CS125191A3 - Analogs of 1,3-oxathiolate-nucleotide, process of their preparation and application - Google Patents

Description

JUDr J. TRAPLOVÁ advokátní kcnce!:/·

Patenty. <xh~anná =:<ηλ/průmyslová vzory, licence 11505 Praha 1, Štěpánská 16 - 1 - Z m"_ I 1 ° i / /®'£7 F Co O zízPř -- /m / o f\o /κγ- o //-<m / 1 N I <o s Λε

Analogy 1 ,3-oxathiolan-nukleosldu, způsob jejichužití vyrt

Oblast techniky

Vynález se týká analogů nukleosidů a jejich použitív medicíně. Konkrétně se vynález týká analogů 1 ,3-oxathio-lan-nukleosidu, farmaceutických prostředků na jejich bázi ajejich použití při léčbě virových infekcí.

Dosavadní stav techniky

Je popsáno, že sloučenina vzorce I NH,

/1/ hoch2

také známá Jako BCH-189 nebo WGPB-21, má protivirové účin-ky, zejména proti virům lidského imunodeficltu /HIV/, původcům AIDS /5th Anti-Aids Conference, Montreal, Kanada, 5.-9.června 1989: Abstracts T.C.0.1 a ITi.C.P. 63, zveřejněná ev-ropská patentová přihláška č. 0382562/. Sloučenina vzorce IJe racemickou směsí dvou enantiomerů vzorců 1-1 a 1-2

HHB 1» - 2 -

'» ·% a byla popsána a testována ve formě racemátu. Jedinou slouče-ninou, schválenou v současné době pro léčení stavů, způsobe-ných HIV, Je 3'-azido-S^-desoxythymidin /AZT, zidovudine, BW 5Q9U/. U této sloučeniny však existuje významné nebezpečívedlejších účinků, a proto u značného počtu pacientů buánemůže být použita nebo po jejím použití může nastat nutnostvysazení. V‘důsledku toho existuje stálá:potřeba sloučenin,které budou účinné proti HIV a současně budou mít významnělepší terapeutický index. )

Podstata vynálezu

Nyní Jsme překvapivě zjistili, že enantiomery slouče-niny vzorce I Jsoui proti HIV stejně účinné, avšak Jedenz nich, /-/-enantiomer, má značně nižší cytotoxicitu neždruhý. Prvním aspektem vynálezu Je tedy /-/-enantiomer /le-votočivý/ sloučeniny vzorce I a Jeho farmaceuticky přija-telné deriváty. Λ · /-/-enantiomer má chemický název /-/«A-amino-1-/2--hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl/-/1H/-pyrimidin-2-on/dále sloučenina A/. IT!á absolutní konfigu- raci sloučeniny vzorce 1-1, která má název /2R,cis/-4-amino--1-/2-hydroxymethyl-1,3-oxathiúlan-5-yl/-/1H/-pyrimidin-2- -on. Výhodně se sloučenina A získává v^podstatě prostá od-<, povídajícího /+/-enantiomeru, tj. ve formě, v níž. Je_pří-__ tomno ne více než asi 5, výhodně ne více než asi 2 a před-* nostně méně než asi 1 % hmotnostní /+/-enantiomeru. "Farmaceuticky přijatelným derivátem" se rozumí Jaká-koli farmaceuticky přijatelná sůl, ester nebo sůl tohotoesteru sloučeniny A nebo Jakékoli Jiné sloučeniny, která Jepo podání příjemci schopna poskytnout /přímo nebo nepřímo/sloučeninu A nebo její antivirálně účinný metabolit neboresiduum.

Jak Je odborníkovi zřejmé, Je možno farmaceuticky při-jatelné deriváty sloučeniny A získávat její modifikací Jakna bazické Jednotce, tak na hydroxymethylové skupině oxa-thiolanového kruhu, kodifikace všech takových funkčníchskupin Jsou zahrnuty do rozsahu vynálezu. Zvláště zajímavéJsou však farmaceuticky přijatelné deriváty, získávané mo-difikací 2-hydroxymethylové skupiny oxathiolanového kruhu. Výhodné estery sloučeniny A zahrnují sloučeniny,v nichž Je vocjík 2-hydroxymethylové skupiny nahrazen acylo-vou funkcí R-C-, kde nekarbonylová část R esteru Je zvolenaze skupiny zahrnující vodík, alkyl s přímým nebo větv.enýmřetězcem /například methyl, ethyl, n-propyl, terc.butyl, n--butyl/, alkoxyalkyl /například methoxymethyl/, alralkyl/například benzyl/, aryloxyalkyl /například fenoxymethyl/,aryl /například fenyl, popřípadě substituovaný halogenem, s alkylem s 1 až 4 uhlíkovými atomy nebo alkoxyskuplnou s 1až 4 uhlíkovými atomy/, sulfonáty, Jako Je alkyl- nebo ar- á alkylsulfony1 /například methansulfonyl/, estery aminokyse- lin /například L-valyl nebo L-lsoíeucyl/ a mono-, di- nebotrifosfáty.

Pokud se týká výše Jmenovaných esterů, pak pokud neníuvedena Jinak, obsahuje každá přítomná alkylová skupina vý-hodně 1 až 16, zejména 1 až 4 uhlíkové atomy. Každá arylová «ηΛΆ. ' · - skupina, přítomná v těchto esterech, výhodně obsahuje feny- lovou skupinu. \ \'· <

Konkrétně může být ester tvořen alkylesterem s 1 až 16uhlíkovými atomy v alkylové části, nesubstituovaným benzyl-esterem nebo benzylesterm, substituovaným alespoň Jednímhalogenem /bromem, chlorem, fluorem nebo Jodem/, alkylems 1 až 6 uhlíkovými atomy, alkoxyskupinou s 1 až 6 uhlíko-vými atomy, nltroskupinou nebo trifluormethylovou skupinou.

Farmaceuticky přijatelné soli sloučeniny A zahrnujísoli, odvozené od farmaceuticky přijatelných anorganickýcha organických kyselin a bází. Příklady vhodných kyselin za-hrnují kyselinu chlorovodíkovou, bromovodíkovou, sírovou,dusičnou, chloristou, fumarovou., maleinovou, fosforečnou,glykolovou, mléčnou, .salicylovou, Jantarovou, .toluen-p-sul-fonovou, vinnou, octovou, citrónovou, methansulfonovou,mravenčí, benzoovou, Jablečnou, naftalen-2-sulfonovou a v benzensulfonovou. Další kyseliny, Jako Je kyselina štavelo-vá, které .neJsou samy farmaceuticky přijatelné, mohou býtpoužity Jako meziprodukty při získávání sloučenin podle vy-nálezu a jejich farmaceuticky přijatelných adlčních solís kyselinami.

Soli, odvozené od vhodných bází, zahrnují soli alka-lických kovů /například sodíku/, kovů alkalických zemin/například hořčíku/, amonné soli a soli NR^+ /kde R Je al-kylová skupina s 1 až 4 uhlíkovými atomy/.

Odkazy na sloučeninu podle vynálezu zde zahrnují Jaksloučeninu A, tak její farmaceuticky přijatelné deriváty.

Sloučeniny podle vynálezu buó samy mají protivirové ú-činky, a/nebo Jsou na takové sloučeniny metabollzovatelné.Tyto sloučeniny Jsou účinné zejména při lnhiblcl replikaceretrovirů, včetně lidských retrovirů, Jako Jsou viry lid-ského lmunodeficitu /HIV/, původci AIDS.

Dalším aspektem vynálezu Je sloučenina A nebo její •í 'S1 žic'! ΪΞΤΪ farmaceuticky přijatelný derivát pro použití Jako účinnýterapeutický prostředek, zejména Jako přotivirový prostře-dek , například při léčení retrovirových infekcí.

Dalším aspektem Je způsob léčení virové infekce, ze-jména infekce vyvolané retrovirem, Jako Je HIV, u savcůvčetně člověka, spočívající v podávání účinného množstvísloučeniny A nebo jejího farmaceuticky přijatelného derivá-tu. ,

Dalším aspektem Je rovněž použití sloučeniny A nabojejího farmaceuticky přijatelného derivátu pro výrobu léči-va k léčení virové infekce.

Sloučeniny podle vynálezu Jsou vhodné rovněž k léčenístavů, příbuzných AIDS, Jako Je "AIDS-related complex"/ARC/, progresivní generalizovaná lymfadenopatie /PGL/,neurologické stavy, spojené s AIDS /Jako Je demence nebotropická paraparesa/, stavy pozitivní na protilátky protiHIV a HlV-pozitlvní stavy, Kaposiho sarkom, thrombocytope-nia purpurea a přidružené oportunní infekce, například způ-sobené Pneumocystis carinii.

Sloučeniny podle vynálezu Jsou vhodné rovněž k preven-ci vývoje klinických příznaků u Jedinců, kteří Jsou pozi-tivní na protilátky proti HIV nebo pozitivní na antlgen HIVa k profylaxi po expozici virem HIV. t •f

Sloučeninu A nebo její farmaceuticky přijatelné deri-váty Je možno používat rovněž k prevenci virální kontamina-ce fyzjďogických tekutin, Jako Je krev nebo sperma, in vit-ro.

Odborníkovi Je zřejmé, že odkazy na léčení Je možnorozšířit na profylaxi, stejně Jako na léčbu stabilizovanýchinfekcí nebo symptomů. Dále Je zřejmé, že množství sloučeniny podle vynálezu,potřebné k léčení, se mění nejen s konkrétní zvolenou slou- čeninou, ale také podle způsobu podávání, povahy léčenéhostavu a věku a stavu pacienta a konečné^rozhodnutí závisí naúvaze ošetřujícího lékaře nebo veterináře^ Obecně Je vhodnádávka v rozmezí asi 0,1 až asi 750, výhodně 0,5 až 60 apřednostně 1 až 20mg/kg/den.

Potřebná dávka může být vhodně podávána v Jediné dávcea nebo rozdělen v dávkách, podávaných v příslušných inter-valech, například ve dvou, třech, čtyřech nebo více dávkáchza den.

Sloučenina se výhodně podává v Jednotkové dávkové formě,například obdahující 10 až 1500, přednostně 20 až 1000 a ze-jména 50 až 700 mg účinné složky na Jednotkovou dávku.

Ideálně se účinná látka dávkuje tak, aby bylo dosaženomaximální koncentrace účinné složky v plazmě asi 1 až asi75, výhodně asi 2 až 50 a přednostně asi 3 až asi 30 /ufTi.

Toho Je možno dosáhnout například intavenózními injekcemiOř1 až 5% roztoku účinné látky, popřípadě v solném roztoku,nebo-orálním podáváním bolusu, obsahujícího asi 1 až asi 100mg účinné látky. Žádoucí koncentraci v krvi Je možno udržo-vat kontinuální infuzí asi 0,01 až asi 5,0 mg/kg/h nebopřerušovanými infuzemi, obsahujícími asi 0,4 až asi 15 mg/ /kg účinné látky.

Sloučeninu podle vynálezu Je možno k terapeutickým ú-čelům podávat i ve formě surové chemikálie, avšak výhodnéJe, Je-li zahrnuta ve farmaceutické formulaci.

Vynález se tedy dále týká farmaceutického prostředku,obsahujícího sloučeninu Anebo její farmaceuticky přijatel-ný derivát spolu s Jedním nebo více farmaceuticky přijatel-nými nosiči a popřípadě s dalšími terapeutickými a/neboprofylaktickými přísadami. Nosič mUsí být přijatelný" vesmyslu kompatibility s ostatními složkami formulace a,ne-škodnosti vůči příjemci.

Farmaceutické prostředky zahrnují formulace vhodné pro ;;·λλ:λ-λ! ti· · ‘ fe i· 'L·

orální, rektální, nasální, místní /včelně bukální a sub-lingvální/, vaginální nebo parenterální ^včetně intramusku-lární, subkutánní a intravenózní/ aplikací^ nebo formulaceve formě vhodné pro aplikací inhalací nebo insuflací. Je-lito vhodné, mohou být prostředky aplikovány v oddělenýchJednotkových dávkách a mohou být připravovány Jakýmkoli způ-sobem, známým v oblasti farmacie. Všechny tyto způsoby za-hrnují míšení účinné látky s kapalnými nosiči nebo Jemněrozmělněnými pevnými nosiči nebo s oběma těmito typy, apak, Je-li to nutné, tvarování produktu do požadované formy.

Farmaceutické formulace, vhodné pro orální aplikaci,mohou být výhodně podávány v oddělených Jednotkových dávkách,Jako Jsou kapsle, tobolky nebo tablety, obsahující stanove-né množství účinné látky, ve formě prášku nebo granulí, veformě roztoku, suspenze nebo emulze. Účinná látka může býtdále podávána Jako bolus, elektuárium nebo pasta. Tablety akápsle pro orální aplikaci mohou obsahovat běžné excipienty,Jáko Jsou pojivá, plniva, maziva, desintegrační přísady ne-bo smáčedla. Tablety Je možno povlékat známým způsobem. 0-rálpí kapalné přípravky mohou mít formu například vodnýchnebo olejových suspenzí, roztoků, emulzí, sirupů nebo eli-xírů nebo mohou být dodávány v suché formě pro naředění vo-dou nebo Jiným vhodným vehikulem. Takovéto kapalné příprav-ky mohou obsahovat běžné přísady, Jako Jsou stabilizátorysuspenze, emulgátory, nevodná vehikula /která mohou zahrno-vat Jedlé oleje/ nebo konzervační přísady.

Sloučeniny podle vynálezu Je možno rovněž formulovatpro parenterální aplikaci /například injekční, Jako Je in-jekce bolusu, nebo kontinuální infuzi/ a mohou být dodává-ny v dávkovačích formách v ampulích, předplněných injekč-ních stříkačkách, maloobjemových infuzních nádobkách nebov nádobách pro vícenásobné dávky s přídavkem konzervačníhoprostředku. Přípravky mohou mít'formu suspenzí, roztoků ne- bo emulzí v olejovém nebo vodném vehlkulu, a mohou obsaho-vat formulační přísady, Jako Jsou stabilizátory suspenze, stabilizátory a/nebo dispergátory. Účinná^složka může býttaké v práškové formě, získané aseptickou izolací sterilnípevné látky nebo lyofilizací z roztoku, která se před pou-žitím ředí vhodným vehikulem, například sterilní apyrogennívodou.

Pro místní aplikaci na pokžku mohou být sloučeniny po-dle vynálezu formulovány Jako masti, krémy nebo lotiony ne-bo Jako transdermální náplasti. Masti a krémy mohou být na-příklad formulovány na vodné nebo olejové bázi s přídavkem v vhodného zahuštovadla a/nebo želatinačního prostředku. Lo-tiony mohou být formulovány na vodné nebo olejové bázi amohou obecně také obsahovat Jeden nebo více emulgátorů,stabilizátorů, dispergátorů, stabilizátorů suspenze, zahuš-tovadel nebo barviv.

Formulace, vhodné pro. místní aplikaci v ústní dutině,zahrnují pastilky,,-obsahující účinnou látku v aromatizovanémzákladu, obvykle sacharóze s akaciovqu nebo tragantovou si-licí, tabletky, obsahující účinnou látku v inertním základu,Jako Je želatina a glycerin nebo sacharóza a akaciová silice,a ústní vody, obsahující účinnou látku a vhodný kapalný no-sič. í

Farmaceutické formulace, vhodné pro rektální aplikaci,kde nosičem Je pevná látka, se nejvýhodněji dodávají Jakočípky pro Jednotkové dávky. Vhodné nosiče zahrnují kakaovémáslo a další běžně používané látky, a čípky Je možno výhod-ně vyrábět míšením účinné látky se změklým nebo roztavenýmnosičem ,s následujícím chlazením a tvarováním ve formách.

Formulace, vhodné pro vaginální aplikaci, mohou mítformu pesarů, tamponů, krémů, želé, past, pěn nebo sprejů,obsahujících kromě účinné látky vhodný nosič.

Pro intranasální aplikaci Je možno sloučeniny podle vy- nálezu používat ve formě kapalných sprejů nebo dispergova-telného prášku nebo ve formě kapek. ....: ..r — ..., i \

Kapky mohou být formulovány na vodné nebo nevodné bází,obsahující dále Jeden nebo více dispergátorů, solubilizač-ních prostředků nebo stabilizátorů suspenze. Kapalné sprejese výhodně uvolňují z tlakových obalů.

Pro aplikaci inhalací Jsou sloučeniny podle vynálezuvýhodně uvolňovány z lnsuflátoru, nebulizéru nebo tlakovéhoobalu nebo Jiného vhodného zařízení pro uvolňování aeroso-lových sprejů. Tlakové obaly mohou obsahovat vhodný prope-lent, Jako Je dichlordifluormethan, trichlorfluormethan,dichlortetrafluorethan, oxid uhličitý nebo Jiný vhodný plyn^V případě stlačeného aerosolu Je možno dávkování zajistitpomocí ventilu, umožňujícího uvolňovat odměřené množství.

Pro inhalační nebo insuflační aplikaci mohou mít slou-čeniny podle vynálezu rovněž formu suché práškové směsi,například směsi práškové sloučeniny a vhodné práškové báze,Jako Je laktóza nebo škrob. Práškové přípravky mohou být do-dávány ve formě Jednotkových dávek, například v kapslíchnebo tobolkách nebo například v želatinových nebo zpryšlo-vacích obalech, z nichž může být prášek aplikován pomocíinhalátoru nebo insuflátoru.

Je-li to žádoucí, Je možno výše popsané formulace po-užívat ve formě, upravené k dlouhodobému uvolňování účinnélátky.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu mohou dále ob-sahovat další účinné látky, Jako Jsou antimikrobiální pro-středky nebo konzervační přísady.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být rovněž používányv kombinaci s Jinými terapeutickými prostředky, napříklads Jinými antiinfekčními přípravky. Zejména mohou být slou-čeniny podle vynálezu používány spolu se známými protiviro- 10 - výrai prostředky. Výše uvedené kombinace mohou výhodně tvořit farmaceu-tický prostředek, a proto Jsou dalším aspektem vynálezufarmaceutické prostředky, obsahující výše definovanou kom-binaci spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Vhodné terapeutické prostředky pro použití v těchtokombinacích zahrnují acyklické nukleosidy, Jako Je βογοίο-vir nebo gancíclovir, interferony, Jako Je alfa-, beta- ne-bo gama-interferon, inhibitory renální exkrece, Jako Jeprobenecid, inhibitory transportu nukleosidú, Jako Je dipy-ridamol, 2',3'-dldeoxynukleosidy, Jako Je AZT, 2' ,3*-dide-oxycytidin, 2',3'-dideoxyadenosin , 2' ,3*-dideoxylnosin, 2 * ,3'-dideoxythymldin , 2 ,3 -dideoxy-2^ 3'-dldehydrothymi-din a 2', 3*-dideoxy-2',3'-dldehydrocytidin, imunomoduláto-ry, Jako Je interleukin II /IL2/ a faktor stimulující kolo-nie granulocytových makrofágú /GTC=CSF/, erythropoetin,ampligen, thymomodulin, thymopentin, foscarnet, rlbavirin ainhibitory HIV, vážící se na CD4 receptory, například roz-pustný CD4, fragmenty CD4, hybridní molekuly CD4, inhibito-ry glykosylace, Jako Je 2-deoxy-D-glukóza, castanospermin a1-deoxynoJiřimycin.

Jednotlivé složky takovýchto kombinací mohou být podá- vány buď postupně nebo současně v oddělených nebo kombino- í

váných farmaceutických přípravcích. J

Pokud se sloučenina A nebo její farmaceuticky přija- 2 telný derivát používá v kombinaci s dalším terapeutickým í £ prostředkem, účinným proti témuž viru, může být dávka každé ·< sloučeniny stejná nebo odlišná od dávky, v níž Je sloučeni- i] na používána samotná. Příslušné dávky snadno určí odborník. ’ í v

Sloučeninu A a její farmaceuticky přijatelné derivátyJe možno připravovat kterýmkoli známým způsobem pro pří* ξ právu sloučenin analogické struktury, například podle zve- řejněné evropské patentové přihlášky č. 0382562. 61: - 11 -

Je zřejmé, že při použití některých z dále uvedenýchmetod Je možno požadované konfigurace sloučeniny A doááh-nóút“buá~tál<7"žé' Šé^vycKézí z'opticky čisté výchozí látky,nebo rozštěpením racemické směsi v kterémkoli vhodném stup-ni syntézy· V případě všech postupů Je možno požadovaný op-ticky čistý produkt získat rozštěpením konečného produktukaždé reakce.

Postupem /A/ se 1,3-oxathiolan vzorce VIII

/VIII/ fr' í«· kde anomerni skupina L představuje odštěpitelnou skupinu,nechá reagovat s příslušnou bází. Vhodné skupiny L zahrnujískupiny vzorce -0R, kde R Je alkylová skupina, například al-kylová skupina s 1 až 6 uhlíkovými atomy, Jako Je methyl,nsbo acylová skupina, například alkanoylová skupina s 1 až6 uhlíkovými atomy, Jako Je acetyl, nebo halogen, napříkladJod, brom nebo chlor.

Sloučenina vzorce VIII se výhodně nechá reagovat s cy-tosinem nsbo příslušnou pyrimidinovou^bází, která Je Jehoprekursorem /v silylované formě pus oblím silylačního činidla,Jako Je hexamethyldisilazan/, v kompatibilním rozpouštědle,Jako Je methylenchlorid, s použitím Lewisovy báze, Jako Jechlorid titaničitý, dničlté sloučeniny, Jako Je SnCl^, ne-bo trimethylsilyltriflátu. 1,3-oxathiolany vzorce VIII Je možno připravovat na-příklad reakcí aldehydu vzorce VII s merkaptoacetalem vzor-ce VI v kompatibilním organickém rozpouštědle, Jako Je tolu-en, v přítomnosti kyselého katalyzátoru, například Lewisovykyseliny, Jako Je chlorid zinečnatý. βΗΒΒΙΒβ - 12 - HSCH2CH/OC2H:5/2

C6F+5C02CH!2CHD /VI/ /VII/ ÍTerkaptoacetaly vzorce VI Je možno připravovat známýmizpůsoby, například podle G. Hesse a I. Jordeia, Chem. Ber.85, 924-932 /1952/.

Aldehydy vzorce VII Je možno připravovat známými způ-soby, například podle E.G. Halloqulsla a H. Hibberta> Can. J.Research B, 129-13S /1933/. Surový aldehyd vzorce VII Jemožno výhodně přečistit převedením na krystalický adukts bisulfitem a zpětnou konverzí na volný aldehyd.

Druhým postupem /B/ se sloučenina A získá ze sloučeni-ny vzorce IX

/IX/ kde B Je báze, přeměnitelná na cytosin, vzájemnou přeměnoubází. Takovou přeměnu lze uskutečnit buď prostou chemickoutransformací /například přeměnou uracilu na cytosin/, neboenzymatickou přeměnou s použitím deoxyribosyl-transferázy.ÍT.etbdy a podmínky vzíjemné přeměny bází Jsou v oblasti nuk-leosidové chemie známy.

Třetím postupem /C/ Je možno sloučeninu vzorce XI R^ 0. NH, /XI/ převés.t na sloučeninu A konverzí anomerní skupiny NH2 na ίί";^:^/Γ>ίίϋίί;?Εί2;^ϊϊ?ίωϊίί! - 13 - cytosin metodami známými v chemii nukleosidů. Ά „^=__ITInohé z^výše- popsaných -reakcí-Jsou -podrobně -zmiňovány—v souvislosti se syntézou nukleosidů, například v NucleosideAnalogs - Chemistry, Biology and ffedical Applications, vyd.R.T. Walker ad., Plenům Press, New York /1979/, 165-192, T. Ueda v Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, sv. I,vyd. L.B. Townsend, Plenům Press,. New York /1988/, 165-192.

Je zřejmé, že výše uvedené reakce mohou vyžadovat nebobýt výhodné aplikovány na výchozí látky s chráněnými funkč-ními skupinami, a k získání požadované sloučeniny pak můženastat nutnost odstranění chránících skupin Jako mezistupněnebo finálního kroku. Navázání a odstranění chránících sku-.pln Je možno provádět běžným způsobem. Například amlnoskupi-ny Je možno chránit skupinou, zvolenou ze souboru zahrnují-cího aralkyl /například benzyl/, acyl, aryl /například nebo ' 2,4-dinitrofenyl/Z; odstranění chránící skupiny se pak popří-padě provádí hydrolýzou, resp. hydrogenolýzou za standard-ních podmínek. Hydroxylové skupiny Je možno chránit kterou-koli chránící skupinou, běžnou pro tento účel, napříkladskupinami popsanými v Protectlve Groups in Organic Chemistry,vyd. J.F.W, ÍTicOmie, Plenům Press /1973/, nebo v ProtectlveGroups in Organic Synthesis, Theodora W. Greene, John Wileýand Sons /1981/. Příklady vhodných chránících skupin prohydroxyl zahrnují skupiny, zvolené ze souboru obsahujícíhoalkyl /například methyl, terc.butyl nebo methoxymethyl/,aralkyl /například benzyl, difenylmethyl nebo trifenylmethyl/,heterocyklické skupiny, Jako Je tetrahydropyranyl, acyl/například acetyl nebo benzoyl/ a silylové skupiny, Jako Jetrialkylsilyl /například terc.butyldimethylsilyl/. Tyto sku-piny Je možno odstraňovat běžnými metodami. Například alky-lové, silylové, acylové a heterocyklické skupiny Je možnoodstraňovat solvolýzou, například hydrolýzou za kyselých ne-bo zásaditých podmínek. Aralkylové skupiny, Jako Je trife- á!6S2^ííiíSaí^S&amp;aá!Bies5sátóSSt5!ŠSř^ŠžS^^«5iS»«Lisr!«;;feí^^7.^.SÍ· - 14 - nylmethyl, Je rovněž možno odstraňovat solvolýzou, napříkladkyselou hydrolýzou. Aralkylové skupiny, Jako Je benzyl, Jemožno odštěpit například působením BFg-etherátu v acetanhyd-ridu, načež se ve vhodném stupni syntézy odstraní taktovzniklé acetátové skupiny. Sily.lové skupiny Je možno výhodněrovněž odstranit použitím zdroje fluoridových iontů, JakoJe tetra-n-butylamoniumfluorid. Výše uvedeným postupem se sloučenina A obvykle získáváve formě směsi cis a trans isomeru, v níž Je požadovanousloučeninou cis isomer.

Tyto isomery Je možno rozdělit fyzikálními prostředky,například chromatagrafli.na silikagelu nebo frakční krysta-lizací, buň přímo nebo přes jejich vhodné deriváty, napří-klad acetáty /připravené například reakcí s acetanhydridem/,které se po rozdělení převedou zpět na původní produkty /na-příklad deacetylaeí methanolickým amoniakem/.

Farmaceuticky přijatelné soli sloučenin podle vynálezuJe možno připravit podle US 4 383 114. Například Jestližese požaduje adiční sůl sloučeniny A s kyselinou, Je možnoprodukt kteréhokoli z výše popsaných postupů převést na sůlreakcí získané volné báze s vhodnou kyselinou běžným způsobem.Farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinami Je možnopřipravit reakcí volné báze s příslušnou kyselinou, popří-padě v přítomnosti vhodného rozpouštědla, Jako Je ester/například ethylacetát/ nebo alkohol /například methanol,ethanol nebo isopropylalkohol/. Soli s anorganickými bázemiJe možno připravit reakcívhodnou bází, Jako Jealkoxid /například methoxid sodný/, popřípadě v přítomnostirozpouštědla, Jako Je alkohol /například methanol/. Farma-ceuticky přijatelné soli Je možno rovněž připravovat běžný-mi metodami z Jiných solí, včetně Jiných farmaceuticky při-jatelných solí, sloučeniny A.

Sloučeninu A Je možno převést na farmaceuticky přija- ........... „·... - 15 - .-... telný fosfát nebo Jiný ester reakcí s fosforylačním činidlem, J ak o_ J e_^oxychlorid f os f or i t ý _POC 1^ ,„ n ebo 3yhodným_esterχf χ-............ kačním-činidlem, Jako Je halogenid, resp. ánhydrid kyseliny.Ester nebo sul sloučeniny A Je možno na původní sloučeninupřevést například hydrolýzou. Dělení finálního produktu, meziproduktu nebo příslušnévýchozí látky Je možno provádět kteroukoli vhodnou známoumetodou; viz například Stereochemistry of Carbon Compounds,E.L. Eliel, McGraw Hill /1962/, a Tables of Resolving Agents,S.H. Wilen.

Sloučeninu A Je tedy možno získat například pomocí chi-rální vysokoúčinné chromatografie /HPLC/ s použitím vhodnéstacionární fáze, například acetylovaného beta-cyklodextrinunebo triacetátu celulózy, a vhodného rozpouštědla, napříkladalkoholu, Jako Je ethanol nebo vodný roztok například trie-thylamoniumacetátu. Jinou možností dělení Je enzymatickyzprostředkovaný enantioselektivní katabolismus s vhodným en-zymem, Jako Je cytidin-deamináza, nebo selektivní enzymatic-ká degradace vhodného derivátu pomocí 5 -nukleotidázy. Pro-vádí-li se štěpení enzymaticky, Je možno enzym používat buóv roztoku nebo výhodněji v imobllizované formě. Enzymy mo-hou být imobllizovány kterýmkoli známým způsobem, napříkladadsorpcí na pryskyřici, Jako Je Eupergit C.

J Příklady provedeni vynálezu

Meziprodukt 1 5-methoxv-l.3-oxathiolan-2-»methanolbenzoát K míchanému roztoku 34,2 g merkaptoacetaldehyddimethyl-acetalu a 43,3 g benzoyloxyacetaldehydu ve 1300 ml toluenuse přidá roztok 1,6 g chloridu zinečnatého v 15 ml horkéhomethanolu a směs se 30 min zahřívá v dusíkové atmosféře k va-ru pod zpětným chladičem. Ochlazená směs se zahustí, zředí yirjíw^hí.iíá/.řz.^tíí.fefeffiíÍWSfeXMÍÍvMiM/í&amp;S^ - 16 - malým množstvím toluenu a přefiltruje přes křemelinu. Spo-jené filtráty s toluenem se promyjí dvakrát nasyceným vod-ným roztokem hydrogenuhličitanu sodného axpak solným rozto-kem, suší nad síranem hořečnatým a pak se odpaří za vznikuoleje, který se podrobí sloupcové chromatografii na 2 kgsilikagelu /Merck 9385/ s elucí chloroformem, čímž se získá45,1 g titulní sloučeniny ve formě oleje, který Je směsí a-nomerů přibližně 1:1. 1H NMR /DMSO-dg/ 3,1-3,3/4H/, 3,42/6H/, 4,4-4,6/4H/,5,41/1H/, 5 ,46/1H/, 5,54/1H/, 5,63/1H/, 7,46/4H/, 7,58/2H/,8,07/4H/, y* máx /CHBrg/ 1717,6 cm \

Meziprodukt 2 /+/-cis-1-/2-benzoyloxymethy1-1,3-oxathiolan-5-yl/- -/1H/-pyrimidin-2.4-dlon

Směs 9,62 g Jemně mletého uracilu, 50 ml hexamethyldi-silazanu a 30 mg síranu amonného se v dusíkové atmosféřezahřívá k varu pod zpětným chladičem do .získání čirého roz-toku. Pak se ochladí a odpaří na bezbarvý olej, který sev dusíkové atmosféře rozpustí ve 100 ml acetonitrilu. Roz-tok se přidá k míchanému a ledem chlazenému roztoku 19,43 g5-methoxy-1 ,3-oxathiolan-2-methanolbenzoátu /meziprodukt 1/v 600 ml acetonitrilu a přidá se 14,7 ml trlmethylsilyltri-fluormethansulfonátu. Ledová lázeň se odstraní a roztok sezahřívá pod dusíkem 45 min k varu pod zpětným chladičem. Poochlazení a odpaření se zbytek přečistí sloupcovou chroma-tografií na 1 kg silikagelu /Merck 9385/ se směsí 9 dílůchloroformu a 1 dílu methanolu Jako elučním činidlem. Z příslušných frakcí se ochlazením a odpařením získá surovýzbytek. Tento zbytek se podrobí frakční krystalizaci z mi-nimálního množství /cca 1200 ml/ horkého methanolu a získáse 6,32 g titulní sloučeniny ve formě bílých krystalů. 1H NMR /d5DMS0/ 11,35 /1H,bs/, 7,50-8,00 /6H,m/, /: :···. - 17 - 5,20 /1H,t/, 5,46 /2H,m/, 4,62 /2H,m/, 3,48 /1H,m/, 3,25/1H,m/. —..........

Meziprodukt 3 /-/-cls-4-amlno-1-/2-benzovloxvmethyl-1.3-oxathlo1an- -5-yl/-/1H/-pyrlmldln-2-on

Metoda /a/ i

Suspenze 20,705 g cytosinu a několika mg síranu aman-ného ve 110 inl hexamethyldisllazanu se smíchá a 2,5 h za-hřívá v dusíknvé atmosféře k varu pod zpětným chladičem. Pccdpaření rozpouštědla se zbylá pevná látka rczpustí ve 350ml suchého acetonítrilu. Tentc rcztok se s použitím techni-ky pružné Jehly převede pod dusíkem do míchaného a ledemchlazeného roztoku 43,57 g 5-methoxy-1,3-oxathiolan-2-me-thanalbenzoátu /meziprodukt 1/ v 650 ml acetonítrilu. Přidáse 33 ml trimethylsilyltrífluormethansulfonátu, roztok senechá v průběhu 1 ,5 h ohřát na teplotu místnosti a pak sepřes noc zahřívá k varu pod zpětným chladičem. Zbylá směsse zahustí, zředí 500 ml nasyceného vodnéhc roztoku hydro-genuhličitanu sodného a pak extrahuje 3 x 500 ml ethylace-tátu. Spojené extrakty se promyjí 2 x 250 ml vcdy a pak 250ml solného roztoku, suší nad síranem horečnatým, pak odpařína pěnu, která se podrobí sloupcové chromatografii na 600 gsiliky /lYlerck 7734/ se směsí ethylacetátu a methanolu Jakoelučním činidlem, čímž se získá 31,59 g směsi anomerů cca1:1. Směs se překrystaluje ze 45 ml vody a 9,0 ml ethanoluza vzniku 10,23 g pevné látky, která se překrystaluje ze120 ml ethanolu a 30 ml vody, čímž se získá 9,26 g titulní-ho produktu ve formě bílé pevné látky.

Xmax /MeOH/ 229,4 mm /E^% 610/, 272,4 mm /eJ% 293/, . p icm ’ ’ lem ’ 1H NMR /DÍYíSO dg/ ď 3,14 /1H/, 3,50 /1H/, 4,07 /2H/, 5,52/1H/, 5,66 /1H/, 6,28 /1H/, 7,22 /2H/, 7,56 /2H/, 7,72 /2H/8,10 /2H/. :\'·ν3^.'·νΑΛ"ΛΛ^ :;·^^?^0-ί\?ΐϊίΓ^^;Λή·>/?^':,λ':.?ι'/Λ^ί/}.;ώ?':;;-..-.'ί?;ή,;ί'ζΗ.^,υ';<' Ú:J:-V >V,v?i;'í'r"-'.v'»S‘ÍÝ-- t it 13 - fTetoda /b/ 7,0 ml oxychloridu fosforu se přlkape k míchané a ledem chlazené suspenzi 11,65 g 1 ,2,4-triazolu ve 120 ml a- l?

cetonltrilu a pak se za udržování vnitřní teploty pod 15 °C přlkape 22,7 ml triethylamlnu. Po 10 min se pomalu přidá a. roztok 6,27 g /-/-cis-1-/2-benzoyloxymethy1-1,3-oxathiolan--5-yl/-/1H/-oyrimidln-2,4-dionu /meziprodukt 2/ ve 330 mlacetonltrilu. V míchání se pokračuje přes noc při teplotěmístnosti. Pak se směs ochladí ledovou lázní, pomalu sepřidá 30 ml triethylamlnu a pak 21 ml vody. Získaný roztokse odpaří a zbytek se rozdělí mezi 400 ml nasyceného rozto-ku hydrogenuhličitanu sodného a 3 x 200 ml chloroformu.

Spojené chloroformové extrakty se suší nad síranem hořečna-tým, přefiltrují a odpaří za vzniku 9,7 g surového zbytku.

Zbytek se rozpustí v 240 ml 1,4-dioxanu a přidá se 50 mlkoncentrovaného vodného roztoku amoniaku o specifické hmot-nosti 0,380. Po 1,5 h se roztok odpaří a zbytek se rozpustív methanolu. Tím dojde k vysrážení pevné látky, která seodfiltruje. (Tatečné louhy se čistí sloupcovou chromatogra-fií na 600 g silikagelu /(Těrek 9385/. Shromáždí se přísluš-né frakce a odpaří za vzniku 2,18 g titulní sloučeniny Jakosvětle hnědé pevné látky, identické s látkou, získanou me-todou /a/. i Příklad 1 /~/-cls-4-amlno-1-/2-hvdroxymethyl-1.3-oxathlolan-5- -yl/-/1H/-ovrlmldln-2-on

Suspenze 8,19 g cis-4-amlno-1-/2-benzoyloxymethy1-1,3- , -oxathiolan-5-yl/-/1H/-pyrimidin-2-onu /meziprodukt 3/ a8,24 g pryskyřice Amberlite IRA-400 /OH/ ve 250 ml methano- § lu se 1,25 h míchá a zahřívá k varu pod zpětným chladičem. ' ·?

Pak se odfiltruje pevný podíl a promyje methanolem. Spojené L-.itťÍT-—^7-- -· ·—-------- ./·>-.. .ií. - -i ·</, — - -J- - 19 - filtráty se odpaří. Zbytek se trituruje s 80 ml ethylacetá-tu. Filtrací se získá 5,09 g titulního produktu ve forměbílé pevné látky. \ 1H NfíR /DITiSO-dg/ 3,04 /1H/, 3,40 /1H/, 3,73 /2H/, 5,18/1H/, 5,29 /1H/, 5,73 /1H/, 6,21./1H/, 7,19 /2H/, 7,81 /1H/. Příklad 2 ! + Děleni enantiomerů /-/-cls-4-amlno-1-/2-hydroxymethyl- -1 .3-oxathlolan-5-yl/-/1H/~avrlmldln-2-onu pomoci chl-

rálni HPLC /A/ 25 mg racemického produktu příkladu 1 se podrobípreparativní HPLC za těchto podmínek: sloupec: triacetát celulózy FT.erck Hibar, 250 xx 10 mm, 10 ^um eluční činidlo:průtok:λ detekce:teplota:

Odpařením příslušných frakcí se získá 6,8 mg, tj. cca100 %, /2R,cis/-4-amino-1-/2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan--5-yl/-/1H/-pyrimidin-2-onu a 3,6 mg, tj. cca 90 %, /2S,cis/--4-amlno-1 -/2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl/-/1H/-pyri-midin-2-onu. /3/ 26 mg racemického produktu příkladu 1 se podrobípreparativní HPLC za tšchto podmínek: ethanol3 ml/minUV, 270 nmmístnosti sloupec:eluční činidlo: ASTEC cyclobond I acetyl, 250 x 4,6 mm0,2% triethylamoniumacetát /připrave-ný přídavkem ledové kyseliny octovék 0,2 % trlethylamlnu ve vodš do ko-nečného pH 7,2/ 2 ml/min průtok: - 20 - detekce: UV, 300 nm teplota: místnosti r

Odpařením oříslušných frakcí se získá 25 mg surového/2R ,cls/-4-amino-1-/2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl/- ά, -/1H/-pyrimidin-2-onu a 17 mg surového /25,cis/-4-amino-1--/2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl/-/1H/-pyrimidin-2-onu.

Tyto frakce se odděleně podrobí opakované preparativní HPLCza těchto podmínek: sloupec: ASTEC cyclobond I acetyl, 250 x 4,6 mm eluční činidlo: 15mfY! octan amonný, pH 6,8průtok: 0,5 ml/min detekce: UV, 300 nm

teplota: 5 °C

Odpařením příslušných frakcí se získá 5,0 mg, tj. cca91 %, /2R,cis/-4-amino-1-/2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5--yl/-/1H/-pyrimidin-2-onu a 7,6 mg, tj. cca 96 %, /2S,cis/--4-amino-1-/2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl/-/1H/-pyri-midin-2-onu. Příklad ,3 ... /-/-cis-4-amihQ-1-/2-hydroxymethyl-1 \3-oxathlolan-5- -y1/-/1H/-ovrlmidln-2-on /1/ /-/-cls-4-amlno-1-/2-hydroxyměthyl-1.3-oxathlolan- -5-yl/-/1H/-ovrlmldinon- -dlhydroqenfosfát ve formě amonné soli

Na chladnou míchanou suspenzi 1 ,,00 g /-/-cis-4-amino--1-/2-hydroxymethyl-1 ,3-oxathlolan-5-yl/-/1H/-pyrimidin-2--onu /příklad 1/ ve 20 ml suchého trimethylfosfátu o teplo-tě 0 °C se působí 2,44 ml oxychloridu fosforitého, směs semíchá 35 min při 0 °C a pak se rychle ochladí 60 g směsiledu a vody. U chladné směsi se upraví pH na hodnotu 2,5přídavkem vodného 1N hydroxidu sodného a pak se směs uvede Í-'-P't>*.?»-ř'u‘; ^Λ·ώΛΐΜΒώ{5. - 21 - na sloupec 10 g aktivního uhlí /DARCO/ a eluuje nejprve vo-dou a pak směsí ethanolu a vodného amoniaku. Frakce, obsa-hující surový monofosfát, se spojí a zahustí. Získaný roztokse uvede do kolony, obsahující 25 g DEAE Sephadexu A-25/HCO^- forma/. Eluuje se s gradientem 120 ml vody až 240 ml0,101 NH4HC03 a pak 120 ml 0,2ΓΠ NH4HC03, 240 ml 0,30) NH4HC03a 400 ml 4ÍY1 NH4HC03. Příslušné frakce se spojí a zahustí.Zbylý roztok se zředí 40 ml vody a lyofilizuje, čímž se zís-ká 1,37 g titulního produktu ve formě bílé pevné látky.

Amax /pufr o pH 6/: 271,0 nm /E? % 190/ i cm 1H NfTiR /D20/: ó 3,23 /1H/, 3,55 /1H/, 4,0-4,2 /2H/, 5,,43 /1H/, 6,07 /1H/, 6,33 /1H/, 8,08 /1H/. /ii/ /2R,cls/-4-amino-1-/2-hvdroxyméthyl-1,3-oxathio-lan-5-yl/-/1H/-pvrlmidin-2-on a /2S.cis/-4-amino-1-/2- -hydroxvmethyl-1 ,3-oxathiolan-5-vl/-/1H/-oyrlmldin-2-on K roztoku 1 ,35 g amonné soli /-/-cis-4-amino-/2-hydroxy-methyl-1,3-oxathiolan-5-yl/-/1H/-pyrimidin-2-on-6z-dihydro-genfosfátu ve 30 ml tlumivého roztoku, připraveného z 526 mgglycinu a 190 mg chloridu horečnatého ve 100 ml vody, sepřidá 60 mg /17 Jedn./mg/ 5*-nukleotidázy z venomu crotalusatrox /£C 3.1.3.5,.7 a směs se inkubuJe 2,5 h při 37 °C. Při-dá se dalších 20 mg enzymu a inkubuJe se dalších 3,5 h. Zís-kaná směs se uvede na sloupec DEAE Sephadexu A-25 /HC03~forma/. Eluuje se 160 ml vody a pak po 200 ml 0,1, 0,2, 0,3a 0,4M NH4HC03. Příslušné frakce, obsahující první eluova-nou složku, se spojí a odpaří, zbytek se podrobí sloupcovéchromatografii na 60 g sillky /Merck 7734/ se směsí chloro-formu a methanolu Jako elučním činidlem. Odpařením přísluš-ných frakcí ze směsi methanolu a ethylacetátu se získá 0,30g /2R,cis/-4-amino-1-/2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl/--/1H/-pyrimidin-2-onu ve formě bílé pevné látky. /«_7D21 + 137 ° /c 1,04 MeOH/ 1H-NMR /DIYISO/ o 3,04 /1H/, 3,40 /1H/, 3,73 /2H/, 5,18 - 22 - /1H/, 5,29 /1H/, 5,73 /1H/, 6,21 /1H/, 7,19 /2H/, 7,81 /1H/. \ Příslušné frakce ze sloupce Sephadexu, obsahující dru- * k hou eluovanou složku, se spojí a odpaří. Zbytek se rozpustíve 30 ml vody, přidá se 1,5 ml /416 Jedn./ml/ alkalické fos- «*- fatázy z Escherichia coli /EC 3.1.3.1.7 a směs se inkubuje 1h při 37 °C. Pak se odpaří rozpouštědlo a zbytek se podrobísloupcové chromatografli na 60 g slllky /(Těrek 7734/ se směsí chloroformu a methanolu Jako elučním činidlem. Odpa- řením příslušných frakcí ze směsi methanolu a ethylaeetátu se získá 0,32 g /2S,cis/-4-amino-1-/2-hydroxymethyl-1,3- -oxathiolan-5-yl/-/1H/-pyrimidln-2-onu ve formě bílé pevné látky. /SjD21-132 ° /c 1,08, (TeOH/ 1H NMR /DIYISO/ cT 3,04 /1H/, 3,40 /1H/, 3,73 /2H/, 5,18/1H/, 5,29 /1H/, 5,73 /1H/, 6,21 /1H/, 7,19 /2H/, 7,81 /1H/. Příklad 4 /-/-cls-4-amino-1-/2-hvdroxvmethyl-1.3-oxathlolan-5- -yl/-/1H/-oyrlmldln-2-on /1/ Každá ze tří baněk se živnou půdpu /Oxoid Ltd/ seinokuluje očkem Escherichia coli /ATCC 23348/, seškrábnutýmz plotny s agarovou živnou půdou. Baňky se inkubují přes nocpři 37 °C s třepáním rychlostí 250 otáček za minutu a pakse každá baňka použije k inokulaci 4 1 média CDD /3 g/1 ky-seliny glutamové, 0,2 g/1 ITgSO^, 2,5 g/1 K2S04, 2,3 g/1 ,

NaCl, 1,1 g/1 Na2HP04.2H20, -0,6 g/1 NaH2P04.2H20, 1,2 g/1cyt.idinu/ v sedmilitrovém fermentoru. Kultury se fermentujípři 37 °C, 750 otáčkách za minutu a s aerací 4 1/min. Po 24h kultivace se odstředěním při 5000 g po dobu 30 min získá72 g vlhkých buněk. Získaná peleta se suspenduje ve 300 ml20míTl trls-HCl pufru o pH 7,5 a rozruší působením ultrazvuku4 x po 45 s. Buněčné stěny se odstředí při 30000. g po dobu30 min a protein v supernatantu se vysráží přídavkem síranu

•ίΟΚΐΒϊύ τ' - 23 - amonného do 75 % nasycení. Sraženina se odstředí při 30000g po dobu 30 min a suspenduje ve 25. ml l OOmíYl pufru HEPES o "pH"7707^Bša^hu~Jíčiho síran amonný do 75 nasycení. Roztokenzymu se připraví odstředěním při 12000 otáčkách za minutupodobu30 min. Supernatant se odstraní a peleta se rozpus-tí ve lOOmíYl tris-HCl pufru o pH 7,0 na původní objem. /11/ 115 mg produktu příkladu 1 se rozpustí ve 100 mlvody a míchá. Přidá se 0,05 ml roztoku enzymu a směs se udr-žuje na konstantním pH stálým přídavkem 25n3Tl kyseliny chlo-rovodíkové. Konverze se sleduje chirální HPLC, která ukazuje,že přednostně Je v substrátu deaminován /+/-enantlomer. Po22 h Je /+/-enantiomer /retenční čas, RT 12,5 min/ ze sub-strátu zcela odstraněn a pH roztoku se upraví na 10,5 pří-davkem koncentrovaného hydroxidu sodného.

Takto připravený roztok se uvede na sloupec 30 x 1,6 cmQAE Sephadexu /A25, Pharmacia/, preekvilibrovaný na pH 11.Sloupec se promyje 200 ml vody a pak 0,1 ίϊί kyselinou chloro-vodíkovou. Odebírají se frakce po 40 ml a analyzují HPLCs reverzními fázemi. Frakce 5 až 13, obsahující nezreagovaný/-/-enantiomer substrátu, se spojí a kyselinou chlorovodí-kovou upraví na pH 7,5. Frakce 47, obsahující deaminovanýprodukt, se zředěným hydroxidem sodným upraví na pH 7,5. A-nalýza-chirální HPLC ukazuje, že tato látka Je směsí, kde - Jeden énantiůmer /RT 10,2 min/ Je hlavní složkou /tj» tvoříasi 90 %/ a druhý enantiomer /RT 8,5 min/ Je vedlejší slož-kou. /lil/ Stupen /11/ se opakuje ve větším měřítku. 363 mgsloučeniny podle příkladu 1 ve 250 ml vody se inkubuje s 0,5ml roztoku enzymu, připraveného podle stupně /1/. Další all-kvotní díly 0,5 ml enzymu se přidají po 18 a 47 h. Reakčnísměs se míchá 70 h, pak se ponechá 64 h stát. Analýza chi-rální HPLC ukazuje, že /+/-enantiomer substrátu Je kompletnědeaminován. Získaný roztok se hydroxidem sodným upraví napH 10,5. 24.-

Tento roztok se uvede na stejný sloupec QAE a eluujeJako ve stupni /1/. Frakce 2 až 6, obsahující směs zbyléhosubstrátu a deaminovaného produktu, se spojí. Frakce 7 až13, obsahující zbylý substrát, tj. /-/—enantiomer, se spojía upraví na pH 7,5. Frakce 25 až 26, obsahující deaminovanýprodukt, se spojí a zneutrallzují.

Frakce 2 až 6 se znovu uvedou na stejný sloupec. Frak-ce 3 až 11. z tohoto druhého průchodu obsahují nezreagovanýsubstrát, tj. /-/-enantiomer. Frakce 70 obsahuje deamlnova-ný produkt. /Iv/ Rozštěpené frakce substrátu ze stupňů /11/ a /111/se spojí a upraví na pH 7,5. Tento roztok se uvede do kolonyXAD-16 40 x 2,4 cm, plněné .vodou. Kolona se promyje vodou apak eluuje směsí 1'objemového dílu acetonu a 4 objemovýchdílů vody. Frakce., obsahující /-/-enantiomer o BCH 189, sespojí a lyofllizují se získá 190 mg bílého prášku. V příkladech Jsou požity tyto chromatograflcké metody:1. Analytická HPLC s reverzními fázemi kolona Capital Cartridge Spherisorb ODS-2 /5 /um/ eluent 50mlYl dihydrogenfosforečnan amonný + + 5% ffieCN průtok 1,5 ml/min detekce UV, 270 nm retenční časy BCH 189 5,5 min deaminovaný BCH-1B9 8,1 min 2. Chirální analytická HPLC • kolona Cyclobond I Acetyl 250 x 4,6 mm eluent 0,2% trlethylamoniumacetát /pH 7,2/ 5 í vl · průtok 1,0 ml/min detekce UV, 270 nm ·? retenční časy BCH 189 11 ,0 a 12,5 min deaminovaný BCH-189 8,5 a 10,2 min - 25 - /Po biokonverzi se sleduje úbytek peaku při 12,5 min a aku-mulace produktu při 10,2 min/ \\ * · - ~ „ Příklad 5 \ I* /-/-cls-4-amlno-1-/2-hydroxvmethvl-1,3-oxathlolan-5-vl/- -/1H/-pvrlmldln-2-on Očka B buněk E. coll /ATCC 32848/, seškrábnutých z dob-ře narostlé agarové plotny, se použijí k inokulaci dvou flo-rentských baněk, obsahujících po 250 ml živné půdy. Kulturase inkubuje při 37 °C za třepání po dobu 18 h při 250 otáč-kách za minutu a výchylce 5 cm. Touto kulturou se pak inoku-luje. 40 1 média CDD s cytidinem v 701 fermentoru.

Eermantace se provádí za těchto podmínek: aerace 401/min, míchání 750 otáček za minutu, teplota 37 °C. K fer-mentoru se připevní tři rychloběžná míchadla Rushton. Fer-mentace probíhá 18 ha odběr se provádí kontinuální odstře-divkou Sharpless. Buněčná pasta o čisté hmotnosti 150 g se před rozrušením buněk zmrazí na médium CDD g/1 kyselina L-glutamová 3 ITgS04 0,2 k2so4 2,5 NaCl 2,3 · Na2HP04 1,1 NaH2PQ4 0,6

Doplní se destilovanou vodou. Sterilizuje se 30 minpři 121 °C. Před inokulaci se přidá 1,2 g/1 cytidlnu, steri-lizovaného filtrací. 150 g zmrazené buněčné pasty se nechá roztát a suspen-duje se v 750 ml 1 OOmíY! HEPES /N-/S-hydroxymethyl7piperazin--N*-/2-eth anslfonová kyselina7/ pufru o pH 7,5, obsahujícího :: ;r - 26 - 1mM ethylendiamintetraoctovou kyselinu /sodnou sůl/ a lmMdithithreitol /pufr/. Buňky se rozruší průchodem suspenzeManton-Gaulinovým homogenizátorem, pracujícím s tlakem 51,7MPa. Tato operace se provádí třikrát a po''každém průchodu ho-mogenizátorem se suspenze ochladí na přibližně 5 °C. Homoge-nizát se vyčeří odstředěním při 1400 g pó dobu 60 min. Cyti-din-deaminázová aktivita se adsorbuje na sloupec Q-Sepharosy/objem lože 490 mg/, preekvilibrovaný 50mM tris/hydroxymet-hyl/methylaminem o pH 7,5, obsahujícím 1mM chlorid sodný.210 ml spojených aktivních frakcí se nanese na sloupec fenyl-Sepharosy /objem lože 490 mg/, preekvilibrovaný zásobním puf-rem, obsahujícím 3,2M síran amonný. Navázaný enzym se eluujegradientem klesající koncentrace síranu amonného. Shromáždíse 695 ml .f rakcí ,. .obsahu jících cytidin-deaminázovou aktivitu,a částečně přečištěný enzym sevysráží 80% síranem amonným.Po odstředění při 1400 g po dobu 60 min se peleta resuspen-duje v 54 ml supernatantu z výše uvedené operace a uchovávápři 4 °C. 6,2 ml tohoto roztoku se odstředí při 18000 g po dobu90 min a peleta se rozpustí v 24 ml pufru, obsahujícího 0,5M fosforečnan draselný o pH 7,5. Suspenze se dialyzuje přesnoc proti pufru na bázi 1M fosforečnanu draselného o pH 7,5.20 ml retentátu se pak zředí stejným objemem destilované vody.K 35 ml tohoto roztoku se přidá 1 g suchých perliček EupergitC a směs se nechá stát při teplotě místnosti 150 až 300 h/stanoveno měřením residuální cytidin-deaminázové aktivity vroztoku /. Imobilizovaný enzym se promyje 100mM tris/HCL pufremo pH 7,0, obsahujícím 1 mM EDTA, 1 mM DTT, O,5M NaCl a 500pppm ethylesteru kyseliny p-hydróxybenzoové /zásobní pufr/.Imobilizovaný enzym o čisté hmotnosti 2,7 g se v tomto pufruuchovává při 4 °C až do použití k biotransformaci. 3 g produktu příkladu 1 se rozpustí v 500 ml destilovanévody v 11 baňce s magnetickým míchadlem. Biokonverze se pro-vádí při 32 °C v pH-statu. pH se udržuje na konstantní hod-notě 7,0 přidáváním 1M kyseliny octové. 1 g vlhkých per- - 27 -

I ř i i &amp; 5* i llČek s imobilizovaným enzymem se před započetím reakcepromyje destilovanou vodou» Konverze se sleduje chirálníHPLC, která ukazuje, že Je přednostně deaminován /+/-enanti-omer substrátu. Ňa konci reakce /72 h/ se\perličky enzymuodfiltrují a filtrát se použije k izolaci požadovaného /-/--enantiomeru. 1ΓΠ roztokem amoniaku se pH reakční směsi upraví na10,5 a roztok se aplikuje na pryskyřici Duolite A113 superv OH cyklu /50 ml, 0,4 objemů lože/h/. Analog uridinu seadsorbuje na pryskyřici a /-/-enantiomer projde. Zbylý /-/-renantiomer v pryskřici se odstraní promytím 0,04% roztokemamoniaku /2 objemy lože, průtok 0,8 objemů lože/h/.

Hodnota pH spotřebovaných roztoků a promývacích kapa-lin o objemu S00 ml se upraví na 7,0 koncentrovanou kyseli-nou sírovou a roztok se aplikuje na 50 ml pryskyřice XAD16s průtokem 1,4 objemu lože/h. Kolona se promyje destilova-nou vodou /-2./1 objemu lože, průtok 2 objemy lože/h/ a /-/--enantiomer se eluuje směsí 1 dílu acetonu a 3 dílů vodys průtokem 1,5 objemu lože/h.

Celková frakce, obsahující /-/-enantiomer /4 objemylože/, se zahustí v Buchiho odparce na malý objem, načežse přefiltruje přes skleněnou fritu č. 3. Z přefiltrované-ho roztoku se lyofilizací získá 1,2 g titulní sloučeninyidentické Jako v příkladu 4. Příklad 6

Tabletové přípravky A. mokrou granulací složek s roztokem providonu ve vo-dě, sušením a prosíváním a pak přídavkem stearátu hořečna-těhoá lisováním se připraví tento přípravek: mg/tableta250 /a/ účinná látka ·.';·í·-.:-'ι·ί; ,-'·’.'.'•'ίΛι^'νι^Λ',’,ΊΖ-Χ:»<·.f-·:'ι.'.'^λΰ·.';*·! ,-'i·.λ>.'ί ·,'^· .-· · .; .ν·>·'ί_:ι·;. ’ -28-

'/b/ laktóza B.P. 210 /c/ Providone B.P. 15 /d/ natriumglykolát škrobu 20 /e/ stearát hořečnatý 5 5 DO Β. Přímým lisováním se připraví následující přípravek.Použije se laktóza pro přímé lisování: mg/tableta účinná látka 250laktóza 145Avlcel 100stearát hořečnatý ____5 500 C. /Přípravek s kontrolovaným uvolóváním./ Přípravek sepřipravuje mokrou granulací dále uvedených složek s roztokemprovidonu ve vodě, sušením a prosíváním, načež se přidá ste-arát hořečnatý a provede se lisování: mg/tableta /a/ účinná látka 500 /b/ hydroxypropylmethyl-celulóza /ÍTethocel K4íTi Prémium/ <4 Λ 1 I<C /c/ laktóza B.P. 53 /d/ Providone B.P. 28 ,/e/ stearát hořečnatý 7 700 Příklad 7

Kapsle

Směs pro kapsle se připravuje smísením dále uvedenýchsložek a plní se do dvoudílných kapslí z tvrdé želatiny: • -·" '/A·' - 29 - mg/kapsle účinná látka · 125 \ laktóza 72,5 %

Avlcel 50 \ stearát hořečnatý ____2A5 250 Příklad 8

Infekční přípravek účinná látka 0,200 g roztok hydroxidu sodného, 0,1 ΠΊ, q.s. na pH asi 11sterilní voda, q.s. do 10 ml Účinná látka se supenduje v malém množství vody /kterámůže být ohřátá/ a pH se upraví roztokem hydroxidu sodnéhona asi 11. šarže se pak doplní na daný objem a přefiltrujese přes membránový filtr do sterilní 10ml skleněné nádobky,která se sterilně uzavře a utěsní. Příklad 9 mg/čípek , účinná látka 250 tvrdý tuk B.P. «ΙΖΖ2 i 2020

Jedna pětina tvrdého tuku se roztaví v parou vyhřívanépánvi při maximálně 45 °C. Účinná látka se prošije přes síto200 /Um a přidá se za míchání k roztavenému základu s použi-tím míchadla s vysokým střihem do získání hladké disperze.Při udržování teploty na 45 °C se přidá zbývající tuk a sus-penze se míchá do dosažení homogenní směsi. Celá suspenzese nechá projít nerezovým sítem 250 ^um a pak se za stáléhomíchání nechá vychladnout na 40 °C. Při teplotě 38 až 40 °C - 30 - se směs plní po 2,02 g do vhodných plastových forem o obje-mu 2 ml. Čípky se nechají zchladnout na teplotu místnosti. Příklad 10

Biologické účinnost

Protlvlrová účinnost

Protlvlrová účinnost sloučenin podle příkladu 2 bylastanovována proti třem kmenům HIV-1 a Jednomu kmenu HIV-2v dále uvedených buněčných liniích.

Buňky JIT., polopřirozená buněčná linie T, odvozená odpacienta s lymfoblastickou leukémií, infikovaného kmenemHIV-1 GB9.

Buňky 08168, buněčná linie lidského T-lymfoblastoidu,infikovaného kmenem HIV-1 RF.

Buňky ΠΓΤ-4, buněčná linie lidských leukemických T=buněk,infikovaných kmenem HIV-1 RF.

Buňky CEÍT, .buněčná linie lidského T-lymfoblastoidu,infikovaného kmeny HIV-1 RF a U455 nebo kmenem HIV-2 ROD.

Protlvlrová účinnost u buněk 08166, JÍY! a CElYi byla stano-vena pomocí inhibíce tvorby syncytia /Tochlkura ad., Viro-logy 164. 542-546/ a u buněk ÍYIT—4 pomocí inhlbice konverzeformazanu /Baba a d.;./1987/ Biochem. Biophys. Res. Commun. i,142. 128-134, ÍTossman /1983/ J. Immun. ffeth. 65, 55-57/.Protlvlrová účinnost byla rovněž stanovována analýzou množ-ství p24 antigenu HIV, syntetizovaného v přítomnosti a ne-přítomnosti enantiomerú. Výsledky Jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2: Í-Tá· ý-:ď-.í.:V;<' 5

I

I &amp; \ -- ----- -'= ·--·-- ' .......-- ·-· -"·' = - ' '·· ·"-· 1 i 1 1 1 t 1 1 1 UDI i 1 1 UDI I 1 1 —| 1 1 Lí- 1 I COI 1 1 1 1 ce 1 1 1 1 Ul 1 1 UD τ- 1 1 1 X o 1 1 UD Ι in t—| 1 Jíl o , 1 1 T— > o C3I 1 •Cl t— — H 1 -00 -M - Ί .. — - - -- · - — - ... - — —— 1 31 ID’ "AT ’O' 1 1 1 1 u X o Ol 1 \ 1 XI I m σι 1 1 1 1 1 • 1 1 1 1 1 Ol » 1 1 XI Cl 1 1 00 1 ml (Dl 1 1 CD 1 cm >1 1 I u 1 1 Ul Ol 1 1 1 1 Cl 1 1 τ- 1 1 X O (Dl 1 1 ι m tni 1 Jíl o -Hl 1 1 > C3 Ol 1 •Cl - T- mi 1 1 IH ·* K ! 1 31 Cs in (Dl 1 1 j X o Ol 1 XI M- T— Cl 1 1 | 1 1 1 1 1 1 1 1 1 - 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 x 1 1 1 1 1 1 in 1 1 1 1 1 i 1 •m- 1 1 1 | cm 1 =3 1 1 1 1 XI i 1 1 CD M-l 1 1 t 1 T— UD COI 1 O Ol 1 X o 1 1 1 O Ol 1 Μ- O Ol 1 Jíl o I | > O Ol 1 Ι O Ol 1 ‘Cl Τ- I | u l·—f V* •1 1 h— b_ * 1 31 Α 1 1 u X o Ol 1 ΕΞ x o Ol XI XI CM CO 1 1 (Dl 1 1 Hl 1 Ol l Hl 1 1 1 El Cl ^- 1 -Hl 1 1 1 XI 1 (Dl n I >i b_ 1 1 1 Dl &amp; >1 XI Ul X 1 1 31 “31 Ol 1 -H| Cl - 1 1 X 1 Cl * El X τ- 1 | O UDI XI X (Dl XI tni ι r- H-l 1 O X— I 1 Jíl -Hl Dl 1 's' > O Ol 1 CO o Ol (Dl »CI in X 0)1 □i X bJ l-l w 1 ΕΞ CO ~ 1 -Hl 31 o — (Ul Η,ΌΙ U X o Ol 1 GJ O Ol Hl XI V“ m m Cl XI NI 1 | 1 Ol | 1 Ol 1 1 Hl 1 -Hl >1 XI 1 XI 1 tni -Hl -Hl Ol Ol 1 O El -Hl ΕΞΙ Cl CU Ι- □ CM XI 1 Ol bJI Cl ΟΙ X X C5i 1 Hl Ul Hl Hl 31 X XJl XII CM in tni > T— U3I Ol X o '31 Hl 1 M· ini l-l XI ω CM T-1 1 Jíl o 1 XI S > O Ol X 1 r— O Ol a^i •Cl τ- ini XDI Cl bJ l-l H ’ΦΙ CO · 1» * H Ol 31 Α H >1 Hl U X o Ol X (Ml u cr o Ol XI XI <r— m (Ml Ol 1 1 N OJ 1 1 1 ni 1 1 OJ 1 1 1 Hl 1 1 -H >1 1 1 1 >1 1 c H| 1 (D 1 1 Hl 1 b_ 1 X XI 1 -H 1 1 -Hl Cl X 1 ro 1 H 1 1 , Ol (Dl 00 Ol X 1 o 1 1 NI Τ- CM CMI 0) NI 1 H 1 1 Ol (Dl Ι Ί o XDI 1 X 1 1 I El H· > co Ol H -Hl o 1 1 žRl Hl 1 M 1 X Cl 1 -H 1 1 Ol Ol »- X 1 H X 1 O 1 1 tni <*-l ΣΞ N NI X mi N NI -H 1 1 N N 1 1 X 0) (Dl c 1 0) (Dl X 1 1 0) 0) 1 1 Τ- E El M (Dl E El U 1 1 E E 1 1 Ι O Ol Ul O 01 1 1 O O 1 1 > H Hl • Hl H Hl • 1 (01 H H T" 1 1 l-l -H -Hl CM XI -H -Hl m 1 Cl H -H 1 1 X C · Cl Hl C Cl 1 Hl C C T- I ro 1 1 X ID (Dl (D XI (D 001 ro 1 Cl (D (0 cn “ i _y 1 1 c Cl Jí Cl C Cl jí 1 (Dl C c CO T- 1 i—1 1 ml X ro 0) 0)1 rH Hl X m ω (Dl <H 1 XJl 0) (D Τ- □ 1 31 Jí 3 1 1 1 3 1 Jí 3 1 1 1 3 1 31 1 1 Ι ml X) 1 Jíl »c N X XI X Ěfcl •C H X XI X 1 Ol X X X XDI ro 1 Ol 3 H + 1 1 (0 Ol 3 H + 1 1 ro 1 <H| + 1 u E> l·- 1 Ol XI > X XI 1— tni X > X XI l·- 1 ml X X cn ml

; >> - 32 -

Cytotoxlclta

Cytotoxidtta sloučenin podle příkladu 2, racemické slouče-niny /BCH-189, příklad 1/ a směsi obou enántiomerů 50:50 bylastanovena pro pět buněčných linií: H9, JITI, CEIY), C8166 a U937.

Na mikrotitrových plotnách s 96 prohlubněmi byly testo-vaná sloučeniny postupně zředěny na konečné koncentrace 100až 0,3 /Ug/ml. Do každé prohlubně ploten, obsahujících kont-rolní vzorky bez léčiva, bylo inokulováno 3,6.10^ buněk. Poinkubaci, trvající 5 dní při 37 °C, byl odebráním ťz.ot-kysuspenze a spočtením buněk, vylučujících trypan blue, v he-mocytometru stanoven počet aktivních buněk. Výsledky Jsou uvedeny v tabulce 3. JUDr. U^APLOVÁ trnky rwhysjbvó vzcry, ficence 11505 Praha 1, Štěpánská 16

.i i

C

Claims (16)

1. rivát.
2. 2. Sloučenina podle nároku 1, vyznačující se tím, žev podstatě neobsahuje odpovídající /+/-enantiomer. 3» Sloučenina podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím,že /+/-enantiomer Je přítomen v množství ne vyšším než asi5 ,% hmotnostních.
3. 4. Sloučenina padle nároku 1 až 3, vyznačující se tím,že /+/-enantiomer Je přítomen v množství ne vyšším než asi2 % hmotnostní.
4. 5. Sloučenina podle nároku 1 až 4, vyznačující se tím,že /+/-enantiomer Je přítomen v množství nižším než asi 1 %hmotnostní.
5. 6. Sloučenina podle nároku ve v podstatě čisté formě. 4 í Γ 'T
6. 7. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že ob-sahuje sloučeninu podle nároku 1 a? 6 spolu s farmaceutickypřijatelným nosičem.

   3. Sloučenina podle nároku 1 až 6 pro použití v tera-pii.
7. 9. Použitiléčiva k léčení sloučeniny podle nároku 1 až 6 pro výrobuvirové infekce.
8. 10. Způsob léčení savců včetně člověka, trpících nebo tel

   í‘ - 34 - ohrožených virovou infekcí, vyznačující se tím, že se podá- \ vá účinné množství sloučeniny podle nároku 1 až 6. ΐ \
9. 11. Způsob ořípravy sloučeniny podle'nároku 1 až 6, vy-značující se tím, že se /-/-enantiomer oddělí ze směsi, ob-sahující také /+/-enantiomer.
10. 12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že smě-sí sloučenin Je racemická směs.
11. 13. Způsob podle nároku 11 nebo 12, vyznačující se tím,že oddělení se· provádí chirální HPLC.
12. 14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, žé přiHPLC se Jako stacionární fáze používá acetylovaný beta-cyklp-dextrin nebo triacetát celulózy.
13. 15. Způsob podle nároku 11 nebo 12, vyznačující se tím,že oddělení se provádí enzymaticky zprostředkovaným enantio-selektivním katabolismem.
14. 16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že en-zym se používá v imobilizované formě..
15. 17. Způsob podle nároku 15 nebo 16, vyznačující se tím,že enzymem Je cytidin-deamináza.
16. 18. Způsob podle nároku 15 nebo 16, vyznačující se tím,že enzymem Je 5*-nukleotidáza.

    jUDr. J advoká' Patenty,pru 11505.