asn-Ser-Gln-Gly,

pozitivní větvi této DNA sekvence » je ·' ATG GCT GAT GCT ATT TTT ACT AAT TCT TAT CGT CGT GTC CTT ACT CAG CTG TCT GCG CGC CGT CTG CTG CAG GAT ATC CTG AAT CGT CAG CAA GGT GAA CGT AAT CAG GAA CAA GGT GCT CGT GTA CGT CTG GGT CGC CAA GTT GAT GGT GTT TGG ACT GAT CAA CAG CAG CTT GCT CTC GAG TCT ATA CTA GTT TCT CTG CTG CAG GAA CGT CGG AAT TCT CAA GGT TAA TAG DNA, obsahující kódovací sekvenci,vektorovým fragmentem a váže se s nim,

2.A.I. Směs se transformuje v E. colipopsáno. Plasmid zakodujíci bGRF pHSSOO. Plasmid DNA transformátu, odolného tetracyklinu, seanalyzuje restrikčni enzymovou digesci k ověřeni, že plasmidem jePHS5OO. se misi s Xbal-BamHIjak popsáno v přikladuK12 RV3O8, jak shora sekvenci se označuje jako

2.A.3 Syntéza DNA zakodujíci Meti-hGRF(2-46)OH

Lidské odvozené rekombinantni GRF PEPTIDY se produkuji v pod- statě stejně, jako je popsáno v přikladu 2.A.I. Avšak podle vý-hodného provedeni vynálezu se pro produkci lidského rekombinant-ního GRF PEPTIDU používá modifikovaného hGRF peptidu, přičemž: A9 = Ser, A12 = Lys, A15 = Gly, A21= Lys, A22 = Leu, A25 = Asp, A27 - Met a A28 = Ser, Y obsahuje aminokyselinovou sekvenci:Glu-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu a Zznamená nulu: Pozitivní sekvence větve DNA sekvence zakodujícitento peptid zahrnuje sekvenci:

ATG GCT GAC GCT ATC TTC ACT AAC TCT TAC CGT AAA

GTT CTG GGT CAG CTG TCT GCT CGT AAA CTG CTG CAG

GAC ATC ATG TCT CGT GAG CAG GGT GAA TCT AAC CAG

GAA CGT GGT GCT CGT GCT CGT CTG TAA 29 DNA, obsahující kódující sekvenci, se pak mísí s Xbal-BamHIvektorovým fragmentem a váže se, jak uvedeno v odstavci 2.A.I.Směs se transformuje v E.coli K12 RV3O8, jak shora popsáno.Příklad 2.B.

Izolace rekombinantnich GRF PEPTIDŮ 2.B.I. Exprese GRF analogu v E. coli E.coli K12 RV3O8/pHS451 se nechá růst v živné půdě TY,obsahující 5 mg/ml tetracyklinu při teplotě 32 °C až do dosaženístavu buněk "mid-log" fáze. Teplota směsi se zvýší na 42 "Ca v inkubaci se pokračuje přibližně po další tři hodiny.K teplotě citlivý represor cI857 promotoru lamda pL, umístěnýk navozeni exprese GRF analogu na plasmid pHS451 se inaktivujepři teplotě 42 °C, čímž se umožní exprese GRF analogu. ExpresebGRF PEPTIDU je v podstatě stejná, jak shora popsáno pro pGRFs tou výjimkou, že se používá plasmidu pHS5OO místo pHS452. 2.B.2 Izolace granulí obsahujících GRF analog Při použití vysoce koncentrovaného E.coli expresního systé- mu, jak příkladně uvedeno, se bllkovinový produkt sekvestrujev inklužni formě nebo v granulích. Granule, obsahující GRF ana-log, se izoluji a solubilizuji se k izolaci příslušného GRF pep-tidu. Především se všechny buňky odstředují, pak se resuspendujive vodě o teplotě 10 "C. Suspenze buněk se homogenizuje v homoge-nizeru Gaulin za přetlaku 55200 kPa. Homogenizovaná suspenze, sezředí vodou a míchá se po dobu 10 minut, načež se hodnota pHnastaví na 8,4 až 8,6 10¾ roztokem hydroxidu sodného. Směs se pakodstředí. Pevnými podíly jsou granule obsahující GRF analog, kte-ré se zmrazí na -70 °C až do dalšího použití. 2.B.3 Konečné čištění GRF analogu

Granule, připravené způsobem podle odstavce 2.B.2, se nechají roztát při teplotě 2 až 5 °C. Granule se solubilizuji

přidáním deseti objemů systému 0,05 N kyselina octová - 7M močovina a homogenizuji se po dobu 5 až 8 minut. Hodnota pH se - 30 - se nastaví na 2,5 až 2,6 přidáním 10¾ kyseliny chlorovodíkové. Směsse míchá po dobu 12 až 15 hodin při teplotě 2 až 5 “C. Roztok sevyčeří filtraci filtrem Sparkler povlečeným filtrační pomocnoulátkou Dicalite Speedes (Grefco, Torrance, CA). Vodivost roztokuse snlži na méně než 4000 mohm zředěním roztokem kyseliny octovéa močoviny. Připrav! se katexový sloupec za použiti pryskyřice SSepharoseR (Pharmacia, 800 Centennial Ave., Piscataway NJ 08854).Sloupec obsahuje jeden litr pryskyřice na 50 g mateřiálu.Ma-teriál se vnese na sloupec rychlosti 0,1 1/cm/h a promývá se dvě-ma objemy sloupce 0,1 M chloridu sodného v roztoku kyseliny octovéa močoviny. Analog GRF se eluuje lineárním gradientem 0,25 M až1,6 M chloridu sodného v systému kyselina octové - močovina zapoužiti tři objemů sloupce, přičemž se shromažďuji frakce vždyz O,1 objemu sloupce. Frakce obsahující analog GRF se identifiku-ji podle vodivosti O.D.276; HPLC a po 1yakrylamidovou gelovou elektroforezou. Tyto frakce se pak spoji.

Stejný objem roztoku systému kyselina octová - močovina sepřidá do spojených frakci. Materiál se pak nanese na sloupecpryskyřice S SepharoseR v systému kyselina octová - močovinao rozměru pro 50 g bílkoviny na litr pryskyřice. Průtokovárychlost je 0,02 l/cm2/h. Frakce analogu GRF se eluuji lineárnímgradientem 0,25 M až 1,2 M chloridu sodného v systému kyselinaoctová - močovina. Shromažďuji se frakce o objemu 0,1 sloupce.Frakce se analyzuji, jak shora uvedeno a spoji se frakceobsahující analog GRF. Připraví se sloupec Sephadexu R G-15 (Pharmacia) v 0,02 Mglycinu, hodnota pH 2,5 a objem sloupce odpovídá pětinásobkuobjemu spojených frakcí. Izoluje se frakce s plkem O.D.276. Připrav! se sloupec obsahující pryskyřici SP20SS (SephabeadsR,Mitsubishi Chemical, Tokyo) v systému 10 % acetonitrilu - 0,02 Mglycinu o hodnotě pH 2,5. Připraví se roztok, obsahující spojenýGRF analog 10¾ v acetonitrilu a vnáší se na sloupec rychlosti 1,5až 2 objemy sloupce za hodinu. Sloupec se promyje dvěma objemysloupce pufru acetonitri1-glycin. Analog GRF se eluujegradientem, vytvořeným třemi objemy sloupce systému 10¾ acetonit- - 31 - ril - 0,02 M glycin, smíšenými se třemi objemy sloupce 50% aceto-nitril - 0,02 M glycin. Shromáždí se frakce 0,1 objemu sloupce a zkouší se na analog GRF.

Materiál, obsahující analog GRF se pak chromatografuje nasloupci SephadexR G15 vyváženém v O,25 M kyselině octové. PikO.D.276 se pak izoluje a lyofilizuje se až do dalšího použití.Příklad 3

Příprava hippuroyl-l-pGRF(2-76)OH

Rozpustí se 3,58 g benzoylglycinuu (obchodně dostupnýu společnosti Transworld Chemicals) v přibližně 20 mldimethylformamidu za mícháni a chlazeni v ledové lázni. Doroztoku se přidá 2,5 g N-hydroxysukcinimidu a pak 4,5g dicyklohexylkarbodiimidu /DCC/. Reakčni směs se míchá přes noca zároveň se nechá ohřát na teplotu místnosti. Při reakci vytvořená nerozpustná dicyklohexylmočovina (DCU)se odfiltruje a dimethylformamidový filtrát se zkoncentruje vevakuu, zbytek se zředí dichlormethanem. Vytvořená sraženina seodfilrtujc η vysuší se ve vakuu, čímž se získá 3,79 gsukcinimidylhippuroátu. Přibližně 72 mg pGRF(2-76)0H, připraveného v podstatě, jakoje popsáno shora v odstavci 2.A, se rozpustí ve 3 ml O,1 MTris-HCl, hodnota pH 7,8, 30% propanol za míchání při teplotěmístnosti. Do reakčnmí směsi se přidá 57 mg sukcinimidyl-N-benzoylglycinátu a reakčni směs se míchá přiteplotě místnosti za odebrání 5 μΐ vzorků za 15 minut, za 1hodinu a za 2 hodiny po zavedení sukcinimidy1-n-benzoylglycinátupro sledování postupu reakce. Každý z těchto vzorků se zředí na500 μΐ 0,1% TFA (0,15 až 0,20 mg/ml) a vstřikne se na sloupec0,46 x 15 cm pryskyřice Vydac C18 pro analýzu RP-HPLC a prosrovnáni s výchozím materiálem.

Po 2,5 hodinách se reakčni směs okyselí přibližně 1 mlledové kyseliny octové a vnese se na sloupec 2,2 x 28,5 cmpryskyřice Sephadex G-10. Sloupec se eluuje 10% kyselinou octovoua shromaždují se 7,5 ml frakce. Stáno)ví ne ΛΒ5., každé frakcek indikaci přítomnosti peptidu. Frakce 7 až 10, obsahujícípeptid, se spojí, vymrazí se a lyofilizuji se, č i íp.ž ne získá 70 32 mg lyofi1izátu. Přibližně 9 mg vzorku se rozpustí v 1,O ml 0,1 % TFA.Roztok se rozdělí na 10 podílů o objemu 0,1 ml, které se zmrazía lyofilizují se. Vzorek lyofilizátu se podrobí FAB/MSspektrometrii (Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry). Druhývzorek se podrobí aminokyselinové sekvenční analýze. Přiklad 4

Příprava p-methylhippuroyl pGRF(2-76)OH Část A. Syntéza p-methylbenzoylglycinu Přibližně 7,5 g glycinu se rozpustí v roztoku, obsahujícím 105 ml 2N hydroxidu sodného a 50 ml dioxanu, za mechanického mí-cháni při teplotě O až 5 °C. Přibližně 14,9 ml p-toluoylchloriduse zředí na objem 50 ml dioxanem a přidá se po kapkách do reakčnísměsi v průběhu 15 až 20 minut. Reakční směs se míchá přes noc zaudržováni teploty zahříváním na 25 "C (teplota místnosti).

Reakční směs se alkalizuje vodným roztokem hydroxidu sodnéhoa extrahuje se diethyletherem. Vodná fáze se okyselí na hodnotupH 3,0 6N kyselinou chlorovodíkovou. Vodná fáze se extrahujeethylacetátem, ethylacetátový roztok se promyje vodou a vysuši sesíranem hořečnatým, zfiltruje se a filtrát se zkoncentruje vevakuu téměř k suchu. Pevné podíly se suspendují v diethyle<beru,zfiltruje se a vysuší se ve vakuu, čímž se získá 14,25 gproduktu, který se pak identifikuje jakožto p-methylhippurovákyselina. Identita produktu se potvrzuje teplotou tánía elementární spalovací analýzou, přičemž výsledky se dobřeshoduji s hodnotami pro p-methylhippurovou kyselinu. Teplota tániprodukované sloučeniny je 151 až 154 ”C. Výsledky elementárníspalovací analyzy jsou uvedeny v tabulce.

Část B. Syntéza p-methylhippuroyl pGRF(2-76)0H Přibližně 1,65 g kyseliny p-methylhippurové, připravené v podstatě stejně, jako je shora uvedeno v příkladu 4, část A, se rozpustí v 15 ml dimethylformamidu za míchání a chlazeni v ledové lázni. Do roztoku se přidá přibližně 1 g N-hydroxysukcinimidu a pak 1,9 g DCC. Reakční směs se míchá přes noc a zahříváním se udržuje teplota na teplotě místnosti (25 °C). 33 DCU sraženinazkoncentruje ve vakuu,k určité krystalizaci, se izoluje odfiltrováním a filtrát seZbylý olej se zředí diethylethrem a dojdePevné podíly se izoluji filtrací, promyji se diethyletherem a vysuší se ve vakuu, čímž se získá 3,28 g pro-duktu o teplotě táni 167 až 170 °C. Produkt se analyzuje elementární spalovací analýzou a výsledky se porovnávají s teo-retickými hodnotami, očekávanými pro sukcinimidylester p-methyl-hippurové kyseliny (C24Hi4N20j)· Přibližně 72 mg pGRF(2-76)0H, připraveného v podstatě jakopodle příkladu 2.A., se rozpustí v7,8, 30% propanolu za mícháni připřidá 57 mg a reakčni směs 3 ml 0,1 Tris-HCl, hodnota pHteplotě místnosti. Do reakčnisukei nimidylesteru p-methylhippurové se míchá při teplotě místnosti za směsi sekysel inyodebírání 5 μΐ vzorků 15 minut, jednu hodinu a dvě hodiny pozavedení sukcinimidyl-N(p-methyl)hippurové kyseliny ke sledovánipostupu reakce. Každý ze vzorků se zředí na 500 ml 0,1% TFAa vstřikuje se na 0,46 x 15 cm sloupec pryskyřice Vydac C18 proRP-HPLC analýzu a porovnává se s výchozím materiálem.

Po 2,5 hodinách se reakčni směs okyselí přibližně 1 mlledové kyseliny octové a vnese se na 2,2 x 28,5 cm sloupec Se-phadexu G-10. Sloupec se eluuje 10% kyselinou octovou a 7,5 mlfrakce se shromažďují. Stanoví se ABS2so každé frakce k indikacipřítomnosti peptidylové sloučeniny. Frakce 7 až 10, indikujícípřítomnost polypeptidu, se spojí, zmrazí se a lyofilizuji se,čímž se získá 70 mg lyofilizátu. Příklad 5

Příprava p-chlorhippuroyl bGRF(2-77)OH Příprava p-chlorhippuroylového GRF derivátu je v podstatě stejná, jako je popsáno v přikladu 4, místo p-to1uoy1chloridu sevšak použije p-chlorbenzoylchloridu ve fázi podle odstavceA a bGRF(2-77)OH GRF PEPTID se připravuje v podstatě stejně, jakoje popsáno shora v přikladu 1 (pevná fáze). Přiklad 6

Příprava p-nitrohippuroyl bGRF(2-77)OH r')<· < ι ν·'. ·' (v./?·';)λ ?'>"·/.?.V/··k s;.-/'V,.'ν:' r;ϊΐ.'.;: '·'-;‘?.7λ"λ ··:·'<·.’.b ! Λ ·.Λ-i; - 34 - Příprava p-nitrohippuroylového GRF derivátu je v podstatěstejné, jako je popsáno v přikladu 4, místo p-toluoylchloridu sevšak použije p-nitrobenzoylchloridu ve fázi podle odstavceA a bGRF(2-77)OH GRF PEPTID se připravuje v podstatě stejně, jakoje popsáno shora v přikladu 1 (pevná fáze). Příklad 7

Příprava p-hydroxyhippuroyl bGRF(2-77)OH Příprava p-hydroxyhippuroylového GRF derivátu je v podstatěstejná, jako je popsáno v příkladu 4, místo p-toluoylchloridu sevšak použije p-hydroxybenzoylchloridu ve fázi podle odstavce Aa bGRF(2-77)OH GRF PEPTID se připravuje v podstatě stejně, jakoje popsáno shora v přikladu I (pevná fáze). Přiklad 8

Příprava p-f1uorhippuroyl bGRF(2-77)OH Příprava p-fluorhippuroylového GRF derivátu je v podstatěstejná, jako je popsáno v přikladu 4, místo p-toluoylchloridu sevšak použije p-fluorbenzoylchloridu ve fázi podle odstavceA a bGRF(2-77)OH GRF PEPTID se připravuje v podstatě stejně, jakoje popsáno shora v přikladu 1 (pevná fáze). Přiklad 9

Příprava N-fenylmalonamindoyl-l-bGRF(2-77)OH

Rozpustí se přibližně 9,1 ml (0,1 mol) anilinu ve 100 ml dichlormethanu za mechanického mícháni a při teplotě 25 OC. Doroztoku se přidá 15,1 g uhličitanu draselného a pak po kapkách 14ml ethylmalonylchloridu ve 20 ml dichlormethanu. Reakční směs semíchá po dobu 3 až 4 hodin při teplotě 25 ‘C a nechá sepostupovat po dobu přibližně 72 hodin. Reakční směs se zředípřibližně 500 ml systému voda/dichlormethan. Směs se protřepea dichlormethanová fáze se oddělí, promyje se nejdříve vodnoukyselinou chlorovodíkovou a pak vodou a vysuší se síranemhořečnatým, zfiltruje se a filtrát se odpaří, čímž se získá olejv množství 14,5 g. Přibližně 14 g ethy1-N-feny1malonamidu, připraveného shora,se rozpustí ve 25 ml dioxanu a 75 ml 1N roztoku hydroxidu 35 sodného. Reakčni směs se míchá při teplotě 25 *C po dobu přibliž-ně tří hodin.

Reakčni směs se extrahuje diethyletherem za udržováni alkalického prostředí. Vodná fáze se okyselí 6N kyselinouchlorovodíkovou, extrahuje se ethylacetátem a vysuší se síranemhořečnatým. Ethylacetátový filtrát se odpaří k suchu. Pevnálátka se trituruje s ethyl etikem, zfiltruje se a vysuší se vevakuu, čímž se získá 5,1 g produktu. Produkt se analyzujeelementární spalovací analýzou a 3H-NMR analýzou. Výsledkyukazuji, že produktem je N-fenylmalonamid kyseliny nebo monoamidN-fenylmalonové kyseliny. N-jrinyl malonamid kyseliny se kopuluje na bGRF(2-77)pryskyři-ci prostřednictvím HOBT esteru. Přiklad 10

Příprava N-fenylmalonamindoyl-l-pGRF(2-77)OH Připraví se 3,58 g N-fenylmalonamidkyseliny v podstatě stej-ným způsobem, jako je shora popsáno v přikladu 9, a rozpustí sepřibližně ve 20 ml dimethylformamidu za mícháni a chlazenív ledové lázni. Do roztoku se přidá 2,5 g N-hydroxysukcinimidua pak 4,5 g dicklohexylkarbodiimidu (DCC). Reakčni směs se míchápřes noc při teplotě místnosti za zahříváni. DCU se odfiltruje a dimethylformamidový filtrát se zkoncen-truje ve vakuu. Zbytek se zředí diethylethrem. Vytvořenásraženina se odfiltruje a vysuší se ve vakuu, čímž se získá 3,79g sukcidimylesteru N-fenylmalonamidkyseliny. Přibližně 72 mg pGRF(2-76)0H, připraveného v podstatěstejně, jako je popsáno shora v příkladu 2.A, se rozpustí ve 3 ml0,1 M Tris-HCl, hodnota pH 7,8, 30% propanol za mícháni přiteplotě místnosti. Do reakčni směsi se přidá 57 mg shorapřipraveného sukcidimylesteru N-fenylmalonamidkyseliny a reakčnisměs se míchá při teplotě místnosti za odebírání 5 μΐ vzorků 15minut, jednu hodinu a 2 hodiny po zavedení sukcidimidylesteruN-fenylmalonamidkyseliny ke sledováni postupu reakce. Všechnyvzorky se zředí na 500 μΐ 0,1% TFA /0,15 až 0,20 mg/ml)a vstřikuji se na 0,46 x 15 cm sloupec pryskyřice Vydac C18 pro - 36 - RP-HPLC analýzu a výsledky se porovnávají s výchozím materiálem.

Po 2,5 hodinách se reakčnl směs okyselí přibližně 1 ml ledové kyseliny octové a nanese se na 2,2 x 28,5 cm sloupec SephadexuG-1O. Sloupec se eluuje 10% kyselinou octovou a 7,5 ml frakce seshromažďuji. Stanoví se ABS2eo každé frakce k indikaci pří-tomnosti polypeptidylových sloučenin. Frakce 7 až 10 se zjiště-nou přítomnosti polypeptidu se spoji, zmrazí se a lyofilizujise, čímž se získá 70 mg lyofilizátu. Přiklad 11

Prostředek obsahující p-methylhippuroy1 pGRF (2-76)OH Připraví se roztok nosiče rozpuštěním 1,38 g dihydrogenfos-forečnanu sodného a 1,0 g PSA ve vodě prosté pyrogenu, které sepoužije do konečného objemu jeden litr, přičemž je hodnota pHpřibližně 5,1. Do 64 ml nosičového roztoku se přidá 27,4 mgThe p-methylhippuroyl pGRF (2-76)OH, připraveného způsobem v pod-statě podle přikladu 4.B k dosaženi konečné koncentrace 360mi 1iekviValentů na ml. Přiklad 12 Působeni in vivo p-methylhippuroyl pGRF (2-76)0H při subkutannimvstřiknuti nebo intravenoznim podáni třikrát denně vykastrovanémukanci.

Skupina 20 křížených vykastrovaných kanců o středníhmotnosti přibližně 72 kg, s vnitřním katerem chirurgicky vnesenýmdo stehenní cévy se použije ke stanovení účinku p-methylhippuroylpGRF (2-76)OH. Připraví se prostředek p-methylhippuroyl pGRF(2-OH) v podstatě podle přikladu 11 a vstřikuje se třikrát denněv množství 10,0 pg/kg/injekci bud intravenozně (I.V.) nebo subkutanně /S.Q.). Vykastrovaní kanci se krmi 2000 g 18,5% suro-vým kukuřičným sojovým krmivém, rovnoměrně rozděleným na dvěkrmeni v 8:00 dopoledne a ve 4:00 odpoledne. Kanci dostávajíinjekci v 8:00 , v 16:00 a ve 24:00. Shromažďuji se hodnoty exkrece urinárniho močovinového dusíku v průběhu 1 5 denní kon- trolní periody, 4 3 denní periody ošetřeni a 2 3 denní periody po ukončeném ošetřeni. V průběhu 24 hodin se shromáždi 30 vzorků 7/ - 37

Vzorky séra se zkoušejí se inzulín, FFA a triglyceridy. ou v tabulce IV. krevního séra 12. den ošetřeni,zřetelem na GH, BUN, glukózu,Střední hodnoty výsledků zkoušek js

Tabulka IV TRT. ó.i np HIOČU — zina., GH BUN TIU··— ...kózp FFA TRTG. TN^TTT.TM - a/dsv na/ml JTia/dl tna/dl UM/la CONT. IV o 27,5* 2,5* 15,8* 95,4* 55,8* 23,8* 20,8* / TRT. IV 30 16,3b 9,9b 7, 0b 132.7bi 97,3b 35,3b 76, 8b CONT. SQ 0 28,0a 2, la 15,5* 101,4* 55,9* 24,3a 22,8* TRT. SQ 30 16,4b 8.,9b 7,5b 147,3b 97.5b/ 32.5*b / 112^90 TRT. = p-methylhippuroyl pGRF (2-76)OH se vstřikuje třikrát den-ně odpovídajícím způsobem podáni

Conr. = kontrolním vykastrovaným kancům se vstřikuje třikrát den-ně roztok nosiče (fosfátový pufr) odpovídajícím způsobempodání (a,b) = středy stejného sloupce se stejnými písmeny nejsou od-lišné P<.O5, Student-Newman-Keuls GH = hladina růstového hormonu

Hodnoty dokládají, že p-methyl-hippuroyl pGRF (2-76)OH,vstřikovaný třikrát denně v množství 30,0 pg/kg/den, je velmianabolický, jak dokládá snížení extrece urinárniho močovinovéhodusíku (41 a sníženi hladiny BUN v seru (54 %). Vstřikováni p-methylhippuroyl pGRF (2-76)0H způsobuje čtyřnásobné zvýšeníhladin GH v seru (viz obr. 4), které je spojeno se vzdůstemhladiny glukózy, inzulínu, FFA a triglyceridů v seru. Nejeví sežádný rozdíl odezvy v seru v závislosti na způsobu podáni,s výjimkou hladiny inzulínu v seru, která vzrůstů více přisubkutannim vstřikováni kancům než při intravenozním podání. Takédeprese exkrece urinárniho močovinového dusíku /viz obr. 5) jeprodloužená pro 2 až 3 dny po ukončeném ošetření subkutannicestou v případě kastrovaných kanců. 'Λ',’·' ·.<···., - 37a-

Průmyslová využitelnost

Nové analogy faktoru uvolňujícího růstový hormon (GRF) s mo-

difikovaným aminokoncem, majici vyšší účinnost než nativní GRF a dosud známé analogy, použitelné pro zvyšováni’ libového masa

Claims (18)

1. - 38 - PATENTOVÉ NÁROKY

   1 . Superaktivní analog GRF vzorce I XI- AIa-Asp-Ala-I1e-Phe-Thr-Asn-A9-Tyr-Arg-A12-Val Ser -AIa-Arg-A21-A22- •Leu-GlΠ-Α25-Ι1e-A27-A28-Arg-Y kde znamená A9 Ser, Ala, Leu, Thr, nebo Asn, A12 Arg nebo Lys, A15 Gly, Ala, Thr nebo Leu A21 Arg nebo Lys, A22 Ala nebo Leu, A25 Asp nebo Glu, A27 Met, Ser, Arg, Leu nebo norleucin, A28 Ser nebo Asn, Y 0 nebo peptid s 1 až 15 aminokyselinami, Z 0 nebo peptid s 1 až 32 aminokyselinami, : i' CJ Γ' '« 6 -:A t : ě B B t •Γ-0 XI karboxylovou koncovou skupinu obecného vzorce-COORa, -CRaO, -CONHNHRa, -CON(Ra)(Rb) nebo CH2ORakde znamená Ra a Rb na sobě nezávisle nižši alkylovou skupinu, atomvodíku, Hse(lakton), HseOH nebo HSeN(Rc)(Ra), kdeznamená Rc a Ra na sobě nezávisle atom vodíku ne-bo nižší alkylovou skupinu, acylovou skupinu obecného vzorce O Ri-A-(CH2)a“(NH)c-B-(NH)b~(CH2)a-CH-C- I r2 kde znamená Rj atom vodíku, skupinu methylovou, ethylovou, hydroxyethy-lovou, fenylovou, nebo fenylovou substituovanou popřípaděatomem halogenu, nižši alkylovou skupinou, nižší alkoxy-skupinou, hydroxyskupinou, nitroskupinou nebo aminoskupi-nou, acetamidoskupinu, trifluormethylovou skupinu,skupinuvzorce -CH2-OH nebo sulfamidoskupinu, nebo pětičlennou - 39 - - 1.Ω V O U,_fe.HyJ.JLVtUl·^_nebo fenylnvon gilhRtitlinvapnn pnplUpa-ri* atomem—ha4-ogeŤHJH—nl-žAí_alkýlovou skupí ηη-n-,—rrižšl—alkoxy- sknp-i nnu T—h.v.drnyyskupinou ni4-rnninip4wftn aminIIUÍupŤ-- hoaí-í—acetamidoskupinu,—tri f-1 uumm Lliyl U9ou skupinu, skupinu vz-e^^ca——Clij! OH nebo-sul famiduakupinu?··! nebo—pétiěíennou nebo šestičlennou heterocykl ickou skupinu obsahujícíjeden nebo několik heteroatomů ze souboru z'ahrnujicíhoatom dusíku, kyslíku a síry, a nulu, 1, 2 nebo 3, b nulu nebo 1, c nulu nebo 1, d nulu až 12 A nulu, atom kyslíku nebo siry, B skupinu karbonylovou, sulfonylovou nebo sulfinylovou, R2 atom vodíku, methylovou skupinu, skupinu -CH2OH, p-hydroxybenzylovou skupinu nebo skupinu obecného vzorceO -(CH2)e“C-R3kde znamenáe nulu až 5 R3 skupinu methylovou, ethylovou, hydroxyethylovou,amino-skupinu, hydroxylovou skupinu, fenylovou skupinu nebofenylovou skupinu substituovanou atomem halogenu,alky-lavou skupinou, alkoxyskupinou, hydroxyskupinou,nitro-skupinou nebo aminoskupinou, acetamidoskupinu nebo sulf-amidoskupinu nebo pětičlennou nebo šestičlennou hetero-cykl ickou skupinu obsahující jeden nebo několik atomůze souboru zahrnujícího atom dusíku, kyslíku a siry a jeho farmaceuticky vhodné netoxické soli.
2. 2. Superaktivni analog GRF podle nároku 1 vzorce I, kde zna- /mená a O, b 1, B karbonylovou skupinu, c O, d O a A O. Superaktivni zfnalog GRF podle nároku 2 vzorce I, kde skupi- na Ri je volena ze souboru zahrnujícího skupinu methylovou,fenylovou, p-nitrofenylovou, p-chlorfenylovou, p-f1uorfenylovou,p-hydroxyfenylovou, p-methylfenylovou, p-benzylovou (isonikotiny- 3. - 40 - 1ovou).
3. 4. Superaktivni analog GRF podle nároku 3 vzorce I, kde sku-pina R2 je volena ze souboru zahrnujícího vodík,methylovouskupinu a hydroxymethy1ovou skupinu.
4. 5. Superaktivni analog GRF podle nároku 3 vzorce I, kde R2znamená atom vodíku.
5. 6. Superaktivni analog GRF podle náíoku 1 až 5 vzorce I,kdeA9=Asn, A12=Arg, A15=Thr, A21=Arg, A22=Leu, A25=Asp, A27=Leu and A28=Ser, .
6. 7. Superaktivni analog GRF podle nároku 6 vzorce I, kde Yzahrnuje peptid s aminokyselinovou sekvencí G1n-Gln-Gly-Glu-Arg,Asn,G1n-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-Arg-Leu nebojejí funkční derivát.
7. 8. Superaktivni analog GRF podle nároku 7 vzorce I, kde Zzahrnuje aminokyselinovou sekvenci Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Asp-Gln-Arg-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-lle-Leu-Ala-Thr-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly, nebo její funkční derivát.
8. 9. Superaktivni analog GRF podle nároku 1 až 5 vzorce I, kde A9=Ser, A12=Arg, A15=Thr, A21=Arg, A22=Leu, A25=Asp, a. A28=Asn.
9. 10. Superaktivni analog GRF podle nároku 9 vzorce I, kde Yzahrnuje aminokyselinovou sekvenci Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn- Gln-Glu-Gln- Gly-Ala-Arg-Val-Arg-Leu, nebo její funiční derivát.
10. 11. Superaktivni analog GRF podle nároku 10 vzorce I, kde Zzahrnuje aminokyselinovou sekvenci Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Gly-Val-Trp-Thr- Asp-Gln-Gln-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-Thr-Leu-Val-Ser-Leu- Leu-Gln-Glu-Arg-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly.
11. 12. Superaktivni analog GRF podle nároku 1 až 5 vzorce I, kde A9 = Ser, A12 = Lys, A15 = Gly, A21 = Lys, A22 = Leu, A25 = Asp, A27 = Met, and A28 = Ser.
12. 13. Superaktivni analog GRF podle nároku 12 vzorce I, kde Yzahrnuje aminokyselinovou sekvenci Glu-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg- Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu 41 nebo její funkční derivát.
13. 14. Superaktivni analog GRF podle nároku 13 vzorce I, kde Zznamená nulu.
14. 15. Způsob přípravy superaktivniho analogu GRF podle nároku 1 až 14, vyznačující se t 1 m , že se připravujeGRF PEPTID chemicky nebo rekombinantnl DNA technikou a chemickyse modifikuje aminoterminus.
15. 16. Farmaceutický prostředek pro zvyšováni hladiny růstové-ho hormonu, vhodný . pro ošetřováni dwarfismu, osteoporos^* a prozvyšovánT) 1iěové svaloviny, vyznačující se tlm,ža obsahuje jakožto účinnou látku GRF analog podle nároku 1 až 14spolu s alespoň jedním farmaceuticky vhodným nosičem, excipientemnebo ředidlem.
16. 17. Superaktivni analog GRF podle nároku 1 až 14 vzorce I po-užitelný pro zvyšováni hladiny růstového hormonu.
17. 18. Superaktivni analog GRF podle nároku 1 až 14 vzorce I po-užitelný pro ošetřováni organismu trpícího dwarfismem. L9. Superaktivné analog GRF podle nároku 1 až 14 po- užitelný pro ošetřováni organismu trpícího osteoporosou.
18. 20. Superaktivni analog GRF podle nároku 1 až 14 po- užitelný pro zvyšováni hmoty libové svaloviny. JUOr.