CS195552B1

CS195552B1 - Method of producing l-lysine by fermentation

Info

Publication number: CS195552B1
Application number: CS739777A
Authority: CS
Inventors: Frantisek Smekal; Jana Kucerova; Stanislav Ulbert
Original assignee: Frantisek Smekal; Jana Kucerova; Stanislav Ulbert
Priority date: 1977-11-11
Filing date: 1977-11-11
Publication date: 1980-02-29

Description

Vynález se týká způsobu fermentační přípravy L~lysinu kultivací produkčních mikroorganismů, zejména rodů Corynebacterium nebo Brevíbacteri um, v tekutých živných půdách, obsahujících zdroje asímilovatelného uhlíku a dusíku a minerální živné soli, za submerzních podmínek. Nejčastějším zdrojem asimilovatelného uhlíku je sacharóza, obvyklými zdroji dusíku jsou amonné soli, zejména anorganické, kukuřičný výluh, hydrolyzát arašídové mouky apod,The invention relates to a process for the fermentative preparation of L-lysine by culturing the production microorganisms, in particular of the genus Corynebacterium or Brevinbacterium, in liquid nutrient media containing sources of assimilable carbon and nitrogen and a mineral nutrient salt under submerged conditions. The most common source of assimilable carbon is sucrose, the usual sources of nitrogen are ammonium salts, especially inorganic, corn steep liquor, peanut flour hydrolyzate, etc.,

V novější době se objevují snahy nahradit sacharozu, které se používá ve značném množství, a která je poměrně drahá a Čím dále tím obtížněji dostupná, pokud možno, úplně, nebo alespoň, částečně, jinými zdroji uhlíku, které by byly levnější a snáze dostupné, a které by umožňovaly dosažení přijatelných výtěžků lysinu. Je popsána například fermentační příprava lysinu s použitím kyseliny octové a octanu amonného /dále v kombinaci s glukózou, hydrolyzátem škrobu nebo melasou/ jako zdrojů uhlíku /francouzský patentový spis č. 2 033 119/;More recently, efforts have been made to replace sucrose, which is used in large quantities and is relatively expensive, and the more difficult it is to access, preferably, wholly or at least partially, other carbon sources that are cheaper and easier to access, and allowing acceptable lysine yields to be achieved. For example, a fermentation preparation of lysine using acetic acid and ammonium acetate (hereinafter in combination with glucose, starch hydrolyzate or molasses) as carbon sources is disclosed (French Patent No. 2,033,119);

NSR patentový spis č. 2 100 159 popisuje dávkování směsí kyseliny octové, octanu amonného a glukózy při fermentační přípravě lysinu s produkčními kaněny Brevíbacterium a Corynebacterium. Dále je známa fermentační příprava lysinu se směsí glukózy, kyseliny octové a ethanolu s kmeny Brevibacterium lactofermentum a Corybacteriura acetoacidophilum. Britský patentový spis č. 1 300 654 uvádí přípravu lysinu s kmenem Corynebacterium acetophilum ve fermentačníra médiu s kyselinou octovou a amonnými sole2 mi a (Lávkování acetátové směsi v průběhu fermentace.German Patent Specification No. 2,100,159 discloses the dosing of mixtures of acetic acid, ammonium acetate and glucose in the fermentation preparation of lysine with production canines of Brevebacterium and Corynebacterium. Further, the fermentation preparation of lysine with a mixture of glucose, acetic acid and ethanol with strains of Brevibacterium lactofermentum and Corybacteriura acetoacidophilum is known. British Patent Specification No. 1,300,654 discloses the preparation of lysine with a strain of Corynebacterium acetophilum in a fermentation broth with acetic acid and ammonium salts.

Cílem vynálezu bylo nalezení takových zdrojů uhlíku, respektive jejich kombinace, které by umožnily maximální úsporu sacharózy při zachování ekonomicky únosné výtěžnosti lysinu. Adaptace použitého kmene na tyto zdro je uhlíku začíná již ve stadiu přípravy inokula, kdy se část sacharózy v médiu nahradí zdrojem jiným. Jako zdrojů dusíku se používá obvyklých surovin, tj. amonných solí, kukuřičného výluhu, hydrolyzátu arašídové mouky apod. Vlastní produkční fáze se zahajuje kultivací na půdě již bez sacharozy, s běžnými zdroji dusíku. Hlavní zdroje uhlíku s částí sacharózy se potom dávkují v závislosti na hodnotě pH v dalších fázích kultivace.The object of the invention was to find such carbon sources, or combinations thereof, which would allow maximum sucrose savings while maintaining an economically viable yield of lysine. The adaptation of the strain used to these carbon sources begins as early as the inoculum preparation stage, when some of the sucrose in the medium is replaced by another source. Conventional raw materials, ie ammonium salts, corn steep liquor, peanut flour hydrolyzate, etc. are used as nitrogen sources. The actual production phase is started by cultivation on the ground already without sucrose, with common sources of nitrogen. The major carbon sources with a portion of sucrose are then dosed depending on the pH value in the next phases of the culture.

Způsob fermentační přípravy lysinu s obměněnými zdroji uhlíku a s jejich specifickým dávkováním řeší vynález, jehož podstata spočívá v tom, že se produkční mikroorganismus nejprve namnoží v inokulační půdě obsahující sůl kyseliny octové s alkalickým kovem nebo sůl amonnou v množství 40 až 60 g/litr média a sacharozu v množství 20 až 30 g/litr média a zdroj dusíku, potom se získanou kulturou zaočkuje fermentač ní půda, určená pro nárůst kultury produkčního mikroorganismu, á hodnotou pH 7 až 8, s výhodou 7,2 až 7,5, obsahující jako jediný zdroj asimilovatelného uhlíku sůl kyseliny octové s alkalickým kovem nebo sůl amonnou v množství 38 až 42 g/litr média, načež se po zahájení fermentace při dosažení hodnoty pH média 7,5 až 8,0 udržuje v dalším prů195552 běhu fermentace pH na hodnotě 7,0 až 7,5 dávkováním kombinované směsi zdrojů uhlíku obsahující 90 až 110 hmot. dílů kyseliny octové, 20 až 30 hmot. dílů octanu amonného, 65 až 85 hmot. dílů kyseliny mléčné, 90 až 110 hmot. dílů sacharózy a 140 až 160 hmot. dílů vody, až do ukončení fermentace.The present invention relates to a process for the preparation of lysine with altered carbon sources and their specific dosing by first propagating the production microorganism in an inoculum medium containing an alkali metal or ammonium salt of acetic acid in an amount of 40 to 60 g / liter of medium and sucrose in an amount of 20 to 30 g / liter of medium and a nitrogen source, then the culture obtained is seeded with a fermentation broth intended to increase the culture of the producing microorganism and having a pH of 7 to 8, preferably 7.2 to 7.5, containing an assimilable carbon source of alkali metal acetic acid or ammonium salt in an amount of 38 to 42 g / liter of medium, after which the pH of the fermentation run is maintained at 7 for a further fermentation run after reaching the pH of the medium of 7.5 to 8.0; 0 to 7.5 by dosing the combined carbon source mixture containing 90 to 110 wt. parts by weight of acetic acid, 20 to 30 wt. parts by weight of ammonium acetate, 65 to 85 wt. parts by weight of lactic acid, 90 to 110 wt. parts of sucrose and 140 to 160 wt. parts of water until fermentation is complete.

Uvedeným opatřením, snadno realizovatelným i ve výrobním měřítku, se dosáhne podstatné úspory sacharózy při zachování relativně vysokých a standardních výtěžků lysinu.This measure, which is easy to implement even on a production scale, achieves substantial sucrose savings while maintaining relatively high and standard lysine yields.

Bližší podrobnosti způsobu podle vynálezu jsou patrné z následujících příkladu provedení, které tento způsob pouze ilustrují, ale nijak neomezují.Further details of the method according to the invention can be seen from the following examples, which are illustrative but not limiting.

Příklady provedeníExamples

Příklad 1Example 1

Kmenem Corynebacterium glutamicum se zaočkuje 60 ml inokulaČního média v 500 ml varné baňce, tohoto složení octan sodný 50 g sacharoza 20 g kukuřičný výluh 60%ní 30 g voda do 1000 ml pH po sterilizaci 6,9 až 7.,.2Corynebacterium glutamicum is inoculated with 60 ml of inoculum medium in a 500 ml flask of the following composition: sodium acetate 50 g sucrose 20 g corn steep liquor 60% 30 g water to 1000 ml pH after sterilization 6.9 to 7.

Kultivuje se na rotační třepačce /220 obr./min/ při 29 az 30 °C po dobu 24 hodin. Po této době je pH inokula 7,5. Získanou kulturou se v množství 10 % obj. zaočkuje 20 ml fermentačního média, opět v 500 ml varných baňkách, které má toto složení :Cultivated on a rotary shaker (220 rpm) at 29 to 30 ° C for 24 hours. After this time the pH of the inoculum is 7.5. Inoculate the culture obtained in a volume of 10% by volume with 20 ml of fermentation medium, again in 500 ml flasks having the following composition:

octan sodný sodium acetate 40 40 g G kukuřičný výluh 60Zní corn steep liquor 60Zní 10 10 g G hydrolyzát arašídové Peanut hydrolyzate tno uky tno uky 1 50 1 50 ml ml síran amonný ammonium sulfate 10 10 g G kyselý fosforečnan acid phosphate draselný Potassium 1 1 g G síran horečnatý magnesium sulfate 0,1 0.1 g G uhličitan vápenatý calcium carbonate mletý milled 30 30 g G voda water do 1000 to 1000 ml ml pH po sterilizaci pH after sterilization 7,2 7.2 Kultivuje se na It is cultivated on rotační rotational třepačce při 29 shaker at 29 až 30 °C po dobu 96 to 30 ° C for 96 i hodin. hours. Od From 24.hodiny 24.hodiny kultivace se podle cultivation according to hodnoty values pH pH d ávkuj e d ávej e

do média kombinovaná směs zdrojů uhlíku tohoto složení:Combined mixture of carbon sources of the following composition:

kyselina octová koncentrovaná concentrated acetic acid 100 100 ALIGN! ml ml octan amonný ammonium acetate 25 25 g G kyselina mléčná koncentrovaná concentrated lactic acid 75 75 ml ml sacharoza sucrose 100 100 ALIGN! g G voda water 150 150 ml ml Směs se dávkuje v množství ' The mixture is dosed in an amount I az I az 2 % obj 2% vol /vztaženo na objem média/ mezi (based on media volume) between 24 . 24. az 7 2, up to 7 2,

hodinou fermentace, při pH média 7,8 až 8,2, jehož hodnota se tím snižuje na 7,0 až 7,5. Produkce lysinu činí 33 až 35 g/litr média.hours of fermentation, at a medium pH of 7.8 to 8.2, the value of which is thus reduced to 7.0 to 7.5. Lysine production is 33-35 g / liter of medium.

Příklad 2Example 2

Kmenem Corynebacterium glutamicum se zaočkuje 60 ml inokulaČního média v 500 ml varné baňce, která má stejné složení jako v příkladu 1 a kultivuje se za stejných podmínek jako v tomto příkladě. Kulturou vyrostlou za 24 hodin kultivace se zaočkuje 800 ml fermentačního média ve dvoulitrovém fermentačním tanku. Médium má stejné složení jako v příkladu 1. Kultivuje se při 800 ot./min, vzdušnění stejným objemem vzduchu/mín, při teplotě 29 až 30 °C, po dobu 96 hodin. Od 6. hodiny fermentace se do tanku přidává v dávkách po 15 ml roztok kombinované směsi zdrojů uhlíku /složení jako v příkladu 1/, a to tak, aby se pH fermentačního média udržovalo na hodnotě 7,0 až 7,5. V 96. hodině fermentace se dosáhne produkce lysinu 38 g/litr média.Corynebacterium glutamicum is inoculated with 60 ml of inoculation medium in a 500 ml beaker having the same composition as in Example 1 and cultured under the same conditions as in this example. The culture grown in 24 hours of culture is seeded with 800 ml of fermentation medium in a 2 liter fermentation tank. The medium has the same composition as in Example 1. It is cultured at 800 rpm, aerated with the same volume of air / min, at a temperature of 29 to 30 ° C, for 96 hours. From 6 hours of fermentation, a solution of the combined carbon source composition (composition as in Example 1) was added to the tank in 15 ml portions to maintain the pH of the fermentation medium at 7.0 to 7.5. At 96 hours of fermentation, lysine production of 38 g / liter of medium was achieved.

Příklad 3Example 3

Kmenem Corynebacterium glutamicum se zaočkuje 60 ml inokulaČního média stejného složení jako v příkladu 1, umístěného v 500 ml varných baňkách a kultivuje se za stejných podmínek jako v tomto příkladu. Inokulem vyrostlým za 24 hodin se zaočkuje 10 litrů fermentačního média /složení jako v příkladu 1/ ve 201itrovém fermentačním tanku. pH fermentačního média má po sterilizaci hodnotu 7,0 až 7,2. Fermentuje se za těchto podmínek: míchání 470 ot./min dvěma otevřenými turbinovými míchadly o průměru poloviny průměru tanku, vzdušnění stejným objemem vzduchu, teplota při kultivaci 20 až 30 °C. Po 5 až 7 hodinách kultivace se při dosažení hodnoty pH média 7,8 až 8,0 dávkuje kombinovaná směs zdrojů uhlíku /složení jako v příkladu 1/ při standardním udržování pH na hodnotě 7,5 pomocí automatického regulátoru pH s dávkovačem. Po 96 hodinách fermentace se dosáhne produkce 40 g lysinu/litr média.Corynebacterium glutamicum was inoculated with 60 ml of inoculum medium of the same composition as in Example 1, placed in 500 ml flasks and cultured under the same conditions as in this example. The inoculum grown in 24 hours was inoculated with 10 liters of fermentation medium (composition as in Example 1) in a 201 liter fermentation tank. The pH of the fermentation broth after sterilization is 7.0 to 7.2. Fermentation is carried out under the following conditions: stirring 470 rpm with two open turbine stirrers with a diameter of half the tank diameter, aeration with the same volume of air, cultivation temperature 20 to 30 ° C. After a cultivation time of 5-7 hours, a combined mixture of carbon sources (composition as in Example 1) is metered in at a pH of 7.8-8.0, while maintaining the pH at 7.5 by standard pH regulator with a metering device. After 96 hours of fermentation, 40 g of lysine / liter medium is produced.

Claims

Process for the fermentative preparation of L-lysine by culturing production microorganisms, in particular of the genus Corynebacterium or Brevibacterium, in liquid nutrient media containing sources of sulfur and carbonaceous nitrogen and mineral nutrient salts under submerged conditions, characterized in that the production microorganism is first multiplied in inoculation soil containing an alkali metal or ammonium salt of acetic acid at 40 to 60 g / liter medium and sucrose at 20 to 30 g / liter medium and a nitrogen source, then inoculating the culture obtained with a fermentation broth intended to increase the culture of the producing microorganism, having a pH of 7 to 8, preferably 7.2 to 7.5, containing, as the sole source of assimilable carbon, an alkali metal or ammonium salt of acetic acid in an amount of 38 to 42 g / liter of the medium, after which The pH of the medium is maintained at 7.5 to 8.0 by fermentation of pH to 7.0 to 7.5, by feeding the combined carbon source mixture containing 90 to 110 parts by weight acetic acid, 20 to 30 parts by weight ammonium acetate, 65 to 85 parts by weight lactic acid, 90 to 110 parts by weight, sucrose and 140 to 160 parts by weight of water until the fermentation is complete.