CS202885B1

CS202885B1 - Device for cultivation and maintenance of cell cultures for virological or cytological tests

Info

Publication number: CS202885B1
Application number: CS913778A
Authority: CS
Inventors: Miroslav Koukal; Marta Smolova
Original assignee: Miroslav Koukal; Marta Smolova
Priority date: 1978-12-29
Filing date: 1978-12-29
Publication date: 1981-02-27

Description

Vynález se týká zařízení pro kultivaci, ztnrazování, skladování a rekultivaci buněčných kultur. Postup a zařízení Umožňují rychlejší a standardnější detekci a izolaci zejména virových agens, organicky slučují dosud obvykle jednotlivě prováděné metodické úkony pro přípravu buněčných kultur jako vnímavého materiálu’ pro záchyt virů a umožňují současně použít širší metodické spektrum vizualizace virových antigenů.The invention relates to an apparatus for cultivating, freezing, storing and recultivating cell cultures. Procedure and equipment They allow for faster and more standard detection and isolation of viral agents in particular, organically combine the hitherto customary methodologies for the preparation of cell cultures as a susceptible viral capture material, while allowing a wider method of visualizing viral antigen visualization.

Obtížnost detekce virových činitelů vyplývá z jejich vlastností pomnožovat se výhradně v živých vnímavých buňkách, na rozdíl od většiny jiných infekčních agens /baktérie, mykoplasmata, plísně atd./, která můžeme kultivovat na předem připravených snadněji dostupných umělých živných půdách.The difficulty of detecting viral agents is due to their ability to propagate exclusively in living susceptible cells, unlike most other infectious agents (bacteria, mycoplasmas, fungi, etc.) that can be cultivated on preformed, readily available artificial broths.

V současné době existují ve virologii různé metodické přístupy pro detekci a průkaz virových antigenů, z nichž velká většina využívá metod buněčných kultur ín vítro. Kromě virologie se buněčných kultur in vitro používá v nejrůzněj ších výzkumných odvětvích cytologie, imunologie a dalších.Currently, there are various methodological approaches in virology for the detection and detection of viral antigens, the vast majority of which utilize methods of cell culture and vitality. In addition to virology, cell cultures are used in vitro in a variety of research fields of cytology, immunology and others.

Pro příslušnou virologickou techniku nebo sérii diagnostických a izolačních metod se v konkrétní praxi využívá vnímavých buněčných kultur odvozených z příslušných orgánů /tripsinizačně, fragmentárně/ nebo se tyto buněčné kultury rekultivují ze zmrazené suspenze nebo,pokud jsou k dispozici.se pasážují za účelem pomnožení a teprve následně distribuují do příslušných kultivačních zařízení.In practice, susceptible cell cultures derived from competent organs (tripsinisation, fragmentation) or are recultivated from a frozen suspension or, if available, passage for propagation only for the relevant virological technique or series of diagnostic and isolation methods they are then distributed to the appropriate cultivation equipment.

Pro účely vizualizace virových antigenů cytopatickým efektem nebo fluorescenční meto- . dou je používáno obvykle vložených krycích sklíček s nárůstem buněk do Leightonových nebo normálních zkumavek. Hemadsorpční, hemaglutinačněinhibiční a plakové testy se provádějí převážně ve zkumavkách nebo lahvích /Roux—', Black—, Carrel—, Míiller- typu/, seroneutrali— začni testy a titrační metody se většinou provádějí ve zkumavkách nebo zařízení typu mikrotitračních destiček. ,For the purpose of visualizing viral antigens by cytopathic effect or fluorescence metho-. Usually embedded coverslips with cell growth into Leighton or normal tubes are used. Hemadsorption, haemagglutination inhibition and plaque assays are performed predominantly in tubes or bottles (Roux, Black, Carrel, Miiller-type), seroneutral initiation, and titration methods are mostly performed in tubes or microtiter plate type devices. ,

Jednotlivě volená kultivační zařízení limitují spektrum použitelných virologických metodik. Např. z USA patentu č. 3 597 326 je známo zařízení, které obsahuje na podložce z průhledné umělé hmoty, například ze styrénu,několik řad misek pro pěstováni buněčných kultur, které jsou přikryty těsnicím víčkem. Jednotlivé sady těchto misek lze vrstvit na sebe. Toto zařízení nelze hermeticky uzavřít tak, aby sneslo zmrazovaci podtlak v tekutém dusíku a není umožněn centrální přístup k jednotlivým kultivačním oddílům. Mimoto nelze kultivovat v normální atmosféře.Individually selected cultivation devices limit the spectrum of applicable virological methodologies. E.g. U.S. Pat. No. 3,597,326 discloses a device comprising on a substrate of transparent plastic, such as styrene, several rows of cell culture dishes which are covered with a sealing cap. The individual sets of these trays can be stacked on top of each other. This device cannot be hermetically sealed to withstand freezing vacuum in liquid nitrogen, and central access to individual culture compartments is not allowed. Furthermore, it cannot be cultivated in a normal atmosphere.

Inokulace nelze provést jinak než ve sterilním prostředí /odklopením víčka/ a mikroskopicky lze prohlížet vzorek jen zvětšením cca ,00- až 200krát. Rovněž vzorky monolayeru helze z poměrně silného dna vykrojit bez porušení vlastního vzorku. Podobné řešení má US patent č. 3912596.The inoculation can not be done other than in a sterile environment (by lifting the lid) and the sample can be viewed microscopically only by magnification of approximately 00 to 200 times. Also, helo monolayer samples can be cut from a relatively thick bottom without breaking the sample itself. US Patent No. 3912596 has a similar solution.

Nevýhodou dosavadních postupů při využívání buněčných kultur k diagnostickým účelům je skutečnost, že vhodná buněčná kultura není okamžitě k dispozici k příslušnému úkonu, a že zmiňovaná kultivační zařízení nemohou být současně využita jako skladovací, třansportní a rekultivační.A disadvantage of the current methods of using cell cultures for diagnostic purposes is that a suitable cell culture is not readily available for action, and that said culture facilities cannot be simultaneously used as storage, trisport and recultivation.

Uvedené nedostatky stávajících metodik z velké části odstraňuje zařízení podle vynálezu, jehož podstatou je, že sestává z umělohmotného výlisku nebo výlitku, 8 výhodou ve tvaru Petribo misky, jejíž spodní část má symetricky uspořádané komůrky se spodními dny sloužícími jako podloží pro nárůst buněčných kultur a horní část je ve tvaru víčka s centrálním výstupkem, přičemž obě tyto části mají na obvodu plochý okraj pro hermetické uzavření celého zařízení.These drawbacks of the existing methodologies are largely eliminated by the device according to the invention, which consists of a plastic molding or molding, preferably in the shape of a Petribo dish, the bottom of which has symmetrically arranged chambers with bottom bottoms serving as a bed for growth of cell cultures and upper the portion is in the form of a lid with a central projection, both of which have a peripheral edge at the periphery for hermetically closing the entire device.

Zařízení podle vynálezu umožňuje, aby se monolayerový nárůst kultur zmrazil podle předem stanovené závislosti poklesu teploty na čase, skladoval a transportoval přímo na kultivačním podloží v hermeticky uzavřeném sterilním a průhledném zařízení, kde bezprostředně před virologickým nebo cytologickým testováním se buněčné kultury rozmrazí za sterilních podmínek.The device according to the invention allows the monolayer growth of the cultures to be frozen according to a predetermined temperature-time dependence, stored and transported directly on the culture medium in a hermetically sealed sterile and transparent device where the cell cultures are thawed under sterile conditions immediately prior to virological or cytological testing.

Výhody zařízení podle vynálezu jsou zejména:The advantages of the device according to the invention are in particular:

1. Zařízení je vyrobeno z umělé hmoty, netoxické pro kultivované buňky, která je průhledná pro sledování buněčných kultur makroskopicky i mikroskopicky.1. The device is made of plastic, nontoxic to cultured cells, which is transparent to the observation of cell cultures macroscopically and microscopically.

2. Vnitřní plochy zařízení umožňují adhezi a proliferaci buněk a jsou do té míry tenké, že dovolují mikroskopováni kultur i výkonnými objektivy s krátkou ohniskovou vzdáleností ve fázovém kontrastu fluorescenčním mikroskopem.2. The internal surfaces of the device allow for cell adhesion and proliferation and are so thin that they allow microscopy of cultures and powerful short-focal objective lenses in phase contrast with a fluorescent microscope.

3. Zařízení umožňuje vyříznutím vnitřní plochy zpracování pro různá elektromikroskopická vyšetření.3. The device enables processing of various electromicroscopic examinations by cutting the inner surface.

4. Zařízení umožňuje aplikaci radioisotopických metod.4. The device allows the application of radioisotopic methods.

5. Zařízení je hermeticky uzavřené, což je nutným předpokladem kultivace buněk v médiích s běžně užívaným bikarbonátovým ústrojím,5. The device is hermetically sealed, which is a prerequisite for cell culture in media with a commonly used bicarbonate device.

6. Zařízení je sterilní. Pokud je třeba nutná manipulace za sterilních podmínek, je toto umožněno středovým vpichem do všech sekcí a pokud zpracováváme kultury například pro vísualisací antigenů, je možné víčko jednoduše odstřihnout nůžkami.'6. The device is sterile. If handling under sterile conditions is required, this is made possible by a central puncture into all sections and when processing cultures for example for the visualization of antigens, the lid can simply be cut off with scissors.

7. V zařízení je možná i kultivace orgánových kultur i buněčných kultur nádorového původu.7. The cultivation of organ and tumor cell cultures is also possible in the facility.

8. Zařízení je skladovatelné v běžně vyráběných kontejnerech na tekutý dusík nebo v suchém ledu.8. The equipment shall be stored in commercially available liquid nitrogen or dry ice containers.

9. Zařízení je výhodné i z bezpečnostních důvodů pro jednoduchou dekontamíptaci /spálením/.9. The device is also advantageous for safety reasons for simple decontamination (incineration).

10. Pro trvalé preparáty lze vložit na dno zařízení sklíčka ve tvaru daného sektoru /jako Leightonovy zkumavky/.10. For permanent specimens, sector-shaped slides (like Leighton tubes) can be placed on the bottom of the device.

11. Použití způsobu a zařízení podle vynálezu umožňuje centrální přípravu různých buněčných kultur pro velký počet zdravotnických, pracovišt humánních a veterinárních.The use of the method and apparatus of the invention allows the central preparation of various cell cultures for a large number of health, human and veterinary workplaces.

12. Zařízení je jednoduché, modifikovateIné, lehce.vyrobitelné ve velkých sériích a levné.12. The device is simple, modifiable, easy to manufacture in large series and inexpensive.

Při' eventuální obtížnosti zmrazení a rekultivace určitého typu buněk přímo na podloží lze toto zařízení využít pro dodatečnou rekultivaci buněk zmrazených v suspenzi v prostoru zařízení. Při tomto alternativním způsobu je určité časové zpoždění, dané dobou, během které buněčná suspenze po rozmraženi a aplikaci na kultivační podloží doroste do monolayeru. Zůstávají zachovány výhody jednoduché manipulace pro rutinní diagnostické účely i možnostGiven the potential difficulty of freezing and reclaiming certain types of cells directly on the ground, this device can be used to additionally reclaim cells frozen in suspension in the space of the device. In this alternative method, there is a certain time delay due to the time during which the cell suspension, after thawing and application to the culture substrate, will grow into a monolayer. The advantages of simple handling for routine diagnostic purposes as well as the possibility are retained

202385 skladování, transportu a kultivace. Pro cytologické účely je tento alternativní «působ, tj . zmrazování buněk v suspenzi, v mnoha případech výhodnější.202385 storage, transport and cultivation. For cytological purposes, this alternative action is e.g. freezing the cells in suspension, in many cases preferable.

Zmrazování buněk se provádí podle předem stanovené závislosti poklesu teploty na čase. Rychlost zmrazování, kryoprotektivní látky /dimethylsulfoxid, glycerin/ a jejich koncentrace v zmrazovacích médiích je nutno volit pro příslušné typy buněčných kultur individuálně. Pokles teploty se obvykle pohybuje v rozmezích 0,5 až 2 °C za minutu, s výjimkou oblasti eutektického bodu.The freezing of the cells is performed according to a predetermined temperature-time dependence. The freezing rate, cryoprotectants (dimethylsulfoxide, glycerin) and their concentration in the freezing media must be selected individually for the respective cell culture types. The temperature drop typically ranges from 0.5 to 2 ° C per minute, except for the eutectic point area.

V této oblasti, kde dochází k uvolňování skupenského tepla, se osvědčilo rychle snížit teplotu okolního prostředí. Koncentrace dimethylsulfoxidu je optimální v rozmezí 7,5 až 12,5 procent. Pro některé buněčné kultury je výhodnější použít glycerinu. Zmrazovací médium nesmí obsahovat antibiotika. Rovněž opracování buněčných kultur před zmrazením, např. versenem nebo trypsinem a synchronizace buněčných kultur před zmrazováním vyžaduje individuální přístup k jednotlivým buněčným typům. Tento postup je nutno předem odzkoušet a pro daný typ buněk charakterizovat.In this area where latent heat is released, it has proven to rapidly reduce the ambient temperature. The concentration of dimethylsulfoxide is optimal in the range of 7.5 to 12.5 percent. For some cell cultures it is preferable to use glycerin. The freezing medium must not contain antibiotics. Also, treating cell cultures prior to freezing, e.g., versen or trypsin, and synchronizing cell cultures prior to freezing requires an individual approach to individual cell types. This procedure must be tested in advance and characterized for the cell type.

Po rozmražení, které je nutno provádět rychlou metodou, nejlépe ponořením zařízení do cirkulující vody 37 °C teplé, např. v Heplerově přístroji nebo Cyklotermu a odsátí zmrazovacího média, přičemž by úkon neměl převýšit doby 3 minut, lze buněčných kultur s nízkou mortalitou buněk použít okamžitě k testování virologických vzorků. V případe vyšší úmrtnosti buněk /cca 30 Z/ je výhodné nechat buněčné kultury dorůst opět do monolayerů, čehož je možno dosáhnout obvykle do 24 hodin po rozmražení a výměně zmrazovacího média za kultivační. V případě, že mortalita buněčných kultur po rozmražení je vyšší než 50 Z, je lépe využít alternativní metody paralelního zmrazení buněčné suspenze. Typ buněčné kul tury,jakož i tvar kultivačního podloží se zvolí podle předpokládané metodiky nej efektivnější pro danou cytologickou a virologickou prácí.After thawing, which must be carried out by a rapid method, preferably by immersing the device in a circulating water of 37 ° C warm, eg in a Hepler or Cyclotherm and aspirating the freezing medium, with no action exceeding 3 minutes, low cell mortality cell cultures can be used immediately to test virological samples. In case of higher cell mortality (about 30 Z), it is advantageous to allow the cell cultures to grow back into monolayers, which can usually be achieved within 24 hours after thawing and replacement of the freezing medium with culture medium. In case the mortality of the cell cultures after thawing is higher than 50 Z, it is better to use alternative methods of parallel freezing of the cell suspension. The type of cell culture as well as the shape of the culture bed are selected according to the presumed methodology most effective for the given cytological and virological work.

Další výhody nové metody spočívají v možnosti rychlého'použití,'větší standardnosti jednotlivých metodik, umožňují srovnání a opakovatelnost na tomtéž homogenním materiálu, pouze později rozmraženém, umožňuje centralizaci přípravy většího množství těchto zařízení, z jediného a jednorázově kontrolovaného zdroje citlivé buněčné kultury. Při přípravě těchto · nakultivovaných a zmrazených tkáňových systémů in vitro, která bude centralizována, lze tyto materiály pro jednotlivé laboratoře ekonomičtěji zajistit. Skladovat lze větší množství namnoženého materiálu v běžných nádobách pro skladování vzorků v tekutém N? nebo pevném CO?» event. v hlubokorarazicích pultech a poměrně snadno transportovat v přítomnosti pevného CO?.Further advantages of the new method are the possibility of rapid application, greater standardization of the individual methodologies, allowing comparison and repeatability on the same homogeneous material, only later thawed, allowing the centralization of the preparation of more of these devices from a single and single controlled source of sensitive cell culture. By preparing these cultured and frozen tissue systems in vitro, which will be centralized, these materials can be made more cost-effective for individual laboratories. Can large quantities of material be stored in conventional sample storage containers in liquid N? or solid CO? in deep-beating shelves and relatively easy to transport in the presence of solid CO 2.

V případě kultivací na agarosové vrstvičce na podloží nebo přímo na umělohmotném podloží je umožněno vyříznutí i jednotlivých, virem efektovaných nebo suspektních buněk z daného systému, např.. mikromanipulátorem. Tento odebraný vzorek je potom možno zmrazit a nakrájet běžnými technikami pro elektronmikroskopické vyšetření. Při potřebě zhotovit trvalé preparáty je možno podloží s nárůstem buněk přímo vystřihnout a zamontovat běžnými technikami na podložní sklíčka. V některých testech, např. určitých typů fixací, lze pomnožit buněčné kultury na vložených krycích sklíčkách na dno kultivačního zařízení.In the case of cultivation on an agarose layer on a substrate or directly on a plastic substrate, it is also possible to excise single virus-affected or suspect cells from the system, for example by a micromanipulator. The sample can then be frozen and cut using conventional electron microscope techniques. If there is a need to make permanent preparations, the subsoil can be directly cut out with cell growth and mounted on glass slides using standard techniques. In some assays, e.g., certain types of fixations, cell cultures on embedded coverslips at the bottom of the culture apparatus can be propagated.

Navrhovaným způsobem lze zajistit orientační virovou diagnostiku běžně i v menších nemocnicích a transfúzních stanicích. Nutné vybavení by sestávalo pouze ze skladovacího prostoru vybaveného pevným CO? nebo z kontejnerů tekutého N?, sterilního boxu /dostačuje Hansenova skříň nebo Lamínflow/, termostatu s nastavitelnou regulací teplá pro kultivaci, obvykle 37 °C.The proposed method can be used for routine viral diagnosis even in smaller hospitals and transfusion stations. The necessary equipment would consist only of a storage space equipped with solid CO? or from containers of liquid N 2, a sterile box (a Hansen box or Laminflow), a thermostat with an adjustable temperature control for cultivation, usually 37 ° C is sufficient.

Při menší úpravě by se mohly některé získané virologické vzorky inokulovat na buněčnou kulturu přímo v terénu, takže by se zamezilo případným inaktivacím virových činitelů dlouhým skladováním a transportem do míst, která jsou pro virologickou diagnostiku vybavena. Jednotlivé laboratoře by mohly poté provádět orientační diagnostiku bez zvláštního technického vybavení a bez personálu erudovaného v oblasti tkáňových kultur.With minor treatment, some obtained virological samples could be inoculated onto cell culture directly in the field, thus avoiding possible inactivation of viral agents by long storage and transport to sites that are equipped for virological diagnosis. Individual laboratories could then perform screening diagnostics without special technical equipment and without staff knowledgeable in tissue culture.

Zařízení, k provedení navrhovaného postupu s výhodou sestává ze sady umělohmotných průsvitných a steri 1 izovateIných výlisků /výlitků/, skládajících se ze dvou lisovatelných .The apparatus for carrying out the proposed process preferably consists of a set of plastic translucent and sterile moldings consisting of two moldable parts.

částí, Dolní část je rozčleněna na 6 až 9 polí, které mají plochu větší než 1 cm a jsou odděleny přepážkami z téhož materiálu. Ve středu dolní části může být vylisována jamka ve tvaru spodní části zkumavky, sloužící ke zmrazení buněčné suspenze ve·zmrazovacím médiu.The lower part is subdivided into 6 to 9 fields having an area of more than 1 cm and separated by partitions of the same material. A well in the shape of the bottom of the tube may be pressed in the middle of the bottom to freeze the cell suspension in the freezing medium.

Obsah zmrazených buněk dostačuje k následné rekultivaci nebo sériovému zpracování na ploškách polí /komůrek/ tohoto výlisku nebo výlítku. Horní část /víčko/ zařízení může být s výhodou ve tvaru víčka Petriho misky se středovou vyvýšeninou umožňující centrální přístup ke váem ploškám /u alternativního zařízení i k spodní centrální jamce/ při aplikaci, odsávání.a inokuíaci buněčné suspenze, nejlépe injekční jehlou. Obě částí jsou ze stejného materiálu a spojitelné na okraji.The frozen cell content is sufficient for subsequent recultivation or serial processing on the fields of the molding or shed. The upper part (lid) of the device may preferably be a lid-shaped petri dish with a central elevation allowing central access to your plots (alternate device and lower central well) for application, aspiration and inoculation of the cell suspension, preferably by injection needle. Both parts are made of the same material and connectable at the edge.

Velikost a tvar zařízení je koncipován tak, aby umožnil zmrazování a skladování v běžně dostupných skladovacích Dewerových nádobách pro tekutý dusík s vložnými skladovacími pouzdry ve tvaru válce o průměru cca 6,5 x 30 cm, přičemž jednotlivá zařízení zapadají horní částí jednoho výlisku /výlitku/ do dolní části dalšího.The size and shape of the device is designed to allow freezing and storage in commercially available liquid nitrogen storage containers with cylindrical cylindrical shells of approximately 6.5 x 30 cm in diameter, with the individual devices engaging the top of a single molding. to the bottom of the next.

Naskládání jednotlivých výlisků /výiitkú/ umožňuje vyvýšenina ve tvaru trnu na víčku zařízení. Horní část trnu může být ve tvaru malé jamky, která zapadá do spodní části výlisku /výlitku/ dalších zařízení a lépe umožní hermetické uzavření otvoru po vpichu při zmrazování, kultivaci a transportu.Placing of the individual moldings allows the projection in the shape of a mandrel on the lid of the device. The upper portion of the mandrel may be in the form of a small well that fits into the lower portion of the molding / molding / other device and better allows hermetically closing the opening after injection during freezing, culture and transport.

Velikost zařízeni je volena tak, že umožňuje centrífugací jednotlivých výlisků /výlitků/ i jejich sady ve větších centrifugách, např. Janetzkí K 70, což je nezbytné pro sedimentaci suspenze buněk v centrální jamce při alternativním řešení.The size of the device is chosen such that it allows centrifugation of the individual moldings (moldings) and their sets in larger centrifuges, eg Janetzki K 70, which is necessary for sedimentation of the cell suspension in the central well in an alternative solution.

Popsané zařízení, obsahující řadu komůrek, je možno použít též k rekultivaci a sériovým testům s virologickým a cytologickým materiálem v případě, že buněčné suspenze cíleně vybrané k daným testům budou zmrazený samostatně v nádobkách ověřených pro zmrazování, např. polyethylenové trubičky, nádobky a ampule z PVC. Plošky komůrek umožňuji screeningové odečítání běžných virologických a cyto logických metodik /seroneutralizačni testy, imunofluorescenční metody, různé druhy titrací, některé radioizotopové metody a další/.The described device, containing a number of chambers, can also be used for recultivation and serial tests with virological and cytological material if cell suspensions specifically selected for the tests are frozen separately in containers for freezing, eg polyethylene tubes, containers and ampoules of PVC. Cell plates allow screening readings of common virological and cytological methods (seroneutralization tests, immunofluorescence methods, various titrations, some radioisotope methods and others).

Dále jsou uvedeny příklady zařízení podle vynálezu. Na přiložených výkresech 1 až 6 jsou schematicky znázorněny příklady zařízení dle vynálezu. Na obr. 1 v půdorysném pohledu je znázorněno uvedené zařízení sestávající z umělohmotného výlisku ve tvaru Petriho misky, jejíž spodní část 4 sestává ze symetricky uspořádaných komůrek 1 se spodními dny _2_, které slouží jako podloží pro kultivaci buněk. Na obr. 2 je znázorněna v půdorysu horní část 3^ zařízení. Horní část 3_ tvoří víčko s centrálním výstupkem 8^, který slouží jako vstup, případně výstup do komůrek _1_ /injekční jehlou/.The following are examples of devices according to the invention. 1 to 6 show schematically examples of the device according to the invention. FIG. 1 is a top plan view of the apparatus comprising a petri dish-shaped plastic molding, the bottom part of which consists of symmetrically arranged chambers 1 with bottom bottoms 2 serving as a substrate for cell culture. FIG. 2 shows a plan view of the upper part 3 of the apparatus. The upper part 3 forms a cap with a central protrusion 8, which serves as an inlet or outlet into the chambers 7 (injection needle).

Na obr. 3 je celé zařízení znázorněno v nárysu. Obě části, tj . spodní část 4^ a horní část 3.,mají po obvodu plochý okraj 7 pro hermetické uzavření celého zařízení. Na obr. 4 až 6 je znázorněn příklad dalšího typu zařízení podle vynálezu pro buňky v suspenzi.FIG. 3 shows the entire device in front view. Both parts, ie. the lower portion 4 and the upper portion 3 have a peripheral edge 7 around the periphery for hermetically closing the entire device. Figures 4 to 6 show an example of another type of device according to the invention for cells in suspension.

Na obr. 4 v půdorysu je znázorněna spodní část £ s komůrkami £ ve tvaru dutých válečků s rovným dnem v počtu šest s jednou centrální jamkou 5^ pro zmrazení buněk v suspenzi. Po obvodu části 4 je plochý okraj 7 pro hermetické uzavření obou částí 3_ a slisován nebo svařen.FIG. 4 is a plan view of a bottom part 6 with flat-bottom hollow-chamber cells 6 with six central wells 5 for freezing the cells in suspension. Around the periphery of the part 4, the flat edge 7 is hermetically closed for both parts 3 and pressed or welded.

Na obr. 5 v půdorysu je znázorněna horní část j4, která má tvar víčka s centrálním výstupkem £ tvaru jamky.FIG. 5 is a top view of a top portion 14 having a lid-like shape with a central well-shaped protrusion 6;

Na obr. 6 je v nárysném pohledu znázorněno celé zařízení podle vynálezu. Centrální jamka 5 s konvexně vypuklým dnem 6_ slouží ke zmrazování buněk v suspenzi, kde se tyto skladují pro případ, že je nelze udržet při zmrazování přímo na podloží. Význam kónického dna 6 je důležitý zejména pro odsávání kryoprotektivního média injekční stříkačkou /supernatantu/, tj. kdy buňky jsou v sedimentu.FIG. 6 is a side elevational view of the entire apparatus of the present invention; A central well 5 with a convex convex bottom 6 serves to freeze cells in suspension, where they are stored in case they cannot be kept directly on the substrate during freezing. The importance of the conical bottom 6 is particularly important for aspirating the cryoprotective medium by syringe (supernatant), i.e. when the cells are in sediment.

Aby nedošlo ke zborcení zařízení, je nutno při jakémkoliv odsáváni média udělat v oblasti centrálního výstupku 8 vedle otvoru vpichu. ještě druhý otvor pro vyrovnání tlaku.In order to prevent the device from collapsing, any media suction must be carried out in the region of the central projection 8 next to the puncture opening. a second pressure equalization port.

Způsob kultivace buněčných kultur podle vynálezu je předveden na následujícím příkladě, úkolem je nakultivovat buněčný substrát pro záchyt a následnou diagnostiku neznámého virového agens, který je předpokládán ve vzorku nosního výtěru, který byl virologicky připraven.The method of culturing the cell cultures of the present invention is illustrated by the following example, the object of which is to cultivate a cell substrate for capture and subsequent diagnosis of an unknown viral agent contemplated in a nasal swab specimen that has been virologically prepared.

Před odběrem vzorku prasečích ledvin bylo na dno všech komůrek zařízení podle vynálezu pomocí Cornwalovy pipety rozdistribuováno 1 ml suspenze prasečích liniových ledvinných buněk jedním vpichem ze střední horní části centrálního výstupku* a tó do každé komůrky zvlášt* Poté necháme inokulovanou kulturu dorůst do monolayeru /asi 3 dny/. Po každé inokuíaci případně odsátí nebo výměně média se vpich uzavře, například zakápnutím roztaveným voskem nebo PVC,Before collecting the kidney sample, 1 ml of porcine kidney cell suspension was distributed to the bottom of all chambers of the device according to the invention by a single puncture from the central upper part of the central protrusion * using a Cornwall pipette *. days /. After each inoculation or aspiration or replacement of the medium, the puncture is closed, for example by dropping with molten wax or PVC,

Poté podle záměru můžeme narostlé buňky využít ihned k naočkování testovacího výtěru, anebo tuto předem zkontrolovanou šarži buněk zmrazíme, skladujeme /neomezeně/, případně transportujeme do míst použití. Před zmrazením vyměníme kultivační médium za kryoprotektivní a zmrazíme podle předem stanovené závislosti poklesu teploty na čase.Then, according to the intent, the grown cells can be used immediately to inoculate the test swab, or we can freeze, store (unlimited), or transport this pre-checked batch of cells to the place of use. Before freezing, replace the culture medium with cryoprotective and freeze according to the predetermined temperature-time dependence.

V prvním případě inokulujeme do každé komůrky opět středovým vpichem 0,2 ml připraveného vzorku. Po vazbě a doplnění média se opět uzavře vpichový otvor a kultivuje se 1 týden a odečítá se cytopatický efekt /CPE/. V průběhu kultivace inokula sledujeme buněčnou kulturu optickým inversním mikroskopem.In the first case, inoculate 0.2 ml of the prepared sample into each chamber again by means of a central injection. After binding and replenishment of the medium, the puncture opening is again closed and cultured for 1 week and the cytopathic effect (CPE) is read. During the inoculum cultivation, the cell culture is followed by an optical inverted microscope.

Poté se příslušné změny na tkáňové kultuře testovaly běžnými virologickými technikami, například fluorescencí, barvením, hemadsorpcí apod. Příslušné alterované buňky z monolayeru byly pak vykrojeny ze dna komůrky /včetně části dna/ a zpracovány pro elektron-optické vyšetření.Thereafter, appropriate tissue culture changes were tested by conventional virological techniques such as fluorescence, staining, hemadsorption, and the like. The respective altered monolayer cells were then excised from the bottom of the chamber (including part of the bottom) and processed for electron-optical examination.

Podobně zařízení podle vynálezu lze využít pro serodiagnostiku, ale s tím rozdílem, že známé vírové antigeny jsou obsaženy již přímo v buňkách a testují se příslušná rekonvalescentní séra, například nepřímou imunofluorescencí.Similarly, the device according to the invention can be used for serodiagnostics, but with the difference that known viral antigens are already contained directly in the cells and the appropriate convalescent sera are tested, for example by indirect immunofluorescence.

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

Cell culture and storage apparatus for virological and cytological tests, characterized in that it consists of a plastic molding or molding, preferably in the form of a petri dish, whose bottom part (4) has symmetrically arranged chambers (1) with bottom bottoms (2) serving as a bed for growth of cell cultures and the upper part (3) being in the form of a lid with a central projection (8), both parts having a flat edge (7) on the periphery for hermetically closing the whole device,

2. Apparatus according to claim 2, characterized in that, in addition to the chambers IM, which are distributed symmetrically around the periphery of the lower part (4), there is a central well (5) with a convex convex bottom (6) in its center.