CS163191A3 - Process for preparing derivatives of a growth hormone releasing factor and peptides being useful as intermediates in said process - Google Patents

Description

O o & z/éí-My Ο"ϊ αο cc 4 z J L ,

Způsob výroby derivátů růstový hormon uvolňujícího Faktorua peptidů užitečných jako meziprodukty v tomto způsobu «Λ

Oblast techniky

Tento vynález se vztahuje na způsob výroby GRF(1-29)NH2,zajímavého biologicky aktivního derivátu růstový hormon uvol-ňujícího faktoru a jeho analogů stejně jako nových peptidů,které jsou užitečné jako meziprodukty v tomto způsobu.

Dosavadní stav techniky

Použití biologicky aktivních peptidů k farmaceutickýmúčelům a v zemědělství zvýšilo důležitost schopnosti synteti-zovat takové sloučeniny v co nějvětším měřítku. Dsou dostupnétri metody: a) chemická synthesa, b) enzymatická synthesa,ac) fermentace geneticky manipulovanými mikroorganismy. Zatím-co metodám a) a b) nebo jejich kombinaci se dává přednost ukrátkých peptidů, stalo se mnohem a mnohem zřejmějším, že <.dlouhé peptidy budou v budoucnu vyráběny využitím výhod metodpoužívajících rekombinanční DNA. Avšak tyto metody neumožňujířadu modifikací jako je inkorporace D-amino kyselin a C-ter-minálních amidových skupin, které mohou být důležité pro bio-logickou aktivitu. Následná enzymatická modifikace je protovysoce žádaná a takové reakce byly studovány pouze v omezenémrozsahu.

Byl popsán enzym, který katalyzuje hydroxylaci C-termi-nálních glycylových zbytků, které postupně rozkládá ponechá-vajíc předposlední zbytek amidovaný (US patent č. 4 708 934,EP 308067A, DK přihláška č. 4489/88). Tento glycinoxydázovýenzym, který je závislý na Ca^+, 0£ a askorbátu jako kofak-torech, je považován za enzym odpovědný za in vivo vytvářenípeptidových amidů. Byl používán pro amidaci peptidů v malémměřítku, ale je dosud otázkou, zda vykazuje nízkou aktivitusvé použitelnosti pro práci ve velkém měřítku. Enzym, jak je 2 izolován z přirozených zdrojů jako krysí meduální thyroidníkarcinom je velmi drahý.

Amidace může být také dosažena proteázou katalyzovanýmikondenzačními reakcemi s použitím amidu aminokyseliny neboamidu peptidu jako nukleofilu. Výtěžky kondenzačních reakcíjsou dbecně nízké dokonce v přítomnosti organických rozpouš-tědel, leda, že produkt precipituje v reakční směsi a to sečasto nestává s dlouhými peptidy. Nadto prekursorový peptidmůže vykazovat malou rozpustnost v takových médiích. Avšakserinovou nebo thiolproteázou katalyzované transpeptidačníreakce mohou být provedeny s velkými výtěžky, ale je to ne-zbytný předpoklad, že enzym vykazuje specifickou účinnostna peptidickou vazbu těsně u C-zakončení. Endopeptidázy nejsouobecně vhodné, jelikož obvykle budou stejně štěpit v ostatníchposicích peptidového řetězce. Serinové karboxypeptidázy nadruhé straně vykazují přísnou specifitu pro C-terminální pep-tidovou vazbu a jsou schopné katalyzovat výměnu C-terminálníaminokyseliny s amidem amino-kyseliny, přidaný k reakčnímumediu k soutěži jako nukleofil s vodou.

Tato vlastnost serinových karboxypeptidás byla usku-tečněna skupinou výzkumníků v Carlsbergském výzkumném centrua vedla ke skupině patentů určených současnému zplnomocněncizaložených na DK přihlášce č. 1443/79 representovaných EPpatentem č. 17 485, US patentem č. 4 806 534 a jeho otcovskýmUS patentem č. 4 339 543 a W,0 80/02151, které vedly mezi jinýmk DK patentu č. 155 613. Tyto patenty byly založeny na tehdypřekvapujícím nálezu, že exopeptidázy byly vhodné jako kata-lyzátory enzymatické peptidové synthesy, zatímco předchozípráce v obovu jednaly výlučně s endopeptidasami. V závislostina povaze reagujících látek (substrát a nukleofilní složky)a podmínkách reakce, zejména na pH, serinové a thiolové karbo-xypeptidázy mohou katalyzovat peptidovou synthesu prodlouženímřetězu nebo transpeptidací. Výhodným enzymem je karboxypep-tidáza Y(CPD Y) z kvasnic. 3 Základní a následný výzkum byl popsán v řadě článků(odkazy 14 - 10), které spolu se svrchu zmíněnými patentyjsou všechny zahrnuty v odkazech.

Obecný princip enzymatické synthesy peptidů transpepti-dací v přítomností serinových nebo thiolových karboxypep-tidás je popsán v US patentu č. 4 806 473 a v jeho paralel-ním dánském patentu č. 155 613. Se zřejmým odkazem na produk-ci peptidových amidů tyto patenty obecně objevují a nárokujívýrobu peptidových amidů kde A znamená N-terminál chráněný zbytkem aminokyseliny nebo popřípadě N-terminálchráněný peptidový zbytek a B znamená L-aminokyselinový zby-tek, reagováním jeho substrátové složky, popřípadě N-termi-nálu chráněného peptidu A-X-OU, kde A má svrchu uvedený vý-znam a X znamená aminokyselinu, s nukleofilní (aminovou) slož-kou H-B-NH2 v přítomnosti l-specifického serinového nebo thio-lového karboxypeptidázového enzymu z kvasnicového nebo zvíře-cího, rostlinného nebo mikrobiálního původu ve vodném roztokudisperze při pH od 5 do 10,5. Jak je dále vysvětleno v odkazu14, preferované pH je kolem neutrálního, jestliže je žádánaformace peptidového amidu.

Jako representativní příklad z US patentu č. 4 806 473může být zmíněna reakce Bz-Phe-Gly s Leu-Nl·^ v přítomnostiCPD-Y při pH 7,6 a 26 °C vedoucí k vytvoření Bz-Phe-Leu-NN2v 90¾ výtěžku. Další příklady jsou zahrnuty v DK patentu č. 155 613 mezi jiným reakce Ac(Ala)"^ s Leu-NH2 v přítomnostiCPD-Y vedoucí k Ac(Ala)^-Leu-NH2 ve výtěžku 70 %.

Další pokusy jsou popsány v odkazech 14-18, které pod-porují pionýrský charakter těchto časných potratů a obecnouaplikovatelnost serinových karboxypeptidáz jako katalyzátorůpro C-terminální modifikaci peptidů.

Aby se získalo lepší porozumění tohoto vynálezu, kterýje detailněji popsán níže, je považováno za vhodné uvést 4 obecnou diskusi o transpeptidačních principech a kompetič-ních reakcích. C-terminální amidace peptidů působením serinovou kar-koxypeptidázou katalyzovanou transpeptidační reakcí je zá-vislá na : a) rozpustítelnosti peptidu ve vodném mediu,ve kterém je enzym aktivní a relativně stabilní, b) dostupnostC-zakončení enzymatickému štěpení a c) dostupnost serinovékarboxypeptidázy vhodné substrátové preference.

Typ reakcí, které mohou nastat je vyobrazen ve schématu 1se substrátem R-NH-A-B-C-OH a nukleofilem Enzym ata- kuje C-terminální peptidovou vazbu vytvořením acylenzymovéhomeziproduktu, který může být následně deacylován nukleofilemk vytvoření amidovaného transpeptidačního produktu (TI), vsoutěži s vodou produkující produkt hydrolýzy (Hl). Poměr TIk Hl může být zvýšen zvýšením koncentrace reaktivní, depro-tonované formy nukleofilu, to je zvýšením buď pH nebo přidánímmnožství nukleofilu. Povaha odštěpné skupiny, H-C-QH, měla.v případě CPD-Y, stejný signifikan tni vliv na tento poměr(14, 15) nicméně bez žádného zřetelného trendu. Jelikož tentoaminokyselinový zbytek netvořil část žádaného amidovanéhoproduktu (TI), může být v principu zvolen volně.

Serinová karboxypeptidáza může rovněž katalyzovat vytvo-ření prodlouženého kondenzačního produktu (Cl) v soutěži s Hla TI. Avšak při optimálních hodnotách pH pro transpeptidaci,takové reakce jsou ve vodném roztoku energicky nevýhodné av důsledku toho, při ekvilibriu, množství Cl, které může býtvytvořeno, je omezeno na několik procent, dokonce i při kon-centracích nukleofilu přesahujících 1H. Nadto rychlosti tako-vých reakcí jsou normálně velmi nízké ve srovnání ke kompetu-jícímu útoku na C-terminální peptidovou vazbu, a tak, konden-zační produkty jsou zřídka problémem. Avšak, tato reakce můžebýt zvrácena v případech, kde C-terminální sekvence peptiduse nehodí k substrátové preferenci enzymu s důsledkem, že se 5 tvoří malé množství kondenzačních produktů v počátečních fá-zích reakce a potom, s časem zmizí, když substrát je spotře-bován .

Produkt hydrolýzy (Hl) může-být transformován cestoustejného typu reakcí na produkty T2, H2 a TI, následovanýpodobnými reakcemi s H2, atd. Avšak nové produkty mohou ta-ké vzniknout, když enzym působí na C-terminální amidovouvazbu TI, to je amoniak, funguje jeho odštěpená skupina,produkující další transpeptidační produkt (TT1) nebo pro-dukt hydrolýzy (HT1). Proto, aby se tyto produkty objevilyv signifikačních množstvích je vyžadováno, že amidasová akti-vita proti TI je signifikantní ve srovnání k peptidasovó aktivitě vůči substrátu a to je normální jenom v případě pH > 9,kde peptidasová aktivita je nízká a amidazová aktivita jevysoká nebo v případech, kde peptidová aktivita je v důsled-ku nedostatku preference pro C-terminální peptidovou vazbu.

Je zřejmé, že působení serinové karboxypeptidázy naL-zakončení peptidu v přítomnosti amidu aminokyseliny můževést k četným produktům, z nichž je žádaný jenom TI.

SCHĚ.MA I

OJ -NH-fl-B-C-D-NHg (Cl) R-NH-fl-D-D-OH (HT1)

transpcptidační reakce c: kondenza6ní rBa]<oe nukleuf il :H-D-NHg h: hydrelyaační reakce 7

Zatímco reakce s N-blokovanými dipeptidy vhodnéhosložení relativně k substrátové preferenci enzymu v ně-kterých případech vede k výtěžkům TI dosahujících 100 ¾ (14, 15, 17, 10), situace je rozdílná s většími moleku-lami .

Tak v patentové skupině representované US patentemč. 4 645 740 a dánským patentem č. 140 714 určených sou-časnému zmocněnci a zahrnutých zde odkazem, je popsán pro-ces pro enzymatické nahrazení B-30 aminokyseliny v insuli-nech, zejména konversí vepřového insulinu na lidský insu-lin nahrazením B-30 aminokyseliny alaninu threoninem s použi-tím serinové karboxypeptidázy, s výhodou karboxypeptidázyY z kvasnic (CPD-Y) nebo karboxypeptidázy P z Penicilliumjanthinellum (CPD-P) jeho katalyzátoru.

Když vepřový insulin byl uveden do reakce s threonin-amidem v přítomnosti CPD-Y při pH 7,5, byla získána kompliko-vaná směs reakčních produktů (příklad 4 patentů). Směs bylaanalyzována pomocí iontoměničové chromatografie a byly dete-kovány tři hroty. Hroty byly dále analyzovány enzymatickoudigescí a analýzou aminokyselin vedoucí k následujícímusložení (Ins-Pro-Lys-Ala-OH, jenž byl užit k pojmenovánívýchozího materiálu vepřového insulinu), a symboly ze sché-matu I jsou užity jako ilustrace.

Vrchol 1: 21 % z kterého 65 % Ins-Pro-Lys-Thr-Thr-NH2 (TT1) 35 % Ins-Pro-Lys-Thr-NH2 (TI) Vrchol 2: 61 % z kterého 52 % Ins-Pro-Lys-Ala-OH (nereagovaný vepřovýinsulin) (Ξ) 26 % Ins-Pro-Lys-Thr-OH (lidský insulin) (HT1) 22 % Ins-Pro-Thr-NH2 (T2) 8

Vrchol 3: 18 %

Rozkladné produkty.

Tak ve známém způsobu bylo získáno pouze 21 % směsiTI a TT1. Převažující frakce sestávala ze směsi nereagovaného S,HT1 a T2.

Také bylo získáno signifikantní množství rozkladnýchproduktů. V jiném příkladu provedeném při pH 9,5 80 % vepřovéhoinsulinu bylo uvedeno do reakce za vytvoření toho, co seobjevilo být amidem lidského insulinu (TI), který byl všakdále hydrolyzován in šitu na lidský insulin (HT1). Značnémnožství (20 %) reagovalo k vytvoření H2.

Svrchu zmíněná insulinová modifikace je dále analyzovánav odkazech 23 a 16.

Zatímco vytváření amidu lidského insulinu působenímobecných principů svrchu popsané transpeptidace (S -> TI)jeurčeitě možné, není snadno monitorováno. Zřejmě mohou býtvybrány reakční podmínky, které proti tomu se zdají býtvhodné k vytváření TI, ale takové znaky nebyly referovány.

Také oddělení různých reagujících látek může být vícenebo méně obtížné. Jelikož TI postrádá negativní náboj naC-zakončení, může být snadno oddělen od H1 v preparativnístupnici iontoměničovou chromatografií. Avšak pod podmínkou,že postranní řetězec C-terminálního aminokyselinového zbytkuje nenabitý, T2, T3 atd. stejně jako Cl a TT1 vykazují stejnýnáboj a nemohou být proto odděleny od TI iontoměničovou chro-matografií. V takových případech preparativní HPLC se sloupciv reversní fázi se jeví být jedinou a mnohem méně atraktivnínožností. Je proto mnohem žádoucnější dosáhnout potlačení 9 vytvoření takových produktů vybráním optimálního pH, kon-centrace nukleofilu a nejdůležitější je vybrání serinovékarboxypeptidázy s nejvhodnější substrátovou preferencí (viztabulku 1), které rychle a v nejvyšším možném výtěžku pře-měňuje substrát na TI a produkuje, jestliže vůbec nějaký,tak nejnižší možný výtěžek nežádoucích vedlejších produktů. 1< rekapitulaci podstaty svrchu uvedených pozorování,inkorporace C-terminálních amidových skupin do peptidů trans-peptidací v přítomnosti serinové karboxypeptidázy používajícípříslušný amid aminokyseliny jako nukleofil, jak je široce t popsáno a nárokováno v US patentu č. 4 306 473 a ostatníchpříbuzných patentech, je velmi vhodnou metodou efektivně ap-likovatelnou pro jakýkoli peptid.

Avšak způsob není vždy dostatečně selektivní a vyžadu-je čisticí postupy, aby byly odstraněny produkty různýchvedlejších reakcí, zejména jsou-li užity další peptidy,v kterémžto případě je těžké stanovit optimální podmínkyk potlačení vedlejších reakcí. V časných publikacích původních vynálezů publikovanýchkrátce po podání svrchu uvedených patentových přihlášek,byla vyvinuta snaha analyzovat vliv C-terminální (odštěpe-né skupiny) aminokyseliny a předposlední aminokyseliny.

Tak v odkazu 14 Breddam a další, při použití Leu-Nl·^ jehonukleofilu a Gly, Ala, Ser, Val. Leu a Phe jeho odštěpnýchskupin, navrhovaly na základě získaných výtěžků, že pouze vpřípadech kde odštěpnou skupinou je jeden z nejmenšíchaminokyselin, to je Gly, Ala, nebo Ser je reakce úspěšnáa při nejmenším pro jednoduché testované substráty, zde ne-byla žádná závislost na předposledním zbytku (jenž je Ala,

Phe a Gly). V odkazu 15 Breddam a další, s použitím Gly-Nl·^ jakonukleofilu a Z-Ala-X jako substrátem, byl Gly, Ala, Ser, 10

Arg, Pro, Lys, Asn, His, Val, Met, Phe a Asp modifikovanýv dřívějším konstatování k účinku, že když užijeme Gly-NH2jako nukleofil, výtěžek je silně závislý na C-terminální(odštěpné skupině) aminokyseliny. Výtěžky kolísaly od 10do 100 % s nejnižšími výtěžky získanými se substráty, kdehydrofobní kyselina (Val, Met, Phe) slouží jako odštěpná skupina. Oe třeba poznamenat, že výtěžky se zásaditými kyseli-nami (Asn, Lys) jsou srovnatelné s výtěžky s hydrofilnímikyselinami (Ala, Ser), Lys je dokonce lepší než Ser.

Co se týče předposledního aminokyselinového zbytkupeptidových substrátů, byl studován vliv s použitím serieN-blokovaných dipeptidů s různými předposledními aminoky-selinami (Ala, Val, Leu, Ile, Phe a Val), jeho odštěpnouskupinou. S použitím Gly-NH2 jako nukleofilem, bylo zřejmé,že vazebné výtěžky, které se měnily od 45 % pro Ile do 5 %pro Phe, jsou závislé na předposledním aminokyselinovémzbytku, ale nemohl být nalezen žádný zřetelný trend. V odkazu 23 některé z experimentů zakládající USpatent č. 4 645 740 a jejich příbuzných patentů byly dis-kutovány. Zde byl vepřový insulin Ins-Pro-Lys-Ala uvedendo reakce mezi jiným s Thr-NH2 a bylo konstatováno, žeIns-Pro-Lys-0H byl lepší substrát než Ins-Pro-Lys-Ala-OH,jelikožIns-Pro-Thr-NH2 byl vytvářen ve vyšších výtěžcíchnež Ins-Pro-Lys-Thr-NH2. Závěrem byl Lys v této reakci lep-ší odštěpnou skupinou než Ala.

Také se objevila signifikantní oligomerizace za vytvá-ření Pro-Lys-Thr-Thr-NH2.

Tyto výsledky byly dále potvrzeny v odkazu 16 použí-vajícím Bz-Lys-Ala-OH jako modelový peptid vedle vepřovéhoinsulinu. Závěrečnou zprávou bylo, že pro budoucí užitíCPO-Y (serinová karboxypeptidáza užitá v pokusech) vtranspeptidačních reakcích je důležité být si vědom možnosti^že mohou být tvořeny vedlejší produkty. 11

Vedle svrchu uvedených výzkumů aplikovatelnosti seri-nové karboxypeptidázy v C-terminálních modifikacích insuli-nu, další pokus byl referován s amidací delších peptidůpoužívající jako katalyzátor CPD-Y.

Tak v EP-B2-197794 a v paralelním US patentu č. 4 709 014 (Tamaoki), lidský kalcitominový-Leu peptidbyl .uveden do reakce s amoniakem jako nukleofilem po-užívající CPD-Y jako katalyzátor za podmínek jinak podobnýchtěm, jež užil Breddam a další v odkazu 15. Svrchu uvedená dis-kuse odkazu 15 byla omezena na amidy aminokyselin jako nu-kleofily, zatímco hlavním účelem článku bylo srovnat různénukleofily, také včetně amoniaku.

Tamaoki získal lidský kalcitoninamid ve výtěžku 24,7 %,se zbytkem 57 % nereagovaného substrátu a 17,2 ¾ neamidova-ných vedlejších produktů (včetně lidského kalcitoninu).

Ve svých obecnějších hlediscích Tamaokiho patentyobjevují způsob výroby peptidu majícího C-terminální prolin-amid, který pozůstává v reagování ve vodném roztoku peptido-vého substrátu majícího C-terminální Pro-Leu, Pro-Ile,

Pro-Val nebo Pro-Phe s karboxypeptidázou Y v přítomnostiamoniaku.

Bez jakéhokoliv chtění schvalovat vývody činěníTamaokim, je třeba poznamenat, že nárokuje, že na rozdílnálezům Breddama a dalších v odkazu 15, kde je vyjádřenapřednost pro hydrofilní C-terminální aminokyseliny jakoodštěpné skupiny, použití hydrofobních aminokyselin (Leu,

Ile, Val a Phe) poskytuje lepší výtěžky než Gly, když Proje předposlední aminokyselinou. Přesto výtěžky amidačních produktů v Tamaokiho pří-kladech používající Cbz-Ala-Pro-X-OH jako substrátu,kde X je Leu, Leu, Val, Phe a Ile, byly pouze 35,1 %, 12 43 %, 15,4 %, 13,5 %, 22,6 %. Zbytek byl, v referovanémrozsahu, nereagovaný výchozí materiál a neamidované vdlejšíprodukty Cbz-Ala-Pro-OH.

Jak bylo znázorněno dříve, tento vynález se vztahujena způsob pro výrobu derivátů růstový hormon uvolňujícíhofaktoru a jeho analogů. Růstový hormon uvolňující faktor (GRF) nebo soma-tocrinin, stimulující výstup růstového hormonu v glandulapitnitaria, je 44-zbytek amidovaného peptidu 5 10 H2N-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-P&amp;e-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys- 15 20 25

Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp- 30 35

Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg- 40

Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 který může být použit ke stimulaci růstu obratlovců (31).Obě amidové skupiny stejně jako 15 aminokyselinový zbyteknejblíže k C-terminálu mohou být odstraněny bez potlačenéaktivity, ale každé vede k postupnému poklesu biologickéaktivity. Avšak velká část aktivity může být znovuzískánamidací těchto okleštěných peptidů. Jeden takový derivát?značného významu je GRF (1-29)NH2, který může být považo-ván jako bioaktivní jádro GRF.

Od určení aktivity GRF 91-29)NH2 četné strukturálnílineární nebo ckylické analogy byly připraveny výměnou, vy-necháním nebo modifikováním jedné nebo více z 29 L-aminoky-selin v nativním GFR řetězci.

Zejména zajímavé analogy byly připraveny Heimerem adalšími (32), Roche Research Center, New Jersey, USA, viz 13 /des NHZ Tyr1, D-Ala2, Ala15/-GRF (1-29)NH2, který jedesetkrát více účinnější než původní sloučenina in vivoa cyklo(Asp8-lysl2)-/Alal5/GFR(l-29)NH2, který je méněúčinný než lineární sloučenina in vitro, ale zachovávalsi značnou bioaktivitu a vyvolával značné snížení růsto-vého hormonu u vepřů. Článek Heimer a další je zahrnut v odkazech.

Heimer a další se rovněž soustředili na řadu ostat-15 nich modifikací. Nahrazení Gly šroubovnici vytvářející-mi aminokyselinami Val, Leu, Aib a Ala vedl k analogůmse zvyšující se biologickou aktivitou, zatímco náhradaSar, šroubovnici štěpícím zbytkem vedl ke značné ztrátěbiologické aktivity.

Analogy GRF(1-29)NH2 s nahražením Tyr^ desNH2Tyr^nebo inkorporací D-Ala2 také vedly ke zvýšení biologické ak-tivity. Ostatní analogy jsou popsány v patentech a patentovýchpřihláškách níže uvedených, všechny jsou zde zahrnuty jakoodkazy. EP-A-352014 (Salk Inst. for Biol. Studies) ukazuje řadu možných modifikací GRF a GRF(1-29)NH2 v 1, 2, 3, 8, 12, 13, 15, 18, 21, 22, 24, 25, 27 a 28 posicích a kde v zájmu29 současné souvislosti Arg může být nahražen Cys, Abu, Asp,Glu, Orn, Lys, Dab nebo Dap (všechny L nebo D). Zřejmě íbytopeptidy jsou mnohem aktivnější s lepší resistencí k enzyma-tické degradaci než nativní GRF. EP-A-307860 (Roche) popisuje řadu lineárních a cyklickýchGRF analogů vztažených k tem, jenž byly dříve diskutovány. EP-A-292334 (Sall) popisuje řadu možných modifikací GRF aGRF(1-29)NH2 v 1, 2, 3, 8, 10, 12, 13, 15, 18, 21, 22, 24, 25, 27 a 28 posicích. •V. 14 FR-A-2594832 (Sanofi) popisuje modifikovaný GRF(l-29)NHO, 19 27 kde Val může být vyměněn s Ile, Met může být vyměněn 2 8 s Nle a/nebo Ser může být vyměněn s Asn a, ve kterémnejméně 1 a až do 6 aminokyselin, s výhodou v posicích2, 5, 12, 17, 21 nebo 27, jsou nahraženy alfa-aminoalky-noickou kyselinou, s výhodou alfa-amino-4-pentynoickou ky-selinou, alfa-amino-4-hexylnoickou kyselinou a 2,6-diamino--4-hexynoickou kyselinou, které mohou být substituované. EP-A-216517 (Salk) odpovídající US-A-4689318 popisuje raduGRF(1-29)NH2 analogů, kde nejméně 4 ž aminokyselin 5 - 13, 15, 18 - 21 a 26 jsou odlišné od nativní sekvence a s výhodouobsahují Alaz . US-A-4628043 (Salk) popisuje jinou skupinu analogů, kde mezijiným Tyr^ může být nahrazen Met, Leu, D-Tyr, Ο-His nebo Hisa Gly^ může být nahražen D-Ala.

Ostatní analogy jsou popsány v EP-A-188214 (Tulane Educatio-nal French) /D-Ala2, Arg12’21/GRF(1-29)NH2, RP-A-177819(Roche), US-A-4528190 (Salk), US-A-4513586 (Salk), EP-A--121764 (Roche) s Met2? nahraženým Leu nebo Nle, OP-A-63,/287799 (Tulane Educational French) odhalující mezi jiným/1 Pr-Tyr1, i Pr-Lys12’21/GRF(1-29)NH2 jako 106-krát vícemocnější než GRF(1-29)NH2. Obecně řečeno odborník vyhle-dávající způsob amidace GRF(1-29)OH a jeho analogů by určitěočekával obecný způsob podle US patentu č. 4 806 473 užíva-jící GRF(l-28)-X, kde X je L-aminokyselina, jako substráta Ang-NH2 jako nukleofil pracující v přítomnosti serinovékarboxypeptidázy, ale neměl žádný jasný výběr aplikovatelnéaminokyseliny X, a očekával by objevení rady kompetujícíchreakcí, nechávajících ho v nejistotě pokud jde o výtěžky anezbytné purifikační postupy, aby byl získán žádaný amido-vaný konečný produkt. 15

Podstata vynálezu

Vynález je založen na překvapujícím nálezu, že vybrá-ním jeho odštěpené skupiny X ve výchozím materiálu GRF(1-2B)Xřada aminokyselin, které logicky nezapadají do žádného zpreferenčních vzorů navrhovaných v předchozích pracích Bred-damem a dalšími a Tamaokim, svrchu diskutovaných, viz acyk-lické alfa-aminokarbonové kyseliny mající nenabitý hydrofilic-ký postranní řetězec při nejmenším velikosti methylové skupi-ny, je možné získat GRF(1-29)NH2 v překvapivě vysokých výtěž-cích. Výhodné aminokyseliny jsou Thr, Ala, Ser, Clu a Asn,zejména Thr a Ala. Jsou pozorovány velmi malé množství ne-reagovaného substrátu a vedlejších produktů pocházející zkompetujících reakcí, zejména vezmou-li se do úvahy zkušenostis lidským amidem insulinu popsané svrchu a Tamaokiho výsledkys kalcitoninem. V jistém rozsahu, jsou tato pozorování založena napokusech s modelovými tripeptidy obsahujícími nativníGRF(27-28) sekvenci a různými odštěpnými skupinami, stejnějako na syntetickém GRF(l-28) Ala-peptidu, jak je dále nížepopsáno.'···

Založeno na těchto pokusech a obecné korelaci mezimodelovými peptidy a dalšími peptidy ukázanými ve svrchuuvedených článcích, je proto vhodné uzavřít, že způsob neníomezen na výrobu peptidů obsahující nativní GRF(l-29) sek-venci, ale při nejmenším na analogy kde jedna nebo víceaminokyselin v posicích 1 až 26 jsou nahraženy jinými amino-kyselinami jak v D- a L-formě a cyklickými aminokyselinami,které mohou být chráněny nebo derivatizovány, to je analogůtypů odkrytých ve svrchu zmíněných potratech zahrnutých odkazy.

Souhlasně současný vynález se vztahuje na způsob přípra-vy derivátů růstový hoprmon uvolňujícího faktoru, vizGRF(1-29)NH2 a jejich analogů, charakterizovaných uvedením 16 do reakce substrátové složky vysoce

GRF'- Met - Ser - X kde GRF označuje nativní GRF(l-26) sekvenci nebo její ana-logy včetně GRF(n-26) fragmentů, kde n je 1 až 8, a X jeacyklický alfa-aminokarbonový zbytek kyseliny mající nenabi-tý bydrofilický postranní řetězec při nejmenším velikostimethylové skupiny, s N-Arg-Nl·^ jako nukleofilní složkou vpřítomnosti L-specifického serinového nebo thiolkarboxypep-tidasového enzymu z kvasinek nebo zvířat, rostlinného neboostatního mikrobiálního původu ve vodném roztoku nebo disper-zi mající pH od 6 do 9 a je-li třeba vázáním žádaného N--terminálního (l-(n-l)) fragmentu chemicky nebo enzymaticky.

Pro enzymatické vázání fragmentu může být užit endo-peptidázový enzym mající vlastní specificitu s ohledem naC-terminál (l-(n-l)) fragmentu, to je papain nebo chymo-trypsin.

Chemické vázání fragmentu může být provedeno následu-jícím zavedením vhodných ochranných skupin v roztokové fáziv přítomnosti vhodných katalyzátorů, například DCC spolu spřidatnými látkami, například KOBt. Výhodnou skupinou substrátových složek jsou složkyvzorce GRF"-Met-Ser-X, kde GRF" označuje nativní GRF(l-26)sekvenci, kde 1 do 4 aminokyselinových zbytků mohou být na-hraženy nebo vynechány nebo jejich des-alfa-NH^ deriváty aX má svrchu uvedený význam.

Použitelné karboxypeptidázy ve způsobu podle vynálezujsou L-specifické serinové nebo thiolové karboxypeptidázy.Takové enzymy mohou být vytvářeny kvasinkovými houbami, nebomohou být zvířecího, rostlinného nebo ostatního mikrobiální-ho původu. 17

Zejména vhodným enzymem je karboxypeptidáza Y z kvasinko-vých hub (CPD-Y). Tento enzym je popsán v dřívějších patentechmezi jiným s odkazem na johansena a dalších (odkaz 28), kterývyvinul zejména vhodnou purifikační metodu affinitní chroma-tografie na affinitní pryskyřici obsahující polymerickoupryskyřicovou matrix s vázanými benzylsuccinylovými skupi-nami. CPD-Y, která je serinovým enzymem, je dostupná ve vel-kých množstvích a projevuje relativně velkou stabilitu. Dalšídetaily jsou uvedeny v odkazu 14.

Vedle CPD-Y, která je v současnosti výhodným enzymem,způsob podle vynálezu je proveditelný s dalšími karboxypepti-dázami, takovými jako jsou uvedeny v následujícím shrnutí:

Enzym Původ

Houby kaeboxypeptidáza S-lkarboxypeptidáza S-2karboxypeptidáza (y) zkarboxypeptidáza(y) z

Penicillium janthinellumPenicillium janthinellumAspergillus saitoi .Aspergillus oryzae

Rostliny

karboxypeptidáza(y) C karboxypeptidáza C^

Phaseolain karboxypeptidázy M-I a M-IIkarboxypeptidáza W-IIkarboxypeptidázy z pomerančové listy pomerančové slupky

Citrus natsudaidai Hayata (citroník) fazolové listy klíčící ječmen pšeničné otruby klíčící balvněné rosltiny rajská jablíčka melounů bromelinový(ananasový)prášek 18 - Těsný, vztah mezi řadou svrchu uvedených karboxypeptidázje diskutován Kubotou a dalších (odkaz 33).

Jak je uvedeno svrchu, způsob podle vynálezu je prová-děn při pH 6,0 až 9,0, s výhodou při pH 6,5 až 8,0, nejvý-nodněji od 7,5 do 8,0. Preferovaná hodnota pH, která je čas-to ve velmi úzkých hranicích, závisí na užitém enzymu.

Vybraná hodnota pH by měla být udržována v průběhureakce.

Kontrola pH by měla být uskutečněna zahrnutím vhodnéhopufru pro vybraný rozsah pH do reakčního media.

Hodnota pH může být také udržována přidáním kyselinyjako HC1, nebo zásady jako NaOH, v průběhu reakce. To můžebýtběžně dosaženo použitím pH-statu.

Avšak podmínky mohou být rovněž ovlivněny změnou kon-centrace enzymu, reakční doby, atd.

Reakce se provádí ve vodném reakčním mediu, kteréje-li to žádáno, může obsahovat do 80 % objemu organickéhorozpouštědla. Výhodnými organickými rozpouštědly jsou alka-noly například methanol a ethanol, glykoly, například ethy-lenglykol nebo polyethylenglykoly, glycerol, alkanoické kyse-liny, například kyselina octová, dimethylformamid, dimethyl-sulfoxid, tetrahydrofuran, dioxan a dimethoxyethan. Výběr složení reakčního media závisí zejména na roz-pustnosti, teplotě a pH složek reakce a produktů reakce aa stabilitě enzymu.

Reakční medium může také obsahovat složka, která po-skytuje enzymu nerozpustnost, ale zachování značnou částenzymové aktivity, takovou jako je iontoměničová prysky- 19 řiče. Alternativně enzym může být immobilizován známým způso-bem, například vázáním k matrix, takové jako přičně vázanýdextran nebo aragosa, nebo ke kysličníku křemičitému, poly-amidu nebo celulose, nebo enhapsulací v polyakrylamidu, al-ginátu nebo vláknech. Vedle toho enzym může být modifikovánchemickými způsoby ke zlepšení jeho stability nebo enzyma-tických vlastností. S výhodou je v reakčním mediu zahrnuto chelační činidlonapříklad EDTA, které; rovněž může zahrnovat soli.

Koncentrace dvou účastníků reakce může se měnit v širo-kém rozsahu, jak je níže vysvětleno. Výhodná výchozí koncen-trace pro substrátovou složku je 0,1 - 20 mM, výhodně 1-10 mMa pro nukleofilovou složku 0,02 do 2,0 M, s výhodou 0,2 -1,5 M.

Enzymová aktivita se může také měnit, ale koncentrace __ o _ Λ , je výhodně 10 do 10 M. Nejvýhodnější aktivita závisí me-zi jiným na řetězci substrátu a koncentraci, koncentracinukleofilu, reakční době, reakční teplotě, pH a přítomnostorganických rozpouštědel a/nebo solí. Množství enzymu by mě-lo být v každém případě upraveno k poskytnutí nezbytnéhostupně konverze pro vytvoření optimálního absolutního množ-ství produktu.

Podle vynálezu reakční teplota je 10 až 50 °C, s vý-hodou 20 až 40 °C. Nejvýhodnější reakční teplota pro danousynthesu může být určena pokusy, ale závisí zejména na kon-centraci nukleofilové složky a koncentraci enzymu. Vhodnáteplota bude obvykle kolem 20 až 30 °C, s výhodou kolem 25 °Cberouc do výpočtu úvahu pro aktivitu a stabilitu enzymu.

Podobné variace se objevují pro reakční dobu, kterámnohem více závisí na ostatních parametrech reakce, zejménana koncentraci enzymu. Standardní reakční doba ve způsobupodle vynálezu je 1 - 3 hodin. 20 -

Zkratky aminokyselin, aminokyselinových derivátů apeptidu jsou uvedeny podle Pokynů IUPAC-IUB Commission onBiochemical Nomenclature a aminokyseliny jsou v L-forměpokud není uvedeno jinak, Vazební místo pro C-terminálníaminokyselinový zbytek substrátu je označeno S^ a ty proaminokyselinové zbytky v amino-terminálním směru pryč odštěpné vazby jsou .označeny S^, S2, ... S^. Posice substrá-tu jsou všechny označeny P^, P^, P^ ... P^ ve shodě s va-zebnými místy (odkaz 1). Následující přídatné zkratky jsou užity: AcOH, kyselinaoctová, B2, N-benzyl, OCCI, N,N'-dicyklohexylkarboimid,

Dh bz, 3,4-dihydro-4-oxo-l,2,3-benzotriazin-3-y1, DICI,diisopropylkarbodiimid, DMAP, 4-N,N-dimethylaminopyridin,DMF, N,N-dimethylformamid, EDTA, ethylendiamintetraoctovákyselina, Fmoc, flurenyl-9-y1-methylkarbonyl, Ft, frakcetranspeptidace, RGF, růstový hormon uvolňující faktor, HPLC, vysoko výkonostní kapalinová chromatografie, Mtr, 2,3,6-trimethyl-4-methoxyfenylsulfonyl, Pfp, pentafluor-fenyl, TFA, triíluoroctová kyselina, THF, tetrahydrofuran. Předtím, než způsob podle vynálezu bude ilustrovánpříklady, výchozí materiály, metody měření atd. budouvysvětleny v obecných pojmech. Výchozí materiály DMF byl přečištěn frakcionální destilací ve vakuu. THF byl před použitím prohnán přes aktivní kysličník hli-nitý. Fmoc-aminokyseliny byly odkoupeny od Milligenu a bylypřeměněny na Dhbt estery reakcí s karbodiimidy a Dhbt-OH(Fluha) v THF(2O). Peptidy synthesující pryskyřice(Macrosorb SPR) byla zakoupena od Sterling Organics. Sek-venční analýza byla provedena na ABI sekvenceru v plynovéfázi a d Durrum D-500 zařízení bylo užito k analýze amino-kyselin. HPLC zařízení bylo od Waters Associates. Vzorky 21 byly hydrolyzovány 24 hodin v 6N kyselině chlorovodíkovéa odpařeny, před analýzou aminokyselin. H-Arg-NH2-2HC1, Bz-Met-OH, ostatní aminokyseliny aDERIV8TY AMINOKYSELIN A GRF(1-29)-NH2 byly získány odBachem, Švýcarsko. CPD-Y je obchodně dosažitelný od žada-telů . Substráty Bz-Met-Ser-Ala-OH, Bz-Met-Ser-Leu-OH,Bz-Met-Ser-Thr-OH, Bz-Met-Ser-Arg-OH, Bz-Met-Ser-Gly-OHa Bz-Met-Ser-Ser-OH byly syntetizovány jak popsáno níže.Všechny ostatní reakční činidla a rozpouštědla byly odMerck, W. Germany. CPD - W - II a CPD- S - 1 byly při-praveny jak v předchozím popsáno (18, 21).

Obecné postupy pro přípravu tripeptidových substrátůvzorce BzMetSerX, X = Ala, Gly, Ser, Thr, Leu,Arg, Asn,

Glu,Met 10,7 g methylesteru benzylmethioninu bylo rozpuštěnove 240 ml DME a bylo přidáno 36,6 g serinisopropylesteru,následované přidáním 400 ml H20. Pak bylo pH upraveno na8,5 s použitím vodního roztoku hydroxidu sodného a bylo přindáno 0,8 ml 0,1 M EDTA. Pak byla započata reakce přidáním10 ml 0,2¾¾ hmotnostních roztoku surového papainu preakti-vovaného inkubací s 0,1 M tetramerkaptoethanolem při 35 °C.Reakční směs byla 3 hodiny míchána a po 30 minutách bylopřidáno 25 ml roztoku enzymu a po další jedné hodině bylopřidáno dalších 25 ml roztoku enzymu. Potom bylo pH sníženona 3 přidáním vodného roztoku HC1 a směs byla filtrována apurifikována v reverzní fázi HPLC na Waters Preppak 50060/Um C^g sloupcích s použitím alkoholového gradientu připH 3 v 50/UM kyselině octové. Sloučené frakce obsahujícíčistý produkt benzoylmethionylserinisopropylester bylysloučeny a uvedeny do sucha za sníženého tlaku, čímžvzniklo 9,0 g BzMetSerOiPr (54 % ). - 22 - Příklad syntézy BzMetSerThr: 2,0 g BzMetSerOiPr byly rozpuštěny v 30 ml DMP apřidány k roztoku 24,0 g threoninu ve 34 ml 1^0 a 2 ml0,1 N EDTA, ve kterém pH bylo upraveno na 9,0 s použitímroztoku hydroxidu sodného. Pak byla vyvolána reakce přidámním 2,8 ml, 0,35 mH roztoku CPD-Y a směs byla míchána zakonstantního pH 4,5 hodiny při teplotě místnosti. Reakcepak byla zastavena přidáním 10 M roztoku HC1 na pH 3,0 a u :po filtraci, směs byla přečištěna v reversní fázi HPLC naWaters Deltapak 300 8J.l5/um Ο^θ sloupcích s použitím alko-holového gradientu v 50 mM kyselině octové pH 3.

Kombinované frakce odpovídající čisté produkty bylyuvedeny do sucha za sníženého tlaku, čímž vzniklo 0,63 gBzMetSerThrOH (34 %) s analytickou čistotou více než 95 %podle HPLC při 220/um.

BzMetSerAla, BzMetSerSer, BzMetSerGly, BzMetSerLeu,BzMeiSerArg, BzMetSerAsn, BzMetSerGlu a BzMetSerMet bylypřipraveny analogickým způsobem s použitím volných aminoky-selin Ala, Ser, Gly, Leu, Arg, Asn, Gin a Met jako nukleo-filů místo Thr a byly získány podobně čisté produkty.

Sestavení lidského GRF(l-28)-Ala-0H

Sloupec byl naplněn křemelinou podporovanou polydi-methylakrylamidmethyl esterovou pryskyřicí, Macrosorb SPR-100(500/ug, 0,05 mmol funkčních skupin) derivatizovaných s ethy-lendiaminem o acylovaných 4-hydroxymethylfenoxyoctové ky-seliny. Fmoc-Ala-0-Pfp (137 mg, 275/umol) a DMAP (6 mg,6/Umol) bYlo rozpuštěno v DMF a recirkulováno přes prysky-řici (500 mg) přes noc. Reakční směs byla přemístěna s DMFa anhydridem kyseliny octové (50/ul) a byl přidán DMAP ’‘ (3 mg). Po lŮ-mínutách recirkulace reakční směs byla opět 23 přemístěna a okruh byl:pečlivě promyt DMF.

Standardní cyklus synthesy sestával zesekvence10 minutové deprotekce piperidinem v DMF (20 %), pro-mytí DMF, zavedení a recirkulaci acylačního činidla apromytí bylo zavedeno na deprotakční bod. V průběhu promý-vacích období všechny záklopky a kličky byly provozovány.Všechna vázání byla uskutečněna jediným přidáním esterůDhbt Fmoc aminokyseliny (3 ekv,), jak je popsáno TAther-tonem a dalšímu (20) s t-butyl založené ochranně postran-ního řetězce a Mtr ochraně argininu. Vazebné doby byly urče-ny blednutím insivní žluté barvy vyvolané na pryskyřicivytvořením iontového páru mezi aminoskupinami a 0hbt-0H(22).Dvouhodinová vazební doba byla dostatečná pro většinu reakcí.Pomalejší vázání bylo pozorováno pro Arg(20) (6 hodin) a prosekvenci z Ala(4) na Leu(14) (5 - 10 hodin).

Deprotekce a štěpení z pryskyřice bylo provedeno 16hodinovým působením TFA obsahujícího fenolu (5 %). Odpařenía rozetření diethyletherem, 3 x 25 ml, vedlo k izolaci su-rového peptidu (210 mg). Ten byl analysován v reversní fáziHPLC (5yU Vydac) s použitím gradientu 30 % do 70 % B(A = 0,1 % TFA, B = 10 % voda a 0,1 % TFA v acetonitrilu).Byly nalezeny dvě složky ve stejných množstvích, pravděpodob_ně v důsledku přítomnosti methioninsulfoxidu v jedné z nich.Na 200 mg peptidu bylo působeno TFA obsahujícím thioanisolem(10 %) po dvě hodiny. Potom pouze jedna hlavní složka bylanalezena analytickou HPLC jak popsáno svrchu. Po odpařenía rozetření diethyletherem peptid byl rozpuštěn v 10 mlDMF/1 % AcOH (2/3, 10 ml) a chromatografován na G15 sloup-ci s 1¾ AcOH. Frakce obsahující hlavní složku byly shromáž-děny a lyofilizovány. Ten byl oddělen preparativní HRLC na25 mm x 300 mm 15/U v reversní fází sloupci (Waters delta-preparátO. Vzorek byl rozdělen na dva díly, každý z nichbyl rozpuštěn ve 20 ml 15¾ DMF ve vodě. Vzorek byl apliko- - 24 - ván na sloupec a eluován 10 ml/min nejprve po 10 minuts 30 % B a potom s gradientem (20 % - 70 % B) v průběhu 30minut. Hlavní hrot eluoval po 32 minutách a byl shromážděna lyofilizován, čímž vzniklo celkově 44 mg peptidu. Analýzaaminokyselin ukázala: Asp 2,93, Thr 0,94, Ser 2,B2, Glu 2,23,Gly 1,08, Ala 3,91, Val 1,05, Met 1,0, Ile 2,05, Leu 4,07,

Tyr 1,67, Phe 0,90, Lys 2,16, Arg 2,31. Struktura peptidu hbyla potvrzena plynovou fázovou sekvenční analýzou.

Transpeptidační reakce

Transpeptidační reakce referované v níže uvedené tabulece II byly provedeny následujícínv!způsobem: nukleofil (H-Arg--Νϊ^, 2 HC1) byl rozpuštěn v 6 mM EDTA a pH upraveno roztokemNaOH na vybranou reakci pH- Pak byl přidán substrát (25/ulna 1 ml roztoku nukleofilu ze 40 - 80 mH roztoku buď v DMF(Bz-peptidy) nebo 5% kyselině octové (GRF(l-2S)-Ala-0H),následovaný enzymem z vodného roztoku. Reakce s benzoylo-vanými tripeptidy byly provedeny v pH státu (1 ml) zatímcoreakce s GRF(l-28)-Ala-0H byly provedeny v malém stupni90,1 ml) s nukleofilem působícím jako puifr. Když byl přidánsubstrát z 5¾ kyseliny octové, byl pozorován pokles v pH.

Ke kompenzaci, pH roztoku nukleofilu bylo zvýšeno před při-dáním substrátu. Tyto reakční podmínky byly lehce modifiková-ny v experimentech referovaných v tabulkách III a IV, jakníže vysvětleno. HPLC-analýzy V průběhu reakce lo^ul části byly odebrány z reakčnísměsi a složení reagenací bylo určeno HPLC. Byl užit násle-dující eluční systém: 50 mM triethylammoniumfosfát, pH 3,0(A-pufr) a 50 mM triethylammoniumfosfát, pH 3,0 v 80 %CH^CN(B-pufr) užívající různé lineární a konkávní gradienty.Pro N-blokované tripeptidy Nova-Pak 5/U C-18 reversní fázový 25 sloupec od Waters byl užit, zatímco Vydac C-18 reversnífázový sloupec byl užit pro GRF(l-28)-Ala-0H. Byl nale-zen gradient, který mohl oddělit N-benzoylované tripepti-dové substráty stejně jako možné produkty reakce včetněreferovaných vedlejších produktů. To umožnilo detailníanalýzu reakční směsi. Podobný systém nebyl vyvinut prodelší peptidy. Avšak bylo získáno maximální rozlišení a ’každý produkt byl shromážděn a podroben kyselé hydrolýzea anlýze aminokyselin. Oddělení byly provedeny za teplotymístnosti a monitorovány UV-absorbancí při 254 nrn(Bz-peptidy) nebo 280 nm (GRF).

Procentuální složení reakční směsi bylo určeno přímoz integrovaných hrotových oblastí jelikož všechny složkyměly Bz, nebo, v případě GRF, tyrosin jaho dominantní chro-mofor v příslušných vlnových délkách. Frakce aminolysí (Ft)byla vyjádřena jako poměr mezi TI a všech ostatních vytvoře-ných produktů, to je nekonsumované substráty byly v kalkula-ci zanedbány.

Vynález je dále osvětlen doprovodnými ilustracemiv kterých

Obr. 1. Časový průběh CPD-Y katalyzované transpepti-dace na GRF(l-2B)-Ala-0H používající H-Arg-MH2 jako nukleo-fil. Reakční podmínky jsou uvedeny v tabulce II O, GRF(l-28)--Ala-OH(S), , GRF(l-29)-NH2CTl), Q , GRF(l-28)-0H (Ηχ), , GRF(l-28)-Arg-Arg-NH2 (TT1).

Obr. 2: Oddělení produktů od GRF(1-28)-Ala-0H po půso-bení s CPO-Y po 147 minut v přítomnosti H-Arg-NH2. Odděleníbylo provedeno ňa Vydac, C-18, 5/U sloupci s užitím TEAPpufrovacího systému popsaném svrchu a 30 až 45 % B gradien-tu v průběhu 30 minut. L: GRF(l-28)-Arg-Arg-NH2, 2: GRF(l-29)--NH2, 3: GRF(l-28)-0H, 4: GRF(1-28)-Ala-0H. 26 V počátečních třídících pokusech serinovou karboxypepti-dasou katalyzovaná trasnpeptiaační reakce vedoucí keGRF(l-29)-NH2 byla studována v modelových reakcích s ná-.sledujícími N-benzoylovanýrai tripeptidy: Bz-Met-5er-Arg-0H,Bz-Met-Ser-Leu-OH a Bz-Met-Ser-Ala-OH používající H-Arg-NH2jako nukleofil. Transpeptidační produkt je ve všech třechpřípadech Bz-Met-Ser-Arg-NH2 odpovídající Bz-GRF(27-29)-NH2.Počáteční .výběr odštěpných skupin byl motivován vysokoukatalytickou aktivitou nelezenou z očekávání hydrolyticképreference dostupných serinových karbopeptidech, jak jsouuvedeny v tabulce I kombinovaných s jejich očekávanou vhod-ností v transpeptidačních reakcích. Tak -Arg-OH byl považo-ván za vhodný pro CPD-W-II(18,21,26) a pravděpodobně CPD-—S-l, pro který byly předtím získány dobré výsledky s užitímtaké Leu OH jako odštěpné skupiny s ArgNH2 jako nukleofilem(lá), zatímco SerOH se tvořil špatně. Ala-OH a pravděpodobněLeu-OH byly považovány za vhodné pro CPD-Y(14,15) z hlediskaaktivity (14,15). Pokud jde o transpeptidační vhodnost těchtoskupin, předchozí práce v oboru nezanechaly žádné nedvojsmysl-né nebo nejednotné vodítko pro CPD-Y, jak bylo v předchozímpopsáno. Tak zatímco v některých odkazech (14, 15) prefero-vané odštěpné skupiny byly malé hydrofilní aminokyselinovézbytky, ostatní odkazy (US patent č. 4 709 014) nárokujíurčité skupiny velkých hydrofobních aminokyselinových zbyt-ků, a Ala, který s ohledem na velikost a hydrofilicitu zaují-má intermediální posici mezi přirozenými aminokyselinami,splňoval značně chudě pouze v jediné zprávě pro dlouhé pep-tidy, to je vepřový insulin (US patent č. 4 645 740), kdecelkový výtěžek byl menší než 10 % správného produktu. Z tohoto hlediska by mělo být poznamenáno, že hydro-filní aminokyseliny jsou definovány jako aminokyseliny ma-jící postranní řetězce mnohem hydrofilnější než cystein,indikováno hodnotami hydrofilicit,· udávanými Hoppem a Woodsem(Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 78 (6), str. 3824 - 3828? 1981(odkaz 34). Dobré počáteční výsledky s Ala proti Leu v 27 tomto modelu opravňovaly další studia používající růziiévelikosti hydrofilních aminokyselinových zbytků (to je Gly,Ser, Thr, Asn a Gin) k ustanovení velikostních požadavkůpro možnou úspěšnou formaci produktu, a také ustavení stup-ně hydrof ilicity potřebného testováním Met jeho odštěpné sku·^ ’piny, která měla hodnotu hydrofilicity mezi Leu a Ala.

Tabulka I

Substrátové preference serinové karboxypeptidážy pro hydrolýzu P-X-Y-OH peptidových substrátů X, Y CPD-Y CPD-W-II CPD-M-I CPD-S-1 skupina(amino- kyseliny) P^ P^P^ P-j/ Pj P^ ' P^ P| ' 1 Arg,Lys 2 Glu,Asp 3 Ser,Thr,Gin,Asn,His,Gly,Cys 4 Tyr,Phe,Trp 5 Ala,Met,Leu 6 Val,Ile 7 Pro

D D D D D

A A B C A

B A C C C

CAD C DD D E E E

C EB DA CA EB E

A

D

D

A

B

B

E

Preference jsou uvedeny podle kdujícím pořadí: A>B>C>D>E, to jerychlá hydrolýza a E extrémně pomalá „ ,/Km hodnot v násle-cat m A odpovídající velmihydrolýza. Údaje jsou z odkazů 17, 18, 21, 26, 30.

Optimální podmínky pro serinovou karboxypeptidázoukatalyzované transpeptidační reakce mohou být stanoveny vkaždém případě pokusy. Výtěžek transpeptidace je obecnědobře ovlivněn vzestupem pH v důsledku depiotonace amino-skupiny aminokyselinového amidu nukleofilu, ale simultánně 28 peptidázová aktivita klesá, vedouc k nižším rychlostem kon-verse a amidázová aktivita se zvYšuje, vedouc k degradaciamidovaného produktu. Vzestup pH může být kompenzován vzestu-pem v koncentraci nukleofilu, ale to také snižuje rYchlostkonverse, jelikož nukleofil působí jako inhibitor (25). S ohledem na pH, kompromis je mezi 7,5 a 8,0 s výjimkouCPD-S-1, které je nestálé nad pH 7,0.

Transpeptidační reakce s CPD-W-II a Bz-Met-Ser-Arg-QHbyla zpočátku provedena při pH 7,6 a 10 mM H-Arg-NH2, nízkákoncentrace nukleofilu byla monitorována účinnou vazbou nukleofilů s positivně nabitými postranními řetězci k tomuto enzymu.Po 47 minutách, 91 % substrátu bylo přeměněno na následujícíprodukty (viz tabulka II): 64 % Bz-Met-Ser-Arg-NH2/Tl), 20 %Bz-Met-Ser-OH(Hl) a 6 % Bz-Met-0H(H2). Bz-Met-Arg-NH2(T2)stejně jako ostatní možné produkty (viz schéma 1) byly ne-přítomny. Frakce transpeptidace byla 0,71 a tato hodnota bylarovněž získána při pH 8,0. S 2,5 a, 25 mM H-Arg-NH2frakce transpeptidace byly 0,55, 0,64 a 0,72 respektive, vedoucí k domněn-ce, že hodnoty kolem 0,7 nemohou být překročeny.

Transpeptidační reakce s CPD-Y na Bz-Met-Ser-Ala-OH aBz-Met-Ser-Leu-OH byly zpočátku provedeny při pH 7,5 a 0,5 MH-Arg-NH2, spíše vysoká koncentrace nukleofilu způsobenáočekávanou slabou vazbou k CPD-Y, které má preferenci pronukleofily s hydrofobními postranními řetězci. Frakce trans-peptidace byla 0,91 s Bz-Met-Ser-Ala-OH a pouzd 0,41 sBz-Met-Ser-Leu-OH. Obecný trend závislosti na povaze amino-kyseliny odštěpné skupiny je v souhlase s těmi uvedenými vpředchozích pozorováních, kde frakce transpeptidace s CPD-Yve většině případů bylo signifikantně a někdy drasticky vyš-ší, kde odštěpná skupina je malá a/nebo hydrDfilní, to je-Ala-OH, ve srovnání s hydrofobní, to je -Leu-0H(14,15). Avšakvýtěžky pro Leu je na rozdíl k výsledkům referovaným v odkazu14, str. 243, kde Leu byl užit jako odštěpná skupina vedoucík 0 % výtěžku transpeptidace. 29

Tak z počátku pouze reakce s Bz-Met-Ser-Ala-OH bylaprovedena za jiných reakčních podmínek a jao baze pro dalšívýzkumy transamidace delších peptidů. Při 0,025 ΙΊ a 0,1 MH-Arg-NHz frakce transpeptidace byly nižší, to je 0,77 a0,87 respektive, a koncentrace 0,5 M byla protoízachována.Avšak pres vysokou frakci transpeptidace za této koncentra-ce bylo produkováno malé množství (2 nežádouoího Bz-Met-Arg-NH2(T2). Vzestup pH na 7,8 předešel vytvoření tohotoproduktu a současně frakce transpeptidace byla zvýšenana 0,98. CPD-S-1 byla rovněž testována v transpeptidačních reak-cích s Bz-Met-Ser-Arg-OH a Bz-Met-Ser-Leu-OH. S 0,2 MH-Arg-Nl^a pH 6,5 frakce transpeptidace byly 0,38 a 0,48respektive. Vyšší koncentrace nukleofilu neměly žádný přízni-vý účinek.

Počáteční výsledky transpeptidačních reakcí v třídí-cích testech s N-benzoylovanými tripeptidy se zdálo indi-kovat, že nejúčinnější amidace vedoucí k dobrému výtěžkuTI o potlačení vytvoření nežádoucích peptidů jako je T2, bymohlo být dosaženo s CPD-Y a s -Ala-OH jeho odštěpenou sku-pinou . V důsledku toho GRF(l-28)-Ala-0H byl vybrán jako tes-tovací meziprodukt a byl připraven souvislým tokem peptidovésyntézy. Seskupení GRF(1-28)-Ala-0H(2) byl proveden metolo-gií v pevné fázi svrchu popsané a odštěpen Od pryskyřice 20hodinovým působením TFA a fenolu.

Reakce GRF(1-28)-Ala-0H s CPD-Y v přítomnosti H-Arg-Nl·^byla provedena za podmínek uvedených v tabulce II. Reakcebyla následována HPLC a časový průběh je ukázán na obr. 1.

Za přibližně 2,5 hodiny v podstatě všechny substráty bylypřeměněny na produkty GRF(l-28)-Arg-NH2(Tl), GRF(l-28)--OH(H1) a GRF(1-28)-Arg-Arg-NH2(TTl). HPLC chromatogram finální reakční směsi je ukázán na obr. 2. Identita GRF(1 — 29)-NFl2jako dominantního produktu byla dále zkoumána společnou 30 chromatografií s autentickým GFR(l-29)-NH2: byl pozorovánpouze jeden hrot. Oddělené pokusy bez přidání H-Arg-NH2potvrdily retenční čas Hl. Menší složky eluují kolem po-lohy GRF(l-28)-Ala-0H, každá tvořící méně než 2 % reakč-ní směsi, byly shromážděny, ale analýza aminokyselin neur-čila žádnou z nich jako C-terminálně modifikované derivátyGRF(l-29).

Ve 147 minutách reakční směs obsahovala 84 % GRF(l-28)-Arg-NH2, to je GRF(l-29)-NH2. Tak s 1 g CPD-Y přibližně2,7 kg GRF(l-29)-NH2 může být vyrobeno s použitím reakč-ních dob a podmínek uvedených v tabulce II. Avšak CPD-Y jedosti stabilní při pH 8,0 a 22 °C a proto je možné užít mno-hem delší reakční doby a odpovídajícně sníženou enzymovoukoncentraci. Jelikož CPD-Y je snadno isolován z pekařskýchkvasnic po autolýze (odkaz 28) nebo z prostředí genetickymanipulovaných kvasnicových buněk (odkaz 29), cena enzymuje poměrně nízká a zde popsané procedura se proto zdá býthodnotnou alternativou k použití mnohem vzácnější glycinovéoxidázy. - 31 - u. i—i i—< cm tn < cor^. > iTi O ΓΊ i—I 03<ř >-4 r-~ r--~ coco n- ca 03

CM Ή.

C ta>!MO»—itfi

Tabulka II. Amidace GRF(l-29) a jeho modelových peptidů. tn Cto ’ť >ta =

Q CL,

O

N 2 - • : ω r4 *< c < n n o . o o o o o o o o O o o o o o o Ol OJ OJ o o O 1—1 03 03 tn co *c tO O O CJ co OJ OJ i—1 OJ OJ *>3" CO 1—1 r—í < O O O C\ o <ř ro m tn o Ό M3 ua <3 <3 ΓΟ OJ 1—1 CO o o o co C\ lo O O m τ—1 m m co o o « m η m c\ OJ <r o* i—! i—1 m m o o < Γ0 r-l o tn O ca cm r- <r o m ca ca OJ OJ co o OJ O- to r—1 OJ o r—l OJ r-J O O CO O O UO m m tn tn tn co o n « rx co co O o* o o* 1— i~" Γ- co z~s z—S S“-\ Z—s LO z-S Z-\ z—s z—\ z—\ Ό M3 Ό C-> Γ-~ r—1 ua ca i-< Η H CJ OJ O O O O O o O o o o o o o o · » . » . o O O O O O o • o o o o o S_Z M^Z s^z s_z '"S o s-z· s»z s^z o s-** \-z Η Η Η Η H Η Η Η Η K i—í 1—1 as 3 3 2 :3 co >* on >a >· > >- O O N l3 O O o o O ua o o t“J t—i OJ o o o o O CM o o oj to oj η r-j tn tn

CM CM

CM CM CM CM

CM O · i 1 . o > 1 1 1 X z—- to <0 O 1 r·* -53 u o r-1 cí C < · ‘ 'i Ji < 1 t t l—J 1 1 1 < z-l z-l z-l 1 O ώ ω ✓-'‘I V co * « II CO 1 CO · 1 « CO C 1 t 1 OJ u iJ «J 4U o O o 1“^ W s: » . • · E I E · · « JO 1 1 i U- fj N N cť co cq i i i II CQ · eO i i i o □

LcJ

E

IA

-H tn o c

E ta +j

‘H >f-l Q. C. ta 2 ta > o n Q. 3^ 2 ta ta v* to ta p >. c

CJ ta >tn i C5

Ui <

I

O tq

C

I z~\ co

CM

I cst ca Ό32SH>oa 2o ať ta 2 ta fa 2 <a

>N at ro i—i2ta> ta tn ;a

O c •Ή Γ3

N '>>

rH C . Π3 32

Jak bylo znázorněno dříve, počáteční výsledky s N-benzo-ylovanými tripeptidy Bz-Met-Ser-Ala-DH, Bz-Met-Ser-Arg-OH aBz-Met-Ser-Leu-QH se zdály indikovat, že mezi těmito třemimodelovými peptidy nejúčinnější amidace by bylo dosaženo sAla-OH jako odštěpnou skupinou, a tento přístup byl dále tes-tován s úplnou peptidovou sekvencí. Aby byla získána mnohempečlivější analýza vhodných odštěpných skupin pro amidaci,byla syntetizována další serie modelových peptidů obsahujícíhydrofilní aminoskupiny různé velikosti jeho odštěpné skupiny.Tak byly zvoleny malý Gly, střední Ser a větší Thr, a trans-peptidační testy byly provedeny s použitím Bz-Met-Ser-Ala-OHjako srovnání. Výsledky jsou zřejmé z níže uvedené tabulky III: T a b u 1 k a III substrát CPD-Y čas složení mg/ml min S TI H1 jiné Ft BzMetSerAlaOH 0,06 64 10,4 76,9 9,1 3,610,86 BzMetSerSerOH 0,62 51 17,0 61,0 3,1 18,0 0,74 BzMetSerGlyOH 1,23 89 13,6 48,3 1,5 36,6 0,56 BzMetSerThrOH 0,10 94 10,8 72,9 8,0 8,4 0,82

koncentrace substrátu: 2 mM

koncentrace ArgÍ-Jl·^: 1000 mM pH: 7,90

Oe vidět, že pokud jde o výtěžek produktu o frakci trans-peptidace, překvapivě Thr, který nebyl dříve referován jako od-štěpná skupina, je srovnatelný s Ala přes svoji větši velikost.Přes vyšší enzymovou koncentraci Ser vede k poněkud méně se-lektivní reakci, zatímco Oly zanechává větší množství nerea-govaného substrátu a signifikantní množství vedlejších produktů. 33

V některých reakcích metodou podle tohoto vynálezu,absolutní množství vytvořeného produktu závisí na stupnikonverse a prochází pres optimum, které by ospravedlňovalozastavení reakce a recyklaci zbývajícího substrátu, zatímcou ostatních, proběhnutí reakce do úplného dokončení je plněoprávněno. V Bz-Met-5er-X peptidovérn modelu uskutečněnýchpokusů, Ala a Thr jako odštěpné skupiny X se zdají nacházetv poslední kategorii, zatímco Asn a Glu jako odštěpné skupi-ny by se onjevovaly v předchozí. V níže uvedené tabulce IV některé výsledky při nekompletní konversi jsou uvedeny s po- užitím velké, ale hydrofobní Met jako referenčního příkladu: T a b u 1 k a IV substrát CPD-Y čas složení mg/ml min. S i TI H1 ostatní F t BzMetSerAsnOK 1,60 52 47,0 40,0 3,0 10,0 0,76 BzMetSerGlnQH 1,30 38 29,0 52,6 4,4 15,0 0,73 BzMetSerMetOH 0,03 25 30,0 32,2 33,0 4,3 0,46

Koncentrace substrátu: 2 mM, koncentrace ArgNl·^: 1000 mM, pH: 7,9.

Je vidět, že mezi 50 % a 70 % konverze, jsou vytvářenadobrá množství produktu relativně k množství substrátu spotře-bovanému s použitím velkých, hydrofilních amidů Asn a Ginjako odštěpných skupin, zatímco Met vytváří stejně slabě jakoLeu a Gly v tabulkách II a III a dává vznik množství hydroly-začních vedlejších produktů. je třeba poznamenat, že toto jepřes skutečnost, že je L uvedeno v tabulce I, kde Met je se-skupen spolu s Leu a Ala, Met je aktivní substrát jako od-štěpná skupina, redukující enzymové požadavky jak zřejmé ztabulky IV. Může být poznamenáno, že tabulka I také seskupuje 34

Ser, Thr, Glu a Asn.

Společně s Gly jako odštěpnými skupinami, ale v úplněodlišné kategorii než Ala, Leu, Met. Tak výsledky v tabulkáchII, III a IV ilustrují nedostatek možnosti předvídat syntetic-ké výtěžky pouze na bázi hydrolytických preferencí uvedenýchv tabulce I.

Logickým standardem pro hodnocení aplikovatelnosti růz-ných možných odštěpných skupin by byla nativní GRF sekvence,ve které C-terminální sekvence je -Met-Ser-Arg-OH.

Založeno na svrchu uvedených výsledcích může být uzavřet-no, že transamidace může být provedena.-s dostatečnou selekti-vitou při užití Ala, Thr, Ser, Asn a Glu jako odštěpných sku-pin, zatímco Leu, Gly a Met dávají vznik signifikantnímumnožství vedlejších produktů. Tak se zdá, že hydrofilní po-stranní řetězec při nejmenším velikosti methylové skupiny,je nezbytný pro žádanou selektivitu a zlepšený výtěžek nadpřirozenou GRF sekvencí. Tento výsledek nemohl být předvídánz článků svrchu diskutovaných a znamená, že je skutečně možnévybrat substráty mající větší možnosti jako meziprodukty protránsamidaci než přirozené GRFG-29).

Claims (13)

1. - 37 - PATENTOVÉ NÁROKY í 3 C r

   1. Způsob výroby derivátů růstový hormon uvolňujícíhofaktoru, viz GRF(1-29).NH2 a jeho analogů, vyznaču-jící se tím, že se uvede do reakce substrátovásložka vzorce GRF'- Met - Ser- X kde GRF" označuje nativní GRF(l-26) sekvenci nebo její ana-logy včetně GRF(n-26) fragmentů, kde n je 1 až 8, a X je acyk-lický alfa-aminokarbonový zbytek kyseliny mající nenabitýhydrofobní postranní řetězec při nejmenší velikosti methy-lové skupiny, s H-Arg-Nl·^ jako nukleofilní složkou v přítom-nosti L-specifického serinového nebo thiolkarboxypeptidazové-ho enzymu kvasnicového nebo zvířecího, rostlinného nebo ji-ného mikrobiálního původu ve vodném roztoku nebo disperzi ma-jící pH od 6 do 9, a je-li třeba vázáním žádaného N-terminál-níno (l-(n-l)) fragmentu chemicky nebo enzymaticky.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující set í m , že užitá, substrátová složka je GRF"-Met-Ser-X, kdeGRF" označuje natiní GRF(l-26) sekvenci, kde od o do 6 amino-kyselinových zbytků mohou být nahraženy nebo vynechány nebojejí des-alfa-Nl·^ deriváty a X má svrchu uvedený význam.
3. 3. Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyznačujícíse tím, že X je vybrána z Ala, Ser, Thr, Asn, a Glu.
4. 4. Způsob podle nároků 1 až 3, vyznačujícíse t í m , že užitý karboxypeptidazový enzym je karboxy-peptidáza Y z kvasnic.
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující setím, že karboxypeptidáza- je užita, která byla přečiště-na afinitní chromatografií na afinitní pryskyřici tvořené 1 - 30 - polymerickou pryskyřičnou matrix s množstvím vázaných benzyl-sukcinylových skupin.
6. 6. Způsob podle .'jakéhokoliv z nároků 1 až 3, vyzná-č u j í c í s e t í m , že užitý karboxypeptioázový enzymje vybrán ze skupiny sestávající z karboxypeptidázy S-l a S-2 z Penicillium janthinellum, karboxypeptidázy z Aspergillussaitoi nebo Aspergillus oryzae, karboxypeptidázy C z pomeran-čových listů nebo pomerančových slupek, karboxypeptidázuz Citrus natsudaidai Hayata, phaseolain z fazolových listů,karboxypeptidázy MI a Mil z klíčícího ječmene, karboxypepti-daza I/II z pšeničných otrub, karboxypeptidázy z klíčícíchrostlin bavlníku, rajčat, melounů a bromellinového (anana-sového) prášku.
7. 7. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nárokůvyznačující se tím, že je užit immobilizova-ný karboxypeptidázový enzym.

   0. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků,v y z n'-a čující se tím, že je použit vodný reakč-ní roztok obsahující od 0 do 30 % organického rozpouštědla.
8. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující setím, že užité organické rozpouštědlo je vybráno ze skupi-ny sestávající z alkanolů, alkanoických kyselin, dimethylsul-foxidu, dimethylformamidu, dioxanu, tetrahydrofuranu, dimetho-xyethanu, glycerolu, ethylenglykolu a polyethylenglykolu.
9. 10. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m , že GRF'-Met-Ser-X/je užit, který byl vyroben enzyma-ticky, rekombinančními DNA-metodami, chemickou syntézou nebojejich kombinací. 39
10. 11. GRF-príbuzný peptíd vzorce GRF" Met - Ser- X vyznačující se tím, že GRF" označuje nativníGRF(l-26) sekvenci, kde od1 do 4 aminokyselinových zbytkůmůže být nahraženo nebo vynecháno nebo jako des-alfa-NHgderiváty a X je acyklický zbytek alfa-aminokarbonové kyselinymající nenabity hydrofobní postranní řetězec nejméně velikostimethylové skupiny.
11. 12. GRF příbuzný peptid podle nároku 11, vyznaču-jící se tím, že GRF" označuje nativní GRF(l-26)sekvenci a X má význam uvedený svrchu.
12. 13. GRF příbuzný peptid podle nároku 11» nebo 12, vy-značující se tím, že X je Ala, Thr, Ser, Asn,nebo Gin.
13. 14. GRF příbuzný peptid podle nároku 13, vyznaču-jící se tím, že X je Ala nebo Thr. řas tupuje: