CS206427B1

CS206427B1 - Apparatus for exact and reproducible performance of mobile phase gradient in liquid chromatography

Info

Publication number: CS206427B1
Application number: CS874379A
Authority: CS
Inventors: Pavel Jandera; Jaroslav Churacek
Original assignee: Pavel Jandera; Jaroslav Churacek
Priority date: 1979-12-13
Filing date: 1979-12-13
Publication date: 1981-06-30

Description

(54) Zařízení pro přesnou a reprodukovatelnou tvorbu gradientu mobilní fáze v kapalinové chromatografii yynález se týká provedení zařízení pro přesnou a reprodukovatelnou tvorbu gradientu mobilní fáze v kapalinové chromatografii.(54) A device for accurate and reproducible gradient formation of a mobile phase in liquid chromatography is provided. The present invention relates to an apparatus for accurate and reproducible gradient formation of a mobile phase in liquid chromatography.

Stále se rozšiřující aplikace účinné vysokotlaké kapalinové ohromatografie pro analýzu složitých směsí organických látek v průmyslových i přírodních vzorcích i v biologických materiálech vyžadují zavádění techniky gradientově eluoe pro analytické dělení těchto směsí. Při gradientově eluci se kontinuálně (méně často i diskontinuálně) mění složení mobilní fáze v průběhu vlastního dělení. K tomuto účelu je třeba mít k dispozici zařízení, které je schopno vytvářet koncentrační gradient mobilní fáze podle předem zvoleného programu. Aby toto zařízení tvořilo požadovaný gradient mobilní fáze přesně a reprodukóvatelně, musí být jednak schopno směšovat složky mobilní fáze přesně v požadovaném, časově proměnném poměru, dávkovat takto připravenou mobilní fázi na chromatografickou kolonu za vysokého tlaku (až několika desítek MPa) a dále kompenzovat odchylky od požadovaného, časově proměnného složení a průtoku mobilní fáze, k nimž dochází v důsledku objemových změn (kontrakcí) při míchání různých kapalin či roztoků a v důsledku různé stlačitelnosti složek mobilní fáze při používaných vysokých tlacích.The ever-expanding application of efficient high pressure liquid chromatography for the analysis of complex mixtures of organic substances in industrial and natural samples as well as in biological materials requires the introduction of gradient elution techniques for the analytical separation of these mixtures. In gradient elution, the composition of the mobile phase changes continuously (less often and discontinuously) during the separation. For this purpose, it is necessary to have a device capable of generating a mobile phase concentration gradient according to a pre-selected program. In order to accurately and reproducibly produce the desired mobile phase gradient, the device must be capable of mixing the components of the mobile phase exactly in the desired, time-varying ratio, feeding the mobile phase thus prepared to a high pressure chromatography column (up to several tens of MPa). The desired, time-varying composition and flow rate of the mobile phase, which results from volume changes (contractions) when mixing different liquids or solutions and due to different compressibility of the mobile phase components at the high pressures used.

Dosud známá a používaná zařízení pro tvorbu gradientu mobilní fáze při kapalinové chromatografii lze dělit do několika skupin. Zařízení, používající k tvorbě koncentračního gradientu kombinace několika vzájemně spojených' uzavřených či otevřených nádob rozličného tvaru a objemu, obsahujícíoh jednotlivé složky mobilní fáze, přičemž k míšení jednotlivých složek a k dopravě smíšené mobilní fáze do chromatogxafiokýoh kolon s® používá jako hnacíThe liquid chromatography gradient devices known and used so far can be divided into several groups. Apparatus using a combination of a plurality of interconnected closed or open containers of different shape and volume containing individual components of a mobile phase to form a concentration gradient, using as a propellant to mix the individual components and deliver the mixed mobile phase to the chromathoxafiococci columns.

206 427 síly gravitace, nelze použít při vysokých tlacích běžných v moderní kapalinové chromatograV fii. řoužije-li ee analogické kombinace několika nádob k míšení «obilní řáse před vstupem do vysokotlaké psuspy, ktexá' dodává smíšenou «obilní fázi s koncentračním gradientem na kolona, je jednak značně ©mezená možnost výběru gradientů různého tvaru a strmosti a dále jo utvořený gradient značné nepřesný, jednak vlivem různé hustoty směšovaných kapalin a jednak vlivem odchylek tvaru nádob (většinou skleněnýoh) od přesně definovaného geometrického tvaru.206 427 of gravity, cannot be used at the high pressures common in modern liquid chromatography. If analogous combinations of several vessels are used to mix the «grain algae before entering the high pressure psuspa, which delivers a mixed« grain phase with a concentration gradient to the column, both the choice of gradients of different shape and steepness is considerably limited inaccurate, partly due to different density of mixed liquids and partly due to deviations of the shape of containers (mostly glass) from a precisely defined geometric shape.

Další typ zařízení pro gradientovou eluoi používá k tvorbě gradientu směšování dvou kapalin ve vysokotlaké části přístroje (US. patent 8. 3,446,057? SSR patent 8. 1953076?Another type of gradient elution device utilizes a blend of two liquids in the high pressure portion of the apparatus to create a gradient (U.S. Patent 8,446,057? SSR Patent 8; 1953076;

US. patent 8. 4,032,445). K čerpání každé ze složek mobilní fáze je zapotřebí zvláštního vysokotlakého čerpadla. Poměr průtoků kapalin dávkovaných jednotlivými čerpadly se mění s Sasem podle požadovaného program pomocí elektronického programátoru tak, aby suma průtoků všech kapalin čerpaných jednotlivými čerpadly byla konstantní v průběhu gradlentoÝá aluoe. Zvláštní variantou této skupiny jsou zařízení pro .tvorbu gradientu ve vysokotlaké části přístroj®, která používají pouze jednoho vysokotlakého čerpadla dávkujícího jednu složku mobilní fáze, přičemž druhá složka mobilní fáze j® obsažena ve zvláštní smyčcespojené a tímto čerpadlem. Gradient složení mobilní fáze se v tomto případě vytváří pomocí elektronicky programovaných časových spínačů, ovládajících ventily propouštějící do směšovací komůrky střídavě jednu složku mobilní fáze přímo z čerpadla a druhou složku ze saforčky. Zařízení vytvářející gradient ve vysokotlaké části přístroje jsou schopna podle zvoleného programu přesně řídit rychlost elektromotorů pohánějících pumpy čerpající jednotlivé složky mobilní fáze. Při práci při vysokých tlacích obvyklých v kapalinové ohromátografli však řUS. No. 8, 4,032,445). A separate high-pressure pump is required to pump each of the components of the mobile phase. The liquid flow rate of the individual pumps is varied with Sas according to the desired program using an electronic programmer so that the sum of the flow rates of all the liquids pumped by the individual pumps is constant throughout the gradient. A special variant of this group are high-pressure gradient generating devices employing only one high-pressure pump dispensing one mobile phase component, the other mobile phase component being contained in a separate loop connected by the pump. In this case, the mobile phase composition gradient is generated by electronically programmed timers controlling the valves passing into the mixing chamber alternately one component of the mobile phase directly from the pump and the other component from the saxophone. The gradient generating devices in the high pressure part of the device are able to accurately control the speed of the electric motors driving the pumps pumping the individual components of the mobile phase according to the selected program. However, when working at the high pressures usual in liquid ohromatographs, the dia

může docházet k významným odchylkám tvořeného koncentračního gradientu mobilní fáze od požadovaného profilu v důsledku různé stlačitelnosti jednotlivých čerpaných složek mobilní fáze.there may be significant deviations of the mobile phase concentration gradient formed from the desired profile due to different compressibility of the individual pumped components of the mobile phase.

®yto ©hyby jsou potlačeny a další skupiny zařízení, kde se vytváří gradient mobilní fáze v nízkotlaká části před vstupe® do vysokotlakého čerpadla pomocí programovaných časových spínačů ovládajíofoh přívodní ventily pro jednotlivé složky mobilní fáze. K míšení těchto složek dochází v mísící komůrce před vstupem do vysokotlaké pumpy anebo přímo ve vlastní pístové komoře této pumpy. (US. patenty 8. 3,985,019 a 3,985,021? US. patent 8» 3,917,531 a US. patent č. 4,018,685) ,The bends are suppressed, and other groups of devices where a mobile phase gradient is formed in the low pressure portion prior to entry into the high pressure pump using programmed timers control the inlet valves for each component of the mobile phase. Mixing of these components occurs in the mixing chamber before entering the high pressure pump or directly in the actual piston chamber of the pump. (U.S. Patent Nos. 3,985,019 and 3,985,021; U.S. Patent 8, 3,917,531 and U.S. Patent No. 4,018,685),

Žádné z dosud známých a používaných zařízení pro tvorbu gradientu mobilní fáze však neumožňuje kompenzovat odchylky vytvářeného gradientu cd požadovaného profilu v důsledku objemových kontrakcí při směšování různých kapalin, fak např. při míšení methanolu s voten v poměru 4 < 6 je objem vzniklého roztoku o cca 4 až 55& menší než součet objemů čistýoh složek před smísením. Směsi vodar-methanol představují v současné době snad. nejpoužívanější mobilní fáze v kapalinové ohroaatografii a objemové kontrakce v tomto systému při gradientově eluoi mohou výrazně ovlivnit retenční časy, šířky i výšky píků, oož se projeví chybami výsledků, zejména při korelaci dat získaných při různém průběhu gradientu a při eluoi s konstantním složením mobilní fáze.However, none of the known and used mobile phase gradient generators allows to compensate for deviations of the generated gradient cd of the desired profile due to volume contractions when mixing different liquids, for example when mixing methanol with votene at a ratio of 4 < up to 55 & less than the sum of the volumes of pure components prior to mixing. Water-methanol mixtures currently represent perhaps. The most widely used mobile phase in liquid endangering and volume contractions in this system at gradient elution can significantly affect peak retention times, widths and heights, resulting in error results, particularly when correlating data obtained at different gradient gradients and eluting with constant mobile phase composition.

Výš® uváděnou nevýhodu dosud užívaných zařízení pro tvorbu gradientu mobilní fáze odstraňuje a výhodu vyšší přesnosti a reprodukovatelnosti měření při gradientově eluci ¹s sebou přináší předmětný vynález.The aforementioned disadvantage of the mobile phase gradient generators used hitherto is eliminated and the present invention brings the advantage of higher accuracy and reproducibility of the measurements in gradient elution ¹ .

Podstata zařízení pro přesnou a reprodukovatelnou tvorbu gradientu mobilní fáze v k&.palinové ohromatografii spočívá v tom, že je tvořeno nízkotlakou programovatelnou tlačnou jednotkou, např. pístovým čerpadlem, kde každý jeho blok o objemu pístových komor max.The essence of the device for the accurate and reproducible generation of the mobile phase gradient in liquid chromatography is that it consists of a low pressure programmable pusher, eg a piston pump, each of its blocks having a volume of piston chambers of max.

0,5 ml je připojen přes vstup k zásobníku příslušné složky mobilní fáze, přičemž jeho výstup je připojen ke směšovací komůrce o objemu 0,005 až 2 ml, která je pak 8 pomoerí kapilárního potrubí o světlosti 0,05 až 2 mm připojen® přes rozdělující Člen jednak na vstup vysokotlakého pístového čerpadla s objemem komory pístu max. 0,5 ml a podruhé na přepadové potrubí s vyústěním umístěným'nad úrovní vstupu vysokotlakého čerpadla a současně nad úrovní rozdělujícího členu, přičemž vysokotlaké čerpadlo mobilní fáze j® s pomočí výstupu spojeno se zařízením pro zavádění vzorků a dále s ohromatografiokou kolonou, a to případně přes průtokové čidlo a přes průtokový tlumič tlakových rázů.0.5 ml is connected through the inlet to the container of the respective mobile phase component, the outlet of which is connected to a mixing chamber of 0.005 to 2 ml, which is then connected via an 8-member capillary piping of 0.05 to 2 mm in diameter. on the one hand to the inlet of the high-pressure piston pump with a piston chamber volume of max. 0.5 ml, and the other to the overflow pipe with an outlet located above the inlet of the high-pressure pump and above the level of the distributor. for the introduction of samples and further with an ohromatography column, optionally via a flow sensor and a flow shock absorber.

Z výhod zařízení pro přesnou a reprodukovatelnou tvorba gradientu mobilní fáze v kapalinové ohromatografii lze uvést alespoň tyto:Among the advantages of the apparatus for accurate and reproducible mobile phase gradient formation in liquid chromatography is at least the following:

- Zařízení umožňuje přesně á reprodukovatelně mísit dvě i víoe složek mobilní fáze podle požadovaného, časově proměnného poměru. .The device allows two or more components of the mobile phase to be mixed accurately and reproducibly according to the desired time-varying ratio. .

- Při nastavení celkového množství kapaliny čerpaného nízkotlakým programovatelným čerpadlem o oca 10 - 20% výše než množství kapaliny čerpané vysokotlakým čerpadlem nedochází k odchylkám skutečného průběhu gradientu mobilní fáze od požadovaného profilu, protože případné objemové kontrakce při míšení kapalin jsou kompenzovány tím, ž© vysokotlaké čerpadlo má možnost odebírat stéle stejná množství mobilní fáze a mění ee pouze množství kapaliny Odcházející do přepadu^- When setting the total amount of liquid pumped by the low pressure programmable pump by 10 - 20% higher than the amount of liquid pumped by the high pressure pump, the actual gradient of the mobile phase gradient does not deviate from the required profile. it has the ability to withdraw the same amounts of mobile phase over and over and only change the amount of liquid leaving the overflow

- Já-li vysokotlaké čerpadlo opatřeno zpětnevazebnýa kontrolním systémem nebo zařízením pro elektronickou kompenzaci stlačitelnosti kapalin při vyšších tlacích (což je u většiny čerpadel pro kapalinovou ohromatografii splněno), nedojde k odchylkám skutečného gradientu mobilní fáze od požadovaného profilu v důsledku stlačitelnosti kapalin, protož© k míšení obou kapalin dochází v nízkotlaké části přístroje.- If the high-pressure pump is equipped with a feedback control system or a device for electronically compensating the compressibility of liquids at higher pressures (which is fulfilled for most liquid chromatography systems), the actual mobile phase gradient will not deviate from the required profile due to the compressibility of liquids. mixing of both liquids occurs in the low-pressure part of the device.

- Nedochází k porušení požadovaného profilu gradientu při průtoku mobilní fáze od místa smísení až na ohromatografiokou kolonu. Mrtvý objem v této části zařízení j® zcela srovnatelný s ostatními běžně používanými zařízeními pro tvorbu gradientu mobilní fáze v kapalinové ohromatografii.- The desired gradient profile is not violated when the mobile phase flows from the mixing point to the ohromatography column. The dead volume in this part of the device is completely comparable to other commonly used devices for creating a mobile phase gradient in liquid chromatography.

- Zařízení podle vynálezu umožňuje současné splnění výše uvedených výhod, což se projeví vysokou přesností při reprodukci požadovaného koncentračního gradientu mobilní fáze, jak ukazuj© typický příklad znázorněný na obr. 1 (plná čára - skutečný gradient? přerušovaná čára - požadovaný gradient).The device according to the invention allows simultaneous fulfillment of the above advantages, which results in high accuracy in reproducing the desired concentration gradient of the mobile phase, as shown in the typical example shown in Fig. 1 (solid line - actual gradient - dashed line - desired gradient).

Zařízení pro přesnou a reprodukovatelnou tvorbu gradientu mobilní fáze v kapalinová ohromatografii podle vynálezu je znázorněno na obr. 2 a je tvořeno nízkotlakým programovatelným čerpadlem 1, s výhodou pístovým s objemem komor pístů max. 0,5 ml, přičemž každý blok 2, 3 pístu (alespoň dva) je na svém vstupu 21, 31 připojen k samostatnému zásobníku £, £ jedné ze složek mobilní fáze.The apparatus for accurately and reproducibly generating a mobile phase gradient in liquid hydromatography according to the invention is shown in Fig. 2 and consists of a low pressure programmable pump 1, preferably a piston with a piston chamber volume of max. 0.5 ml, each piston block 2, 3 ( at least two), at its inlet 21, 31, is connected to a separate container 60 of one of the components of the mobile phase.

Výstup 22, 32 nízkotlakého programovatelného čerpadla 1 je připojen ke směšovací kemůrce 6 o objemu 0,005 až 2 ml, která je pak s pomocí kapilárního potrubí 2 o světlostí 0,05 až 2 no připojena přes rozdělující člen 2 jednak na vstup 81 vysokotlakého pístového čerpadla 8 s objemem komory pístu mas. 0,5 ml a podruhé na přepadové potrubí 10 s vyústěním 11 umístěným nad úrovní vstupu 81 vysokotlakého čerpadla 8 a současně nad úrovní rozdělujícího členu 2·The outlet 22, 32 of the low pressure programmable pump 1 is connected to a mixing chamber 6 of a volume of 0.005 to 2 ml, which is then connected via a capillary pipe 2 with an orifice of 0.05 to 2 n. with the volume of the mass piston chamber. 0.5 ml and for the second time to the overflow pipe 10 with the orifice 11 located above the level of the inlet 81 of the high-pressure pump 8 and at the same time above the level of the distributor 2.

Za výstup vysokotlakého čerpadla Q je připojena ohromatografická kolona 12 se zařízením 13 pro nástřik vzorků, případně je mezi čerpadlem 8 a kolonou 12 dále umístěno čidlo pro měření tlaku a průtokový tlumič tlakových rázů (nejsou na obr. 2 naznačeny).The output of the high-pressure pump Q is connected to a chromatographic column 12 with a sample injection device 13, or a pressure sensor and a flow shock absorber (not shown in FIG. 2) are further positioned between the pump 8 and the column 12.

Funkce zařízení podle vynálezu je zřejmá z obr. 2, kde je směr toku kapaliny znázory >The operation of the device according to the invention is apparent from FIG. 2, where the direction of fluid flow is shown

něn šipkami, a spočívá v tom, že jednotlivé kapalné složlqr mobilní fáze nasávané nízkotlakým programovatelným čerpadlem 1 ze zásobníků £, 5, případně dalších, jsou podle požadovaného programu směšovány v komůrce 6 v časově proměnném poměru á takto smísená mobilní fáze je tímto Čerpadlem 1 dávkována kapilárním potrubím 2 do rozdělujícího členu 9, přičemž celkový průtok mobilní fáze mezi směšovací komůrkou 6 a rozdělujícím členem j) Je o cca 10 - 20$ větší než průtok mobilní fáze dávkované vysokotlakým čerpadlem 8. Čerpadlo 8 nasává mobilní fázi z rozdělujícího členu 2» ^z něhož přebytečná mobilní fáze, jejíž množství se mění podle velikosti objemových kontrakcí při směšování složek mobilní fáze, je odvětvována do přepadového potrubí 10, jehož výstup 11 je umístěn nad úrovní vstupu 81 vysokotlakého čerpadla 8 a současně nad úrovní rozdělujícího členu 2» ^&by na vstupu 81 čerpadla 8 nemohl vzniknout podtlak. Mobilní fáze s přesně reprodukovaným koncentračním gradientem je dávkována čerpadlem 8 za vysokého tlaku na chromatografiokou kolonu 12» ©patřenou zařízením 13 P¹*® hástřik vzorku.The liquid phase of the mobile phase sucked by the low-pressure programmable pump 1 from the tanks 5, 5 or others is, according to the desired program, mixed in the chamber 6 in a time-varying ratio and the mixed mobile phase is dosed by the pump 1. a capillary tube 2 to the dividing member 9, and the total flow rate of the mobile phase between the mixing chamber partitioning member 6 and j) is approximately 10 to 20 $ higher than the flow rate of the mobile phase dosed high pressure pump 8. the pump 8 sucks the mobile phase from the partitioning member 2 ^»of whereby excess mobile phase, whose amount varies according to the size of the volume contraction during blending of the components of the mobile phase is branching into the overflow pipe 10, the outlet 11 is positioned above the level of inlet 81 of high pressure pump 8 and also above the partitioning member 2 ^»& vacuum could not be generated at pump inlet 81. The mobile phase with a precisely reproduced concentration gradient is fed by a pump 8 under high pressure to a chromatography column 12 equipped with a 13 P ¹ * ® sample spray device.

Claims

PÍlBIÍJ.TIlXlBBB

Apparatus for accurate and reproducible mobile phase gradient formation in liquid chromatography, characterized in that it consists of a low-pressure programmable piston pump (1), each of its blocks (2, 3) having a piston chamber volume of up to 0.5 ml being connected via an inlet ( 21, 31) to a container (4, 5) of the respective mobile phase component, the outlet (22, 32) of which is connected to a mixing chamber (6) of 0.005 to 2 ml, which is then 0.05 to 2 mm in diameter connected through the distributor (9) to the inlet (81) of the high-pressure piston pump (8) with a piston chamber volume of up to 0.5 ml and to the overflow pipe (10) with the outlet (11) level of the inlet (81) of the high-pressure pump (8) and at the same time above the level of the distributor (9), wherein the high-pressure pump (8) of the mobile phase is connected to the sample injection device (13) and by a matography column (12), optionally via a flow sensor and a flow shock absorber.